Evaluierung verschiedener Synthesestrategien zur Festphasensynthese des Lipodepsipeptides Syringomycin E

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1 Evaluierung verschiedener Synthesestrategien zur Festphasensynthese des Lipodepsipeptides Syringomycin E Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. der Fakultät für Biologie an der Universität Duisburg-Essen vorgelegt von Yvonne Blaß aus Essen Juni 2016

2 Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden Experimente wurden am Zentrum für Medizinische Biotechnologie in der Abteilung Chemische Biologie der Universität Duisburg-Essen durchgeführt. 1. Gutachter: Prof. Dr. Markus Kaiser 2. Gutachter: Prof. Dr. Peter Bayer Vorsitzender des Prüfungsausschusses: Prof. Dr. Michael Ehrmann Tag der mündlichen Prüfung:

3 Meiner Familie und Jan

4 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis I. Einleitung Syringomycin Allgemeines Phytotoxine des Bakteriums Pseudomonas syringae Syringomycin E Festphasenpeptidsynthese Grundlagen der Festphasenpeptidsynthese Schutzgruppen Harze Peptidkupplung Chemoselektive Ligation II. Ziel der Arbeit III. Ergebnisse und Diskussion Grundlegende Syntheseüberlegungen Synthesestrategie Fmoc-SPPS mit säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen Synthese von Fmoc-L-Dab-OH (8) und Fmoc-D-Dab-OH (9) Synthese von Fmoc-L-Dab(Boc)-OH (10) und Fmoc-D-Dab(Boc)-OH (11) Synthese von Alloc-L-Phe-OH (6) Festphasensynthese und Eliminierung am Harz Abspaltung der Alloc-Schutzgruppe SPPS zum linearen Precursor am Harz (27) Abspaltung vom Harz zum linearen Precursor (28)... 55

5 Inhaltsverzeichnis Methoden zur Macrolactonisierung Zyklisierung über Yamaguchi-Veresterung Zyklisierung über Steglich-Veresterung Vollständige Abspaltung vom Harz: Synthese des linearen Derivates Synthese von Derivaten mit 3-Hydroxydodecansäure Synthese der geschützten 3-Hydroxydodecansäure (7) SPPS zum linearen Derivat Versuch der Zyklisierung via Steglich zu SPPS mit Bzl- und Cbz-Schutzgruppen an den Seitenketten Synthese von Derivaten mit β-hyasp und 3-Hydroxydodecansäure Synthese der geschützten L-threo-β-Hydroxyasparaginsäure Enantiomerentrennung Einführung der Benzylschutzgruppe Einführung der TBDMS-Schutzgruppe Einführung der Fmoc-Schutzgruppe Synthese des linearen geschützten Peptids Versuch der Zyklisierung Synthese der linearen Derivate 4 und Synthesestrategie 2: Ser/Thr-Ligation Synthese von Salicylaldehyd-Dimethylacetal (61) SPPS des geschützten linearen Peptids Synthese des ungeschützten linearen Peptid-Salicylaldehydesters Ligation Synthesestrategie 3: Zyklisierung via Peptidkupplung Synthese von Derivat SPPS des geschützten linearen Peptids IV. Zusammenfassung V. Ausblick... 94

6 Inhaltsverzeichnis VI. Material und Methoden Reagenzien und Materialien LC/MS HPLC NMR Gefriertrocknung Bestimmung des Drehwertes Allgemeine Methode: Beladung von 2-Chlorotitylchlorid-Harz mit Carbonsäuren Allgemeine Methode: Fmoc-Bestimmung zur Ermittlung der Harzbeladung Allgemeine Methode Fmoc-Abspaltung am Harz Allgemeine Methode: Peptidkupplung am Harz Allgemeine Methode: Testabspaltung Allgemeine Methode: Darstellung von Z-Dhb mittels Thr-Eliminierung an fester Phase Allgemeine Methode: Alloc-Abspaltung Allgemeine Methode: Abspaltung vom 2-Chlorotritylchlorid-Harz unter Erhalt der säurelabilen Seitenketten-Schutzgruppen Allgemeine Methode zum Abspalten der säurelabilen Schutzgruppen mit TFA Allgemeine Methode zum Abspalten von Bzl- und Cbz-Schutzgruppen in Lösung VII. Experimenteller Teil Alloc-L-Phe (6) (TBDMS)-Dodekansäure (7) Fmoc-L-Dab (8) Fmoc-D-Dab (9) Fmoc-L-Dab(Boc)-OH (10) Fmoc-D-Dab(Boc)-OH (11)

7 Inhaltsverzeichnis 7 L-threo-β-HyAsp (12) L-threo-β-HyAsp(OBzl)-OH (13) L-threo-β-HyAsp(OBzl,TBDMS)-OH (14) Fmoc-L-threo-β-HyAsp(OBzl,TBDMS)-OH (15) Synthese Derivate 1 und Harzbeladung Kupplung Fmoc-L-Asp(OtBu) zu Kupplung Fmoc-L-Thr-OH zu Kupplung Alloc-L-Phe-OH zu Eliminierung zu Alloc-Abspaltung zu Kupplung Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH zu Kupplung Fmoc-L-Dab(Boc)-OH zu Kupplung Fmoc-D-Dab(Boc)-OH zu Kupplung Fmoc-D-Ser(tBu)-OH zu Kupplung Fmoc-L-Ser-OH zu Kupplung Dodecansäure zu Abspaltung vom Harz zu Zyklisierung zu Abspaltung der SG zum linearen Derivat Synthese lineares Derivat Kupplung von 3-(TBDMS)-Dodecansäure (7) zu Abspaltung vom Harz zu Synthese der Testsequenz Harzbeladung SPPS zu Synthese lineare Derivate 4 und Harzbeladung

8 Inhaltsverzeichnis 11.2 Kupplung von Fmoc-β-L-threo-HyAsp(OBzl,TBDMS)-OH (15) zu Kupplung Fmoc-L-Thr-OH zu Kupplung Alloc-L-Phe-OH zu Eliminierung zu Alloc-Abspaltung zu Kupplung Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH zu Kupplung Fmoc-L-Dab(Boc)-OH zu Kupplung Fmoc-D-Dab(Boc)-OH zu Kupplung Fmoc-D-Ser(tBu)-OH zu Kupplung Fmoc-L-Ser-OH zu Kupplung 3-(TBDMS)-Dodecansäure (7) zu Abspaltung vom Harz zu Abspaltung der säurelabilen SG zu Abspaltung der Bzl-SG zu den linearen Derivaten 4 und Ligation Salicylaldehyd-Dimethylacetal Harzbeladung zu Kupplung Fmoc-L-Thr-OH zu Kupplung Alloc-L-Phe zu Eliminierung zu Alloc-Abspaltung zu Kupplung Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH zu Kupplung Fmoc-L-Dab(Boc)-OH zu Kupplung Fmoc-D-Dab(Boc)-OH zu Kupplung Fmoc-D-Ser(tBu)-OH zu Kupplung Fmoc-L-Ser-OH zu Veresterung am Harz zu Kupplung Dodecansäure zu

9 Inhaltsverzeichnis Abspaltung vom Harz mit SG zu Kupplung Salicylaldehyd-Dimethylacetal zu Schutzgruppenabspaltung zu Zyklisierung via Peptidkupplung Kupplung Dodecansäure zu Veresterung am Harz zu Abspaltung vom Harz zu Zyklisierung zu VIII. Literaturverzeichnis Danksagung

10 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Å Ångström AcOH Essigsäure Adoc Adamantyloxycarbonyl Alloc Allyloxycarbonyl α D aq. Arg AS Asp Boc Boc 2 O Bzl β-hyasp c Drehwert aqua (lateinisch: wässrig) Arginin Aminosäure Asparaginsäure Butyloxycarbonyl Di-tert-butyl-dicarbonat Benzyl β-hydroxyasparaginsäure Konzentration C Grad Celsius Ca Kalzium Cbz Benzyloxycarbonyl CDCl 3 deuteriertes Chloroform Cl Chlorid, Chlorid CLP cyclic lipodepsi nonapeptides 4-Cl-Thr 4-Chlorothreonin Cu(I)Cl Kupfer(I)chlorid d Duplett Dab Diaminobuttersäure DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en DCC N,N -Dicyclohexylcarbodiimid DCM Dichlormethan Dhb Dehydrobutansäure DIPEA Diisopropylethylamin DMAP 4-(Dimethyl)-aminopyridin DMSO Dimethylsulfoxid DMF Dimethylformamid D 2 O deuteriertes Wasser EDT Ethandithiol

11 Abkürzungsverzeichnis et al. et alii (lateinisch: und andere) Et 2 O Diethylether EtOAc Ethylacetat eq. Äquivalente FS Fettsäure Fmoc 9-Fluorenylmethoxycarbonyl g Gramm Gln Glutamin Glu Glutaminsäure Gly Glycin h Stunden H Wasserstoff, Proton HBTU 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronium-hexafluorophosphat HOAt 1-Hydroxy-7-aza-benzotriazol HOBt 1-Hydroxybenzotriazol HF Fluorwasserstoffsäure HPLC High pressure liquid chromatographie Hse Homoserin Ile Isoleucin J Kopplungskonstante K Kalium KAHA α-ketosäure-hydroxylamin-ligation LC/MS Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie- Kopplung LiBF 4 Lithiumtetrafluoroborat Lys Lysin m Multiplett M molar MBHA p-methylbenzhydryl-amin mg Milligramm MHz Megahertz min Minuten µl Microliter ml Milliliter

12 Abkürzungsverzeichnis mm Millimolar MeOH Methanol Na Natrium NaCl Natriumchlorid NAD(P)H Nicotinamidadenindinukleotidphosphat NaHCO 3 Natriumhydrogencarbonat NaOH Natriumhydroxid NCL native chemical ligation NEt 3 Triethylamin NH 4 OH wässrige Ammoniaklösung NMP N-Methyl-2-pyrrolidon NMR nuclear magnetic resonance OH Hydroxyl Orn Ornithin PAM Phenalacetamidomethyl P. syringae Pseudomonas syringae Pd(PPh 3 ) 4 Tetrakis(triphenylphosphin) Palladium (0) PIFA [Bis(trifluoroacetoxy)iod]benzen PSA Pseudomycin A Pbf 2,2,4,6,7-Pentamethyl-2,3-dehydrobenzofuran-5- sulfonyl Pd Palladium PG protecting group Phe Phenylalanin ppm parts per million Pro Prolin PyBOP Benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphat q Quartett R t SAL Ser SPPS Retentionszeit Salicylaldehyd Serin Festphasenpeptidsynthese (solid phase peptide synthesis) SRA 1 Syringomycin A 1

13 Abkürzungsverzeichnis SRE SRG SSA STB STL Tab. TBDMS t t-bu TFA TFE Thr TIS Val Syringomycin E Syringomycin G Syringostatin A Syringotoxin B Serin/Threonin-Ligation Tabelle tert-butyldimethylsilyl Triplett tert-butyl Trifluoressigsäure Trifluorethanol Threonin Triisopropylsilan Valin

14 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Chemische Strukturen ausgewählter CLP Abbildung 2: Chemische Struktur von Syringomycin E Abbildung 3: Allgemeines Schema der Durchführung einer SPPS Abbildung 4: Mechanismus der Fmoc-Entschützung einer Aminosäure durch das Abspaltreagenz Piperidin Abbildung 5: Schematische Darstellung des Konzeptes der orthogonalen Schutzgruppenstabilität Abbildung 6: Schematische Darstellung des Schutzgruppenkonzeptes der abgestuften Labilität Abbildung 7: Eine Auswahl chemischer Strukturen heutzutage verwendeter Peptidkupplungsreagenzien Abbildung 8: Mechanismus der Bildung eines HOBt-Aktivesters einer Aminosäure durch das Aktivierungreagenz HBTU Abbildung 9: Schematische Darstellung der konzeptionellen Unterschiede zwischen einer Peptidkupplung und einer chemoselektiven Ligation Abbildung 10: Schematische Darstellung der Reaktionsschritte der Ser/Thr-Ligation Abbildung 11: Chemische Struktur von Syringomycin E...43 Abbildung 12: Chemische Strukturen der Im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten Syringomycin E- Derivate...45 Abbildung 13: Synthesestrategie 1 mit verschiedenen Schutzgruppen (SG) über eine Macrolactonisierung Abbildung 14: Chemische Struktur von SRE und von dem daraus abgeleiteten Derivat 1 mit vereinfachter Struktur...47 Abbildung 15: Retrosynthese der Darstellung des Modellderivates Abbildung 16: Synthese von Fmoc-L-Dab-OH (8)...49 Abbildung 17: Synthese von Fmoc-L-Dab(Boc)-OH (10) Abbildung 18: Synthese von Alloc-L-Phenylalanin (6) Abbildung 19: SPPS und Eliminierung am Harz zu Abbildung 20: Palladium-katalysierte Alloc-Abspaltung zu Abbildung 21: SPPS zum linearen Precursor am Harz (27) Abbildung 22: Abspaltung des linearen Precursors (28)...55 Abbildung 23: Allgemeines Schema der Yamaguchi-Veresterung....56

15 Abbildungsverzeichnis Abbildung 24: Versuch der Veresterung des geschützten linearen Peptids 28 nach Yamaguchi Abbildung 25: Schmema der Steglich-Veresterung Abbildung 26: Zyklisierung des Precursorpeptides 28 zu 1 via der Steglich- Veresterung Abbildung 27: Abspaltung des linearen Produkts 2 vom Harz Abbildung 28: Retrosynthese für das Derivat 42 mit 3-Hydroxyl-substituiertem Fettsäurerest Abbildung 29: TBDMS-Schützung der 3-Hydroxydodecansäure (7)...63 Abbildung 30: Synthese von Derivat Abbildung 31: Abspaltung des linearen geschützten Peptids (41) vom Harz und Versuch der Zyklisierung nach Steglich Abbildung 32: Synthese der Testsequenz 44 mittels SPPS unter Verwendung von Bzl- und Cbz-Schutzgruppen Abbildung 33: Die Hydrierung der Testsequenz Abbildung 34: Chemische Formeln der Produkte nach der Hydrierung der Testsequenz Abbildung 35: Retrosynthese des Derivates 59 per SPPS und anschließender intramolekularer Steglich-Veresterung Abbildung 36: Chemische Struktur des Synthesebauteins Fmoc-L-threo-HyAsp mit Bzl- und TBDMS-geschützten Seitenketten...72 Abbildung 37: Schema der Reaktionsabfolge zur Enantiomerentrennung von L-threo- HyAsp Abbildung 38: Synthese (2S,3S)-2-amino-4-(benzyloxy)-3-hydroxy-4-oxobutansäure (L-threo-β-HyAsp(OBzl)-OH) (13) Abbildung 39: Synthese von (2S,3S)-2-amino-4-(benzyloxy)-3-(tertbutyldimethylsilyloxy)-4-oxobutansäure (L-threo-β-HyAsp(OBzl, TBDMS)-OH) (14). 74 Abbildung 40: Synthese (2S,3S)-2-Fmoc-amino-4-(benzyloxy)-3-(tertbutyldimethylsilyloxy)-4-oxobutansäure (Fmoc-L-threo-β-HyAsp(OBzl, TBDMS)-OH) (15) Abbildung 41: SPPS und Abspaltung des linearen geschützten Peptids 57 vom Harz...76 Abbildung 42: Versuch der Steglich-Veresterung des linearen Peptids Abbildung 43: Schutzgruppenabspaltung von Peptid Abbildung 44: Übersicht über die Synthesestrategie 2, der Thr-Ligation...81

16 Abbildungsverzeichnis Abbildung 45: Synthese von Salicylaldehyd-Dimethylacetal (61)...82 Abbildung 46: SPPS des Peptids 71 am Harz Abbildung 47: Synthese des geschützten linearen Peptids Abbildung 48: Synthese des Peptid-Salicylaldehydesters Abbildung 49: Chemische Struktur des N,O-Benzylidenintermediates der Ser/Thr- Ligation Abbildung 50: Übersicht über die Synthesestrategie 3, der Zyklisierung via einer Peptidkupplung in Lösung Abbildung 51: Retrosynthese für das Derivat 1 nach der Synthesestrategie Abbildung 52: SPPS des linearen Precursors Abbildung 53: Zyklisierung von 80 zu Derivat 1 via Peptidkupplung...90

17 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Differenz der Massen der gefundenen Produkte... 68

18 Einleitung 18 I. Einleitung 1 Syringomycin 1.1 Allgemeines Infektionen mit Pilzen (Mykosen) sind ein schwerwiegendes gesundheitliches Problem und tragen z. B. bei Patienten in Krankenhäusern und anderen Einrichtungen zu einer Erhöhung der Morbidität und Mortalität während der Behandlung bei. Besonders betroffen sind hiervon AIDS- und andere immunsupprimierte Patienten [1]. Eine effektive Bekämpfung der Mykose scheitert dabei häufig an Hygienemängeln, aber auch einer erhöhten Resistenz der pathogenen Pilze gegenüber bestehenden Chemotherapien. Um dieser Entwicklung entgegenzuwirken, sind neue antimykotische Wirkstoffe mit einem breiten Spektrum an Aktivitäten, geringer Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung von Resistenzen und minimaler Toxizität notwendig [2]. Neben dem Gesundheitssektor, zeigt sich auch in der Landwirtschaft in den letzten Jahren eine erhöhte Anzahl an Pilzinfektionen, die sich nicht mehr mit klassischen Fungiziden bekämpfen lassen, was auch hier zu einer Suche nach neuen Wirkstoffen führt, welche gezielt gegen die Erreger eingesetzt werden können, ohne den Nutzpflanzen und der Umwelt zu schaden [3]. Als potentielle neue Wirkstoffe gegen Mykosen könnten dabei phytotoxe Substanzen des Bakteriums Pseudomonas syringae dienen, welche in diversen Studien vielversprechende antifungale und fungizide Eigenschaften aufwiesen [2, 4]. 1.2 Phytotoxine des Bakteriums Pseudomonas syringae Pseudomonas syringae (P. syringae) ist ein stäbchenförmiges, gramnegatives und aerobes Bakterium. Es ist ein Pflanzen-pathogener Erreger und besitzt ein großes Wirtspektrum mit über 50 Pathovaren [5]. Infektionen mit dem Bakterium Pseudomonas syringae führen bei Pflanzen unter anderem zu Braunfäule, Dehydratisierung (water soaking) und Nekrose des Pflanzengewebes [6]. Neben einer direkten Wirkung auf Pflanzen biosynthetisiert P. syringae jedoch auch verschiedene Substanzen welche nicht nur auf Pflanzen wirken, sondern auch signifikant andere Pflanzenpathogene in ihrem Wachstum hemmen. Die Produktion dieser bioaktiven Substanzen erlaubt es somit den Pseudomonas syringae-arten,

19 Einleitung 19 sich gegen Pilze und anderen Bakterienstämmen auf den Oberflächen der Pflanzen zu behaupten. Die wichtigsten, von P. syringae produzierten niedermolekularen Phytotoxine sind dabei monozyklische β-lactame wie z. B. die Substanz Tabtoxin, Sulfodiaminophosphinylpeptide wie z. B. die Substanz Phaseolotoxin, Lipodepsinonapeptide wie z. B. der Naturstoff Syringomycin und verschiedene Polyketide wie z. B. die Verbindung Coronatin. Die ersten ausführlich untersuchten zyklischen Lipodepsinonapeptide (CLP, cyclic lipodepsi nonapeptides) aus P. syringae waren drei eng-verwandte Substanzgruppen, nämlich die Syringomycine, die Syringotoxine und die Syringostatine. Dabei produzieren die einzelnen individuellen P. syringae pv. syringae-stämme jeweils individuelle CLP-Gruppen. Beispielsweise produzieren die Stämme P. syringae pv. syringae B301D, SCl und M1 Syringomycine, der Stamm SY12 Syringostatine und der Stamm 116H Pseudomycine, während Syringotoxine von auf Zitruspflanzen-wachsenden gebildet werden. Innerhalb jeder Gruppe gibt es Hauptformen der produzierten Peptide, z. B. Syringomycin E (SRE) für die Syringomycine, Syringotoxin B (STB) für die Syringotoxine, Pseudomycin A (PSA) für die Pseudomycine und Syringostatin A (SSA) für die Syringostatine. Sie besitzen alle antimikrobielle Eigenschaften, was auf ihre gemeinsamen strukturelle Eigenschaften zurückzuführen ist [6]. Die Lipodepsinonapeptide bestehen aus einem neun Aminosäuren umfassenden Lactonring, dessen N-Terminus mit einer 3-Hydroxyl-Fettsäure acetyliert ist. Der Lactonring wird durch eine Esterbindung zwischen der Hydroxylgruppe des L-Serins (L-Ser) und der Carboxylgruppe eines L-4-Chlorothreonins (L-4-Cl-Thr) am C- Terminus zyklisiert. Dadurch haben die Moleküle einen amphipathischen Charakter mit einem positiv-geladenen Lactonring und einem neutralen, hydrophoben Fettsäurerest. Dieser amphiphatische Charakter führt dazu, dass die Peptide mit Membranoberflächen interagieren können. Die vier Lipodepsipeptide unterscheiden sich in ihrer Aminosäuresequenz zwischen den Positionen 2 und 6 und der Länge der Fettsäurekette. Das N-terminale L-Ser und das C-terminale Tripeptid, bestehend aus 2,3-Dehydroaminobutansäure (Dhb), L-β- Hydroxyasparaginsäure (β-hyasp) und L-4-Cl-Thr, sind bei allen vier Peptiden gleich [7].

20 Einleitung 20 Abbildung 1: Chemische Strukturen ausgewählter CLP. Der Kern aus den vier Aminosäuren L-4-Cl-Thr, L-β-HyAsp, Z-Dhb und L-Ser ist in allen Strukturen gleich. 1.3 Syringomycin E Eine der am besten untersuchten Gruppe von CLP sind die Syringomycine. Dabei lassen sich drei Syringomycine anhand der Kettenläge ihrer Fettsäuren unterscheiden: Syringomycin A (SRA 1 ) mit einem 3-Hydroxydecansäurerest, Syringomycin G (SRG) mit einem 3-Hydroxytetradecansäurerest und Syringomycin E (SRE) mit einem 3-Hydroxydodecansäurerest [8, 9]. SRE ist das Hauptpeptid dieser Gruppe und eines der am meisten untersuchten Peptide der CLP. Abbildung 2: Chemische Struktur von Syringomycin E. Die bakterielle Produktion von SRE wird durch spezifische Pflanzenmetabolite reguliert. Quigley et al. konnten dabei zeigen, dass über 90 % der P. syringae pv. syringae-stämme größere Mengen an SRE in Gegenwart von pflanzlichen Signalmolekülen oder von Metaboliten mit Signalaktivität produzieren [10, 11]. Beispielsweise wurden von Mo et al. in Blättern von Kirschbäumen zwei Arten von Metaboliten nachgewiesen [12]: Zum einen Phenolglycoside, und zum anderen Zucker, wie D-Fruktose oder Saccharose, welche eine Produktion von SRE auslösen. Das zeigt, dass das Bakterium dazu in der Lage ist, sich auf dynamische

21 Einleitung 21 Veränderungen in der Umgebung von Pflanzen einzustellen. Durch einen sensorischen Mechanismus für Metabolite werden Gene aktiviert, die für die Biosynthese von SRE verantwortlich sind [13]. In der Tat spielt SRE eine entscheidende Rolle in der Interaktion von Pflanzen und Mikroben, denn es ist dazu in der Lage, die bakterielle Pathogenität als Sekundärmetabolit von Pseudomonas syringae zu erhöhen [14]. Neben einer phytotoxischen Bioaktivität hat das Peptid jedoch auch eine interessante antifungale als auch fungizide Aktivität [15, 16]. In der Tat wurde vorgeschlagen, diese Substanz unter anderem zur biologischen Bekämpfung von Schimmelbefall an Zitrusfrüchten einzusetzen. So konnten Bull et al. in ihren Versuchen zeigen, dass SRE den Schimmelbefall kontrollieren kann, ohne Nekrosen an den Früchten hervorzurufen [17]. Auch als potentielle Substanz gegen lebensbedrohliche Pilzinfektionen ist SRE medizinisch von Interesse. Es weist eine antimykotische Wirkung in vitro gegen die Pathogene Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Cryptococcus neoformans, Fusarium moniliforme und Fusarium oxysporum auf [2, 15, 16]. In vivo konnte an Mausversuchen ebenfalls eine antimykotische Wirkung von SRE gegen den Hefepilz Candida albicans nachgewiesen werden. Hierzu wurde ein murines vaginales Candidose-Modell genutzt. Es zeigte, dass SRE auf verschiedenen Trägersystemen eine Reduzierung der Pilze in der Mausvagina herbeiführte. Effektive Konzentrationen lagen hier bei 12 % SRE auf einem Aquaphor-basiertem Trägersystem. Anschließende HPLC-Untersuchungen zeigten weder im Gewebe, in den Organen, noch im Plasma der Tiere SRE-Rückstände. Auch wurden keine Entzündungen des umliegenden Gewebes festgestellt [18]. Allerdings ist SRE auch in der Lage, Erythrozyten zu lysieren, was an Schafs-, Pferde- und Kaninchenerythrozyten sowie an humanen roten Blutkörperchen nachgewiesen wurde [19, 20]. Sorensen et al. konnten in vitro an Schafserythrozyten zeigen, dass die cyclischen Lipodepsinonapeptide aus Pseudomonas syringae eine höhere Toxizität gegenüber Erythrozyten aufwiesen als die bisher verwendeten Antimykotika Amphotericin B, Triazol und Flucytosin [2]. Versuche an humanen roten Blutkörperchen und Doppellipidmembranen von Agner et al. wiesen dabei einen temperaturabhängigen Effekt auf die Bildung und Inaktivierung von SRE-Poren auf [21].

22 Einleitung 22 Neben seiner fungiziden und antibiotischen Eigenschaft induziert SRE auch Nekrosen in Pflanzengeweben. Frühe in vitro-studien, beispielsweise an Knospen von Pfirsichbäumen, ergaben, dass sich nach 24 Stunden, in denen der Stamm in einer Wasserlösung mit einer 600 µg/ml Syringomycin-Konzentration getaucht war, erste Symptome an den Knospenblättern auftraten. Nach einer Inkubationszeit von einer Woche in einer Lösung mit einer Konzentration von nur 6 µg/ ml wurden die Knospen braun und nekrotisch. Eine Inokulation mit dem Bakterium P.syringae selbst zeigte einen vergleichbaren Effekt auf das Gewebe, was darauf schließen lässt, dass Syringomycin das Hauptphytotoxin bei der bakteriellen Erkrankung von Pfirsichbäumen zu sein scheint [22]. Untersuchungen zu Techniken mit einem fluoreszierenden Antikörper gegen SRE konnten diese Theorie bestätigen. Hierbei wurden unbehandelte Blätter eines Pfirsichbaumes und mit dem Bakterium -infizierte bzw. mit SRE-behandelte Blätter untersucht. Die in der Peripherie der Zellen beobachtete Fluoreszenz führte dabei zu dem Schluss, dass Syringomycin E an den Zellmembranen agiert [23]. Untersuchungen an Karotten- und Kartoffelgeweben, sowie an Blättern und Gewebe von Tabakpflanzen zeigten ebenfalls eine phytotoxische Wirkung von SRE auf [6, 24, 25]. In Versuchen konnte eine leichte Elektrolytleckage an Karottenscheiben, Nekrose an Tabakpflanzen und Zelltod sowie Gewebeaufweichung an Kartoffeln beobachtet werden [25]. An der Epidermis von Xanthium strumarium konnte unter Einfluss von SRE eine Schließung der Stomata beobachtet werden [26, 27]. Desweiteren wurde nachgewiesen, dass SRE Einfluss auf wichtige Funktionen von Pflanzen wie z. B. die mitochondriale Zellatmung und die Produktion von ATP nimmt [22, 28-30]. Auch von Effekten auf E. coli-zellen und einer Inhibierung von zellfreien RNA-Polymerasesystemen grampositiver Bakterien wurde berichtet [31, 32]. Sowohl in Pflanzen und Pilzen als auch in Erythrozyten scheint dabei die Plasmamembran das primäre Angriffsziel (target) zu sein. Der Effekt beruht auf Veränderungen der Membranfunktionen, wie die des Membranpotentials der K + -H + - ATPase-Aktivität, des H + -, Ca 2+ - und K + -Transports sowie generell der Proteinphosphorylierung [29, 33-35]. Diese Effekte lassen sich auf den molekularen Wirkmodus der Peptide zurückführen. Diese induzieren Transmembranporen in der Lipiddoppelschicht der Plasmamembran, die dann als nicht-selektive Ionenkanäle agieren [36-39].

23 Einleitung 23 Untersuchungen zur Interaktion von SRE mit künstlichen und natürlichen Membranen konnten Erkenntnisse in Struktur und Funktion der SRE-induzierten Poren und die Relevanz der Membrankomponenten für die Bildung der Poren liefern. Beispielweise wurde der Einfluss der Zusammensetzung der Plasmamembran bzgl. ihres Sterol- bzw. Sphingolipidgehaltes auf die Porenbildung sowohl genetisch als auch biophysikalisch ermittelt [20, 37, 40-48]. So zeigten S. cerevisiae-mutanten mit Mutationen in verschiedenen Genen der Ergosterol- und Sphingomyelinbiosynthese eine Resistenz gegenüber SRE-Behandlungen. Experimente an künstlichen Doppellipidschichten konnten außerdem beweisen, dass Sterole die SRE-induzierte Porenbildung erhöhen. Außerdem konnte eine Korrelation zwischen einer C4- Hydroxylierung bei Sphingolipiden und der Sensitivität gegenüber SRE gezeigt werden [41]. Bei Hämolyse-Studien und Untersuchungen an spannungsabhängigen Ionenkanälen konnte desweiteren belegt werden, dass SRE-Moleküle oligomerisieren und mindestens 6 SRE-Moleküle an der Bildung eines Membrankanals beteiligt sind [20, 38, 49]. Der Acylrest von SRE ist dabei in die Doppellipidschicht eingelagert. Der Peptidring stabilisiert den Membrankanal, der einen Durchmesser von ca. 20 Å aufweisen soll [38, 50, 51]. Eine Besonderheit der SRE-Kanäle ist die Rolle der Lipidmoleküle im Aufbau und der Architektur der Poren, die insgesamt eine konische Form aufweisen [52, 53]. Die hierzu notwendige Interaktion von SRE mit den Membranlipiden wird durch eine spezifische Konformation des SRE-Moleküls vermittelt, welche durch intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den einzelnen Aminosäureresten stabilisiert wird. Dabei spielt die Verteilung der Oberflächenladung der CLP eine besondere Rolle bei dem zugrundeliegenden molekularen Erkennungsprozeß, so dass in der gebildeten Pore die hydrophoben und die geladenen Bereiche mit den geladenen und hydrophoben Regionen der Doppellipidschicht interagieren können [51]. Die gebildeten Membranporen haben einen Radius von etwa 0.6 bis 1 nm und sind sowohl für monovalente (K +, H + ) als auch für divalente Kationen (Ca 2+ ) durchlässig [54]. Dieser Fluss führt zu vielfältigen biologischen Effekten. So konnten verschiedene Studien an künstlichen, pflanzlichen und Hefemembranen zeigen, dass eine Applikation von SRE zu einem enormen Einstrom von Ca 2+ ins Zytoplasma führt. Ein erhöhter Ca 2+ -Einstrom stimulierte dann die Ca 2+ -sensitive zytoplasmatische Proteinkinase, welche wiederum die Phosphorylierung und somit Aktivierung der

24 Einleitung 24 membrangebundenen NAD(P)H-Oxidase initiierte [33, 55]. Einen Zusammenhang zwischen einem rapiden K + -Ausfluss und einem hieraus resultierenden Schließen der Stomata in Blättern der Pflanze Xanthium strumarium konnte erstmals Mott et al. gezeigt werden [26]. Die Vielzahl der bisher beschriebenen biologischen Effekte, welche durch eine Gabe von SRE ausgelöst werden, belegt somit das hohe bioaktive Potential dieser Substanz bzw. der Substanzklasse der CLP. 2 Festphasenpeptidsynthese 2.1 Grundlagen der Festphasenpeptidsynthese Unter der Festphasenpeptidsynthese (engl. solid phase peptide synthesis, SPPS) versteht man die Synthese von Peptiden an einem festen Träger (dem sogenannten Harz) durch eine schrittweise Kupplung von Aminosäuren. Diese Methode wurde 1962 erstmals von R. B. Merrifield beschrieben, der dafür 1984 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet wurde. In dieser Studie gelang es ihm erstmals, ein Oligopeptid mit definierter Aminosäuresequenz in hoher Reinheit an fester Phase zu synthetisieren [56]. Der erste Schritt einer Festphasensynthese ist die Beladung des Harzes mit der C- terminalen Aminosäure. Für gewöhnlich wird die Carboxylgruppe der Aminosäure an das Harz gebunden, wobei der N-Terminus und die funktionellen Gruppen der Seitenkette orthogonal zueinander geschützt sind. Aufgrund von Racemisierungen während der Aktivierung der Carboxylatgruppe sind Anbindungen der Aminosäuren über den N-Terminus an das polymere Trägersystem eher selten. Anschließend folgen die Entschützung der Aminogruppe und die Kupplung der nächsten Aminosäure unter Verwendung diverser Kupplungsreagenzien und einer Base. Dieser Schritt kann in mehreren Zyklen von bis zu 50 Aminosäuren wiederholt werden. Das Peptid wird somit schrittweise vom C- zum N-Terminus aufgebaut. Ist die gewünschte Länge des Peptids erreicht, werden die Schutzgruppen der Seitenketten entfernt und das Peptid vom Harz abgespalten (s. Abbildung 3).

25 Einleitung 25 Abbildung 3: Allgemeines Schema der Durchführung einer SPPS. Ein Vorteil des SPPS-Ansatzes gegenüber einer Synthese in Lösung ist die Möglichkeit zur Automatisierung der Syntheseführung, was zu einer möglichen parallelen Synthese mehrerer Peptide gleichzeitig, einer enormen Zeitersparnis bei der Synthese und einem insgesamt viel geringerem manuellen Arbeitsaufwand führt. Desweiteren können die einzelnen Reaktionsschritte durch die Verwendung eines großen Überschusses an Reagenzien nahezu quantitativ und in verkürzter Reaktionszeit ablaufen. Die abnehmende Löslichkeit der länger-werdenden Peptidkette führt auch zu weniger Problemen wie bei einer entsprechenden Lösungssynthese. Auch die Aufreinigung der einzelnen Reaktionsschritte vereinfacht sich, da überschüssige Reagenzien und mögliche lösliche Nebenprodukte durch einfaches Waschen quantitativ entfernt werden können [57].

26 Einleitung Schutzgruppen Für eine erfolgreiche Synthese ist nicht nur eine retrosynthetische Planung nötig, sondern auch eine Schutzgruppenstrategie, die die Synthese bestimmende Faktoren wie z. B. die Labilität der Intermediate oder die Verwendung bestimmter Reagenzien berücksichtigt. Die große Auswahl an unterschiedlichen Schutzgruppen der α- Aminogruppe und der Seitenketten, die man selektiv abspalten kann, ermöglicht eine mittlerweile große Anzahl an orthogonalen Schutzgruppenstrategien [58]. Dabei müssen die eingesetzten Schutzgruppen bestimmte Voraussetzungen erfüllen. Zum einen müssen sie selektiv in guten Ausbeuten und unter milden Bedingungen abspaltbar sein, so dass unter den gewählten Abspaltkonditionen die verbleibenden Schutzgruppen nicht angegriffen werden. Desweiteren sollten sie für die Dauer und unter den Bedingungen der nachfolgenden Reaktionen und Reinigungsschritten stabil sein. Auch sollten die Schutzgruppen einen stabilisierenden Effekt auf das Molekül ausüben, keine neuen Stereozentren einbringen und möglichst wenig zusätzliche Funktionalitäten aufweisen, um das Auftreten möglicher Nebenreaktionen zu vermeiden [59]. Die Schutzgruppen werden meistens nach ihrer Labilität (und somit ihren Abspaltbedingungen) eingeteilt. Aufgrund der Vielzahl an unterschiedlichen Schutzgruppen soll der Fokus hier nur kurz auf einige Beispiele gelegt werden, die auch in dieser Arbeit verwendet wurden. Säurelabile Gruppen zählen zu den am häufigsten verwendeten Schutzgruppen für die Seitenketten. Die wichtigsten, in der Peptidchemie verwendeten Schutzgruppen sind dabei die auf tert-butylresten basierenden Schutzgruppen wie beispielsweise tert-buthylether bzw. -ester (t-bu) zum Schutz von Alkoholen und Thiolen bzw. Carbonsäuren oder der tert- Butyloxycarbonylgruppe (Boc) zum Schutz von Aminen. Weitere säureempfindliche Schutzgruppen sind Adamantyloxycarbonylverbindungen (Adoc) oder die Tritylschutzgruppe, welche alle in der Peptidchemie Verwendung finden. Auch lassen sich Silylschutzgruppen mit Säuren unterschiedlicher Stärke abspalten. Andere Schutzgruppen lassen sich hingegen durch basische Hydrolyse oder baseninduzierte β-eliminierung abspalten. Durch basische Hydrolyse werden vor allem Esterschutzgruppen wie z. B. Methyl- oder Ethylester gespalten. Vorteil hier ist, dass sich die Hydrolysegeschwindigkeit über sterische und elektronische Einflüsse steuern lässt. Das bekannteste und in der SPPS am häufigsten verwendete Beispiel

27 Einleitung 27 einer baseninduzierten β-eliminierung ist hingegen die Verwendung einer Fmoc- Gruppe (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) zum Schutz der N-terminalen Aminofunktionen von α-aminosäuren (bzw. gelegentlich zum Schutz der Seitenkettenaminofunktion von Lysin). Nach Deprotonierung eines aziden Wasserstoffs durch ein sekundäres Amin als Abspaltreagenz und anschließender E 1cb -Eliminierung wird hierbei die Fmoc-Schutzgruppe unter Bildung einer Carbanion- Zwischenstufe als Vinylverbindung abgespalten (s. Abbildung 4) [58]. Abbildung 4: Mechanismus der Fmoc-Entschützung einer Aminosäure durch das Abspaltreagenz Piperidin. Die bereits erwähnten Silylschutzgruppen gehören zu den Fluorid-labilen Schutzgruppen. Sie sind jedoch auch, in Abhängigkeit von ihren Alkylketten, im unterschiedlichen Maße säure- bzw. basenlabil. Interessant sind sie vor allem deshalb, weil sie mit Fluoridionen unter Bedingungen abgespalten werden, unter denen die meisten anderen bei der Peptidsynthese verwendeten Schutzgruppen stabil bleiben. Desweiteren hat man auch hier die Möglichkeit, durch unterschiedliche Substituenten am Silicium die Stabilität der Schutzgruppen zu variieren. Die Stabilität der Schutzgruppen korreliert dabei weitestgehend mit dem sterischen Anspruch der Substituenten am Silicium. Benzylschutzgruppen, die als Benzylether bzw. -ester (Bzl) oder Benzyloxycarbonylverbindungen (Cbz) Verwendung finden, werden als reduktionslabile Schutzgruppen eingesetzt und werden z. B. durch Hydrogenolyse abgespalten. Sie werden als Ether, Ester, Urethane und in gelegentlichen Fällen auch als Carbonaten und Benzylidenacetale zum Schutz von Alkoholen, Carbonsäuren, Aminen und Diolen eingesetzt. Ihre hydrogenolytische Abspaltung erfolgt dabei häufig unter relativ milden, nahezu neutralen Bedingungen. Allerdings

28 Einleitung 28 werden die Hydrogenolysen meistens mittels heterogener Katalyse durchgeführt, so dass eine Abspaltung dieser Schutzgruppen in der Regel nicht am Harz durchgeführt werden kann. Allylische Schutzgruppen werden Palladium-katalysiert abgespalten. Hierbei findet eine Pd-vermittelte Allylübertagung auf Nucleophile wie Amine oder C-H-azide Verbindungen statt. Auch diese Schutzgruppe erlaubt somit in der Regel eine orthogonale Abspaltung gegenüber den meisten anderen bei der Peptidsyntheseverwendeten Schutzgruppen [59-61]. Die unterschiedlichen Labilitäten der Schutzgruppen (und auch der Linker auf dem Harz) ermöglichen es, individuelle Synthesestrategie zu entwickeln. Dabei unterscheidet man prinzipiell zwei Schutzgruppenkonzepte in der Synthese: die Verwendung orthogonal-stabiler Schutzgruppen oder der Verwendung von Schutzgruppen abgestufter Labilität. Bei der orthogonalen Schutzgruppenstrategie lassen sich die einzelnen Schutzgruppen selektiv unter Erhalt aller anderen Schutzgruppen mittels selektiver Reagenzien abspalten, da alle Schutzgruppen unterschiedliche Labilitäten aufweisen. Somit können die Schutzgruppen in beliebiger Reihenfolge abgespalten werden (s. Abbildung 5). Beispielsweise lassen sich auf diese Weise säurelabile und basenlabile Schutzgruppen miteinander kombinieren. Wird die basenlabile Schutzgruppe abgespalten, wie es bei der Fmoc- SPPS der Fall ist, bleiben somit die säurelabilen Schutzgruppen der Seitenketten erhalten. Abbildung 5: Schematische Darstellung des Konzeptes der orthogonalen Schutzgruppenstabilität. Die Schutzgruppen A, B und C lassen sich in beliebiger Reihenfolge mit unterschiedlichen Methoden a, b und c abspalten.

29 Einleitung 29 Anders als eine orthogonale Schutzgruppenstrategie lassen sich bei einer Schutzgruppenstrategie der abgestuften Labilität die Schutzgruppen nicht selektiv abspalten. Sind die Gruppen z.b. säurelabil, so können sie nacheinander mit unterschiedlich starken ph-werten abgespalten werden (s. Abbildung 6). Die labilsten Gruppen lassen sich somit vor den stabilsten abtrennen, allerdings ist es so nicht möglich, die stabilste Schutzgruppe vor einer labileren Schutzgruppe abzuspalten. Abbildung 6: Schematische Darstellung des Schutzgruppenkonzeptes der abgestuften Labilität. Die Schutzgruppen haben dieselbe, jedoch unterschiedlich stark ausgeprägte Labilität. Die Schutzgruppen lassen sich nach ihrer Stabilität nacheinander (s. oben), jedoch nicht selektiv abspalten (s. unten). In der SPPS unterscheidet man zwei große Synthesestrategien, die sogenannte Bocbzw. Fmoc-Strategie, die auf einem unterschiedlichen Schutzgruppenkonzept basieren. Bei der Boc-Strategie wird die α-aminofunktion einer Aminosäure als eine tert-butyloxycarbonylverbindung geschützt. Die Abspaltung der Schutzgruppe, die vor der Durchführung jedes iterativen Kupplungsschrittes notwendig ist, erfolgt somit unter sauren Bedingungen und folgt in der Regel einem E 1 -Mechanismus über eine Carbokation-Zwischenstufe. Bei dieser Synthesestrategie werden als Seitenkettenschutzgruppen in der Regel Benzylderivate eingesetzt. Bei dieser SPPS- Synthesestrategie wird also eine unterschiedliche Labilität der Seitenkettenschutzgruppen und der Boc-Gruppe gegenüber verschieden starken Säuren verwendet. Bei der Fmoc-Strategie wird hingegen ein orthogonales Schutzgruppenkonzept verfolgt. Bei diesem Ansatz trägt die α-aminofunktion eine Fmoc-Schutzgruppe, die Seitenketten sind in der Regel mit säurelabilen Schutzgruppen ausgestattet. In der vorliegenden Arbeit wurde die Fmoc-Strategie zur Synthese der Peptide herangezogen.

30 Einleitung Harze Die feste Phase, an der bei der SPPS die Synthese durchgeführt wird und die auch das Harz genannt wird, besteht in der Regel aus Polystyrol, das durch die Zugabe von m-divinylbenzol quervernetzt und somit mechanisch stabilisiert wurde. Desweiteren trägt das Harz einen Linker, der eine kovalente Verankerung des Peptides an den polymeren Träger ermöglicht. Wichtig für die Eigenschaften eines Harzes sind dessen Quelleigenschaften, dessen potentielle Beladungsdichte sowie dessen Inertheit gegenüber den verwendeten Reagenzien. Polystyrol ist im trockenen Zustand zwar unlöslich und starr, quillt aber in einigen Lösemitteln wie z. B. Dichlormethan (DCM) beträchtlich auf. Durch dieses Aufquellen können sich Reagenzien leichter in die Polymermatrix hinein und aus ihr heraus bewegen. Für eine erfolgreiche SPPS-Synthese kommt desweiteren dem Linker eine besondere Bedeutung zu. Der Linker ist das Bindeglied zwischen dem Polymer und dem Peptid und legt fest, welche Gruppe, z.b. Carbonsäure oder ein Amid, nach der Synthese am C-Terminus erhalten wird und vor allem unter welchen Bedingungen das Peptid abgespalten wird. Für die Fmoc-Strategie werden normalerweise Harze eingesetzt, von denen die Peptide in der Regel sauer, z. B. mit Trifluoressigsäure (TFA) oder Essigsäure (AcOH), abgespalten werden. Hierzu eignen sich beispielsweise Wang-, Rink- und Chlorotritylharze. Die Harze sind unterschiedlich säurelabil, was eine Vielzahl an Synthesebedingungen ermöglicht. So können auch Peptide erhalten werden, die an den Seitenketten vollständig geschützt sind. Für die Boc-Strategie eignen sich Harze wie MBHA (p-methylbenzhydrylamin)- und PAM (Phenalacetamidomethyl)-Harze sowie das klassische Merrifield-Harz, bei denen die Peptidabspaltung sauer über Fluorwasserstoffsäure (HF) erfolgt. Oxim- Harze werden basisch mit Ammoniak oder Hydrazinen gespalten und eignen sich daher dazu, auch mit einer Boc-Strategie geschützte Peptide zu erhalten. Die Möglichkeit einer orthogonalen Abspaltung bieten z.b. Harze mit einem Nitrobenzyl-Linker oder einem Allyl-Linker. Bei den Nitrobenzyl-Harzen handelt es sich um photolabile Linker, die mit Licht gespalten werden. Bei den Allyl-Harzen wird der Linker Palladium-katalysiert abgespalten. Um reaktive Intermediatedie, die bei der Abspaltung entstehen und dann in unerwünschter Weise mit dem Peptid reagieren könnten, werden Abfangreagenzien (scavenger) wie z. B. Thioanisol, Triisopropylsilan (TIS), Ethandithiol (EDT) oder

31 Einleitung 31 Dimethylsulfid der Abspaltlösung zugesetzt. Ohne diese Zusätze könnten die bei der Abspaltung entstehenden, stabilen Carbokationen wie z.b. das tert-butyl- oder Tritylkation mit den elektronenreichen funktionellen Seitengruppen einiger Aminosäuren (z.b. Tryptophan, Tyrosin, Methionin) irreversibel modifizieren. 2.4 Peptidkupplung Die Bildung einer Amidbindung verläuft normalerweise über einen Additions- Eliminierungs-Reaktionsmechanismus und erfolgt bei Raumtemperatur nicht spontan, sondern benötigt zur Eliminierung von Wasser hohe Temperaturen. Für die Peptidsynthese sind jedoch milde, schnelle, racemisierungsfreie und quantitative Kupplungen wichtig. Zur Bildung einer Amidbindung zwischen zwei Aminosäuren muss daher zunächst die Carboxylfunktion der N-geschützten Aminosäure für einen nucleophilen Angriff des Amins aktiviert werden. Eine solche Aktivierung kann jedoch zu unerwünschten Nebenreaktionen wie z. B. eine Azlactonbildung, unerwünschte Zyklisierungen, Racemisierungen oder eine Überaktivierung der Aminosäuren führen [62, 63]. Um diese Probleme zu vermeiden und milde Synthesebedingungen zu schaffen, wurden daher in den letzten Jahrezehnten spezielle Peptidkupplungsreagenzien entwickelt. Die heutzutage gebräuchlichsten Reagenzien sind Phosphonium- und Aminiumsalze sowie Carbodiimide [64-66]. Eine Übersicht über einige der gängigsten Kupplungsreagenzien ist in Abbildung 7 dargestellt. Abbildung 7: Eine Auswahl chemischer Strukturen heutzutage verwendeter Peptidkupplungsreagenzien.

32 Einleitung 32 Bevorzugt werden dabei heutzutage in der Festphasensynthese vor allem Aminiumund Phosphoniumsalz-basierte Kupplungsreagenzien eingesetzt, da ihre Kupplungseffizienz im Vergleich zu den Carbodiimiden in der Regel höher ist. Die Aktivierung der Carbonsäure verläuft dabei in der Regel über die Bildung unterschiedlicher Zwischenprodukte ab, deren Bildungsgeschwindigkeit von den verwendeten Substraten, Lösemittel, Basen und dem Zusatz von N- Hydroxyverbindungen wie z. B. den Hydroxybenzotriazolen HOBt (1- Hydroxybenzotriazol) bzw. HOAt (1-Hydroxy-7-aza-benzotriazol) oder den Hydroxybenzotriazinen wie HODhbt (3-Hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3- benzotriazin) abhängt [67]. Durch die Reaktion des Hydroxylderivates mit dem racemisierungsanfälligen intermediären O-Acylisoharnstoff wird dabei ein weniger Racemisierungs-gefährdeter Aktivester gebildet. Dieser reagiert anschließend mit einem Amin unter Bildung der Amidbindung [68, 69]. In Abbildung 8 ist ein detaillierter Mechanismus der Aktivierung von Aminosäuren dargestellt. Zunächst muss die am N-Terminus geschützte Aminosäure durch eine Base (z.b. DIPEA) in das Säureanion überführt werden. Nun kann das Carboxylanion das positiv geladene Kohlenstoffatom des Kupplungsreagenzes (z.b. HBTU) angreifen. Es werden ein O- Acyluroniumkation und ein Benzotriazoylanion gebildet. Das Benzotriazoylanion greift nun am Acylkohlenstoff an, was zu einem Benzotriazoylester führt. Dieser wird anschließend mit der freien Aminogruppe der wachsenden Peptidkette zum gewünschten Peptid umgesetzt. Abbildung 8: Mechanismus der Bildung eines HOBt-Aktivesters einer Aminosäure durch das Aktivierungreagenz HBTU.

33 Einleitung 33 3 Chemoselektive Ligation Eine chemische Ligation bietet in der Peptidchemie die Möglichkeit, aus kurzen Peptidfragmenten größere Peptide zu synthetisieren und zu modifizieren. Bei der SPPS können lineare Peptide mit einer Kettenlänge von 40 bis 50 Aminosäuren synthetisiert werden [70]. Um längere Peptide zu erhalten, gibt es die daher nur die Möglichkeit, mehrere Peptidsegmente miteinander zu kuppeln. Geschützte Peptidsegmente über einen Angriff der Aminogruppe auf eine aktivierte Carboxylgruppe zu kuppeln, eignet sich jedoch nur wenig, da die Reaktivität zwischen den beiden Gruppen nicht hoch genug ist, um die aufgrund der schlechten Löslichkeit der Peptide resultierende, niedrige Konzentration der Reaktionslösung auszugleichen. Außerdem besteht der Nachteil, dass Epimerisierungen bei der Aktivierung am C-Terminus des Peptidfragments, Aggregation durch hydrophobe Schutzgruppen sowie eine generell schlechte Löslichkeit geschützter Peptidfragmente auftreten können. Mit einer chemoselektiven Ligation lassen sich Peptidfragmente jedoch ungeschützt miteinander verbinden. Im Gegensatz zu konventionellen Kupplungen von Peptidfragmenten haben chemoselektive Ligationen somit den Vorteil, dass diese aufgrund von teil- oder komplett-entschützten Fragmenten das Problem der Löslichkeit umgehen können, was zu einer erhöhten Ausbeute und einer vereinfachten Charakterisierung und Aufreinigung der Produkte führen kann. Bei der Ligation gehen zwei wechselseitig-reaktive funktionelle Gruppen eine chemoselektive Reaktion ein, die unabhängig von den restlichen funktionellen Gruppen der Aminosäuren ist. Diese Ligationen verlaufen prinzipiell über zwei bzw. drei Stufen. Ein Capture -Schritt verbindet die Peptide über eine chemische Reaktion, die schneller ist als ein intermolekularer Acyltransfer auf ein Amin. Der daran anschließende, entscheidende Acyltransfer-Schritt verläuft dann intramolekular ab und ist sehr effizient. Wurde der Capture-Schritt durch ein Auxiliar bewirkt, so wird dieses in einem dritten, letzten Schritt entfernt. Dies kann entweder unter milden chemischen Bedingungen oder aber spontan ablaufen. Idealerweise finden chemische Ligationen in wässrigem Medium, bei geringen Konzentrationen der Reaktionspartner und unter milden Bedingungen statt [71-76]. Neben der Darstellung linearer Proteine wurden verschiedene chemischen Ligationsmethoden dabei auch eingesetzt, um linear synthetisierte Peptide effizient und unter milden wässrigen Bedingungen intramolekular zu zyklisieren [77-80].

34 Einleitung 34 Abbildung 9: Schematische Darstellung der konzeptionellen Unterschiede zwischen einer Peptidkupplung und einer chemoselektiven Ligation. A) Schema einer Kupplung von Peptiden mit Schutzgruppen (protecting group, PG) und anschließender Entschützung; B) Schema einer Ligation. Die chemoselektiven Reaktionspartner benötigen keine Schutzgruppen und führen direkt zum Produkt. Mit der Zeit wurden mehrere Methoden der chemischen Ligation entwickelt. Hier wird nur eine Auswahl einiger Ligationsmethoden erläutert. Die Entwicklung der nativen chemischen Ligation (NCL) durch Dawson et al. ermöglichte es, ein ungeschütztes Peptidsegment, das eine Thioester-Funktion am C-Terminus trägt, mit einem zweiten ungeschützten Segment mit einem Cystein-Rest am N-Terminus zu ligieren [72]. Hierbei bildet sich ein Thioester-Intermediat, welches über eine spontane, schnelle intramolekulare Reaktion eine Peptidbindung bildet. Die Reaktion dauert nur wenige Minuten bei Raumtemperatur, verläuft unter sehr milden Bedingungen und ist hochselektiv. Nachteile dieser NCL sind die aufwendige Synthese der Thioester- Bausteine sowie das geringe Vorkommen von Cystein-Resten in Peptidsequenzen [72, 81]. Die Staudinger-Ligation beruht auf der Reaktion von Aziden mit Phosphanen zu Phospho-Aza-Yliden, die von Acylgruppen abgefangen werden können, wobei eine stabile Amidbindung entsteht [82]. Die Ligation kann je nach Phosphanreagenz spurlos oder nicht spurlos ablaufen. Bei der nicht-spurlosen Staudinger-Ligation nach Bertozzi et al. reagieren ein Phosphan und ein Azid in Wasser quantitativ zu einem Amid [82]. Mithilfe eines Phosphanreagenzes, das mit einer intramolekularen elektrophilen Gruppe versehen ist, wird verhindert, dass das bei der Reaktion entstehende Aza-Ylid zu einem primären Amin hydrolysiert wird. Durch intramolekulare Zyklisierung wird das Aza-Ylid abgefangen, wobei die Phosphanoxid- Einheit als Spur im Ligationsprodukt verbleibt.

35 Einleitung 35 Die von Raines et al. entwickelte spurlose Staudinger-Ligation hingegen verläuft in drei Schritten ab und hinterlässt keine Reaktionsprodukte des Phosphan- Kupplungsreagenzes im Produkt [83]. Hierzu wird ein Phosphinothiolreagenz benutzt, welches mit einem C-terminalen Thioester eine Transthioveresterungsreaktion unter Abspaltung des Thiols eingeht. Eine anschließende Kupplung mit einem N-terminalen Azid auf dem zweiten Peptid führt zur Bildung eines reaktiven Iminophosphorans, aus dem durch einen Angriff des Stickstoffs auf den Thioester ein Amidophosphoniumsalz entsteht. Das Salz kann nun durch Hydrolyse zum Amid und dem Nebenprodukt Phosphinoxid umgesetzt werden. Die Staudinger-Ligation wurde beispielsweise in der Totalsynthese von Ribonuclease A eingesetzt [84]. Allerdings wurden hier geschützte Peptidfragmente am Harz ligiert. Untersuchungen der Kupplung eines ungeschützten Peptids mit einem Lysinrest zeigten neben dem gewünschten Ligationsprodukt auch ein Aminolyseprodukt, welches durch einen nucleophilen Angriff der Aminogruppe an der Seitenkette des Lysins entsteht. Während das Aza-Ylid-Intermediat sehr schnell gebildet wird, verläuft die Weiterreaktion zum Ligationsprodukt sehr langsam, was eine Folge von sterischer Hinderung der Zwischenprodukte oder von den Seitenketten der Aminosäuren sein kann [85]. Eine weitere Alternative zur NCL ist die von Bode et al. entwickelte α-ketosäure- Hydroxylamin-Ligation (engl. α-ketoacid Hydroxylamine, KAHA) [86]. Ursprünglich handelt es sich bei dieser Methode um eine chemoselektive Kondensation zwischen einer C-terminalen α-ketosäure und einem N-terminalen N-Hydroxylamin [86, 87]. Dieser Mechanismus wird als Typ I-Ligation bezeichnet. Diese Typ I-Ligation ist allerdings sehr schlecht in wässrigen Medien durchzuführen [88-90]. Ein neuerer Ansatz der KAHA-Ligation ist die Typ II-Ligation, bei der anstelle des O- unsubstituierten Hydroxylamins eine O-substituierte Variante, meistens 5-Oxaprolin, eingesetzt wird [87, 88]. Oxaprolin stellt eine vielseitige N-Hydroxylaminosäure für chemische Ligationen dar, da diese ausreichend reaktiv in wässrigem Medium ist und sowohl unter Ligationsbedingungen als auch in der SPPS eine geeignete Stabilität zeigt. Als Primärprodukt bildet sich während der Ligation aus dem 5- Oxaprolin ein Depsipeptid. Die Esterbindung lagert sich in dann in einem basischen Puffer in eine Amidbindung um, woraus ein Homoserin an der Ligationsseite resultiert [91]. Die Reaktion verläuft sehr sauber mit guten Ausbeuten, jedoch ist die Typ II-Ligation aufgrund des entstehenden unnatürlichen Homoserins nur für Peptide

36 Einleitung 36 geeignet, die ein Homoserin bzw. eine daraus chemisch-ableitbare Aminosäure enthalten [90, 92]. Eine andere Möglichkeit der chemischen Ligation bietet die Serin/Threonin-Ligation (STL). Bei dieser von Tam et al. entwickelten Methode wird ein ungeschütztes Peptidsegment mit einem Glycoaldehydester am C-Terminus mit einem anderen Peptidsegment ligiert, welches ein Serin, Threonin oder Cystein am N-Terminus trägt [93]. Diese Ligation resultiert in der Bildung eines Pseudoprolin-Derivates, welches jedoch mit der Originalmethode nicht in eine native Peptidbindung überführt werden konnte. Desweiteren verlief diese Ligation insgesamt nur sehr langsam [93-95]. Li et al. jedoch gelang es, hieraus eine zwei-stufen-ligation zu entwickeln, in der ein Salicylaldehydbaustein am C-Terminus des einen Peptidfragmentes mit der N- terminalen Aminogruppe von Serin bzw. Threonin eines zweiten Peptidfragmentes reagieren (s. Abbildung 10) [96]. Diese bilden zunächst eine Iminzwischenstufe, an welche anschließend die -Hydroxylgruppe der N-terminalen Serin- oder Threonin- Aminosäure addiert. Nach einem O N-Acyltransfer bildet sich ein stabiles Acetalintermediat (N,O-Benzylidenacetal), welches unter milden sauren Bedingungen in die natürliche Peptidbindung hydrolysiert werden kann. Diese Methode konnte z.b. sehr erfoglreich bei der Synthese des Naturstoffes Daptomycin eingesetzt werden [77].

37 Einleitung 37 Abbildung 10: Schematische Darstellung der Reaktionsschritte der Ser/Thr-Ligation (STL). Nachteilig ist jedoch, dass diese Ligation nicht mit allen Aminosäuren am C-Terminus durchführbar ist. Wong et al. konnten vor kurzem zeigen, dass von den 20 kanonischen Aminosäuren lediglich 17 für eine Ser/Thr-Ligation geeignet waren [97]. Mit Asp, Glu und Lys am C-Terminus des Salicylaldeyhdpeptidesters scheint diese Ligation nicht möglich zu sein. Als Ursache hierfür vermuteten die Autoren der Studie, dass der Peptid-Salicylaldehydester bei diesen Aminosäuren nicht stabil ist. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Reaktion mit β-verzweigten Aminosäuren, wie z.b. Thr, Val oder Ile nur deutlich schlechter ablief und für diese Aminosäuren daher optimierte Syntheseprotokolle entwickelt werden mussten. Nichtsdestotrotz stellt die Ser/Thr-Ligation eine potente Methode zur Synthese von

38 Einleitung 38 Proteinen bzw. zur Zyklisierung von Cyclopeptiden dar und sollte im Rahmen dieser Arbeit zur Synthese von Syringomycin E evaluiert werden.

39 Ziel der Arbeit 39 II. Ziel der Arbeit Aufgrund der Häufung der Resistenzen von pathogenen Pilzen gegenüber gängigen Chemotherapien ist man beständig auf der Suche nach neuen antifungalen Stoffen, die in der Medizin eingesetzt werden können [15]. SRE bietet aufgrund seiner antifungalen Aktivität, die in vivo und in vitro nachgewiesen wurde, eine Alternative zu den bisher eingesetzten Antimykotika [18, 49]. Allerdings weist SRE ebenso toxische Aktivitäten gegenüber Erythrozyten auf, was den Einsatz als Therapeutikum wiederum in Frage stellt [40]. Ein Ziel dieser Arbeit ist es daher, eine Syntheseroute zu SRE bzw. zu Derivaten dieser Substanz zu entwickeln, welche dann in der Zukunft auf ihre antifungale bzw. ihre generelle biologische Wirkung bzw. auf unerwünschte Nebenwirkungen getestet werden können. Bisher konnte noch keine chemische Synthese von SRE oder seinen Derivaten beschrieben werden. Als Syntheseweg sollte aufgrund ihrer breiteren Anwendbarkeit zur Synthese von Derivaten eine Festphasenpeptidsynthese (SPPS) zu einem linearen Peptid entwickelt werden. Zur Darstellung zyklischer Syringomycin E- Derivate sollten diese linearen Peptide anschließend in Lösung zyklisiert werden. Ein solcher Ansatz hat sich bei vielen Synthesen anderer zyklischen Peptide bewährt [98]. Zur Darstellung der Syringomycin E-Derivaten sollte dabei auf eine Fmoc-Strategie zurückgegriffen werden, da diese im Gegensatz zur Boc-Strategie kein HF zum Abspalten der Peptide benötigt. Desweiteren sollten die Synthesen für ein 2- Chlorotritylchlorid-Harz entwickelt werden, da das lineare Peptid sich dann mit einer schwachen Essigsäure/DCM-Lösung unter Erhalt der Seitenketten-Schutzgruppen abspalten lässt, wodurch sich vielfältige Derivatisierungsmöglichkeiten ergeben können, was wiederum die mögliche Anwendungsbreite der zu entwickelnden Synthese vergrößern könnte. Wie bereits erwähnt, sollten neben der Synthese von linearen Syringomycin E- artigen Peptiden auch zyklische Derivate hergestellt werden, was sicherlich die synthetisch-anspruchsvollere Aufgabenstellung darstellt. Um die Darstellung solch zyklischer Peptide zu erreichen, sollten daher im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Zyklisierungsmethoden evaluiert werden. Zum einen sollten Macrolactonisierungen nach Yamaguchi und Steglich getestet werden, desweiteren Zyklisierungen mittels

40 Ziel der Arbeit 40 einer chemoselektiven Serin/Threonin-Ligation sowie mittels einer intramolekularen Amidkupplung in Lösung.

41 Ergebnisse und Diskussion 41 III. Ergebnisse und Diskussion Grundlegende Syntheseüberlegungen CLP von Pseudomonas syringae haben antimikrobielle Eigenschaften, die jedoch bisher noch nicht als mögliche Chemotherapeutika eingesetzt worden sind, unter anderem aufgrund ihrer Nebenwirkungen. Um diese Substanzklasse für eine mögliche Anwendung zu erschließen, wurden daher chemische Modifikationen der Strukturen an Isolaten verschiedener CLP durchgeführt und diese anschließend auf ihre biologische Aktivität getestet. Diese Studien führten zu ersten Hinweisen bzgl. der chemischen Reaktivität von CLP und erste Einblicke in Struktur- Wirkungsbeziehungen und sollen dementsprechend hier erst einmal kurz dargestellt werden. Am ausführlichsten wurden in diesem Rahmen Modifikationen der N-terminalen Fettsäure des CLPs Pseudomycin C beschrieben. Dabei zeigten Untersuchungen von Rodriguez et al. an Pseudomycin C -Derivaten, die sich unter anderem in der Stereochemie der Hydroxylgruppe in der Fettsäure unterschieden, dass die Stereochemie an dieser Stelle in der Fettsäure starken Einfluss auf die antifungale Aktivität der Derivate hatte [99]. Zur Synthese dieser Derivate spalteten diese die Fettsäure von aus Mikroorganismen isoliertem Pseudomycin A ab, so dass nur aus den Aminosäuren-gebildete Lactonring bestehen blieb. Aus diesem Ausgangsprodukt konnten mit synthetisch hergestellten 3-Hydroxyfettsäuren mit definierten Konfigurationen Pseudomycin C -Derivate unterschiedlicher Kettenlänge und Stereochemie synthetisiert werden. Anschließende biologische Aktivitätstests zeigten, dass die 3-Hydroxypalmitinsäure mit R-Konfiguration eine weitaus höhere Aktivität und ein breiteres Spektrum besitzt als z. B. das S-Isomer. Ein racemisches Gemisch der beiden Enantiomere zeigte jedoch ebenfalls eine höhere Aktivität gegenüber dem reinen S-Enantiomer. Zum anderen wurde die Fettsäure mit starren Substituenten versehen, was zu keiner Beeinträchtigung der antifungalen Aktivität in vitro führte [100, 101]. Weitere Tests von modifizierten CLP wurden hinsichtlich der Halogenatome in den Molekülen gemacht. Die Rolle der Halogenatome in den CLP-Strukturen ist noch nicht eindeutig geklärt. So wurde vermutet, dass diese die Hydrophobizität der CLP erhöhen und somit die Einlagerung der Peptide in biologische Membranen verbessern. Pseudomonas-Kulturen, die in Halogen-freiem Medium wachsen,

42 Ergebnisse und Diskussion 42 produzieren Deschloro-CLP, die eine verminderte antifungale Aktivität aufweisen [102]. Zur Charakterisierung dieses Derivates wurde allerdings nur MS-Analytik betrieben. In anderen Peptiden wie beispielsweise in dem linearen antimikrobiellen Peptid Styelin D konnte nachgewiesen werden, dass die Inkorporation von einem halogenierten Tryptophanderivat zu einer Steigerung der biologischen Aktivität und in Abhängigkeit vom Salzgehalt und dem ph-wert des Mediums führt [103]. Im Gegensatz zu Modifikationen am isolierten Naturstoff bieten chemische Synthesen den Vorteil eines größeren Spektrums an möglichen Strukturveränderungen. Hierbei können schon während der Synthese vielfältige Variationen in den entstehenden Naturstoff eingebracht werden. Bisher ist noch keine Totalsynthese eines CLP in der Literatur beschrieben worden. Allerdings wurden erste Strategien zur Synthese des Lipodepsinonapeptides Syringotoxin von Bayo et al. aufgezeigt [104]. Jedoch gelang es den Autoren in dieser Publikation nur, ein vereinfachtes Derivat des Toxins per Festphasensynthese herzustellen. Dieses Derivat wies eine verringerte Aktivität gegenüber Parasiten im Vergleich zum Naturstoff auf. In der von den Autoren der Studie entwickelten SPPS wurde dabei eine Fmoc-Strategie mit säurelabilen Schutzgruppen an den Seitenketten verfolgt. Dabei wurden in diesem Derivat die unnatürlichen Aminosäuren 4-Cl-Thr, und β- HyAsp durch die natürlichen Aminosäuren Threonin (Thr) und Asparaginsäure (Asp), D-Homoserin (D-Hse) und L-allo-Threonin durch D-Serin (D-Ser) und die Hydroxyfettsäure durch eine unsubstituierte Fettsäure ersetzt. Die Zyklisierung erfolgte über eine Amidkupplung in Lösung. Des Weiteren wurde für die biologischen Tests das Rohprodukt verwendet, welches auch nur mittels MS-Analysen charakterisiert wurde. Vorteilhaft beim Syringotoxin ist das vorhandene Glycin (Gly) in der Struktur. Dadurch lässt sich eine Peptidkupplung in Lösung mit Gly am C- Terminus ohne die Gefahr einer Epimerisierung durchführen, welche hingegen bei allen anderen Aminosäuren auftreten kann.

43 Ergebnisse und Diskussion 43 Syringomycin E weist folgende Strukturmerkmale auf (s. Abbildung 11): Das Grundgerüst ist ein Macrolacton Es besteht aus neun Aminosäuren Es beinhaltet eine Vielzahl nicht-kanonischer Aminosäuren, nämlich 4-Cl-Thr, β-hyasp, Z-Dhb, L- und D-Dab sowie D-Ser Am N-Terminus ist eine 3-Hydroxydodecansäure an das L-Ser über eine Amidbindung gekuppelt; die Stereochemie der Hydroxylgruppe ist S. Der Macrolactonring wird über das N-terminale L-Ser und das C-terminale 4-Cl-Thr gebildet Abbildung 11: Chemische Struktur von Syringomycin E Syringomycin E weist im Gegensatz zu Syringotoxin kein Glycin auf, sodass eine Zyklisierung via Amidbindung zu Epimeren führen könnte. Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit verschiedene Zyklisierungsmethoden getestet werden. Zum einen gibt es die Möglichkeit einer Macrolactonisierung. Hierbei könnte der Ester in Lösung über das N-terminale Ser und das 4-Cl-Thr am C-Terminus gebildet werden. Zum anderen kann eine Serin/Threonin Ligation in Betracht gezogen werden. Diese Art der Synthese hat den Vorteil, dass die Zyklisierung an einem ungeschützten Peptid stattfinden kann. Somit kann ausgeschlossen werden, dass der Zyklus durch spätere Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen in Mitleidenschaft gezogen wird. Neben der Schutzgruppenstrategie mit säurelabilen Schutzgruppen wurde auch die Verwendung von Bzl- und Cbz-Schutzgruppen in Betracht gezogen, welche z. B. durch Hydrogenolyse aus dem Naturstoff abgespalten werden könnten. In der Tat hatten Mitarbeiter der Lilly Research Laboratories Derivate der Pseudomycin-CLP hergestellt, in dem die freien Aminogruppen eines biotechnologisch-hergestellten Pseudomycin-Derivates erfolgreich mit Cbz-Schutzgruppen versehen wurden und

44 Ergebnisse und Diskussion 44 dann Veränderungen an der Struktur durchgeführt wurden, um in einem letzten Schritt diese anschließend wieder hydrogenolytisch zu entfernen [99-101]. In dieser Arbeit wurden drei Syntheserouten zur Darstellung zyklischer Syringomycin E-Derivate evaluiert: zum einen eine Zyklisierung über eine Macrolactonisierung (Synthesestrategie 1), eine Zyklisierung via einer Ser/Thr-Ligationsstrategie (Synthesestrategie 2) sowie eine Zyklisierung via Peptidkupplung in Lösung (Synthesestrategie 3). In der ersten Syntheseroute wurden desweiteren zwei mögliche Schutzgruppenstrategien untersucht. Außerdem wurden lineare Derivate synthetisiert, um auch diese in biologischen Inhibierungs-Tests an Hefen im Vergleich zum Naturstoff zu testen. Dabei gelang die Synthese von fünf Derivaten (s. Abbildung 12). Aufgrund der Empfindlichkeit von 4-Cl-Thr in der Synthese und der aufwendigen Herstellung dieser nicht kommerziell erhältlichen Aminosäure, wurde der Fokus lediglich auf die Synthese von Derivaten ohne 4-Cl-Thr gelegt.

45 Ergebnisse und Diskussion 45 Abbildung 12: Chemische Strukturen der Im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten Syringomycin E- Derivate 1 Synthesestrategie 1 In der ersten Syntheseroute sollte das Peptid via SPPS mit Fmoc-Strategie aufgebaut werden. Anschließend sollte das Molekül mittels Macrolactonisierung in Lösung zyklisiert werden. Es wurden hierbei außerdem zwei Schutzgruppenstrategien verfolgt. Zum einen wurden die Seitenketten mit säurelabilen Schutzgruppen versehen. Zum anderen wurde eine mögliche Verwendung von Bzl- und Cbz-Schutzgruppen untersucht.

46 Ergebnisse und Diskussion 46 Abbildung 13: Synthesestrategie 1 mit verschiedenen Schutzgruppen (SG) über eine Macrolactonisierung. Zum einen wird eine Strategie mit säurelabilen Schutzgruppen verwendet und zum anderen eine mit Bzl- und Cbz-Schutzgruppen. 1.1 Fmoc-SPPS mit säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen Zunächst wurde ein strukturell-reduziertes Molekül mit kommerziell erhältlichen Aminosäuren und Fettsäure hergestellt (s. Abbildung 14), um kritische Schlüsselreaktionen wie die Eliminierung am Harz und eine geeignete Zyklisierung zu optimieren. Das 4-Cl-Thr wurde durch L-Thr, β-hyasp durch L-Asp und die 3- Hydroxydodecansäure durch die unsubstituierte Dodecansäure ersetzt.

47 Ergebnisse und Diskussion 47 Abbildung 14: Chemische Struktur von SRE und von dem daraus abgeleiteten Derivat 1 mit vereinfachter Struktur. Die Aminosäuren 4-Cl-Thr und β-hyasp sowie die substituierte Fettsäure wurden durch kommerziell erhältliche Analoga (rot) ersetzt. Die Retrosynthese von Derivat 1 (Abbildung 15) beinhaltete eine Festphasenpeptidsynthese nach Fmoc-Strategie mit säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen und anschließender Macrolactonisierung. Bis auf die Hydroxylgruppe des L-Ser wurden die funktionellen Gruppen der Seitenketten mit säurelabilen Boc-, tbu- und Pbf-Schutzgruppen blockiert. Das Peptid wurde vom C-Terminus mit Fmoc-Thr zum N-Terminus mit der Fettsäure hin aufgebaut. Als polymerer Träger wurde ein 2-Chlorotritylchloridharz verwendet. Mit diesem Harz lässt sich das Peptid unter sehr milden Bedingungen mit einem Essigsäure/DCM/TFE-Gemisch als Carbonsäure abspalten. Dies hat den Vorteil, dass säurelabile Seitenkettenschutzgruppen unter diesen Bedingungen erhalten bleiben. Diese sind essentiell, um die anschließende Macrolactonisierung zwischen L-Ser und C-terminalem L-Thr selektiv durchführen zu können.

48 Ergebnisse und Diskussion 48 Abbildung 15: Retrosynthese der Darstellung des Modellderivates 1. Über eine SPPS nach Fmoc-Strategie mit säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen wird der lineare Precursor 28 aufgebaut. Die anschließende Macrolactonisierung und Schutzgruppenabspaltung führt zu Derivat 1. Zunächst mussten die Bausteine Fmoc-D- und Fmoc-L-Dab(Boc)-OH hergestellt werden. Die Synthese der Aminosäure Z-Dhb wurde durch Eliminierung von L-Thr am Harz durchgeführt. Dafür musste allerdings das N-terminal benachbarte L-Phe für diese Reaktion am N-Terminus mit einer Allyloxycabonyl-Schutzgruppe (Alloc) geschützt werden. Diese Reaktionen werden im Folgenden näher erläutert Synthese von Fmoc-L-Dab-OH (8) und Fmoc-D-Dab-OH (9) Die Synthese der beiden Bausteine Fmoc-L-Dab-OH (8) und Fmoc-D-Dab-OH (9) wurden nach Lau et al. synthetisiert [105]. Die Synthese erfolgte über die Umsetzung von Fmoc-D-Gln-OH bzw. Fmoc-LGln-OH mit [Bis(trifluoroacetoxy)iod]benzen (PIFA) und Pyridin nach einer Hofmann-

49 Ergebnisse und Diskussion 49 Umlagerung (Abbildung 16). In Gegenwart der Base läuft an primären Amiden die Umlagerung ab, bei der die Carbonylgruppe aus dem Molekül abgespalten wird. Hierbei entsteht ein Amin, das ein Kohlenstoff weniger in seiner Kette aufweist [106]. Abbildung 16: Synthese von Fmoc-L-Dab-OH (8). Durch den Einsatz von Pyridin entsteht ein Amidat-Ion, welches durch PIFA halogenisiert und anschließend erneut durch die Base in das N-Halogen-Amidat umgesetzt wird. Durch spontane Halogenid-Eliminierung bildet sich das kurzlebige Acylnitren als reaktive Zwischenstufe, welches durch eine 1,2-Verschiebung der Alkylgruppe in das stabilere Isocyanat überführt wird. Bei diesem Schritt wird die Alkylgruppe mit derselben Seite an das Stickstoffatom gebunden, wie sie zuvor am Kohlenstoffatom gebunden war. Als Lösemittel wird in der Reaktion ein DMF- Wasser-Gemisch (2:1) eingesetzt. Durch das wässrige Medium entsteht durch Anlagerung von Wasser an das elektrophile Isocyanat eine instabile Carbamidsäure, die sich schnell zu Kohlenstoffdioxid und dem entsprechenden Amin zersetzt [107]. Mit dieser Methode konnten in beiden Fällen moderate Ausbeuten erlangt werden. Die Ausbeute von Fmoc-D-Dab-OH betrug 56 %, die von Fmoc-L-Dab-OH 62 %. Die Stereochemie wurde anhand der Drehwertmessung festgestellt. Die Reinheit der beiden Produkte wurde anhand von LC/MS- und NMR-Analysen festgestellt. Durch intensives Waschen der sauren wässrigen Lösung nach der Reaktion mit Diethylether (Et 2 O) und anschließendem Fällen des Produkts bei einem ph-wert von 6 ließ sich ohne weitere Aufreinigungsschritte ein reines Produkt gewinnen. Allerdings könnte dieser Reinigungsschritt auch die nur moderate Ausbeute in diesem Reaktionsschritt erklären, da ein Teil des gewünschten Produkts in der organischen Phase verblieben sein könnte. Aufgrund der Einfachheit der Aufarbeitung wurden jedoch keine weiteren Versuche zur Optimierung der Ausbeute durchgeführt.

50 Ergebnisse und Diskussion Synthese von Fmoc-L-Dab(Boc)-OH (10) und Fmoc-D-Dab(Boc)-OH (11) Zur Schützung der Seitenketten-Aminogruppe wurde die Boc-Schutzgruppe gewählt. Diese Schutzgruppe lässt sich nach der Synthese mit geringen Mengen TFA abspalten und eignet sich daher sehr gut für eine Synthesestrategie der abgestuften Säurelabilität [108]. Abbildung 17: Synthese von Fmoc-L-Dab(Boc)-OH (10). Die Boc-Schutzgruppe wurde mit Natriumbicarbonat und dem Anhydrid Di-tert-butyldicarbonat (Boc 2 O) in das Molekül eingeführt. Die Ausbeuten lagen hier ebenfalls im moderaten Bereich mit einer Ausbeute von 42 % im Fall des Fmoc-D-Dab(Boc)-OH (11) und 46 % Fmoc-L-Dab(Boc)-OH (10) Synthese von Alloc-L-Phe-OH (6) Für die im nächsten Abschnitt erforderliche Eliminierung von L-Thr zu Z-Dhb ist die Verwendung von Alloc-L-Phe (6) anstelle von Fmoc-Phe als benachbarte Aminosäure notwendig. Die Alloc-Schutzgruppe wurde basenkatalysiert mit Allylchlorformiat eingeführt. Abbildung 18: Synthese von Alloc-L-Phenylalanin (6). Zunächst wurde Natriumcarbonat als Base eingesetzt. Diese Base führte jedoch zu einem verunreinigten Rohprodukt, so dass eine Säulenchromatographische Aufreinigung durchgeführt wurde. Mittels dieser Reaktionssequenz konnte das gewünschte Produkt dann in 60 % Ausbeute erhalten werden.

51 Ergebnisse und Diskussion 51 In einem zweiten Reaktionsansatz wurde Natriumhydroxid als Base verwendet. LC/MS- und NMR-Analysen zeigten, dass das Rohprodukt in diesem Fall so sauber war, dass es ohne weitere Aufreinigung für die Festphasensynthese verwendet werden konnte. Auch die Ausbeute konnte durch diese Maßnahme erhöht werden. Die Ausbeute betrug hier 82% Festphasensynthese und Eliminierung am Harz Zur Festphasensynthese des ersten Teilstücks 20 wurde das 2-Chlorotritylchlorid- Harz eingesetzt. Die Eliminierung wurde am Harz durchgeführt. Abbildung 19: SPPS und Eliminierung am Harz zu 20. Die Beladung des Harzes mit Fmoc-Thr(t-Bu)-OH erfolgte über die Aktivierung mit der Base DIPEA unter trockenen Bedingungen und Schutzgas. Anschließend wurde ein Capping-Schritt durchgeführt, um nicht-beladene Linkergruppen zu inaktivieren.

52 Ergebnisse und Diskussion 52 Die Beladung wurde mittels der Fmoc-Bestimmung berechnet. Es konnte eine Beladung von 0,67 mmol/g erreicht werden. Anschließend erfolgte die Fmoc-Abspaltungen mit 20 % Piperidin in DMF und die Kupplung der nächsten Aminosäuren unter Verwendung der Kupplungsreagenzien HBTU und HOBt sowie DIPEA als Base. Nach Kupplung der Aminosäure Alloc-Phe- OH wurde zur Kontrolle eine Testabspaltung durchgeführt. Es zeigte sich im LC/MS, dass die Umsetzung bis zu dieser Stelle vollständig verlaufen war. Die Eliminierung von L-Thr zu Z-Dhb am Harz erfolgte mit Cu(I)Cl als Katalysator und EDC als Base nach López-Macià et al. [109]. Die zugrunde-liegende Reaktion verläuft dabei vermutlich nach E1 oder E cb -Mechanismus unter Bildung des thermodynamisch-stabileren Isomers [110]. Eine Verwendung von Fmoc als Schutzgruppe der Nachbaraminosäure führt laut Bayo et al. nicht zum gewünschten Dehydropeptid [104]. Die Reaktion bildete keine Nebenprodukte, benötigte allerdings bei Raumtemperatur mindestens 4 Tage bis zur vollständigen Umsetzung. Desweiteren zeigte sich, dass ein aufwendiges und langes Waschen der schwer löslichen Reagenzien notwendig war, unter anderem da sehr hohe Mengen an Reagenzien eingesetzt wurden. So wurden in diesem Schritt 100 eq. EDC und 60 eq. Cu(I)Cl eingesetzt. Dennoch wurde diese Methode aufgrund der sicheren selektiven Umsetzung in den weiteren Synthesesequenzen beibehalten Abspaltung der Alloc-Schutzgruppe Die Alloc-Schutzgruppe gehört zu den Schutzgruppen, die Palladium-katalysiert abgespalten werden. Die Abspaltung erfolgt über einen Transfer der Allylgruppe auf diverse Scavenger wie beispielsweise Phenylsilan und Morpholin. Diese Scavenger sind nötig, um z. B. eine Allylanlagerung an das frei gewordene Amin zu verhindern [108]. Abbildung 20: Palladium-katalysierte Alloc-Abspaltung zu 21.

53 Ergebnisse und Diskussion 53 Die Alloc-Schutzgruppe ist kompatibel mit den Boc- und Fmoc- Festphasensynthesestrategien und eignet sich daher auch in diesem Fall zur Verwendung als Schutzgruppe der α-aminogruppe des Phenylalanins. Der Katalysator Tetrakis(triphenylphosphin) Palladium(0) (Pd(PPh 3 ) 4 ) wurde mit 0,25 eq. eingesetzt, als Scavenger wurden 24 eq. Morpholin verwendet. Die Synthese verlief unter Schutzgasatmosphäre. Nach einer halben Stunde Reaktionszeit wurde das Lösemittel abgesaugt und das Harz mit 0,02 M Natriumdiethyldithiocarbamat in N- Methyl-2-pyrrolidon (NMP) mindestens 3 Mal für 15 Minuten gewaschen. Dithiocarbamate sind Chelatoren und können so Palladium und andere Schwermetalle komplexieren und aus der Reaktion entfernen. Anschließend wurde das Harz mehrere Male mit DMF und DCM gewaschen und nach einer Testabspaltung mit 100% TFA im LC/MS auf die Vollständigkeit der Abspaltung getestet. Die LC/MS-Messungen zeigten gewöhnlich eine vollständige und saubere Abspaltung ohne weitere Nebenprodukte SPPS zum linearen Precursor am Harz (27) Nach der Alloc-Abspaltung konnte die Festphasensynthese weitergeführt werden. Die Standardbedingungen wurden beibehalten. Dabei wurde nach jeder Kupplung eine Testabspaltung durchgeführt und der Umsatz kontrolliert, da bei wachsender Kette die Wahrscheinlichkeit nicht-vollständiger Kupplungen steigt [57]. Um dadurch auftretende Nebenprodukte möglichst zu vermeiden, wurden die Kupplungen mittels LC/MS noch vor der Fmoc-Abspaltung kontrolliert und bei unvollständiger Kupplung wurde die Kupplung der entsprechenden Aminosäure wiederholt. So konnte zumindest einem möglichen parallel zur Hauptkette entstehenden Nebenpeptid entgegengewirkt werden. Als Seitenschutzketten wurden neben den Boc- Schutzgruppen der beiden zuvor synthetisierten Bausteine Fmoc-Dab(Boc)-OH (10, 11) die säurelabilen tbu-schutzgruppen im D-Serinbaustein eingesetzt. Zum Schutz der funktionellen Guanidino-Gruppe an der Seitenkette des Fmoc-Arginins wurde die TFA-labile 2,2,4,6,7-Pentamethyl-2,3-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl-(Pbf-)- Schutzgruppe verwendet. Das Fmoc-L-Ser als letzte Aminosäure wurde mit ungeschützter Seitenkette in das Peptid an fester Phase eingebaut. Für die nachfolgende Kupplung der Fettsäure stellte dies kein Problem dar. Testkupplungen mit geringen Mengen Harz zeigten dabei, dass die Fettsäure am besten mit 2 eq. und

54 Ergebnisse und Diskussion 54 entsprechend 2 eq. der Kupplungsreagenzien an das L-Ser gekuppelt werden konnte. Die Verwendung eines ungeschützten Serinbausteines ermöglicht dabei eine signifikante Vereinfachung der Schutzgruppentaktik, da die für die Macrolactonisierung (Abschnitt 1.1.8) notwendige freie Hydroxylgruppe direkt nach der Abspaltung vom Harz zur Verfügung steht. Abbildung 21: SPPS zum linearen Precursor am Harz (27). Nach einer Testabspaltung mit 100% TFA konnte mittels LC/MS das ungeschützte lineare Peptid analysiert werden.

55 Ergebnisse und Diskussion Abspaltung vom Harz zum linearen Precursor (28) Durch das 2-Chlorotritylchlorid-Harz war es möglich, das lineare Peptid unter sehr milden Bedingungen von der festen Phase zu trennen, ohne die Schutzgruppen der Seitenketten zu verlieren. Die Abspaltung erfolgte mit einer AcOH/DCM/TFE-Lösung im Verhältnis 1:8:1 über 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Die Abspaltlösung, die das Produkt enthält, wurde aus dem Reaktor entfernt und aufgefangen. Das restliche Harz wurde zwei Mal mit DCM gewaschen und das Lösemittel mit der Abspaltlösung vereint. Abbildung 22: Abspaltung des linearen Precursors (28) vom Harz mit AcOH/DCM/TFE (1:8:1) nach 1,5 h. Aufgrund der geschützten Seitenketten ist das Peptid extrem unpolar, sodass zur LC- MS-Analyse zuerst die Laufbedingungen optimiert werden mussten. Hierzu wurde ein Lauf mit einem steileren Gradienten über einen Zeitraum von 25 Minuten genutzt (s. Allgemeine Methode 2, Gradient 2). Erst dadurch konnte das vollständig geschützte Peptid (28) im Spektrum detektiert werden. Die Analyse zeigte, dass das gewünschte Peptid als Hauptprodukt erhalten werden konnte, jedoch konnten auch mittlere Mengen von nicht identifizierbaren Nebenprodukten detektiert werden. Da

56 Ergebnisse und Diskussion 56 eine Aufreinigung aufgrund des unpolaren Charakters des geschützten linearen Peptids mittels HPLC nicht möglich war, wurde das Rohprodukt zur Zyklisierung (Abschnitt 1.1.8) verwendet Methoden zur Macrolactonisierung Zyklisierung über Yamaguchi-Veresterung Eine Möglichkeit der intramolekularen Zyklisierung liefert die Yamaguchi- Veresterung. Die Reaktion erlaubt eine Veresterung unter milden Bedingungen. Sie verläuft unter Ausbildung eines gemischten Anhydrids [111]. Dazu wird das sogenannte Yamaguchi-Reagenz (2,4,6-Trichlorbenzoylchlorid) in Anwesenheit von Triethylamin (NEt 3 ) und DMAP eingesetzt. Diese Reaktion hat sich vor allem in der Naturstoffsynthese zur Synthese von Polyketid-Macrolactonen bewährt [112]. Abbildung 23: Allgemeines Schema der Yamaguchi-Veresterung. In dieser Reaktion deprotoniert Triethylamin die Carboxylgruppe, sodass nun das Carbonsäurechlorid des Yamaguchi-Reagenzes nucleophil angegriffen werden kann, wodurch ein gemischtes Anhydrid gebildet wird. Durch die intermediäre Anlagerung von DMAP an die Carbonylgruppe wird dann 2,4,6-Trichlorbenzoesäure abgespalten, und das DMAP-Konjugat kann nun von einer Hydroxylgruppe unter Ausbildung eines Lactons und Abspaltung von DMAP nucleophil angegriffen werden [113]. Die Reaktion erfolgte als One Pot -Reaktion bei Raumtemperatur und einer Konzentration des Eduktes von 0,5 mm in THF. Es wurden zunächst 1 eq. des Yamaguchi-Reagenzes, 2 eq. NEt 3 und 0,25 eq. DMAP eingesetzt. Da nach 2 Tagen noch kein Umsatz des Eduktes festgestellt werden konnte, wurde die Temperatur des Reaktionsgemisches auf 40 C erhöht und weitere 2 Tage gerührt.

57 Ergebnisse und Diskussion 57 Abbildung 24: Versuch der Veresterung des geschützten linearen Peptids 28 nach Yamaguchi. Auch unter den Bedingungen von 40 C, Verlängerung der Reaktionszeit und den doppelten Äquivalenten an Reagenzien wurde das Edukt nicht umgesetzt. Um auszuschließen, dass das voll-geschützte zyklisierte Peptid nur aufgrund seiner hohen Hydrophobizität im LC/MS nicht nachweisbar war, wurde das Rohprodukt mit verschiedenen Konzentrationen TFA in DCM (5 %, 10 % und 50 % TFA) versetzt. Hier zeigte sich, dass lediglich das lineare ungeschützte Peptid zu finden war, jedoch nicht das zyklisierte Produkt. Auch eine erneute Zugabe von Reagenzien auf insgesamt der doppelten Zahl an Äquivalenten brachte kein verbessertes Ergebnis. Da auch keine neuen Nebenprodukte in der Analyse zu finden waren, lässt sich daraus schließen, dass die Reaktion unter diesen Bedingungen nicht ablief und kein Umsatz des Eduktes vorlag.

58 Ergebnisse und Diskussion Zyklisierung über Steglich-Veresterung Dementsprechend wurde nach einer alternativen Veresterungsmethode gesucht. Eine weitere Möglichkeit der Macrolactonisierung ist die Veresterung nach Steglich (Abbildung 25). Die Steglich-Veresterung ist eine milde Reaktion, die die Umsetzung von sterisch gehinderten und säurelabilen Edukten ermöglicht. Abbildung 25: Schmema der Steglich-Veresterung. Bei der Steglich-Veresterung werden klassisch DCC und katalytische Mengen DMAP eingesetzt [114]. Die Reaktion verläuft über ein O-Acylisoharnstoff-Derivat. DMAP fungiert hier als Acyltransferreagenz. Die Reaktion zwischen der Carboxylgruppe und einem Alkohol benötigt, im Gegensatz zu einer Kupplung von einer Carboxylgruppe und einem Amin, DMAP zur Beschleunigung. Ohne DMAP kann der intermediär auftretende O-Acylisoharnstoffs zum N-Acylisoharnstoffs irreversibel umlagern. Durch Zugabe von DMAP entsteht ein DMAP-Konjugat als Zwischenprodukt, welches sterisch weniger gehindert ist und über eine polarisierte Acylgruppe verfügt, so dass eine schnelle Reaktion mit dem Alkohol möglich wird. Vorteil dieser Reaktion ist die Veresterung auch von sterisch anspruchsvollen Edukten. Daher ist sie auch für eine intramolekulare Veresterung einer Peptidkette mit diversen Seitenketten geeignet. Zunächst wurde versucht, die Zyklisierung mit DCC und DMAP durchzuführen, was jedoch nicht zum Erfolg führte. Die Reaktionskontrollen mittels LC/MS zeigten weder nach 2 h noch nach einer Reaktionsdauer über Nacht einen Umsatz zum gewünschten Produkt. Auch hier konnte lediglich das Edukt in Analysen gefunden werden. Die Zyklisierung zu Produkt 1 erfolgte erst mit dem Einsatz von jeweils 5 eq. EDC und DMAP bei Raumtemperatur bei einer Konzentration des linearen Rohproduktes 28 von 0,1 mm in trockenem DCM. Die Umsetzung wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mittels LC/MS kontrolliert. Diese Reaktionskontrollen zeigten dabei, dass bereits nach 1,5 Stunden zyklisiertes Produkt zu sehen war. Allerdings waren hier auch noch große Mengen des Eduktes in den Analysen vorhanden, weshalb die Reaktion noch nicht beendet wurde. Nach 2 Stunden war

59 Ergebnisse und Diskussion 59 das Edukt nicht mehr nachweisbar. Jedoch war die Ausbeute des gewünschten Produktes nicht gestiegen. Stattdessen wurden neue Produkte mit nicht identifizierbaren Massen festgestellt und der Peak des gewünschten Peptids verkleinerte sich deutlich. Nach nur 2,5 Stunden waren nur noch Nebenprodukte in der Analytik auszumachen. Dieses Phänomen ließ sich auch bei anderen Reaktionsbedingungen, z. B. einer veränderten Konzentration von 28 (0,5 mm bzw. 0,05 mm) oder dem Einsazt von jeweils 1 eq. der Reagenzien beobachten. Daher wurde als optimale Reaktionszeit eine Reaktionsdauer von 1,5 Stunden festgesetzt. Nach Beendigung der Zyklisierung wurde das Lösemittel dann bei Raumtemperatur evaporiert und der Rückstand mit einer Lösung aus TFA/H 2 O/TIS (95:2,5:2,5) zur Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen für 1 Stunde versetzt. Anschließend wurden die Lösung mit Toluol co-evaporiert und das Rohprodukt unter Hochvakuum getrocknet. In LC/MS-Analysen konnte die Masse (bzw. der m/z-wert) des ungeschützten zyklischen Peptids ([M+H + ]=1160 g/mol) bei einer Retentionszeit von 5,42 Minuten gefunden werden. Dabei handelte es sich jedoch um einen breiten Peak, welcher neben der gewünschten Masse noch eine Vielzahl an nichtidentifizierbaren Massen enthielt. Die Vielzahl der sehr dicht beieinander-liegenden Signale im LC/MS machte somit eine Aufreinigung und die Trennung der Massen mittels HPLC zu einer schwierigen Aufgabe und es musste dementsprechend ein sehr flacher Gradient zur Aufreinigung verwendet werden. Durch diese optimierten Aufreinigungsbedingungen konnte dann aber das gewünschte Produkt in einer Ausbeute von 6,3 % erhalten werden.

60 Ergebnisse und Diskussion 60 Abbildung 26: Zyklisierung des Precursorpeptides 28 zu 1 via der Steglich-Veresterung. Mittels 1 H-NMR-spektroskopischer Analyse konnte die Identität und Reinheit des zyklisierten Produktes nachgewiesen werden. Möglicherweise lässt sich die Ausbeute durch eine vorherige Aufreinigung des Rohproduktes über eine Kieselgelsäule verbessern, indem mögliche Reaktionen mit Nebenprodukten vermieden werden. Wahrscheinlich sind hier eine strenge Einhaltung der Reaktionszeit und Reaktionsbedingungen nötig, sodass schon kleinste Veränderungen an Konzentration, Menge der Reagenzien oder Zeit ausschlaggebend für eine selektivere Zyklisierung sein können. Schon kleinste Verunreinigungen oder Mengen an unerwünschten Nebenprodukten könnten sich negativ auf die Reaktion auswirken Vollständige Abspaltung vom Harz: Synthese des linearen Derivates 2 Zur Darstellung des linearen Produkts 2 wurde das Peptid komplett ohne Seitenkettenschutzgruppen von einem Teil des Harzes abgespalten. Dazu wurde das

61 Ergebnisse und Diskussion 61 Harz mit TFA/H 2 O/TIS (95:2,5:2,5) versetzt und 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurde das Peptid in eiskaltem Ether gefällt und getrocknet. Abbildung 27: Abspaltung des linearen Produkts 2 vom Harz. Mittels LC/MS konnte das gewünschte Produkt ([M+H + ] 1179 g/mol) bei einer Retentionszeit von 5,24 Minuten gefunden werden. Nach der Aufreinigung des Rohproduktes mittels HPLC konnte das gewünschte Produkt mit einer Ausbeute von 14 % erhalten werden.

62 Ergebnisse und Diskussion Synthese von Derivaten mit 3-Hydroxydodecansäure Die Synthese erfolgte analog zu der Synthese von Produkt 1 und 2. Im Gegensatz zur Synthese dieser Derivate wurde hier als N-terminale Fettsäure die im Syringomycin vorkommende 3-Hydroxy-substituierte Fettsäure 3- Hydroxydodecansäure gekuppelt. Abbildung 28: Retrosynthese für das Derivat 42 mit 3-Hydroxyl-substituiertem Fettsäurerest (rot). Hierzu musste zunächst eine geeignete Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe gefunden werden. Silylschutzgruppen sind etablierte Schutzgruppen zum intermediären Schutz von Alkoholen [108]. Ihre Säurebeständigkeit (neben ihrer Abspaltbarkeit durch Fluoride) hängt dabei von der Art der Silylschutzgruppe ab und nimmt in der folgenden Reihenfolge zu: TMS<TES<TBDMS<TIPS. Ein TBDMS-Ester ist dabei gegenüber Essigsäure, d.h. den gewählten Abspaltbedingungen bei der

63 Ergebnisse und Diskussion 63 SPPS, stabil [59]. Daher wurde diese Schutzgruppe zur Schützung der OH-Gruppe an der Fettsäure ausgewählt Synthese der geschützten 3-Hydroxydodecansäure (7) Die Hydroxylgruppe der 3-Hydroxydodecansäure wurde mit der TBDMS- Schutzgruppe versehen. Obwohl es sich bei dieser Hydroxylgruppe um einen sekundären Alkohol handelt, welcher normalerweise eine geringere Reaktivität als primäre Alkohole zeigen, wurde die Schützung zur Verhinderung von Nebenreaktionen während der späteren Zyklisierung eingeführt. Wie im Fall der Hydroxyl-Schützung der Aminosäure β-hyasp (Abschnitt 4.4.4) wurden hierzu TBDMS-Triflat und DIPEA eingesetzt. Nach zwei Tagen konnte das Produkt in moderaten Ausbeuten von 61 % erhalten werden. Abbildung 29: TBDMS-Schützung der 3-Hydroxydodecansäure (7). Mit verschiedenen Methoden konnte belegt werden, dass das SRE-Molekül eine R- Konfiguration der Fettsäure am C3-Kohlenstoffatom besitzt [7, 115]. In dieser Arbeit wurde jedoch aus Vereinfachungsgründen ein kommerziell erhältliches Racemat eingesetzt, da in dieser Studie zuerst einmal ein Syntheseweg aufgefunden werden sollte SPPS zum linearen Derivat 3 Nach der Synthese des Bausteins 7 wurde dieser gemäß Abschnitt an die Peptidkette 26 am Harz gekuppelt. Anschließend erfolgten die Abspaltung vom Harz und die Entschützung mit 95 %iger TFA. Das Produkt wurde mittels HPLC aufgereinigt und konnte sauber mit einer Ausbeute von 4 % erhalten werden.

64 Ergebnisse und Diskussion 64 Abbildung 30: Synthese von Derivat Versuch der Zyklisierung via Steglich zu 42 Ein Teil des linearen Produkts am Harz 40 wurde dazu verwendet, ein zyklisches Derivat zu synthetisieren. Da eine Veresterung nach Steglich prinzipiell wie bei Derivat 1 gezeigt zu Syringomycin-artigen Macrolactonen führen kann, wurde auf diese Methode zur Macrolactonisierung zurückgegriffen. Hierzu wurde das geschützte lineare Peptid 40 gemäß Abschnitt mit einer Mischung aus AcOH/DCM/TFE (1:8:1) vom Harz abgespalten. Dies führte zu 2 mg des

65 Ergebnisse und Diskussion 65 gewünschten Rohproduktes. LC/MS-Messungen des Rohproduktes zeigten dabei, dass neben dem gewünschten Produkt noch weitere nicht-zuordnenbare Nebenprodukte im Rohprodukt vorlagen. Analog zur Synthese von Derivat 1 wurde das Rohprodukt jedoch auf dieser Stufe nicht aufgereinigt, sondern direkt im Zyklisierungsschritt eingesetzt. Zur Zyklisierung wurden die gleichen Bedingungen wie in Abschnitt zur Synthese des Derivats 1 beschrieben. Zunächst wurde nur 1 mg des Rohprodukts eingesetzt. Abbildung 31: Abspaltung des linearen geschützten Peptids (41) vom Harz und Versuch der Zyklisierung nach Steglich.

66 Ergebnisse und Diskussion 66 Allerdings konnten in der LC/MS-Analytik der Reaktionskontrolle nach 1 Stunde und ebenso nach anschließender Aufarbeitung der Reaktion kein zyklisiertes Produkt und interessanterweise auch kein Edukt mehr nachgewiesen werden. Stattdessen wurden eine Vielzahl dicht beieinanderliegender Peaks undefinierbarer Massen sichtbar. Auch eine Wiederholung des Versuchs mit einer Reaktionskontrolle nach bereits 30 Minuten führte zum selben negativen Ergebnis. Ein Grund für das Scheitern der Zyklisierung könnte an der geringen Ausbeute des Rohprodukts und der Vielzahl an aufgetretenen Nebenprodukten sein, die somit Einfluss auf die Selektivität der Reaktion genommen haben könnten. Diese Nebenprodukte könnten als Reaktionspartner agieren, Veresterungen mit dem Edukt eingehen und somit die intramolekulare Zyklisierung zum gewünschten Produkt blockieren. 1.3 SPPS mit Bzl- und Cbz-Schutzgruppen an den Seitenketten Die Anwendbarkeit einer alternativen Schutzgruppenstrategie, welche auf der Verwendung von Benzyl- bzw. Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppen basiert, wurde als nächstes getestet. Diese Schutzgruppen lassen sich reduktiv mittels katalytischer Hydrierung unter neutralen Bedingungen abspalten [59]. Der Vorteil hinsichtlich der Synthese des vollständigen Naturstoffs SRE wären somit die milden Bedingungen der Abspaltung, insbesondere in Bezug auf das eventuelle Vorhandensein der empfindlichen 4-Cl-Thr-Aminosäure. Andererseits beinhaltet die Struktur eine Doppelbindung in der Aminosäure Z-Dhb. Durch die katalytische Hydrierung besteht jedoch die Gefahr, auch diese Doppelbindung zu hydrieren. Versuche an dem Phytotoxin Pseudomycin unter anderem von Jamison et al., in denen die freien Aminogruppen der Seitenketten des Moleküls Cbz-geschützt wurden, konnten jedoch zeigen, dass bei einer 40 minütigen Palladium-katalysierten Hydrogenolyse keine Hydrierung der Doppelbindung stattfand [100]. In diesen Versuchen wurden jedoch keine Bzl-Schutzgruppen verwendet, die möglicherweise aufgrund ihrer geringen Reaktivität nicht in dieser Reaktionszeit abgespalten werden können. Daher wurden Hydrierungen mit unterschiedlichen Bedingungen an einer Aminosäuresequenz getestet, die sowohl Bzl- und Cbz-Schutzgruppen als auch eine

67 Ergebnisse und Diskussion 67 Z-Dhb-Aminosäure enthielt. Hierzu wurden die ersten fünf C-terminalen Aminosäuren von Syringomycin verwendet. Abbildung 32: Synthese der Testsequenz 44 mittels SPPS unter Verwendung von Bzl- und Cbz-Schutzgruppen. Die Schutzgruppen sollten anschließend durch Hydrierung abgespalten werden. Die Synthese des Testpeptides 44 erfolgte mittels Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung der Fmoc-Strategie an einem 2-Chlorotritylchlorid-Harz und einer Eliminierung am Harz. Der m/z-wert der Sequenz betrug 1196,55 g/mol. Die Synthese und die Eliminierung wurden nach den in Abschnitt 1 etablierten Reaktionsbedingungen durchgeführt. Die Bedingungen der Hydrierungen variierten zwischen der Reaktionszeit, dem Lösemittelgemisch und dem Zusatz von Ameisensäure (FA) oder Essigsäure (AcOH). Hydriert wurde mit Palladium auf Aktivkohle und Wasserstoff. Die Reaktionen wurden anhand der molaren Massen mittels LC/MS kontrolliert und die Differenz der gefundenen Massen zu der Masse des Peptids nach vollständiger

68 Ergebnisse und Diskussion 68 Entschützung in Tabelle 1 dargestellt. Der m/z-wert der ungeschützten Sequenz unter Beibehaltung der Doppelbindung sollte 748,39 g/mol betragen. Tabelle 1: Differenz der Massen der gefundenen Produkte zum vollständig entschützten Peptid mit Doppelbindung unter verschiedenen Reaktionsbedingungen. Blau: Die Differenz entspricht genau einer Bzl-Schutzgruppe; gelb: die Differenz entspricht der Masse zusätzlich einer Bzl-Schutzgruppe und zweier Protonen. Bei diesen Tests zeigte sich, dass bei Verwendung eines MeOH/H 2 O-Gemisches oder eines THF/H 2 O-Gemisches ohne Säurezusatz kaum ein Umsatz des Eduktes auftrat. Bei den anderen Bedingungen mit Ameisensäure konnte nach einiger Zeit eine Abspaltung ausgemacht werden. Jedoch entsprachen die gemessenen Massen von 839,4 g/mol der Masse des Eduktes zusätzlich einer Benzylschutzgruppe (M+H ). Auch bei den Reaktionen über Nacht wurde keine Veränderung der Massen festgestellt. Abbildung 33: Die Hydrierung der Testsequenz 44 mit Pd auf Aktivkohle und Wasserstoff lieferte nicht das gewünschte Produkt 45 mit komplett abgespaltenen Schutzgruppen und Erhaltung der Doppelbindung.

69 Ergebnisse und Diskussion 69 Nach der Zugabe von Essigsäure konnte im Fall des THF/H 2 O/AcOH-Gemisches schon nach 30 Minuten, bei dem MeOH/H 2 O/AcOH-Gemisch nach 45 Minuten diese Masse festgestellt werden. Schon nach 1,5 Stunden wurde bei THF/H 2 O/AcOH eine neue Masse von 841,5 g/mol gemessen. Diese entsprach der Masse des Eduktes zuzüglich einer Benzylschutzgruppe und zwei weiterer Protonen. Diese Masse konnte ebenso für MeOH/H 2 O/AcOH nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden ausgemacht werden. Vermutlich handelt es sich bei der verbleibenden Benzylschutzgruppe um die des Benzylethers am C-terminalen Thr, da Benzylether in der Regel stabiler als Benzylester sind. Es ist davon auszugehen, dass die Doppelbindung des Z-Dhb noch vor der Abspaltung des Benzylethers auftritt, wodurch die Masse +2 in den Spektren erklärt werden kann. Abbildung 34: Chemische Formeln der Produkte nach der Hydrierung der Testsequenz 44. Peptid a weist noch eine Doppelbindung auf, während bei Produkt b die Doppelbindung noch vor der Abspaltung der Bzl-Schutzgruppe hydriert wurde. In beiden Fällen hat jedoch keine vollständige Abspaltung der Schutzgruppen stattgefunden. Dies könnte unter anderem an der verwendeten Reaktionsapparatur liegen, in welcher der Wasserstoff über handelsübliche Ballons durch ein Septum der Reaktion zugeführt wurde. Durch diesen einfachen Ansatz ist jedoch bereits nach kurzer Zeit der gesamte Wasserstoff verbraucht (d.h. er ist durch Undichtigkeiten in der Versuchsapparatur ausgetreten), so dass bereits nach einiger Zeit nicht mehr genügend Wasserstoff für die Hydrierung zur Verfügung steht. Dennoch lässt sich sagen, dass diese Strategie aufgrund der Hydrierung der Doppelbindung nur bedingt für eine Synthese von SRE und seinen Derivaten geeignet ist. Der Einsatz von Cbz- Schutzgruppen und vermutlich auch der von Benzylestern scheinen hingegen keine Probleme hinsichtlich der Hydrierung der Doppelbindung zu machen. Diese ließen

70 Ergebnisse und Diskussion 70 sich schon nach kurzer Zeit von den Seitenketten unter Erhalt der Doppelbindung abspalten. Ob es sich letztendlich wirklich um den Benzylether und nicht um den -ester handelt, ließ sich mit der LC/MS-Methode nicht klären. Allerdings wird diese Theorie in Abschnitt 1.4 durch die erfolgreiche Verwendung von Fmoc-β-HyAsp(OBzl, TBDMS)- OH und der anschließenden Hydrierung zum linearen Produkt 4 unterstützt. 1.4 Synthese von Derivaten mit β-hyasp und 3-Hydroxydodecansäure Nachdem eine mögliche Synthesestrategie in 1.1 über eine Fmoc-Strategie und mit säurelabilen Schutzgruppen entwickelt wurde, sollte nun diese Strategie für die Synthese eines linearen und zyklischen Derivates angewendet werden, die anstelle der Aminosäure L-Asp ein L-threo-β-HyAsp-Aminosäure und anstatt der unsubstituierten Dodecansäure eine 3-Hydroxydodecansäure aufwies. Außerdem wurde eine mögliche Eignung von Bzl-Schutzgruppen in der Form eines Benzylesters in dieser Synthese getestet, d.h. eine Carboxylgruppe der L-threo-β-HyAsp- Aminosäure wurde als Benzylester geschützt.

71 Ergebnisse und Diskussion 71 Abbildung 35: Retrosynthese des Derivates 59 per SPPS und anschließender intramolekularer Steglich-Veresterung. Die Struktur weist im Gegensatz zum reduzierten Derivat 1 ein L-threo-β-HyAsp und eine 3-Hydroxydodecansäure (rot) auf. Die säurelabilen Schutzgruppen sollten mit TFA abgespalten werden. Die Entschützung der Bzl-geschützten Carboxylgruppe des β-hyasp sollte durch eine Palladium-katalysierte Hydrierung stattfinden. Anschließend sollte das lineare geschützte Produkt über eine Steglich-Veresterung zyklisiert werden. Zunächst mussten die Bausteine mit Schutzgruppen versehen werden. In der Synthese des Syringotoxinanaloges von Bayó et al. wurde aufgrund fehlender Optionen für geeignete Schutzgruppen der funktionellen Seitengruppen unter anderem auf diese Aminosäure und die substituierte Fettsäure verzichtet [104]. Jedoch gibt es mögliche Schutzgruppen, die eingesetzt werden können und orthogonal sowie durch abgestufte Säurelabilität entfernt werden können. Zum einen dient die Benzylschutzgruppe als mögliche Schutzgruppe, um die Carboxylgruppe des L-threo-β-HyAsp zu blockieren. Versuche an Pseudomycin A zeigten, dass eine Abspaltung einer Cbz-Schutzgruppe von einem Amin durch katalytische Hydrierung ohne unerwünschte Reduktion der Doppelbindung möglich ist [100]. Im Folgenden werden die Synthesen der geschützten Bausteine vorgestellt.

72 Ergebnisse und Diskussion Synthese der geschützten L-threo-β-Hydroxyasparaginsäure Die Synthese des Bausteins L-threo-β-HyAsp erfolgte gemäß der Vorschriften von Bionda et al. [116]. Für die Fmoc-Synthesestrategie ist eine orthogonale Schützung der funktionellen Seitengruppen erforderlich. Hierzu wurde eine Schützung der Seitenketten-Carboxylgruppe als Benzylester und eine Schützung der Hydroxylgruppe durch eine TBDMS-Schutzgruppe angestrebt. Die Abspaltung der Benzylschutzgruppe sollte im Idealfall nach kurzer Abspaltdauer keine Hydrierung der Doppelbindung des benachbarten Aminosäure Z-Dhb hervorrufen. Die TBDMS- Schutzgruppe lässt sich sauer mit TFA abspalten und sollte bei der Abspaltung unter Standardbedingungen vom Harz mit Essigsäure stabil bleiben. Sie eignet sich daher gut zum Blockieren der Hydroxylgruppe. Abbildung 36: Chemische Struktur des Synthesebauteins Fmoc-L-threo-HyAsp mit Bzl- und TBDMS-geschützten Seitenketten Enantiomerentrennung Zunächst muss das kommerziell erhältliche Enantiomerengemisch (TCI Europe) aus D- und L- threo-hyasp getrennt werden. Die Trennung wurde durch eine Co- Kristallisation mit L-Lysin und einer anschließenden Ionenaustauschchromatographie nach Okai et al. erreicht [117]. Hierbei wurde das Enantiomerengemisch in Wasser zusammen mit äquivalenten Mengen L-Lysin gelöst. Durch Zugabe von MeOH fiel dann ein Komplex aus L-threo-HyAsp mit Lysin aus, während das D-threo-HyAsp in Lösung verblieb. Durch einfaches Abfiltrieren konnten die beiden Enantiomere nun voneinander getrennt werden. Das gewünschte L-HyAsp wurde nun mittels Ionenautauschchromatographie gereinigt. Zunächst wurde das L-Lysin mit 0,5 M AcOH und anschließend das L-HyAsp mit 2 M AcOH von der Säule eluiert.

73 Ergebnisse und Diskussion 73 Abbildung 37: Schema der Reaktionsabfolge zur Enantiomerentrennung von L-threo- HyAsp. Die optische Reinheit wurde mittels Drehwertmessung am Polarimeter ermittelt. Die Drehwerte wurden in 5 N HCl mit einer Konzentration von 1 gemessen. Die gemessenen Werte stimmten mit den Literaturwerten überein [116, 117] Einführung der Benzylschutzgruppe Anschließend wurde die Carboxylgruppe der Seitenkette als Benzylester geschützt. Hierzu wurde die Aminosäure L-HyAsp in Benzylalkohol gelöst, mit konzentrierter HCl versetzt und anders als in der Vorschrift von Bionda et al. vorgegeben nur 3,5 Stunden bei 70 C gerührt, da bei der publizierten Reaktionszeit von 4,5 Stunden eine unerwünschte Benzylierung der C-terminalen Carboxylgruppe auftrat [116]. Durch die Verkürzung der Reaktionszeit um eine Stunde konnte dieses Problem umgangen werden.

74 Ergebnisse und Diskussion 74 Abbildung 38: Synthese (2S,3S)-2-amino-4-(benzyloxy)-3-hydroxy-4-oxobutansäure (Lthreo-β-HyAsp(OBzl)-OH) (13). Nach Fällung des Produktes und anschließender Umkristallisation in heißem Wasser konnte ein sauberes Produkt 13 mit einer Ausbeute von 88 % erhalten werden, das ohne weitere Aufreinigung weiter umgesetzt werden konnte Einführung der TBDMS-Schutzgruppe Die nachfolgende Schützung der Hydroxylgruppe erfolgte mit TBDMS-Triflat. Abbildung 39: Synthese von (2S,3S)-2-amino-4-(benzyloxy)-3-(tert-butyldimethylsilyloxy)-4- oxobutansäure (L-threo-β-HyAsp(OBzl, TBDMS)-OH) (14). Da die Vorschrift von Bionda et al. [116] mit der Verwendung von TBDMS-Chlorid (TBDMS-Cl) und 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) als Base nicht zu den gewünschten Ausbeuten führte, wurde auf eine alternative Synthese zurückgegriffen. Da die Hydroxylgruppe sich an einem sekundären C-Atom des Moleküls befindet, wurde TBDMS-Triflat als Reagenz genutzt. Als Base wurde DIPEA verwendet. Nach dreitägiger Reaktionszeit konnte somit eine Ausbeute von 70 % erreicht werden Einführung der Fmoc-Schutzgruppe Die Fmoc-Schützung der α-aminogruppe erfolgte wieder nach Vorschrift von Bionda et al. [116].

75 Ergebnisse und Diskussion 75 Abbildung 40: Synthese (2S,3S)-2-Fmoc-amino-4-(benzyloxy)-3-(tert-butyldimethylsilyloxy)- 4-oxobutansäure (Fmoc-L-threo-β-HyAsp(OBzl, TBDMS)-OH) (15). Verwendet wurden Fmoc-OSu und NaHCO 3 als Base in einem Aceton/Wasser- Gemisch. Hierbei kam es jedoch zu Problemen hinsichtlich der Stabilität der Silyl- Schutzgruppe. In der Tat kann bei einem ph-wert von 12 im wässrigem Medium eine unerwünschte Abspaltung der Silyl-Schutzgruppe auftreten [59]. Schon bei Reaktionskontrollen nach 2 Stunden konnte eine Abspaltung der TBDMS- Schutzgruppe im LC/MS ausgemacht werden, obwohl das Edukt noch nicht vollständig umgesetzt war. Nach einer säulenchromatographischen Aufreinigung über Kieselgel mit einem Lösemittel-Gemisch aus EA/CH (1:1) und 0,1 % Ameisensäure konnte das gewünschte Produkt 15 sauber erhalten werden. Allerdings lag hier die Ausbeute aus oben genannten Gründen bei nur 39 %. Das Nebenprodukt mit abgespaltener TBDMS-Schutzgruppe wurde daraufhin erneut wie in umgesetzt und wieder über eine Kieselgel-Säule aufgereinigt. Dadurch ließ sich die Gesamtausbeute des Produktes 15 auf insgesamt 64 % im Verhältnis zum ursprünglich eingesetzten Edukt erhöhen. Das Produkt wurde mit LC/MS- und NMR-Spektroskopie analysiert Synthese des linearen geschützten Peptids 57 Die Synthese des linearen geschützten Peptids 57 erfolgte über eine SPPS mit Fmoc-Strategie. Eingesetzt wurden das in Abschnitt beschriebene Allocgeschützte L-Phe-Aminosäure und die beiden Boc-geschützten Dab-Isomere (s. 1.1). Die Eliminierung fand ebenfalls wie in Abschnitt unter gleichen Bedingungen am Harz statt. Nach erfolgreicher Alloc-Abspaltung (s. Abschnitt 1.1.5) wurde die SPPS wie gewohnt und wie zuvor beschrieben fortgesetzt. Nach der Abspaltung vom Harz mit AcOH/DCM/TFE wurde ein Rohprodukt erhalten, das mittels LC/MS

76 Ergebnisse und Diskussion 76 analysiert wurde. Das gewünschte Produkt konnte nach einer Testabspaltung mit TFA im Spektrum bei einer Retentionszeit von 5,89 Minuten und einem m/z-wert von [M+H + ] 1299,69 aufgefunden werden. Das LC/MS-Spektrum des abgespaltenen Produkts, dessen Seitenketten voll geschützt sein sollten, zeigte jedoch eine Masse, die darauf hindeutete, dass die beiden TBDMS-Schutzgruppen teilweise mitabgespalten wurden, da das Hauptprodukt einem m/z-wert entsprach, welcher einem Peptid mit freien Hydroxylgruppen zugeordnet werden konnte: [M+Na + ] = 1886,91 bei einer Retentionszeit von 13,32 Minuten. Desweiteren zeigte sich in der LC/MS-Analyse, dass im Laufe der Synthese eine Vielzahl undefinierter Nebenprodukten gebildet wurde. Abbildung 41: SPPS und Abspaltung des linearen geschützten Peptids 57 vom Harz mit AcOH/DCM/TFE. Die beiden TBDMS-Schutzgruppen wurden ebenfalls abgespalten.

77 Ergebnisse und Diskussion Versuch der Zyklisierung Wie bei Derivat 1 sollte nun auch versucht werden, das geschützte Peptid 57 über eine Steglich-Veresterung zu zyklisieren. Zwar zeigte die LC/MS-Messung des Rohproduktes, dass beim Hauptprodukt die beiden TBDMS-Schutzgruppen ebenfalls mitabgespalten wurden. Diese schützten jedoch zwei sekundäre Hydroxylgruppen, welche im Vergleich zur primären Hydroxylgruppe weniger reaktiv sind, so dass eine Zyklisierung trotzdem erfolgreich sein könnte. Zur Zyklisierung wurden daher die gleichen Bedingungen wie bei der Macrolactonisierung von Derivat 1 (Abschnitt ) gewählt. Aufgrund des etwas höheren Verunreinigungsgrades des Rohproduktes wurde jedoch eine höhere Verdünnung des Reaktionsgemisches von 0,05 mm gewählt. Abbildung 42: Versuch der Steglich-Veresterung des linearen Peptids 57. Es wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben entnommen und Reaktionskontrollen durchgeführt. Auch nach 2 Tagen bei RT konnte kein Umsatz zum gewünschten Produkt festgestellt werden. So konnte das Produkt weder vor

78 Ergebnisse und Diskussion 78 noch nach TFA-Entschützung bei LC/MS-Analysen detektiert werden. Zu beachten ist hier, dass das β-hyasp eine Bzl-Schutzgruppe trägt, die auch unter TFA- Bedingungen stabil ist. Dennoch wurde auch nach einer möglichen Masse ohne Bzl- Schutzgruppe gesucht, was allerdings ebenso wenig zum Erfolg führte. Auch das Edukt war nicht mehr zu sehen. Vermutlich wurde es zu undefinierten Nebenprodukten umgesetzt oder polymerisiert Synthese der linearen Derivate 4 und 5 Die Seitenketten des Peptids lassen sich bis auf die Bzl-Schutzgruppe der β-hyasp- Aminosäure sauer mit TFA abspalten. Nach zweistündiger Inkubation in der Abspaltlösung und anschließendem Fällen des Peptids in kaltem Et 2 O konnte das Rohprodukt, welches noch die Bzl-Schutzgruppe trug, erhalten werden. Die Benzylschutzgruppe konnte anschließend mittels Palladium-katalysierter Hydrierung nach einer Stunde in einem Gemisch aus MeOH und 10% Essigsäure abgespalten werden. Allerdings kam es unter diesen Reaktionsbedingungen auch bereits zu einer Hydrierung der Doppelbindung der Z-Dhb-Aminosäure.

79 Ergebnisse und Diskussion 79 Abbildung 43: Schutzgruppenabspaltung von Peptid 57. Die säurelabilen Schutzgruppen wurden mit einem 95 %igen TFA-Gemisch abgespalten. Nach Coevaporation mit Toluol und anschließender Trocknung unter Hochvakuum wurde die Bzl-Schutzgruppe hydrogenolytisch abgespalten. Dabei sind zwei Produkte 4 und das Hautprodukt 5 entstanden. Beide Produkte ließen sich aber gut mittels HPLC aufreinigen. Die Produkte wurden mittels LC/MS und NMR charakterisiert. Die Ausbeute von Produkt 4 betrug 1,3 % und war somit geringer als die von Produkt 5 mit einer Ausbeute 2,2 %. Dies lag wahrscheinlich daran, dass hier eine etwas zu lange Reaktionszeit gewählt worden war. Mit einer kürzeren Reaktionszeit ließe sich wahrscheinlich eine bessere Ausbeute von Produkt 4 erreichen bzw. die Entstehung von Produkt 5 komplett

80 Ergebnisse und Diskussion 80 verhindern. Da jedoch beide Produkte in ausreichenden Mengen erhalten worden waren, wurde keine weitere Optimierung der Synthese an dieser Stelle versucht. 2 Synthesestrategie 2: Ser/Thr-Ligation Obwohl eine Zyklisierung via Steglich-Veresterung zumindestens für das Produkt 1 erfolgreich etabliert werden konnte, wurde eine weitere Synthesestrategie, die Thr- Ligation, in Betracht gezogen. Die Ser/Thr-Ligation hat den Vorteil, dass ungeschützte Peptidfragmente eingesetzt werden können, was die Löslichkeit und die Aufreinigung der Vorläuferpeptide stark vereinfachen sollte. Das sollte wiederum zu einer verbesserten Ausbeute führen. Desweiteren könnte die Schutzgruppenstrategie durch eine solche Reaktionsführung eventuell vereinfacht werden. Eine Ser/Thr-Ligationsstrategie wurde beispielsweise in der Synthese des Naturstoffes Daptomycin eingesetzt [77]. Hier konnte das lineare Peptid mittels Ser- Ligation zyklisiert werden. Zur Durchführung einer Zyklisierung mittels einer Ser/Thr-Ligation stehen in Syringomycin prinzipiell mehrere potentielle Zyklisierungsstellen zur Verfügung. Zunächst wurde eine Ser-Ligation in Betracht gezogen. Hierzu eignete sich die Synthese eines linearen Peptids mit der Aminosäure L-Ser am C-Terminus. Am N- Terminus wäre dann eine D-Ser-Aminosäure. Dazu wurde ein 2-Chlorotritylchlorid- Harz mit Fmoc-L-Ser-OH beladen. Mittels Fmoc-Bestimmung konnte dabei eine Beladungsausbeute von 30 % ermittelt werden. Die Kupplung der Dodecansäure auf diesen Baustein war jedoch nicht erfolgreich, vermutlich aufgrund der freien Hydroxylgruppe am Serin, welche zu einer zusätzlichen Veresterung an dieser Gruppe führen kann. Um dieses Problem zu umgehen, hätte daher eine neue Schutzgruppenstrategie ausgearbeitet werden müssen. Um diesen Aufwand zu umgehen, wurde daher eine alternative Ligation, nämlich eine Thr-Ligation (Abbildung 44) als nächster Syntheseweg evaluiert. Wie nach Beginn dieser Synthesestudien von Wong et al. berichtet wurde, liefert eine Ser/Thr-Ligation auf ein C-terminale geladene Aminosäure wie z. B. Asp, Arg, Glu und Lys oder bei Pro häufig nur schlechte Ausbeuten und benötigt lange Reaktionszeiten [97]. Nichtsdestotrotz sollte auch dieser Syntheseweg im Rahmen der Synthesestudien ausgetestet werden.

81 Ergebnisse und Diskussion 81 Abbildung 44: Übersicht über die Synthesestrategie 2, der Thr-Ligation. Ausgehend von Fmoc-L-Asp(t-Bu) am C-Terminus soll ein linearer geschützter Precursor 74 mittels SPPS synthestisiert werden. In Lösung soll das Peptid anschließend mit Salicylaldehyd- Dimethylacetal verestert und entschützt werden. Der SAL-Ester 74 soll dann in einem Pyridin-Acetat-Puffer zum gewünschten Zyklus 77 liegieren.

82 Ergebnisse und Diskussion Synthese von Salicylaldehyd-Dimethylacetal (61) Zur Darstellung des Ligationsreagenzes wurde Salicylaldehyd zuerst als Dimethylacetal geschützt. Die Synthese nach Hamada et al. verwendet hierzu Salicylaldehyd als Edukt und Lithiumtetrafluoroborat (LiBF 4 ) und Trimethylorthoformiat (TMOF)als Reagenzien [118]. Abbildung 45: Synthese von Salicylaldehyd-Dimethylacetal (61) Die Synthese mit LiBF 4 als Katalysator hat sich aufgrund der einfachen Handhabung, der schnellen Umsetzung und der guten Ausbeuten bewährt. Die Reaktion fand in trockenem MeOH unter Rückfluss statt und konnte nach nur 30 Minuten durch Zugabe von NaHCO 3 beendet werden. Nach der Aufreinigung durch Extrahieren mit EA wurde das Produkt 61 sauber mit einer Ausbeute von 85 % erhalten. 2.2 SPPS des geschützten linearen Peptids 74 Die Synthese des linearen Precursors 74 erfolgte über eine SPPS wie in Abschnitt 1.1 beschrieben. Die erste Aminosäure, die auf das Harz gekuppelt wurde, war somit Fmoc-L-Asp(tBu)-OH. Anschließend erfolgten die Kupplungen mit Fmoc-Thr-OH und Alloc-Phe-OH sowie die Eliminierung am Harz. Die Alloc-Abspaltung und die folgenden Kupplungen der Aminosäuren erfolgten ebenfalls nach den bereits beschriebenen allgemeinen Methoden.

83 Ergebnisse und Diskussion 83 Abbildung 46: SPPS des Peptids 71 am Harz. Anschließend wurde eine Veresterung nach Steglich am Harz durchgeführt. Hierzu wurde jedoch anstelle von DCC Diisopropylcarbodiimid (DIC) eingesetzt. DCC bildet im Gegensatz zu DIC ein schwerlösliches Salz, das sich schlecht aus der Reaktion an der festen Phase herauswaschen lässt. Die Veresterung wurde mit einem Bocgeschützten Boc-Thr(tBu)-Baustein durchgeführt. Die Ligationsreaktionssequenz sieht vor, dass die Boc-Schutzgruppe nach der Abspaltung vom Harz erhalten bleiben soll, um die Aminogruppe während der Kupplung des Salicylaldehyd- Dimethylacetals zu blockieren und Nebenreaktionen zu vermeiden. Der Umsatz der Reaktion wurde mittels Testabspaltung im LC/MS ermittelt. Nach erfolgreicher Veresterung wurde Fmoc vom N-terminalen Ser abgespalten und die unsubstituierte Dodecansäure auf den N-Terminus gekuppelt.

84 Ergebnisse und Diskussion 84 Abbildung 47: Synthese des geschützten linearen Peptids 74. Anschließend wurde das lineare Peptid vom Harz unter Beibehaltung der Schutzgruppen unter Standardbedingung abgespalten. Es konnte 12 mg des Rohproduktes erhalten werden. 2.3 Synthese des ungeschützten linearen Peptid-Salicylaldehydesters Nachdem das Peptid vom Harz abgespalten wurde, wurde die freie Carboxylgruppe mit dem Salicylaldehyd verestert. Hierzu wurden nach Lam et al. PyBOP und DIPEA eingesetzt [77]. Nach 2 Stunden wurde eine Testabspaltung mit TFA durchgeführt und der Umsatz mittels LC/MS kontrolliert. Nach erfolgreicher Veresterung wurden die Schutzgruppen mit einer Lösung aus 95 %iger aq. TFA abgespalten.

85 Ergebnisse und Diskussion 85 Abbildung 48: Synthese des Peptid-Salicylaldehydesters 76. Das nach der Abspaltung erhaltene Rohprodukt 76 konnte mittels HPLC mit einer Ausbeute von 38 % aufgereinigt und isoliert werden. 2.4 Ligation Mit dem aufgereinigten Peptid-Salicylaldehydester sollte nun versucht werden, das lineare Edukt via Thr-Ligation zu zyklisieren. Dazu wurde eine 5 mm Lösung des Peptides in einem Pyridin-Acetat-Puffer (mol/mol, 1:1) hergestellt. Unter diesen Reaktionsbedingungen sollte zunächst ein zyklisches N,O-Benzylidenacetal- Intermediat 77 entstehen (Abb. 49).

86 Ergebnisse und Diskussion 86 Abbildung 49: Chemische Struktur des N,O-Benzylidenintermediates der Ser/Thr-Ligation. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt, anschließend wurde das Gemisch lyophilisiert und mittels LC/MS analysiert. Jedoch konnte das gewünschte Intermediat nicht aufgefunden werden. Auch das Edukt konnte in dem Chromatogramm nicht mehr detektiert werden. Eine mögliche spontane Umlagerung zum zyklisierten Endprodukt (unter den sauren Bedingungen der LC/MS-Analyse) konnte ebenfalls nicht aufgefunden werden. Trotz dieses negativen Befundes wurde das entstandene unbekannte Zwischenprodukt weiter mit TFA/H 2 O versetzt, um zu überprüfen ob die Zwischenstufe nicht vielleicht doch zum gewünschten Produkt umgesetzt werden kann. Allerdings konnten auch hier das gewünschte Produkt nicht im LC/MS-Lauf gefunden werden. Wong et al. haben die STL an 20 natürlichen Aminosäuren getestet [97]. Es stellte sich heraus, dass die STL nur für 17 der 20 Aminosäuren sehr gut kompatibel ist, für die Aminosäuren Asp, Glu und Lys ist sie weniger gut geeignet. Desweiteren zeigte sich, dass für Aminosäuren, die Verzweigungen am β-c-atom aufweisen (Thr, Val und Ile), die Reaktion nicht unter normalen Ligationsbedingungen stattfindet. Wong et al. zeigten in ihrer Arbeit, dass Asp, Glu und Lys als C-terminale Aminosäuren in der Ligation ungeeignet seien, da der SAL-Ester nicht stabil und isolierbar sei. Jedoch konnte in dieser Arbeit der SAL-Ester sowohl isoliert als auch mittels HPLC aufgereinigt werden. Allerdings wurde der Ester nur per LC/MS analysiert. Es könnte sich bei dem Produkt, wenn auch unwahrscheinlich, daher möglicherweise um ein Nebenprodukt handeln, welches dieselbe Masse besitzt wie der erwartete SAL-Ester. Eine andere Möglichkeit wäre, dass der SAL-Ester stabil ist, jedoch nicht aber das Intermediat, das sich während der Reaktion bildet.

87 Ergebnisse und Diskussion 87 3 Synthesestrategie 3: Zyklisierung via Peptidkupplung Als weitere, alternative Synthesestrategie sollte eine Zyklisierung via Peptidkupplung in Lösung getestet werden. Der Vorteil dieser Synthesestrategie ist die höhere Reaktivität der Aminogruppe gegenüber der Hydroxylgruppe bei der Zyklisierung, was zu schnelleren Reaktionen führen sollte. Obwohl SRE im Gegensatz zum zyklischen Syringotoxinderivat von Bayó et al. kein Glycin in seiner Aminosäuresequenz besitzt [104], welches sich als Zyklisierungsstelle besonders gut eignet, da es aufgrund seiner fehlenden Seitenkette während der Kupplung nicht racemisieren kann, sollte eine Zyklisierung zwischen einem N-terminalem L-Thr- Baustein und einem C-terminalen L-Aspartat- bzw. L-threo-β-HyAspartat-Baustein getestet werden. Abbildung 50: Übersicht über die Synthesestrategie 3, der Zyklisierung via einer Peptidkupplung in Lösung.

88 Ergebnisse und Diskussion Synthese von Derivat 1 Zunächst sollte das vollständig reduzierte Derivat 1 synthetisiert werden. Hierzu wurde als Zyklisierungsstelle ein C-terminales Fmoc-L-Asp(OtBu) ausgewählt. Die Veresterung der Hydroxylgruppe des L-Serin-Bausteines mit Fmoc-L-Thr(tBu)-OH sollte am Harz stattfinden. Die Zyklisierung hingegen sollte in Lösung unter Verwendung von Kupplungsreagenzien durchgeführt werden. Abbildung 51: Retrosynthese für das Derivat 1 nach der Synthesestrategie SPPS des geschützten linearen Peptids 80 Es wurde analog zu Abschnitt 2.2 ein Peptid bis zur Stufe von Fmoc-D-Ser(t-Bu) am Harz synthetisiert. Im Gegensatz zur Synthese in Abschnitt 2.2 wurde im nächsten Schritt jedoch Fmoc-L-Ser-OH gekuppelt, Fmoc abgespalten und die Dodecansäure gemäß der Synthesevorschrift in Abschnitt 1.1 gekuppelt. Anschließend wurde die freie Hydroxylgruppe des L-Serins mit Fmoc-Thr(tBu)-OH verestert. Nach erfolgreicher Veresterung wurde die Fmoc-Schutzgruppe entfernt und das voll-

89 Ergebnisse und Diskussion 89 geschützte lineare Peptid unter den milden Standardbedingungen vom Harz abgespalten, was zu einem Rohprodukt in einer Ausbeute von 2 mg führte. Abbildung 52: SPPS des linearen Precursors 80. Zunächst wurde die unsubstituierte Fettsäure gekuppelt. Anschließend erfolgten die Veresterung mit Fmoc-L-Thr(tBu)-OH am Harz und die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe. Das Peptid wurde unter Beibehaltung der Seitenkettenschutzgruppen mit AcOH/DCM/TFE vom Harz abgespalten. Allerdings war auch hier das Peptid nicht komplett sauber und viele undefinierte Nebenprodukte wurden in der LC/MS-Analyse gefunden. Daher wurde das geschützte Peptid mit einer niedrigeren Konzentration von 0,05 mm in DCM gelöst

90 Ergebnisse und Diskussion 90 und die Kupplung nach Vorschrift zur Synthese des Syringotoxin-Derivats von Bayó et al. durchgeführt [104]. Hierzu wurde allerdings DCC als Kupplungsreagenz verwendet. Nach 2 und 6 Stunden wurden Reaktionskontrollen durchgeführt, indem ein Teil der Lösung entnommen wurde und diese Mischung mit einer Lösung aus 50 % aq. TFA versetzt wurde. Die Kontrollen wurden mittels LC/MS analysiert. Auch nach 6 Stunden Reaktionszeit wurde noch Edukt, in diesem Fall in Form des ungeschützten linearen Peptids, in größeren Mengen gefunden. Daher wurde die Reaktion über Nacht laufen gelassen. Abbildung 53: Zyklisierung von 80 zu Derivat 1 via Peptidkupplung in Lösung und anschließende Schutzgruppenabspaltung mit 95 %iger TFA-Lösung. In der folgenden Reaktionskontrolle konnte das Produkt mit einer Masse von [M+H + ] = 1158,64 bei einer Retentionszeit von 5,7 min im LC/MS aufgefunden werden. Die Retentionszeit entsprach dabei der Retentionszeit des über die Steglich- Zyklisierung hergestellten Derivates 1. Aber auch in diesem Reaktionsansatz entstanden analog zur Synthese von Derivat 1 über die Steglich-Veresterung (Abschnitt ) eine Vielzahl von Nebenprodukten und der Produktpeak befand in einem sehr dicht zusammenliegenden Pulk aus Peaks. Das Lösemittel des Reaktionsgemisches wurde daraufhin einrotiert und das Rohprodukt mit H 2 O

91 Ergebnisse und Diskussion 91 aufgenommen. Leider war es nicht möglich, das Produkt in reiner Form mittels HPLC zu isolieren. In diesem Fall wurde aufgrund der geringen Menge an Rohprodukt (2,5 mg) eine Semi-Prep-Säule verwendet.

92 Zusammenfassung 92 IV. Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Synthesewege zur chemischen Darstellung von zyklischen und linearen Syringomycin E-Derivaten evaluiert. Mittels dieser Studien gelang es, eine SPPS-Strategie zur Synthese von 4 strukturreduzierten linearen Derivaten und eines zyklischen Derivats des antimikrobiellen Lipodepsipeptids SRE zu entwickeln. Diese Derivate stehen nun für weiterführende biologische Aktivitätsstudien zur Verfügung. Die hierzu verwendeten Synthesen basierten dabei auf einer Fmoc-SPPS-Strategie, d.h. es wurden säurelabile Seitenkettenschutzgruppen verwendet. Nach der Synthese wurde diese unter Erhalt der Seitenkettenkettenschutzgruppen vom Harz abgespalten und bei den zyklischen Derivaten einer anschließenden Zyklisierung in Lösung unterzogen. Zur Synthese der ausgewählten Modellpeptide mussten zu Beginn der Synthesen zuerst die nicht-kanonischen Aminosäuren mit den notwendigen Schutzgruppen dargestellt werden. So wurde im Rahmen dieser Arbeit ein L-threo-β-HyAsp(OBzl, TBDMS)-OH-Baustein hergestellt und in einige Modellpeptide eingebaut. Um dessen Anwendbarkeit in der Synthese von Syringomycin E-Derivaten zu testen, konnte in Vorstudien gezeigt werden, dass die verwendete Bzl-Schutzgruppe zum Blockieren der Seitenketten-Carboxylgruppe des β-hyasp in der Tat kompatibel mit der Z-Dhb-Gruppe von Syringomycin E ist und unter Erhalt der Doppelbindung durch Hydrierung abgespalten werden kann. Demgegenüber zeigte sich, dass eine Schutzgruppenstrategie unter Verwendung von Benzylethern in Anwesenheit von Z-Dhb nicht geeignet war. Die Darstellung der benötigten Z-Dhb-Gruppe gelang durch eine Cu(I)Cl- und EDC-vermittelte Eliminierung von Thr. Die benötigten Boc-geschützten Dab-Derivate wurden aus Fmoc-Gln-OH mittels einer Umlagerungsreaktion hergestellt. Neben der Fettsäure Dodecansäure wurde in einigen Derivaten ebenfalls eine substituierte 3- Hydroxydodecansäure für die Synthese von Derivaten eingesetzt. Hierzu wurde ein Derivat mit einer Silylether-geschützten Hydroxylgruppe hergestellt. Die Synthese der linearen Derivate gelang durch ein Standard-Protokoll der SPPS. Die Synthese der zyklisierten Derivate stellte sich jedoch als viel herausfordernder heraus. Es wurden drei große Synthesestrategien evaluiert: 1) eine

93 Zusammenfassung 93 Macrolactonisierungsstrategie, 2) eine Ser/Thr-Ligationsstrategie und 3) eine Macrolactamisierungsstrategie. Ein zyklisiertes Syrinomycin E-Derivat konnte letztlich durch einen Macrolactonisierungsansatz nach der Methode von Steglich erhalten werden. Leider konnte diese Synthesestrategie jedoch nicht auf strukturell-komplexere Syringomycin E-Derivate übertragen werden. Auch die Macrolactamisierungsstrategie stellte sich als prinzipiell-gangbarer Weg zur Synthese von Syringomycin E-Derivaten dar. Jedoch zeigte diese Methode keine nennenswerten Vorteile gegenüber der Macrolactonisierungsstrategie, so dass keine weiteren Optimierungen der Synthese zur Isolierung eines zyklisierten Produktes (und nicht nur der Detektion mittels LC- MS) unternommen wurden. Die synthetisch sicherlich anspruchsvollste, aber auch in seiner Anwendungsbreite optimalste Strategie stellte sicherlich die Ser/Thr-Ligation dar, welche jedoch im Rahmen dieser Arbeit leider nicht erfolgreich durchgeführt werden konnte. Zwar gelang, entgegen der Literaturvorhersagen von Wong et al. [97], die Synthese eines linearen Peptid-Salicylaldehydesters-Ligationsvorläufers, jedoch gelang unter keiner der gewählten Bedingungen dessen Zyklisierung in das gewünschte Produkt. Nichtsdestotrotz könnte eine Synthese mittels dieses Ligationsansatzes gelingen, wenn in zukünftigen Studien eine alternative Ligationsstelle in Syringomycin E gewählt werden würde.

94 Ausblick 94 V. Ausblick Die Ergebnisse dieser Arbeit öffnen sowohl weitere biologische als auch chemische Fragestellungen. Von biologischem Interesse ist dabei insbesondere die biologische Aktivität der synthetisierten Derivate und ihren direkten Vergleich mit dem Naturstoff, der in geringen Mengen kommerziell erhältlich ist. Dabei können mehrere biologische Testsysteme verwendet werden, jedoch bietet sich insbesondere eine Evaluierung an verschiedenen Hefestämmen an, da Syringomycin eine starke und für eine Anwendung vielversprechende antifungale Wirkung zeigt. Von besonderem Interesse für eine medizinische Anwendung ist dabei insbesondere der Vergleich der linearen Derivaten mit den zyklisierten Produkten, da die linearen Peptide, wie diese Arbeit zeigte, synthetisch viel leichter zugänglich sind als zyklisierte Derivate. Auch ermöglichen die hier dargestellten Derivate erstmals, Struktur-Wirkungsbeziehungen in Bezug auf einzelne Aminosäuren in Syringomycin E aufzustellen. Dies könnte unter anderem zur Auffindung von synthetisch leichter zugänglichen, aber auch eventuell selektiv wirkenderen Syringyomcin E-Derivaten führen. Vom chemischen Gesichtspunkt her öffnet die vorliegende Arbeit verschiedene Ansatzpunkte zur Verbesserung der Synthese zyklischer Syringomycin E-Derivate. So könnten durch eine weitere Optimierung der Reaktionsbedingungen die Ausbeuten der zyklisierten Reaktionsprodukte bei der Macrolactonisierungs- und der Macrolactamisierungsstrategie noch verbessert werden. Allerdings zeigte sich bei diesen Synthesen, dass nicht unbedingt die Ausbeute, sondern die starke Verunreinigung des Reaktionsrohproduktes die größte Herausforderung für das Isolieren des zyklisierten Derivates darstellte. Dementsprechend könnte eine Verbesserung der Ausbeute auch durch eine Optimierung der Reinigungsbedingungen eventuell erreicht werden. Leider gelang es in dieser Arbeit nicht, die Ser-/Thr-Ligationsstrategie erfolgreich zur Synthese von zyklischen Syringomycin E-Derivaten einzusetzen. Jedoch zeigen die in dieser Arbeit durchgeführten Studien, dass sich zumindestens die für diese Strategie notwendigen Peptid-Salicylaldehyd-Vorläufer darstellen lassen. Daher lässt sich vermuten, dass diese Strategie bei Verwendung alternativer Ligationsstellen durchaus zum Erfolg führen könnte. Aufgrund der breiten Anwendbarkeit dieser Ligationsmethode zur

95 Ausblick 95 Darstellung verschiedener Derivate würde es sich daher lohnen, weitere Studien in diese Richtung in Zukunft durchzuführen..

96 Material und Methoden 96 VI. Material und Methoden 1 Reagenzien und Materialien Die Reagenzien und Lösemittel wurden von den Firmen Iris Biotech, Acros, Fluka, Novabiochem, Merck, Roth oder Sigma-Aldrich bezogen und ohne weitere Aufreinigung verwendet. Die Spritzenreaktoren wurden von der Firma MultiSynTech bezogen. 2 LC/MS Die LC/MS-Analysen wurden an einem Thermo Scientific LCQ Fleet TM ESI Spektrometer mit einer Eclipse XDB-C18 Säule (5 µm) von Agilent durchgeführt. Als Lösemittel wurden Wasser (A) und Acetonitril (B) verwendet. In Messungen im positiven Modus wurden jeweils 0,1 % Ameisensäure den Lösemitteln und im negativen Modus jeweils 0,1% Ammoniumacetat zugesetzt. Die Flussrate betrug 1 ml/min. Gradient 1 C 18 : 0 min/10% B 1 min/10% B 10 min/100% B 12 min/100% B 15 min/10% B Gradient 2 C 18 : 0 min/10% B 1 min/10% B 7 min/100% B 20 min/100% B 25 min/10% B 3 HPLC Die Peptide wurden mit einem HPLC-System von Shimadzu über eine RP-C 18 -Säule von Phenomenex aufgereinigt. Als Lösemittel wurden Acetonitril und Wasser mit jeweils 0,1% TFA verwendet. Der Gradient wurde manuell eingestellt und variierte je nach Reinheit und Retentionszeit des Rohproduktes, das aufgetragen wurde. Die Flussrate betrug 25 ml/min. 4 NMR Die 1 H-NMR-Analysen wurden an einem Varian Mercury 400 bzw. 700 System (400 MHz oder 700 MHz) durchgeführt. Die Spektren wurden hinsichtlich ihrer chemischen

97 Material und Methoden 97 Verschiebung (δ), ihrer Multiplizität (s, Singulett; d, Dublett; t; Triplett; m, Multiplett, br, broad signal), Kopplungskonstanten (J) und Anzahl der Protonen (H) ausgewertet. Die 13 C-NMR-Analysen wurden an einem 100 MHz-System der Firma Bruker durchgeführt. Die Spektren wurden hinsichtlich der chemischen Verschiebung ausgewertet. 5 Gefriertrocknung Die Gefriertrocknung (Lyophilisation) erfolgte an dem Gefriertrockner Alpha 2-4 LD von der Firma Christ bei einer Eiskondensatortemperatur von -80 C. Die Substanzen wurden in möglichst wenig Wasser gelöst, in flüssigem Stickstoff eingefroren und über Nacht lyophilisiert. 6 Bestimmung des Drehwertes Die Bestimmung des Drehwertes einiger Bausteine wurde an einem Polarimeter bei einer Temperatur von 23 C und einer Wellenlänge von 589 nm durchgeführt. Die Lösemittel variierten je nach Substanz. Die Lösungen hatten eine Konzentration von c = 1 g/l 7 Allgemeine Methode: Beladung von 2-Chlorotitylchlorid-Harz mit Carbonsäuren Das 2-Chlorotritylchlorid-Harz wurde in einem ausgeheizten, vom Glasbläser angefertigten Rosenbaumreaktor zunächst unter Hochvakuum getrocknet und anschließend dreimal mit trockenem DCM für jeweils 10 Minuten gequellt. Die Aminosäure (1,2 eq.) und trockenes DIPEA (4,8 eq.) wurden in trockenem DCM (10 ml pro g Harz) gelöst und unter Argon dem Harz zugeführt. Das Reaktionsgemisch wurde mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Schutzgas (Argon) vorsichtig geschüttelt. Anschließend erfolgte der Capping-Schritt. Hierbei wurde das Harz dreimal für jeweils fünf Minuten mit einem DCM/MeOH/DIPEA-Gemisch (17:2:1) gewaschen. Nach dem Capping-Schritt wurde das beladene Harz dreimal mit DCM, zweimal mit DMF und wiederum zweimal mit DCM für jeweils 3 Minuten gewaschen und anschließend unter Hochvakuum

98 Material und Methoden 98 getrocknet. Das Harz wurde zur weiteren SPPS in einen Spritzenreaktor mit einer PE-Fritte der Firma MultiSynTech überführt. 8 Allgemeine Methode: Fmoc-Bestimmung zur Ermittlung der Harzbeladung Etwa 4-5 mg des zuvor beladenen und getrockneten Harzes wurden in 5 ml eines Gemisches aus 20 % Piperidin in DMF 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurden drei Verdünnungsreihen mit den Faktoren 3, 5 und 10 mit der Abspaltlösung (20 % Piperidin in DMF) und der Lösung mit dem abgespaltenen Fmoc angesetzt. Der Fmoc-Gehalt der Lösungen wurde durch UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 301 nm an einem UV/Vis-Spektrometer gemessen und mittels Lambert-Beer schen-gesetzes berechnet. Als Blank diente die reine Abspaltlösung. Der verwendete Extinktionskoeffizient ε betrug 780 mol -1 m -1. Lambert-Beer-Gesetz: 9 Allgemeine Methode Fmoc-Abspaltung am Harz c = Konzentration A = Absorption V = Volumen ε = Extinktionskoeffizient m = Einwaage d = Schichtdicke Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe erfolgte mit einer Lösung aus 20 % Piperidin in DMF im Spritzenreaktor bei Raumtemperatur. Das Harz wurde hierbei zweimal mit der Lösung versetzt und für jeweils 30 Minuten geschüttelt. Anschließend wurde das Harz mit DCM und DMF intensiv gewaschen. 10 Allgemeine Methode: Peptidkupplung am Harz Für die Standardpeptidkupplungen am Harz wurden jeweils 4 eq. HBTU und HOBt, 6 eq. DIPEA und 4 eq. der Aminosäure in DMF gelöst und zum Harz in einem Spritzenreaktor gegeben. Der Spritzenreaktor wurde daraufhin für 1,5-2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurde das Harz mehrmals mit DCM, MeOH und DMF gewaschen. Gegebenenfalls ist eine mögliche Abweichung der Reaktionsbedingungen, Reagenzien und Äquivalente im experimentellen Teil dieser Arbeit angegeben.

99 Material und Methoden Allgemeine Methode: Testabspaltung Zur Ermittlung der vollständigen Kupplung wurde eine Testabspaltung durchgeführt und das Peptidfragment im LC/MS gemessen. Dazu wurde eine kleine Menge Harz entnommen, mit 100% TFA versetzt und 15 Minuten geschüttelt. Die TFA-Lösung wurde am Hochvakuum entfernt, das entschützte Peptid in H 2 O/ACN (1:1) aufgenommen und mittels LC/MS analysiert. 12 Allgemeine Methode: Darstellung von Z-Dhb mittels Thr-Eliminierung an fester Phase Für die Thr-Eliminierung an fester Phase wurden Cu(I)Cl (60 eq.) und EDC (100 eq.) in einem Gemisch aus DCM und DMF (10:2) aufgenommen. Das Harz wurde gleichmäßig auf zwei 20 ml Spritzenreaktoren aufgeteilt und die Lösung dazugegeben. Die Aufteilung auf zwei Spritzen war nötig, da die Reagenzien aufgrund ihrer Menge schlecht löslich waren und entsprechend viel Lösemittel verwendet werden musste. Die Reaktoren wurden daraufhin mindestens 4 Tage bei Raumtemperatur geschüttelt und das Harz anschließend mehrmals intensiv mit DCM und DMF so lange gewaschen, bis keine grüne Färbung des Cu(I)Cl-Salzes mehr sichtbar war. 13 Allgemeine Methode: Alloc-Abspaltung Zur Entschützung einer am N-Terminus Alloc-geschützten Aminosäure an fester Phase wurde das Harz am Hochvakuum in einem Rosenbaumreaktor getrocknet und dreimal in trockenem entgasten DCM unter Schutzgas gequollen. Eine Lösung aus Morpholin (24 eq.) in trockenem entgastem DCM wurde hinzugegeben und die Mischung vorsichtig geschüttelt. Anschließend wurde eine Lösung aus Pd(PPh 3 ) 4 (0.25 eq.) ebenfalls in trockenem DCM hinzugegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur etwa 1 Stunde vorsichtig geschüttelt. Nach Ende der Reaktion wurde das Harz mindestens dreimal mit DCM, DMF und NMP gewaschen. Danach wurde das Harz dreimal jeweils 5 Minuten mit einer 0,02 M Natriumdiethyldithiocarbamat/NMP-Lösung und anschließend wiederum mehrmals mit NMP, DCM und DMF intensiv gewaschen. Die Vollständigkeit der Entschützung wurde mittels einer Testabspaltung (s. Methode 11) überprüft.

100 Material und Methoden Allgemeine Methode: Abspaltung vom 2-Chlorotritylchlorid-Harz unter Erhalt der säurelabilen Seitenketten-Schutzgruppen Die Abspaltung des Peptids von einem 2-Chlorotritylchlorid-Harz erfolgte durch die Inkubation des Harzes in einer Lösung aus AcOH/DCM/TFE (1:8:1) für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Die Abspaltlösung wurde aufgefangen, das restliche Harz dreimal mit DCM 2 Minuten gewaschen und das Lösemittel mit der Abspaltlösung vereint. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsevaporator entfernt und die Essigsäure mit Cyclohexan coevaporiert. Das erhaltene Rohpeptid wurde am Hochvakuum getrocknet. 15 Allgemeine Methode zum Abspalten der säurelabilen Schutzgruppen mit TFA Die säurelabilen Schutzgruppen der Seitenketten wurden mit einem Gemisch aus 95 % TFA, 2,5 % H 2 O und 2,5 % TIS abgespalten. Dazu wurde das Harz etwa 2 Stunden in dem Gemisch geschüttelt, die Lösung aufgefangen und das Peptid in dieser Lösung in kaltem Et 2 O gefällt. Der Niederschlag wurde 20 Minuten bei 3600 rpm abzentrifugiert und zweimal mit Et 2 O gewaschen. Das Rohprodukt wurde über Nacht am Hochvakuum getrocknet. 16 Allgemeine Methode zum Abspalten von Bzl- und Cbz-Schutzgruppen in Lösung Zur Entschützung der Bzl- und Cbz-geschützten Gruppen wurden die Peptide entweder in THF oder MeOH gelöst. Zusätzlich wurden 10 % Ameisen- oder Essigsäure hinzugegeben. Als Katalysator wurde 5 Gew.-% Palladiumkatalysator (10 % Pd auf Aktivkohle, Pd/C) eingesetzt. Anschließend wurde der Kolben mit der Lösung mit Argon gespült und mit einem Septum verschlossen. Der Wasserstoff wurde über zwei handelsübliche Luftballons über eine Kanüle durch das Septum der Reaktion zugeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurde die Lösung über Celite (Sigma Aldrich) abgenutscht und das Lösemittel abrotiert.

101 Experimenteller Teil 101 VII. Experimenteller Teil 1 Alloc-L-Phe (6) Phenylalanin (2 g, 13,5 mmol) wurde in einer Mischung aus H 2 O (20 ml) und Et 2 O (15 ml) gelöst und das Gemisch in einem Eisbad gekühlt. Eine Lösung aus 1,3 eq. Allylchloroformiat (1,8 ml, 17,55 mmol) in Dioxan (15 ml) wurde langsam gleichzeitig mit einer 1 M wässrigen NaOH-Lösung (18 ml) unter Rühren zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und die Reaktion bei RT für 16 h gerührt. Nach Kontrolle des Umsatzes mittels DC (DCM/MeOH, 19:1, R f = 0,6) wurde das Gemisch anschließend mit EtOAc verdünnt und 3 Mal mit ges. NaHCO 3 -Lösung gewaschen. Die wässrige Phase wurde vereinigt, mit konz. HCl angesäuert und 3 Mal mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase wurde über Na 2 SO 4 getrocknet und abrotiert. Das Produkt konnte mit einer Ausbeute von 82 % erhalten werden. [α] D = -9 (23 C, c = 1, EtOH), LC/MS: [M+H + ] 250,19, t R = 6,82 min, 1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ/ppm = 7.57(d, 1 H, J = 8 Hz), (m, 5 H), (m, 1 H), (m, 2 H), (m, 2 H), (m, 1 H), (m, 2 H), 13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ/ppm = 38.62, 56.77, 68.16, , , , , , , , , , (TBDMS)-Dodekansäure (7) Zu einer in einem Eisbad gekühlten Lösung aus 3-Hydroxydodecansäure (200 mg, 0,92 mmol) in DCM (50 ml) wurden 2,5 eq. TBDMS-Triflat (528 µl, 2,3 mmol) und 4 eq. DIPEA (624,6 µl, 3,68 mmol) unter Rühren zugegeben. Die Mischung wurde

102 Experimenteller Teil h gekühlt und anschließend bei RT gerührt. Nach 24 h wurden erneut 2,5 eq. TBDMS-Triflat und 4 eq. DIPEA zugegeben und die Mischung einen weiteren Tag bei RT gerührt. Die Reaktion wurde mit H 2 O (20 ml) verdünnt, die organische Phase jeweils 2 Mal mit 1 M KHSO 4 - und einer gesättigten NaHCO 3 -Lösung gewaschen und über Na 2 SO 4 getrocknet. Das Lösemittel wurde abrotiert und das Rohprodukt über eine Kieselgelsäule (EA/CH, 2:1, R f = 0,4) gereinigt. Das Produkt wurde mit einer Ausbeute von 61 % erhalten. LC/MS: [M] - 329,26, t R = 11,52 min, 1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ/ppm = (m, 1 H), (m, 2 H), (m, 2 H), (m, 14 H), 0.93 (t, 3 H), 0.91 (s, 9H), 0.10 (s, 3 H), 0.09 (s, 3 H). 3 Fmoc-L-Dab (8) Fmoc-L-Gln-OH (1 g, 2,7 mmol) wurde zu einer Lösung aus 3 eq. PIFA (3,5 g, 8,1 mmol) in DMF/H 2 O (2:1, 15 ml) gegeben. Nach 15 min Rühren bei RT wurden 4 eq. Pyridin (874 µl, 10,8 mmol) hinzugefügt und das Reaktionsgemisch bei RT 48 h gerührt. Das Lösemittel wurde abrotiert und der Rückstand in H 2 O (12 ml) aufgenommen. Konz. HCl (0,5 ml) wurden zugegeben und die saure Lösung 4 Mal mit Et 2 O (10 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit 2 M NaOH auf einen ph- Wert von 6 eingestellt und der ausgefallene Feststoff abgefiltert. Der Feststoff wurde anschließend 5 Mal mit jeweils H 2 O (10 ml), 2 Mal mit eiskaltem EtOH (10 ml) und 10 Mal mit Et 2 O (10 ml) gewaschen. Das erhaltene Rohprodukt wurde im Hochvakuum getrocknet. Das Produkt wurde ohne weitere Aufreinigung mit einer Ausbeute von 62 % erhalten. [α] D = + 20 (23 C, c = 1, DMSO)[105], LC/MS: [M+H + ] 341,14, t R = 5,33 min, 1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ/ppm = (m, 4 H), (m, 4 H), (m, 3 H), (m, 1 H), (m, 2 H), (m, 2 H).

103 Experimenteller Teil Fmoc-D-Dab (9) Die Synthese erfolgte analog zur Synthese von 9. Hier konnte eine Ausbeute von 56 % erzielt werden. [α] D = + 12 (23 C, c = 1, MeOH/1 N HCl, 4:1, LC/MS: [M+H + ] 341,09, t R = 5,42 min, 1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ/ppm = (m, 8 H), (m, 3 H), (m, 1 H), (m, 2 H), (m, 2 H). 5 Fmoc-L-Dab(Boc)-OH (10) Produkt 10 (500 mg, 1,1 mmol) wurde in H 2 O (80 ml) gelöst und 2 eq. NaHCO 3 (247 mg, 2,9 mmol) wurden unter Rühren zugegeben. Die resultierende Lösung wurde auf etwa 5 C gekühlt und 1,5 eq. Boc-Anhydrid (480 mg, 2,3 mmol) als Lösung in para-dioxan (20 ml) wurden langsam zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 5 C gerührt und über Nacht langsam auf RT erwärmt. Anschließend wurde H 2 O (80 ml) zugegeben und die wässrige Phase 2 Mal mit EtOAc extrahiert. Die organische Phase wurde 2 Mal mit ges. NaHCO 3 -Lösung gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden mit konz. HCl auf einen ph von 1 angesäuert und mit EtOAc extrahiert. Die organischen Phasen wurden daraufhin über Na 2 SO 4 getrocknet. Das Rohprodukt wurde säulenchromatographisch gereinigt (DCM/MeOH, 30:1 19:1 (R f = 0,2) 9:1). Es konnte eine Ausbeute von 46 % erzielt werden. LC/MS: [M+Na + ] 463,44, t R = 6,44min, 1 H-NMR (400 MHz, DMSO): δ/ppm = (m, 4 H), (m, 1 H), (m, 4H), 6.83 (t, 1 H), (m, 3H), (m, 1 H), (m, 2 H), (br, 2 H), 1.37 (s, 9 H).

104 Experimenteller Teil Fmoc-D-Dab(Boc)-OH (11) Produkt 11 wurde analog zu Produkt 10 aus Edukt 9 synthetisiert. Ausbeute 42 %, LC/MS: [M+Na + ] 463,21, t R = 6,48 min, 1 H-NMR (400 MHz, DMSO): δ/ppm = (m, 4 H), (t, 1 H), (m, 4H), 6.67 (t, 1 H), (m, 3H), (m, 1 H), (m, 2 H), (br, 2 H), 1.38 (s, 9 H). 7 L-threo-β-HyAsp (12) 2 g (13,4 mmol) D,L-threo-β-Hydroxyasparaginsäure wurden in H 2 O (16 ml) bei etwa 40 C suspensiert und 1 eq. L-Lysin (1,96 mg) zugegeben. Nachdem eine Lösung vorlag, wurde MeOH (13 ml) langsam in kleinen Portionen zur Lösung gegeben. Anschließend wurde das Gemisch über Nacht bei 4 C gelagert. Der ausgefallene Feststoff, der aus einem Gemisch aus L-Lysin und L-β-HyAsp besteht, wurde abfiltriert, mit einer geringen Menge MeOH gewaschen und in heißem Wasser umkristallisiert. Über eine Dowex- Ionenaustauschersäule in Acetatform wurden das L-Lysin und das L-β-HyAsp voneinander getrennt. Hierbei wurde zunächst L-Lysin mit 0,5 M wässriger AcOH eluiert, anschließend wurde L-β-HyAsp mit 2 M AcOH eluiert. Die vereinigten Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden einrotiert, so dass das Produkt in einer Ausbeute von 72 % erhalten werden konnte (bezogen auf das 50:50-Enantimerengemisch). [α] D = + 6 (23 C, c = 1, 5 N HCl) [117].

105 Experimenteller Teil L-threo-β-HyAsp(OBzl)-OH (13) Zu einer Lösung aus Benzylalkohol (5 ml) und konz. HCl (600 µl) wurde L-β-HyAsp (500 mg, 3,36 mmol) gegeben. Die Mischung wurde bei 70 C unter Rühren erhitzt. Nach 3,5 h wurde der ph-wert der Lösung durch Zugabe von NH 4 OH auf 6 eingestellt und das Rohprodukt mit eiskaltem EtOH ausgefällt. Das Rohprodukt wurde mit heißem Wasser umkristallisiert. Das Produkt konnte ohne weitere Aufreinigung mit einer Ausbeute von 88 % gewonnen werden. LC/MS: [M+H + ] 239,94, t R = 3,88 min, 1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ/ppm = (m, 5 H), 5.15 (dd, 2 H, J = 12 Hz), 4.55 (d, 1 H, J = 4 Hz), 3.55 (d, 1H, J = 4 Hz), 13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ/ppm = , , , , , 69.87, 65.87, L-threo-β-HyAsp(OBzl,TBDMS)-OH (14) Produkt 13 (500 mg, 2 mmol) wurde in DCM gelöst und die Lösung im Eisbad gekühlt. 5 eq. TBDMS-Triflat (2,3 ml, 10 mmol) und 6 eq. DIPEA (2 ml, 12 mmol) wurden unter Rühren zugegeben und das Reaktionsgemisch für 2 Tage bei RT gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von H 2 O verdünnt und die organische Phase 3 Mal mit 1 M KHSO 4 - und 3 Mal mit ges. NaHCO 3 -Lösung extrahiert. Die organische Phase wurde über Na 2 SO 4 getrocknet und das Lösemittel abrotiert. Die Ausbeute des Produktes lag bei 70 %. LC/MS: [M+H + ] 354,20, t R = 6,45 min.

106 Experimenteller Teil Fmoc-L-threo-β-HyAsp(OBzl,TBDMS)-OH (15) Produkt 14 (360 mg, 1 mmol) und 2 eq. NAHCO 3 (168 mg, 2 mmol) wurden in einem H 2 O/Aceton (1:1, 50 ml)-gemisch gelöst. Die Lösung wurde im Eisbad auf etwa 5 C gekühlt und 1,5 eq. Fmoc-OSu (506 mg, 1,5 mmol) wurden langsam unter Rühren zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht bei RT gerührt. Nach der Umsatzkontrolle mittels DC (EA/CH, 1:1, R f = 0,3) wurde H 2 O zugegeben und die wässrige Phase 3 Mal mit EtOAc (20 ml) gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden 2 Mal mit ges. NaHCO 3 -Lösung extrahiert. Die wässrigen Phasen wurden vereint, mit 10 %iger HCl auf einen ph-wert von 4 eingestellt und 3 Mal mit EtOAc (50 ml) extrahiert. Die organische Lösung wurde über MgSO 4 getrocknet und das Lösemittel evaporiert. Mittels LC/MS-Messung konnten die Massen [M+Na + ] = 598,31, t R = 11,4 min, und [M-TBDMS] = 461,81, t R = 8,75 min aufgefunden werden. Das Rohprodukt wurde über eine Kieselgelsäule (EA/CH, 1:1, R f = 0,3) gereinigt und das Produkt mit einer vorläufigen Ausbeute von 39 % erhalten werden. Das isolierte Nebenprodukt ohne TBDMS-Schutzgruppe wurde erneut gemäß Abschnitt 7.2 umgesetzt, so dass nach einem zweiten Zyklus das Produkt 15 erneut erhalten werden konnte. Insgesamt wurde somit eine Gesamtausbeute von 64 % erzielt. LC/MS: [M+Na + ] 598,31, 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ/ppm = (m, 4 H), (m, 9 H), 5.56 (d, 1 H, J = 10 Hz), 5.13 (dd, 2 H, J = 12 Hz), (m, 1 H), (m, 2 H), 4.22 (t, 1 H), 0.87 (s, 9 H), 0.08 (s, 3 H), 0.01 (s, 3 H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ): δ/ppm = , , , , , , , , , , , , , , 72.23, 67.63, 67.55, 57.34, 47.00, 25.56, 25.45, 18.20, -4.83,

107 Experimenteller Teil Synthese Derivate 1 und Harzbeladung Die Harzbeladung erfolgte nach der allgemeinen Methode 7. Es wurden ein 2- Chlorotritylchlorid-Harzes (max. Beladung 1,6 mmol/g, 500 mg, 0.8 mmol), 1,2 eq. trockenes Fmoc-L-Thr(tBu)-OH (382 mg, 0,96 mmol) und 4,8 eq. DIPEA (652 µl, 3,84 mmol) eingesetzt. Nach 2 h Inkubation wurde das Harz gewaschen, gecapped und die Beladung bestimmt. Es wurde eine Beladung von 0,7 mmol/g (44 % Beladungsausbeute) erhalten. 8.2 Kupplung Fmoc-L-Asp(OtBu) zu 17 Harz 16 (250 mg, 0,175 mmol) wurden nach der allgemeinen Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH erfolgte gemäß der allgemeinen Methode 10: Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH: 288 mg, 0,7 mmol; HBTU: 265 mg, 0,7 mmol; HOBt: 95 mg, 0,7 mmol; DIPEA: 178 µl, 1,05 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Kupplung Fmoc-L-Thr-OH zu 18 Das Produkt 17 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Thr-OH erfolgte nach allgemeiner Methode 10: Fmoc-L-Thr-OH: 238,5 mg,

108 Experimenteller Teil 108 0,7 mmol; HBTU: 265 mg, 0,7 mmol; HOBt: 95 mg, 0,7 mmol; DIPEA: 178 µl, 1,05 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Kupplung Alloc-L-Phe-OH zu 19 Das Produkt 18 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Phe-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Alloc-LPhe-OH: 174,5 mg, 0,7 mmol; HBTU: 265 mg, 0,7 mmol; HOBt: 95 mg, 0,7 mmol; DIPEA: 178 µl, 1,05 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Eliminierung zu 20 Die Eliminierung des Threonin-Bausteines zu der Z-Dhb-Gruppierung erfolgte gemäß allgemeiner Methode 12. Hierzu wurden 100 eq. EDC (3.3 g, 17,5 mmol) und 60 eq. Cu(I)Cl (1 g, 10,5 mmol) eingesetzt und die Reaktion 6 Tage bei RT geschüttelt. Nach mehrmaligem intensivem Waschen mit DCM und DMF wurde die vollständige Umsetzung zu Produkt 20 mittels Testabspaltung belegt.

109 Experimenteller Teil Alloc-Abspaltung zu 21 Die Alloc-Abspaltung wurde nach der allgemeinen Methode 13 mit 24 eq. Morpholin (366 µl, 4,2 mmol) und 0.25 eq. Pd(PPh 3 ) 4 (50,5 mg, 0,044 mmol) unter Schutzgas (Argon) durchgeführt. Nach 1 h war die Abspaltung vollständig verlaufen. Die Testabspaltung ergab einen vollständigen Umsatz zu Produkt Kupplung Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH zu 22 Das Produkt 21 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-L-Arg(Pbf)- OH: 454 mg, 0,7 mmol; HBTU: 265 mg, 0,7 mmol; HOBt: 95 mg, 0,7 mmol; DIPEA: 178 µl, 1,05 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Kupplung Fmoc-L-Dab(Boc)-OH zu 23 Das Produkt 22 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Dab(Boc)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10 mit jeweils 4 eq.

110 Experimenteller Teil 110 der Aminosäure und der Kupplungsreagenzien und 6 eq. DIPEA: Fmoc-L-Dab(Boc)- OH: 308 mg, 0,7 mmol; HBTU: 265 mg, 0,7 mmol; HOBt: 95 mg, 0,7 mmol; DIPEA: 178 µl, 1,05 mmol. Nach 2 h wurde das Harz gewaschen und eine Testabspaltung durchgeführt. Da die Kupplung noch nicht vollständig verlaufen war, wurde der Kupplungsschritt wiederholt. Nach 2 h belegte eine Testabspaltung die Umsetzung des Eduktes zu Kupplung Fmoc-D-Dab(Boc)-OH zu 24 Das Produkt 23 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-D-Dab(Boc)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-D- Dab(Boc)-OH: 308 mg, 0,7 mmol; HBTU: 265 mg, 0,7 mmol; HOBt: 95 mg, 0,7 mmol; DIPEA: 178 µl, 1,05 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Kupplung Fmoc-D-Ser(tBu)-OH zu 25 Das Produkt 24 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-D-Ser(tBu)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-D-Ser(tBu)- OH: 268 mg, 0,7 mmol; HBTU: 265 mg, 0,7 mmol; HOBt: 95 mg, 0,7 mmol; DIPEA: 178 µl, 1,05 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu 25.

111 Experimenteller Teil Kupplung Fmoc-L-Ser-OH zu 26 Das Produkt 25 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Ser-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-L-Ser-OH: 229 mg, 0,7 mmol; HBTU: 265 mg, 0,7 mmol; HOBt: 95 mg, 0,7 mmol; DIPEA: 178 µl, 1,05 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Kupplung Dodecansäure zu 27 Das Produkt 26 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung der Dodecansäure erfolgte mit jeweils 2 eq. der Säure und der Kupplungsreagenzien und 3 eq. DIPEA: Dodecansäure: 70 mg, 0,35 mmol; HBTU: 132 mg, 0,35 mmol; HOBt: 48 mg, 0,35 mmol; DIPEA: 89 µl, 0,525 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu 27.

112 Experimenteller Teil Abspaltung vom Harz zu 28 Die Abspaltung des linearen Peptids 27 vom Harz erfolgte nach der allgemeinen Methode 14 mit einem AcOH/DCM/TFE-Gemisch (1:8:1, 5 ml). Nach 1,5 h wurde die Abspaltlösung gesammelt und unter Vakuum nach Zugabe von Cyclohexan bis zur vollständigen Trocknung coevaporiert. Es konnten 121 mg Rohprodukt erhalten werden. LC/MS: [M + H + ] 1797,61, (t R = 19,97 min).

113 Experimenteller Teil Zyklisierung zu 1 Es wurden 8 mg (0,004 mmol) des Rohproduktes 28 in trockenem DCM (45 ml, c = 0,1 mm) gelöst. Jeweils 5 eq. EDC (3,8 mg, 0,02 mmol) und DMAP (0,488 mg, 0,02 mmol) wurden unter Schutzgas zugegeben und die Lösung 1,5 h bei RT gerührt. Anschließend wurde das Lösemittel bei RT abrotiert, das Rohprodukt mit TFA/H 2 O/TIS (95:2,5:2,5, 2,5 ml) versetzt und für 1,5 h inkubiert. Die Abspaltlösung wurde gesammelt, das Peptid in eiskaltem Et 2 O gefällt und bei 3600 rpm abzentrifugiert. Der Feststoff wurde 1 Mal mit kaltem Et 2 O gewaschen und getrocknet. Das Rohrprodukt wurde mittels HPLC (Gradient: 0 min/10% B 10 min/20% B 20 min/40% B 40 min/100% B) gereinigt. Es konnten 820 µg (0,7 µmol, 6,3 %) des zyklisierten Produkts 1 erhalten werden. LC/MS: [M+H + ] 1159,55, t R = 5,40 min, 1 H NMR (700 MHz, D 2 O): δ/ppm = (m, 5H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 4H), ,29 (m, 3H), (m, 2H), (m, 3H), (m, 4H), (m, 4H), (m, 2H), (m, 3H), (br, 9H), (m, 3H), 1.69 (d, 2H, J = 12 Hz), (m, 4H), (br, 13H), 0.85 (t, 3H).

114 Experimenteller Teil Abspaltung der SG zum linearen Derivat 2 Das Rohprodukt 28 (10 mg) wurde mit einertfa/h 2 O/TIS-Lösung (95:2,5:2,5, 5 ml) versetzt und für 1,5 h inkubiert. Die Abspaltlösung wurde gesammelt und das Peptid in eiskaltem Et 2 O (50 ml) gefällt. Der Feststoff wurde bei 3600 rpm abzentrifugiert, 2 Mal mit kaltem Et 2 O gewaschen und getrocknet. Das resultierende Rohpeptid wurde mittels HPLC (Gradient: 0 min/10% B 30 min/40% B 50 min/100% B) gereinigt. Es konnten 2,55 mg (2 µmol, 14 %) des Produkts 2 erhalten werden. LC/MS: [M+H + ] 1177,59, t R = 5,24 min, 1 H NMR (400 MHz, D 2 O): δ/ppm = (m, 5H), (q, 1H), (m, 2 H), 4.69 (t, 1H), (m, 4H), (m, 3H), (m, 1H), (m, 3H), (m, 3H), (m, 5H), (q, 1H), (m, 1H), (br, 7H), (m, 2H), (m, 4H), 1.34 (d, 3H, J = 4 Hz), (m, 13H), (m, 4H), 0.87 (t, 3H).

115 Experimenteller Teil Synthese lineares Derivat Kupplung von 3-(TBDMS)-Dodecansäure (7) zu 40 Mit 125 mg von 16 (0,0875 mmol) wurde analog zu den Synthesen in Abschnitt 8 das lineare Peptid 26 hergestellt. Die Kupplung von 3-(TBDMS)-Dodecansäure (7) erfolgte nach der allgemeinen Methode 10 mit jeweils 2 eq. der Aminosäure und der Kupplungsreagenzien und 3 eq. DIPEA: 7: 58 mg, 0,175 mmol; HBTU: 66 mg, 0,175 mmol; HOBt: 24 mg, 0,175 mmol; DIPEA: 45 µl, 0,262 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Produkt 40. LC/MS: [M+H + ] 1193,68, t R = 4,94 min.

116 Experimenteller Teil Abspaltung vom Harz zu 3 Die Abspaltung des linearen Peptids vom Harz erfolgte nach der allgemeinen Methode 15 mit TFA/H 2 O/TIS (95:2,5:2,5, 5 ml). Nach 2 h wurde die Abspaltlösung gesammelt und das Peptid in eiskaltem Et 2 O (50 ml) gefällt. Der Feststoff wurde bei 3600 rpm abzentrifugiert und 2 Mal mit kaltem Et 2 O gewaschen. Das Rohprodukt wurde unter Vakuum getrocknet und mittels HPLC (Gradient: 0 min/10% 15 min/30% 20 min/50% 30 min/ 100%) gereinigt. Es konnten 4,12 mg (4%) des Produkts 3 erhalten werden. LC/MS: [M+H + ] 1193,63, t R = 4,98 min, 1 H NMR (400 MHz, D 2 O): δ/ppm = (m, 5H), (q, 1H), (m, 1H), 4.71 (t, 1H), (m, 6H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 1H), (m, 3H), (m, 9H), (m, 1H), (m, 2H), (m, 5H), (m, 2H), (m, 4H), (m, 4H), (m, 13H), (m, 3H), 0.88 (t, 3H). 10 Synthese der Testsequenz Harzbeladung Die Harzbeladung erfolgte nach der allgemeinen Methode 7. Es wurden ein 2- Chlorotritylchlorid-Harz (max. Beladung 1,6 mmol/g, 250 mg, 0,4 mmol), 1,2 eq. trockenes Fmoc-L-Thr(Bzl)-OH (207 mg, 0,48 mmol) und 4,8 eq. DIPEA (326 µl,

117 Experimenteller Teil 117 1,92 mmol) eingesetzt. Nach 2 h Inkubation wurde das Harz gewaschen, gecapped und die Beladung bestimmt. Es wurde eine Beladung von 0,7 mmol/g (44 % Beladungsausbeute) erhalten SPPS zu 44 Das Produkt 43 (0,175 mmol) wurde gemäß der allgemeinen Methode 9 entschützt. Die Kupplungen der Aminosäuren erfolgten analog zur Synthese von 22 nach der allgemeinen Methode 10: HBTU: 265 mg, 0,7 mmol; HOBt: 95 mg, 0,7 mmol; DIPEA: 178 µl, 1,05 mmol. Verwendete Aminosäuren: Fmoc-L-Asp(OBzl)-OH: 312 mg, 0,7 mmol; Fmoc-L-Thr-OH: 238,5 mg, 0,7 mmol; Alloc-L-Phe-OH: 174,5 mg, 0,7 mmol. Die Eliminierung wurde nach der allgemeinen Methode 12 (EDC: 3,3 g, 17,5 mmol; Cu(I)Cl: 1 g, 10,5 mmol) und die Alloc-Abspaltung nach der allgemeinen Methode 13 (Morpholin: 366 µl, 4,2 mmol; Pd(PPh 3 ) 4 : 50,5 mg, 0,044 mmol) durchgeführt. Anschließend wurde die SPPS nach der allgemeinen Methode 10 mit folgenden Aminosäuren fortgesetzt: Fmoc-L-Arg(Z) 2 -OH: 465 mg, 0,7 mmol; Boc-L- Lysin(Z)-OH: 266 mg, 0,7 mmol. Das Peptid 44 wurde durch Abspaltung vom Harz nach der allgemeinen Methode 15 erhalten. Es wurden 15 mg erhalten.

118 Experimenteller Teil Synthese lineare Derivate 4 und Harzbeladung Die Harzbeladung erfolgte nach der allgemeinen Methode 7. Es wurden ein 2- Chlorotritylchlorid-Harz (max. Beladung 1,6 mmol/g, 150 mg, 0,24 mmol), 1,2 eq. trockenes Fmoc-L-Thr(tBu)-OH (115 mg, 0,29 mmol) und 4,8 eq. DIPEA (195 µl, 1,15 mmol) eingesetzt. Nach 2 h Inkubation wurde das Harz gewaschen, gecapped und die Beladung bestimmt. Es wurde eine Beladung von 0,68 mmol/g (43 % Beladungsausbeute) erhalten Kupplung von Fmoc-β-L-threo-HyAsp(OBzl,TBDMS)-OH (15) zu 46 Das Produkt 16 (0,105 mmol) wurde gemäß der allgemeinen Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-β-L-threo-HyAsp(OBzl,TBDMS)-OH (15) erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-β-L-threo-HyAsp(OBzl,TBDMS)-OH: 241,6 mg, 0,42 mmol; HBTU: 159 mg, 0,42 mmol; HOBt: 56 mg, 0,42 mmol; DIPEA: 107 µl, 0,63 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Kupplung Fmoc-L-Thr-OH zu 47

119 Experimenteller Teil 119 Das Produkt 46 wurde gemäß der allgemeinen Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Thr-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-L-Thr-OH: 241,6 mg, 0,42 mmol; HBTU: 159 mg, 0,42 mmol; HOBt: 56 mg, 0,42 mmol; DIPEA: 107 µl, 0,63 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Kupplung Alloc-L-Phe-OH zu 48 Das Produkt 47 wurde gemäß der allgemeinen Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Alloc-L-Phe-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Alloc-L-Phe-OH: 104 mg, 0,42 mmol; HBTU: 159 mg, 0,42 mmol; HOBt: 56 mg, 0,42 mmol; DIPEA: 107 µl, 0,63 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Eliminierung zu 49 Die Eliminierung des Threonin-Bausteines zu der Z-Dhb-Gruppierung erfolgte gemäß allgemeiner Methode 12. Hierzu wurden 100 eq. EDC (2 g, 10,5 mmol) und 60 eq. Cu(I)Cl (623 mg, 6,3 mmol) eingesetzt und die Reaktion 4 Tage bei RT geschüttelt. Nach mehrmaligem intensivem Waschen mit DCM und DMF wurde die vollständige Umsetzung zu Produkt 49 mittels Testabspaltung belegt.

120 Experimenteller Teil Alloc-Abspaltung zu 50 Die Alloc-Abspaltung wurde nach der allgemeinen Methode 13 mit 24 eq. Morpholin (217 µl, 2,52 mmol) und 0,25 eq. Pd(PPh 3 ) 4 (30 mg, 0,026 mmol) unter Schutzgas (Argon) durchgeführt. Nach 1 h war die Abspaltung vollständig verlaufen. Die Testabspaltung ergab einen vollständigen Umsatz zu Produkt Kupplung Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH zu 51 Die Kupplung von Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH: 272,5 mg, 0,42 mmol; HBTU: 159 mg, 0,42 mmol; HOBt: 56 mg, 0,42 mmol; DIPEA: 107 µl, 0,63 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Kupplung Fmoc-L-Dab(Boc)-OH zu 52 Das Produkt 51 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Dab(Boc)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-L- Dab(Boc)-OH: 185 mg, 0,42 mmol; HBTU: 159 mg, 0,42 mmol; HOBt: 56 mg,

121 Experimenteller Teil 121 0,42 mmol; DIPEA: 107 µl, 0,63 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Kupplung Fmoc-D-Dab(Boc)-OH zu 53 Das Produkt 52 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-D-Dab(Boc)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-D- Dab(Boc)-OH: 185 mg, 0,42 mmol; HBTU: 159 mg, 0,42 mmol; HOBt: 56 mg, 0,42 mmol; DIPEA: 107 µl, 0,63 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Kupplung Fmoc-D-Ser(tBu)-OH zu 54 Das Produkt 53 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-D-Ser(tBu)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-D-Ser(tBu)- OH: 161 mg, 0,42 mmol; HBTU: 159 mg, 0,42 mmol; HOBt: 56 mg, 0,42 mmol; DIPEA: 107 µl, 0,63 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu 54.

122 Experimenteller Teil Kupplung Fmoc-L-Ser-OH zu 55 Das Produkt 54 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Ser-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-L-Ser-OH: 137,5 mg, 0,42 mmol; HBTU: 159 mg, 0,42 mmol; HOBt: 56 mg, 0,42 mmol; DIPEA: 107 µl, 0,63 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Kupplung 3-(TBDMS)-Dodecansäure (7) zu 56 Das Produkt 55 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung der 3-(TBDMS)-Dodecansäure erfolgte nach der allgemeinen Methode 10 mit jeweils 2 eq. der Aminosäure und der Kupplungsreagenzien und 3 eq. DIPEA: 3-(TBDMS)- Dodecansäure: 69,3 mg, 0,21 mmol; HBTU: 80 mg, 0,21 mmol; HOBt: 28 mg, 0,21 mmol; DIPEA: 54 µl, 0,31 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu 56.

123 Experimenteller Teil Abspaltung vom Harz zu 57 Die Abspaltung des linearen Peptids 57 vom Harz erfolgte nach der allgemeinen Methode 14 mit einemacoh/dcm/tfe-gemisch (1:8:1, 5 ml). Nach 1,5 h wurde die Abspaltlösung gesammelt und unter Vakuum nach Zugabe von Cyclohexan bis zur vollständigen Trocknung coevaporiert. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Abspaltung der säurelabilen SG zu 60 Die vollständige Abspaltung der säurelabilen Schutzgruppen erfolgte durch Inkubation des Produktes 57 in einer TFA/H 2 O/TIS-Lösung (95:2,5:2,5, 5 ml). Nach 2 h wurde das Peptid wurde in eiskaltem Et 2 O (50 ml) gefällt und 20 min bei 3600 rpm zentrifugiert. Der Feststoff wurde 2 Mal mit Et 2 O gewaschen und getrocknet. Es wurden 48 mg des Rohprodukts 60 erhalten. LC/MS: [M+H + ] 1299,69, t R = 5,91 min Abspaltung der Bzl-SG zu den linearen Derivaten 4 und 5 Die Bzl-Schutzgruppe am β-hyasp wurde gemäß allgemeiner Methode 16 abgespalten. Hierzu wurden 24 mg vom Rohprodukt 60 in MeOH (50 ml) mit 10 % AcOH gelöst und 10%-ige Pd/C (1,2 mg, 5%) unter Rühren zugegeben. Die Reaktion

124 Experimenteller Teil 124 wurde 1,5 h unter Zustrom von Wasserstoff gerührt und anschließend über Celite filtriert. Das Lösemittel wurde bei 40 C nach Zugabe von Cyclohexan coevaporiert. Die resultierenden Rohprodukte wurden mittels HPLC (Gradient: 0 min/5% 5 min/10% 22 min/30% 40 min/55% 50 min/100%) getrennt. Es wurden 840 µg (1,3 %) des Produkts 4 und 1,42 mg (2,23 %) von Produkt 5 erhalten. Produkt 4: LC/MS: [M+H + ] 1209,51, t R = 5,19 min, 1 H NMR (700 MHz, D 2 O): δ/ppm = (m, 5 H), 6.65 (d, 1 H, J = 8 Hz), 5.03 (d, 1 H, J = 4 Hz), 4.94 (d, 1 H, J = 4 Hz), (m, 1 H), (m, 1 H), (m, 1 H), (br, 5 H), (m, 1H), (m, 4 H), (m, 4H), (m, 4 H), (m, 2 H), (m, 4 H), (m, 2 H), (m, 4 H), (m, 3 H), (m, 14 H), (m, 3H), 0.86 (t, 3 H).

125 Experimenteller Teil 125 Produkt 5: LC/MS: [M+H + ] 1211,46, t R = 5,03 min, 1 H NMR (400 MHz, D 2 O): δ/ppm = (m, 5 H), 5.02 (d, 1 H, J = 8 Hz), 4.92 (d, 1 H, J = 4 Hz), (m, 1 H), (br, 5 H), (m, 1 H), (m, 2 H), 4, (m, 1H), (m, 2H), (m, 2 H), (m, 8 H), (m, 1 H), (m, 1 H), (m, 4 H), 1, (m, 4 H), (m, 4 H), (m, 14 H), 0.92 (t, 3 H), 0.84 (t, 3 H), 0.69 (t, 3H).

126 Experimenteller Teil Ligation 12.1 Salicylaldehyd-Dimethylacetal 61 Salicylaldehyd (2 ml, 19 mmol) und 0,03 eq. LiBF 4 (53,43 mg, 0,57 mmol,) wurden in trockenem MeOH (10 ml) unter Rühren und unter Schutzgas gelöst. 1,3 eq. TMOF (2,7 ml, 24,7 mmol) wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch 30 min unter Rückfluss erhitzt. Anschließend wurde die Reaktion mit einer gesättigten NaHCO 3 - Lösung gequenched und das Gemisch 3 Mal mit EtOAc (50 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit einer ges. NaCl-Lösung (30 ml) gewaschen und über MgSO 4 getrocknet. Das Lösemittel wurde abrotiert und das Produkt am Hochvakuum getrocknet. Es wurden 2,7 g (16 mmol, 85%) von 61 erhalten. 1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ/ppm = 8.03 (s, 1H), (m, 2H), (m, 2H), 5.54 (s, 1H) 3.37 (s, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ): δ/ppm = , , , , , , , Harzbeladung zu 62 Die Harzbeladung erfolgte nach der allgemeinen Methode 7. Es wurden ein 2- Chlorotritylchlorid-Harzes (max. Beladung 1,33 mmol/g, 1 g), 1,2 eq. trockenes Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH (657 mg, 1,6 mmol) und 4,8 eq. DIPEA (1 ml, 6,4 mmol) eingesetzt. Nach 2 h Inkubation wurde das Harz gewaschen, gecapped und die Beladung bestimmt. Es wurde eine Beladung von 0,67 mmol/g (50 % Beladungsausbeute) erhalten.

127 Experimenteller Teil Kupplung Fmoc-L-Thr-OH zu 63 Es wurden 0,2 mmol von Produkt 62 (300 mg) gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Thr-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-L-Thr-OH: 273,12 mg, 0,8 mmol; HBTU: 308 mg, 0,8 mmol; HOBt: 108,1 mg, 0,8 mmol; DIPEA: 204 µl, 1,2 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Kupplung Alloc-L-Phe zu 64 Das Produkt 63 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Alloc-L-Phe-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Alloc-L-Phe-OH: 99,64 mg, 0,4 mmol; HBTU: 151,7 mg, 0,4 mmol; HOBt: 54 mg, 0,4 mmol; DIPEA: 102 µl, 0,6 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den vollständigen Umsatz zu Eliminierung zu 65 Die Eliminierung des Threonin-bausteines zu der Z-Dhb-Gruppierung erfolgte gemäß allgemeiner Methode 12. Hierzu wurden 100 eq. EDC (3.8 g, 20 mmol) und 60 eq. Cu(I)Cl (1,18 g, 12 mmol) eingesetzt und die Reaktion 4 Tage bei RT geschüttelt. Nach mehrmaligem intensivem Waschen mit DCM und DMF wurde die vollständige Umsetzung zu Produkt 65 mittels Testabspaltung belegt.

128 Experimenteller Teil Alloc-Abspaltung zu 66 Die Alloc-Abspaltung wurde nach der allgemeinen Methode 13 mit 24 eq. Morpholin (414 µl, 4,8 mmol) und 0,25 eq. Pd(PPh 3 ) 4 (58 mg, 0,05 mmol) unter Schutzgas (Argon) durchgeführt. Nach 1 h war die Abspaltung vollständig verlaufen. Die Testabspaltung ergab einen vollständigen Umsatz zu Produkt Kupplung Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH zu 67 Die Kupplung von Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH erfolgte nach allgemeiner Methode 10: Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH: 519 mg, 0,8 mmol; HBTU: 303 mg, 0,8 mmol; HOBt: 108 mg, 0,8 mmol; DIPEA: 204 µl, 1,6 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Kupplung Fmoc-L-Dab(Boc)-OH zu 68 Das Produkt 67 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Dab(Boc)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10 mit jeweils 4 eq. der Aminosäure und der Kupplungsreagenzien und 6 eq. DIPEA: Fmoc-L-Dab(Boc)-

129 Experimenteller Teil 129 OH: 352,4 mg, 0,8 mmol; HBTU: 303 mg, 0,8 mmol; HOBt: 108 mg, 0,8 mmol; DIPEA: 204 µl, 1,6 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Kupplung Fmoc-D-Dab(Boc)-OH zu 69 Das Produkt 68 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-D-Dab(Boc)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-D- Dab(Boc)-OH: 352,4 mg, 0,8 mmol; HBTU: 303 mg, 0,8 mmol; HOBt: 108 mg, 0,8 mmol; DIPEA: 204 µl, 1,6 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Kupplung Fmoc-D-Ser(tBu)-OH zu 70 Das Produkt 69 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-D-Ser(tBu)-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-D-Ser(tBu)- OH: 306,75 mg, 0,8 mmol; HBTU: 303 mg, 0,8 mmol; HOBt: 108 mg, 0,8 mmol; DIPEA: 204 µl, 1,6 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu 70.

130 Experimenteller Teil Kupplung Fmoc-L-Ser-OH zu 71 Das Produkt 70 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung von Fmoc-L-Ser-OH erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Fmoc-L-Ser(tBu)-OH: 306,75 mg, 0,8 mmol; HBTU: 303 mg, 0,8 mmol; HOBt: 108 mg, 0,8 mmol; DIPEA: 204 µl, 1,6 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Veresterung am Harz zu 72 Für die Veresterung am Harz wurden 5 eq. Boc-L-Thr(tBu) (275,34 mg, 10 mmol), 5 eq. DIC (126 mg, 10 mmol) und 0,5 eq. (12,2 mg, 0,1 mmol) DMAP in einem DMF/DCM-Gemisch (2:1, 5 ml) gelöst direkt zum Harz gegeben. Nach 30 min wurde das Harz 3 x mit DMF, 2 x mit DCM und 2 x mit DMF gewaschen. Der Kupplungsschritt wurde 2 x wiederholt. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu 72.

131 Experimenteller Teil Kupplung Dodecansäure zu 73 Das Produkt 72 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung der Dodecansäure erfolgte nach der allgemeinen Methode 10: Dodecansäure: 160,25 mg, 0,8 mmol; HBTU: 303 mg, 0,8 mmol; HOBt: 108 mg, 0,8 mmol; DIPEA: 204 µl, 1,6 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Abspaltung vom Harz mit SG zu 74 Es wurden 65 mg (0,033 mmol) von Produkt 73 eingesetzt. Die Abspaltung des linearen Peptids vom Harz erfolgte nach der allgemeinen Methode 14 mit einem AcOH/DCM/TFE-Gemisch (1:8:1, 5 ml). Nach 1,5 h wurde die Abspaltlösung gesammelt und unter Vakuum nach Zugabe von Cyclohexan bis zur vollständigen Trocknung coevaporiert. Es wurden 12 mg (0,006 mmol) des Rohprodukts 74 mit Schutzgruppen erhalten.

132 Experimenteller Teil Kupplung Salicylaldehyd-Dimethylacetal zu 75 Es wurden 1,2 eq. Salicylaldehyd-Dimethylacetal (1,21 mg, 0,0072 mmol), 1,2 eq. PyBOP (3,75 mg, 0,0072 mmol) und 3 eq. DIPEA (3 µl, 0,018 mmol) in trockenem DCM (5 ml) gelöst und zum Rohprodukt 74 gegeben. Nach 2 h Rühren bei RT wurde das Lösemittel abrotiert und das Rohprodukt unter Hochvakuum getrocknet. Eine Testabspaltung belegte die Umsetzung zu Produkt Schutzgruppenabspaltung zu 76 Das Rohprodukt 75 wurde mit einer 95%igen TFA/H 2 O-Lösung (2 ml) versetzt und das Gemisch 1 h langsam bei RT geschüttelt. Die Abspaltlösung wurde aufgefangen und unter Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt wurde anschließend mittels HPLC gereinigt. Es konnten 2,9 mg (7 %) des linearen Peptids 76 erhalten werden.lc/ms: [M+Na + ] 1303,34, t R = 4,99 min.

133 Experimenteller Teil Zyklisierung via Peptidkupplung Für eine erneute Synthese des linearen Peptids 71 wurden 140 mg (0,07 mmol) Harz verwendet Kupplung Dodecansäure zu 78 Das Produkt 71 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Kupplung der Dodecansäure erfolgte nach der allgemeinen Methode 10 mit jeweils 2 eq. der Fettsäure und der Kupplungsreagenzien und 3 eq. DIPEA: Dodecansäure: 28 mg, 0,14 mmol; HBTU: 53 mg, 0,14 mmol; HOBt: 19 mg, 0,14 mmol; DIPEA: 36 µl, 0,21 mmol. Die Kupplung war nach 2 h beendet. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu Veresterung am Harz zu 79 Es wurden 5 eq. Fmoc-L-Thr(tBu) (139,1 mg, 4,5 mmol), 5 eq. DIC (44,2 mg, 4,5 mmol) und 0,5 eq. DMAP (4,28 mg, 0,035 mmol) in einem DMF/DCM-Gemisch (2:1, 5 ml) gelöst und die Lösung direkt zum Harz gegeben. Nach 30 min wurde das Harz 3 x mit DMF, 2 x mit DCM und 2 x mit DMF gewaschen. Der Kupplungsschritt wurde 2 x wiederholt. Eine Testabspaltung belegte den Umsatz zu 79.

134 Experimenteller Teil Abspaltung vom Harz zu 80 Das Produkt 79 wurde gemäß allgemeiner Methode 9 entschützt. Die Abspaltung des linearen Peptids vom Harz erfolgte nach der allgemeinen Methode 14 mit einem AcOH/DCM/TFE-Gemisch (1:8:1, 5 ml). Nach 1,5 h wurde die Abspaltlösung gesammelt und unter Vakuum nach Zugabe von Cyclohexan bis zur vollständigen Trocknung coevaporiert. Das Rohprodukt 80 konnte mit einer Ausbeute von 2,5 mg erhalten werden. LC/MS: [M+H + ] 1797,02, t R = 10,54 min Zyklisierung zu 1 Produkt 80 (2,5 mg) wurde in DCM (c = 0,05 mm, 28 ml) unter Rühren bei RT gelöst. Es wurden 4 eq. DCC (0,56 mg, 0,005 mmol), 4 eq. HOBt (0,59 mg, 0,005 mmol) und 6 eq. DIPEA (0,56 µl, 0,008 mmol) zugegeben und das Reaktionsgemisch über Nacht bei RT gerührt. Das Lösemittel wurde evaporiert. Eine Testabspaltung der Schutzgruppen zeigte einen Umsatz zum Rohprodukt von Derivat 1. Der Rückstand wurde mit einem TFA/H 2 O/TIS-Gemisch (95:2,5:2,5, 2 ml) versetzt und 1 h bei RT inkubiert. Die Abspaltlösung wurde gesammelt und nach Zugabe von Toluol bis zur vollständigen Trocknung coevaporiert. LC/MS: [M+H + ] 1159,43, t R = 5,7 min.