*.* Checkliste Humangenetik Molekulargenetische Untersuchungen
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- Monika Brandt
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1 Sektorkomitee Medizinische Laboratorien ZLG *.* Checkliste Humangenetik Molekulargenetische Untersuchungen C. Aulehla-Scholz, C.R. Müller-Reible Anwendungsbereich 2 Personal 2 Räumlichkeiten 2 Geräte und Einrichtungen 4 Reagenzien 4 Untersuchungsverfahren Qualitätsmanagementsystem 7 Untersuchungsgut/Proben 9 Befunde 10 Zusammenarbeit mit Auftraggebern 11 Stand 02/03 1
2 Anwendungsbereich Diese Checkliste erstreckt sich auf die molekulargenetische Analytik konstitutioneller (erblicher) Veränderungen von Nukleinsäuren im Bereich der humangenetischen Diagnostik. Siehe auch: Checkliste für Medizinische Laboratorien Allgemeiner Teil Untersuchungsverfahren und Hilfsmittel Leitlinien zur molekulargenetischen Labordiagnostik. medgen 8 (1996) 3: Bl 4 Leitlinien zur molekulargenetischen Diagnostik nach CVS. medgen 9 (1997) 132 Sowie die Leitlinien zur speziellne Diagnostik einzelner Erkrankungen ( Personal Besitzt der verantwortliche Laborleiter die für die Interpretation der Ergebnisse erforderliche Fachkenntnis? Verfügt das technische Personal, das an den molekulargenetischen Untersuchungen beteiligt ist, über Ausbildung und Erfahrung in der Molekulargenetik? Gibt es ein entsprechendes Trainingsprogramm für neue Mitarbeiter? Gibt es ein fortlaufendes molekulargenetisches Schulungsprogramm? Ist die Anzahl der Mitarbeiter ausreichend? Räumlichkeiten Ist die Anzahl der zur Verfügung stehenden Räume bzw. Arbeitsbereiche den durchgeführten Untersuchungsverfahren angepaßt? 1 1 Die in der Molekulargenetik hauptsächlich angewandten Amplifikationstechniken erfordern eine räumliche Trennung der einzelnen Arbeitsschritte zur sicheren Vermeidung von analytischen Fehlern. Stand 02/03 2
3 Ist der Bereich der Probenvorbereitung vom Analysenbereich im Laboratorium räumlich getrennt? Wird das Untersuchungsgut getrennt von daraus gewonnenen Nukleinsäuren, Kontrollmaterialien und Reagenzien gelagert? Ist der Zugang zu den einzelnen Bereichen zur Vermeidung von Kontaminationen geregelt? Erlaubt die Laboreinrichtung eine effiziente Dekontamination der Arbeitsflächen? Existieren Vorkehrungen und Einrichtungen (z. B. geeignete UV-Bestrahlung der Arbeitsflächen), mit denen sich der Arbeitsbereich effektiv dekontaminieren lässt? Gibt es einen Reinigungsplan? Wird die Reinigung des molekulargenetischen Laborbereiches durch das Laborpersonal durchgeführt? Ist das Reinigungspersonal, auch externes, mit den Zugangsregelungen des Bereiches zur Kontaminationsvermeidung vertraut? Erfüllt das molekularbiologische Laboratorium alle Sicherheitsanforderungen, die in der Checkliste für Medizinische Laboratorien Allgemeiner Teil aufgeführt sind? Ist die Unterweisung des Laborpersonals im sicheren Umgang mit den Elektrophoresegeräten und in den Vorsichtsmassnahmen zum Schutz vor elektrischen Schlägen dokumentiert? Ist die Unterweisung des Laborpersonals im sicheren Umgang mit UV-Licht dokumentiert? Sind UV-absorbierende Brillen bzw. Gesichtsschilde vorhanden? Ist die Unterweisung des Laborpersonals im sicheren Umgang mit gefährlichen Substanzen (Acrylamid, Ethidiumbromid etc.) dokumentiert? Sind Ethidiumbromid- bzw. Acrylamidundurchlässige Einmalhandschuhe vorhanden? Stand 02/03 3
4 Geräte und Einrichtungen Sind Gerätschaften und Bekleidung in den einzelnen Arbeitsbereichen als diesen zugehörig gekennzeichnet, um Kontaminationsquellen zu identifizieren? Sind pro Arbeitsbereich getrennte Pipettensätze vorhanden? Sind Vorkehrungen zur Aerosolvermeidung getroffen (z. B. positive Displacement-Pipetten, aerosoldichte Einmal-Pipettenspitzen)? Wird die Leistung von Thermocyclern bei Inbetriebnahme sowie periodisch überprüft? Reagenzien Sind Reagenzien, wo nötig, adäquat aliquotiert? Untersuchungsverfahren Allgemeines Wird die Nukleinsäureextraktion und reinigung gemäss einer Standardvorschrift durchgeführt? Falls nicht, ist die Validierung der angewendeten Methode dokumentiert? Wird die Nukleinsäure so gelagert, dass ein Abbau nicht eintreten kann? Wird die Nukleinsäure ggf. quantitativ bestimmt? Wird die Qualität (Intaktheit) der hochmolekularen DNA mittels Gelelektrophorese oder einer vergleichbaren Methode bewertet, wenn dies erforderlich ist? Stand 02/03 4
5 Wird die Vollständigkeit von Restriktionsendonukleasen durch geeignete Methoden sichergestellt? Werden die Empfehlungen des Herstellers für die Restriktionsendonukleasen zu folgenden Punkten eingehalten: Lagertemperatur? Testtemperatur? Puffer? Werden in jeder Spur vergleichbare Mengen an DNA aufgetragen? Werden geeignete Molekulargewichtsmarker bei der Elektrophorese mitgeführt? Werden Farbmarker zur Bestimmung des Endpunktes der Gelelektrophorese mitgeführt? Wird jeder Gellauf mit Ethidiumbromid oder einer anderen geeigneten Färbelösung gefärbt und fotografisch dokumentiert? Ist bei den Hybridisierungsverfahren die Spezifität für jede Sonde durch geeignete Untersuchungen (z. B. bekannte positive Proben, Sequenzierung) überprüft und dokumentiert? Werden die folgenden Schritte korrekt durchgeführt und entsprechend kontrolliert: Prähybridisierung? Hybridisierung? Autoradiographie bzw. Farbentwicklung? Wird bei den Amplifikationsverfahren (PCR) durch Anwendung geeigneter physikalischer Massnahmen und Verfahrenskontrollen die Möglichkeit einer Kontamination oder Verschleppung (falsch positive Ergebnisse) so gering wie möglich gehalten? 2 Werden die Benutzungshinweise der Hersteller kommerziell erhältlicher Kits mit Angaben zur Herkunft, der Chargennummer, des Verfallsdatums und der Lagerbedingungen aufbewahrt? Werden die Primer sachgerecht gelagert? Stand 02/03 5
6 Sind die folgenden Bedingungen für jedes Primerpaar optimiert: Konzentration und Temperatur der Annealingund Extensionsphase? Enzymkonzentration? Primerkonzentration? Mg 2+ Konzentration? Sind die als optimal bestimmten Bedingungen schriftlich niedergelegt? Werden bei jeder Testdurchführung alle notwendigen Kontrollproben wenn vorhanden mitgeführt? 3 Werden in jedem Amplifikations-Testansatz negative Kontrollen, die keine Nukleinsäuren enthalten, mitgeführt? Wird die Anwesenheit amplifizierbarer Nukleinsäuren bei jedem Amplifikationstest bestätigt, bei dem das Fehlen einer nachweisbaren Bande ein positives Ergebnis bedeutet? 2 Streng getrennte Arbeitsbereiche, insbesondere für die Vorbereitung der Amplifikation und die Bearbeitung der Proben nach der Amplifikation, einschliesslich der Laborausrüstung und Laborhilfsmittel. Die Aerosolbildung ist so gering wie möglich zu halten. Die Zugabe der Untersuchungsprobe sollte nach Zugabe aller Reagenzien erfolgen. Innerhalb einer Untersuchungsreihe sollte die Abfolge der Vorbereitung und Auftrennung wie folgt sein: Untersuchungsproben, danach Positivkontrollen, danach Negativkontrollen. 3 Für die nachzuweisende Mutation positive (heterozygot oder homozygot) und negative Proben. Stand 02/03 6
7 Abstammungsgutachten Wird routinemässig eine ausreichende Identitätssicherung der zu untersuchenden Personen durchgeführt? Werden die Richtlinien in der jeweils gültigen Fassung beachtet? Werden heimliche Gutachten, d.h. ohne Wissen und Zustimmung einer der beteiligten Personen, nicht durchgeführt. Werden bei den eingesetzten analytischen Verfahren folgende Mindestbedingungen eingehalten: Untersuchung von mindestens 12 voneinander unabhängigen Loci auf 10 verschiedenen Chromosomen bzw. deren Amplifikationsprodukte? Untersuchung solcher Polymorphismen, deren paternale Mutationsraten hinreichend zuverlässig geschätzt und hinreichend klein sind? Untersuchung nur solcher Systeme mit bekannten chromosomalen Positionen und einer Häufigkeit genetischer Besonderheiten, insbesondere stummer Merkmale, von <0.5%? Ist die polymorphe Beschaffenheit des verwendeten DNA-Systems in der Literatur ausführlich beschrieben und dokumentiert? Werden die Analysen doppelt durchgeführt? Qualitätsmanagementsystem Sind die Laboraufzeichnungen in Bezug auf individuelle Untersuchungsreihen und Testbedingungen spezifisch im Hinblick auf Menge und Qualität der eingesetzten Nukleinsäuren, Untersuchungsmethode und bedingungen? Sind die Chargennummern der in einzelnen Untersuchungsgängen verwendeten Reagenzien (z.b. Enzyme, Primer und Gensonden etc.) in den Untersuchungsprotokollen enthalten? Stand 02/03 7
8 Werden misslungene Untersuchungen sowie die durchgeführten Korrekturmassnahmen dokumentiert? Gibt es Kriterien, um ungewöhnliche Untersuchungsergebnisse zu erkennen? Ist schriftlich festgelegt, wie in solchen Fällen weiter zu verfahren ist? Stehen Verfahren zur Verfügung, um abklärungsbedürftige Untersuchungsbefunde durch weitere Methoden zu überprüfen, wo immer dies sinnvoll oder möglich ist? Werden pathologische Befunde unabhängig wiederholt, wenn möglich mit einer anderen Methode? Werden alle pathologischen pränatalen Testergebnisse nach der Geburt oder Schwangerschaftsunterbrechung bestätigt, wenn dies möglich ist? Wird bei allen pränatalen Untersuchungen eine maternale Kontamination ausgeschlossen? Ist die Auflösung und Qualität von Gelfotografien, Autoradiogrammen und sonstigen Untersuchungsergebnissen (z. B. Streifentest) ausreichend (geringer Hintergrund, gut erkennbares Signal, Auflösung des Molekulargewichtsstandards), um das Untersuchungsergebnis nachvollziehen und bestätigen zu können? Werden bei Fragmentanalysen geeignete Längenstandards und bei den Abstammungsgutachten geeignete Allelleitern verwendet? Werden alle Gelfotografien, Autoradiogramme und sonstige Untersuchungsergebnisse ausreichend gekennzeichnet, und werden die Kennzeichnungen in den Ergebnisaufzeichnungen angegeben? Werden alle Dokumente mindestens 10 (?) Jahre, bei Abstammungsgutachten 30 Jahre aufbewahrt? Stand 02/03 8
9 Sind die Sequenziergele von geeigneter Qualität (z. B. Bandenschärfe und auflösung, keine Lauf- und Gelartefakte, Kettenabbrüche, Kompressionen etc.)? Sind die Sequenzen nach Auftrennung auf einem Kapillarsequenzer eindeutig (ausreichende Signalhöhe, klare Signale, keine Farbüberlagerungen)? Sind die Qualitätskriterien für die Signale von Sequenzierreaktionen schriftlich festgelegt? Werden Heterozygoten -Befunde durch Sequenzierung in die umgekehrte Richtung überprüft? Werden Autoradiographien, Elektrophoresegele, Sequenziergele und Sequenzen unabhängig von mindestens zwei qualifizierten Auswertern beurteilt? Gibt es ein Logbuch über ungewöhnliche, schwierige oder lehrreiche Fälle? Nimmt das Labor im Rahmen der Qualitätskontrolle regelmässig an externen Ringversuchen teil? Werden unterschiedliche oder abweichende Ergebnisse zwischen molekulargenetischen und klinisch-chemischen Befunden analysiert und dokumentiert und ggf. Korrekturmassnahmen ergriffen???? Untersuchungsgut/Proben Gibt es Verfahrensvorschriften für den Auftraggeber, damit Probenahme und Transport so erfolgen, daß die Stabilität der Zielsequenz sichergestellt ist? Gibt es schriftlich festgelegte Kriterien für die Zurückweisung von ungeeigneten Untersuchungsproben? Wird der Einsender umgehend informiert, wenn eine Probe ungeeignet ist? Ist eine Reserve-Zellkultur verfügbar, wenn DNA aus Choriongewebe oder Fruchtwasserzellen untersucht wird? Stand 02/03 9
10 Gibt es einen Zeitplan für die Aufbewahrung der Proben? Werden die Proben entsprechend lange aufbewahrt, um eine Wiederholung der Untersuchung zu ermöglichen? Ist die Probenidentifikation in allen Phasen der Analyse gewährleistet, einschliesslich: Probeneingang? Nukleinsäureextraktion? Nukleinsäurequantifizierung? Enzymatische Amplifikation? Spaltung mit Restriktionsenzymen? Elektrophorese? Fotografie? Transfer? Hybridisierung? Detektion? Sequenzierung? Aufbewahrung? Befunde Sind die Befunde so abgefasst, dass die Patientendaten vollständig und übersichtlich vermittelt werden? Enthält der Abschlussbericht eine geeignete Zusammenfassung der verwendeten Methoden, Sonden und Restriktionsendonukleasen, der untersuchten Mutationen, der objektiven Befunde sowie die klinische Bewertung der Ergebnisse in verständlicher Form? Wird im Befund auf mögliche populationspezifische Unterschiede der Mutationsverteilung, z. B. bei der Mukoviszidose, eingegangen? Wird das erhaltene Ergebnis im Hinblick darauf interpretiert? Stand 02/03 10
11 Wird im Befund auf die Grenzen der durchgeführten Untersuchung und ggf. auf die Möglichkeit weiter führender Untersuchungen hingewiesen? Werden in der Befundmitteilung ggf. Literaturangaben gemacht, die dem Empfänger eine geeignete Orientierung ermöglichen? Wird bei einem pathologischen Ergebnis in der Befundmitteilung auf die Konsequenzen für die nächsten Anverwandten eingegangen? Wird auf die Notwendigkeit einer genetischen Beratung verwiesen? Zusammenarbeit mit Auftraggebern Enthalten alle Anforderungen neben den üblichen Angaben (Name des Patienten, Geburtsdatum etc.) folgende zusätzliche Angaben: Begründung der angeforderten molekulargenetischen Untersuchung (Erkrankung in der Familie, Verdacht auf, Erkrankung beim Partner etc.)? Ggf. ethnische Daten? Ggf. beigefügter Stammbaum? Ggf. Ergebnisse von Voruntersuchungen? Ggf. Angabe der Schwangerschaftswoche Wird die Untersuchung von Kindern auf Überträgerschaft oder auf eine erst zu einem späteren Zeitpunkt manifeste Erkrankung abgelehnt? Enthalten die Anforderungen bei Abstammungsgutachten den Ort der Probenentnahme und die Identität der Person, die die Probe entnommen hat? Liegt von jeder zu untersuchenden Person ein unterzeichnetes Protokoll mit Angaben (Name, Geburtsdatum, ethnische Herkunft, Verwandtschaft etc.) vor? Wird der Auftraggeber über den voraussichtlichen Zeitraum der Untersuchung informiert? Stand 02/03 11
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