Bestimmung der Sekundärstruktur von Polylysin und ausgewählter Proteine durch Analyse der Amid I Bande.

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1 Bestimmung der Sekundärstruktur von Polylysin und ausgewählter Proteine durch Analyse der Amid I Bande. Seit ca ist bekannt, daß die Infrarotspektroskopie die Möglichkeit bietet Informationen über die Sekundärstruktur von Proteinen zu erhalten. Krimm (1) listet neun verschiedene infrarot aktive Schwingungen auf die vom Proteinrückgrat hervorgerufen werden. Es sind dies mit abnehmender Wellenzahl der Absorption die Amid A, B und die Amid I bis VII Banden. Die Mehrzahl der strukturellen Informationen jedoch können durch die Amid I Bande erhalten werden, die in erster Linie durch C=O Streckschwingung der Peptidbindung hervorgerufen wird (Fig.1). Diese C=O Gruppe des Peptidrückgrates eines Proteins ist in den verschiedenen Sekundärstukturelementen an C=O... N-H Wasserstoffbrücken unterschiedlicher Bindungsstärke beteiligt. Dies führt zu unterschiedlichen Bandenlagen der Amid I Bande für die verschiedenen Sekundärstrukturelemente wie z.b. Helix, Faltblatt, Turns oder ungeordnete Strukturen, wie sie innerhalb der strukturellen Organisation eines Proteins vorkommen. In theoretischen und experimentellen Studien (2, 3) ist gezeigt worden, dass an Hand dieser unterschiedlichen Bandenlagen der Amid I Bande spezifische Sekundärstrukturelemente durch IR Spektroskopie identifiziert werden können. Die Infrarot Spektroskopie bietet aber nicht nur die Möglichkeit Einsicht in die statische Proteinstruktur in nativer Umgebung zu erhalten. Von großem Interesse ist auch die Detektion von Änderungen der Sekundärstruktur, die durch Variation verschiedener äußerer Parametern wie z.b. ph, Temperatur, Druck oder Lösungsmittel hervorgerufen werden. In der IR Spektroskopie ist es üblich nicht die Frequenzen selbst, sondern die Wellenzahlen, die sich aus dem Kehrwert der Wellenlänge ergeben, in cm -1 anzugeben. Der Zahlenwert gibt also an, wie viele Wellen der Infrarotstrahlung auf einen Zentimeter kommen. Die Amid I Bande Die Amid I Bande die im Bereich 1600 cm -1 bis 1700 cm -1 auftaucht, kann als die wichtigste Informationsquelle über Sekundärstruktur in den Infrarot Spektren von Polypeptiden angesehen werden. Diese Bande wird durch eine gekoppelte Schwingung der Peptidgruppe hervorgerufen, die zu über 80% aus der Valenzschwingung der C=O Gruppe und zu einem kleineren Anteil aus der C-N Streck- und der N-H Deformationsschwingung besteht (Fig. 1). Im Folgenden erhalten Sie eine kurze Bandenzuordnung für die einzelnen

2 Sekundärstrukturelemnte, wobei darauf hingewiesen werden soll, dass es von diesen Angaben sehr viele Abweichungen gibt, die häufig die Interpretation der Spektren erschweren. O R C N H + R Fig.1: Schwingungen die zur Amid I Bande beitragen (+ = out of plane Schwingung) - Helix Das Amid I Frequenz für die helikale Konformation wird im allgemeinen zwischen 1650 und 1658 cm -1 (3) angegeben. Sehr niedrige Frequenzen für die Amid I Bande sind für Polylysin bei 1635 cm -1 und für Polyglutaminsäure bei 1640 cm -1 beschrieben worden (4). Diese für - Helices niedrigen Frequenzen werden durch die starken Wechselwirkungen zwischen den geladenen Seitenketten hervorgerufen. Modell einer rechtsgängigen -Helix (aus: Lubert Stryer. Biochemie, 1988)

3 - Faltblatt Die Bandenzuordnungen für - Faltblatt Strukturen sind nicht so einheitlich wie für helicale Komponenten. Die Absorptionen, die durch solche Ketten hervorgerufen werden umfassen in D 2 O den Bereich 1624 bis 1642 cm -1 und weisen meist eine hochfrequente Komponente bei ca auf. Intermolekulare Ketten wie sie bei der Aggregation von Proteinen durch ph oder Temperatureinfluß auftreten, zeigen zwei Komponenten bei ca cm -1 und bei 1682 cm -1 (5) Antiparalleles -Faltblatt (aus: Lubert Stryer. Biochemie, 1988) Ungeordnete Konformationen. Für ungeordnete Konformationen (Konformationen mit keiner gut definierten, sich wiederholenden Struktur) hat die Amid I Bande eine wesentlich größere Halbwertsbreite als für andere Strukturelemente. Die Bande liegt hier in D 2 O bei etwa 1645 cm -1 (3). Turn Konformationen Turns sind weit verbreitete Strukturen in Proteinen und können bis zu 30% der Gesamtstruktur ausmachen. Entsprechend der Vielfalt an existierenden Turns existieren auch unterschiedliche Angaben für die Bandenlagen. Eindeutig zugeordnet sind Banden bei 1666, 1672, 1680 und 1688 cm -1, wobei die Bande bei 1666 meist am intensivsten ist (3).

4 Struktur einer -Schleife (aus: Lubert Stryer. Biochemie, 1988) Tabellarische Zusammenstellung der Bandenlagen der Amid I Bande (6) Aufgabenstellung: Polylysin ist zur infrarotspektroskopischen Bestimmung von Sekundärstrukturelementen besonders gut geeignet, da hier durch Wahl geeigneter Parameter diese nahzu in Reinform erzeugt werden können Es sollen daher Polylysinlösungen von ca. 10 mg/ml in D 2 O hergestellt werden. Die Messungen werden in D 2 O durchgeführt, da H 2 O bei 1645 cm -1 eine intensive Bande aufweist, die mit der zu analysierenden Amid I Bande überlappen würde. Von den Lösungen sollen Infrarotspektren bei ph 8.0 und bei ph 11.2 aufgenommen werden. Bei ph 11.2 wird die Probe in 5 C Schritten aufgeheizt und bei der jeweiligen Temperatur ein Spektrum aufgenommen. Die Enstehung welcher Strukturelemente lässt sich an Hand der Amid I Bande beobachten? Es werden Lösungen von Lysozym, Myoglobin, Concanavalin A in D 2 O hergestellt (ca 10mg/ml in D 2 O). Davon sollen Infrarotspektren aufgenommen werden. Die Amid I Bande der Proteine, setzt sich nun aus den überlappenden Absorptionen aller im Protein vorhandenen

5 Sekundärstrukturelemente zusammen, sodaß breite, relativ konturlose Banden entstehen. Damit der Anteil der einzelnen Komponenten an diesen Bande aufgelöst werden kann, soll die zweite Ableitung davon gebildet werden (dies kann das Programm routinemäßig). An Hand der zweiten Ableitung soll qualitativ bestimmt werden welche Sekundärstrukturelementen in gemessenen Proteinen vorhanden sind. Die Ergebnisse sollen an Hand der in einer Proteindatenbank (PDB) (7) abgelegten Koordinaten aus einer Röntgenstrukturanalyse, verifiziert werden Die entsprechenden Visualisierungsprogramme ( rasmol, labviewer etc) sind am Institut vorhanden. Lit.. 1. S. Krimm and Bandekar, J. 1986, Adv. Prot. Chem. 38: S. Krimm, 1962, J. Mol. Biol., 4: D.M. Bylar, and Susi H., 1986, Biopolymers, 25: H. Susi, Timasheff, N. and Stevens. L., 1967, J. Biol. Chem., 242, A. A. Ismail, Mantsch, H. H.and Wong, P.T.T., 1992, Biochim. Biophys. Acta, 1121, E. Goormaghtigh et al., 1994, Subcell Biochem, 23,

6 Bestimmung des pk a des Metarhodopsin I / Metarhodopsin II Gleichgewichts. Rhodopsin stellt einen typischen Vertreter der Klasse der G-Protein gekoppelten Rezeptoren dar. Das Rhodopsin Molekül enthält 7 transmembrane α-helices. Das 11-cis-Retinal, der Chromophor im Rhodopsin, ist über eine kovalente Schiffbasenbindung zwischen der Aldehydgruppe des Retinals und der Aminosäure Lysin 296 etwa in der Mitte der siebten Helix im Molekül verankert (1). Fig. 1: Struktur des heptahelikalen Photorezeptors Rhodopsin (bovines Rhodopsin, aus Ref. 1) Lichtaktivierung des Rezeptors führt zuerst zu einer Isomerisierung des 11-cis-Retinal nach alltrans-retinal. Das Molekül antwortet auf diese Änderung der sterischen Verhältnisse mit einer Neuorientierung verschiedener Donor und Akzeptor Gruppen und Wasserstoffbrücken, was schließlich zu verschiedenen Protonentranslokationsreaktionen innerhalb dieser Gruppen führt (2). Dabei durchläuft der Rezeptor eine Reihe spektroskopisch unterscheidbarer Konformationen mit charakteristischen Absorptionsmaxima, die Metarhodopsin Intermediate genannt werden (Fig. 2) (3). Metarhodopsin I mit protonierter und Metarhodopsin II mit deprotonierter Schiffbase liegen dabei in einem temperatur und ph abhängigen Gleichgewicht vor, wobei Glu113 das Gegenion

7 zur Schiffbase darstellt. Hohe Temperaturen und niedriger ph begünstigen die Bildung von Meta II, wohingegen niedrige Temperaturen und hoher ph das Gleichgewicht nach Meta I verschieben. Die beiden Intermediate sind im UV Spektrum durch Ihre Absorptionsmaxima (Meta I 478nm und Meta II 380 nm) unterscheidbar. Der isosbestische Punkt für diesen Übergang liegt bei 417 nm (4). Fig. 2: Metazustände des Rhodopsins Aufgabenstellung: Proben von dunkeladaptiertem Rhodopsin soll auf 7 verschiedene ph Werte (5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0) eingestellt werden. Danach sollen die Proben bei zwei unterschiedlichen Temperaturen (5, 10 ) belichtet werden. Aus den Verhältnissen der Absorptionsmaxima bei 478 nm (Meta I) und 380 nm (Meta II) sollen die Anteile der jeweiligen Intermediate im Gleichgewicht für die angegebenen ph Werte und Temperaturen bestimmt werden. Dann soll eine graphische Auftragung der Verhälnisswerte der beiden Intermediate für jeden ph bei geg. Temperatur erfolgen. Daraus ergeben sich drei verschiedene Kurven die an die Henderson-Hasselbalch-Gleichung angepasst werden sollen. Aus den Kurvenanpassungen ergeben sich für die drei verschieden Temperaturen dann die entsprechenden pk a Werte. Die entsprechenden Programme für die Kurvenanpassung stehen zur Verfügung Für die Spektrenaufnahme kommt ein RSM UV Spektrometer der Firma Olis zum Einsatz. Die Einführung in die Technik und Funktionsweise des Gerätes erfolgt im Praktikum durch den Assistenten.

8 Lit. 1. K. Palczewski et al,. 2000, Science, 289, E.J.M. Helmreich and Hofmann, K.P., 1996, Biochem. Biophys. Acta,1286: R. Matthews, Hubbard R., Brown P. K. and G. Wald, 1963, J. Gen. Physiol., 47: O. P. Ernst and F. J. Bartl, 2002, ChemBioChem, 3,

9 Bestimmung des relativen Anteils von Enantiomeren des Pinen in einem Gemisch durch FT Schwingungzirkulardichroismus Seit langem ist bekannt, daß viele Moleküle chiral sind. Das bedeutet, daß sie in einer von zwei sog. Enatiomeren Formen oder Konfigurationen existieren, die nicht zur Deckung gebracht werden können und sich verhalten wie Bild und Spiegelbild. Um ein Beispiel zu nennen: Ihre rechte und linke Hand können nicht zur Deckung gebracht werden, aber jede kann im Prinzip durch spiegelbildliche Abbildung der anderen erzeugt werden. Im allgemeinen wird also ein Molekül, das in sich selbst kein Symmetrieelement enthält (Achse, Ebene), chiral sein. Typischer Weise wird das dann auftreten, wenn ein tetraedisches Zentrum, wie z.b. ein Kohlenstoffatom, vier verschiedene Liganden aufweist. Solche Punkte werden als assymetrisch oder chiral bezeichnet und ihre Stereochemie kann unzweideutig als R oder S auf der Basis des Cahn Ingold Prelogs gekennzeichnet werden. Eines der einfachsten chiralen Moleküle würde demnach Methan mit drei verschiedenen Substituenten sein (z.b. CHFBrCl), wobei das Zentrale C-Atom das chirale Zentrum repräsentiert. (Fig.1) Komplexere Moleküle wie etwa Zucker oder Steroide können n chirale Zentren aufweisen. Fig.1: Enatiomere des tri-substituierten Methan können mit rechts und links polarisiertem Licht untersucht werden Chemiker kennen seit mehr als einem Jahrhundert das Phänomen der Chiralität oder Händigkeit, da Enatiomere eines geg. Moleküls oft unterscheidbare Kristallformen im Feststoff bilden oder in Lösung die Ebene des polarisierten Lichtes in unterschiedliche Richtungen drehen. Die Symbole (+) oder (-) vor den Namen einer Verbindung geben an, ob ein Enatiomer die Ebene des polarisierten Lichts in oder gegen den Uhrzeigersinn dreht. Techniken, die es erlauben die absolute Konfiguration von Molekülen zu bestimmen, sind äußerst wichtig, besonders für Proben die schwer kristallisierbar und damit mit

10 Röntgentechniken schwer zu untersuchen sind. Es ist offensichtlich, daß die Absorption A R von rechts zirkular polarisiertem Licht durch ein rechtshändiges Molekül gleich der Absorption A L von Linkszirkular polarisierten Licht durch das dazugehörige linkshändige Enantiomer sein wird. Wird mit dem Licht jedoch ein Molekül ohne chirales Zentrum oder ein Racemat (gleiche Anteile von Enantiomeren in der Mischung) untersucht, dann wird natürlich A R - A L = 0. Solange aber ein Überschuss an einer der beiden Enantiomeren in der Mischung vorhanden ist wird die differentielle Absorption von rechts gegen links polarisiertem Licht ungleich Null sein. Die Größenordnung von ΔA = A R -A L hängt von der Wellenlänge ab und wird als Zirkulardichroismus bezeichnet. ΔA kann für eine geg. Konfiguration positiv oder negativ sein, aber wird für zwei Enatiomere immer gleich in der Größenordnung und umgekehrt im Vorzeichen sein. Messungen des Zirkulardichroismus als eine Funktion der Wellenlänge(CD) sind im UV und UV/Vis schon seit langer Zeit möglich. Im CD sind die Absorptionen aber ziemlich breit und besonders für Biomoleküle wegen der hohen Extinktinskoeffizienten und Lichtstreueffekte (besonders unangenehm im UV) limitiert. Die chirale Empfindlichkeit des CD kann aber mit der Fülle an spektralen Informationen in infraroten Bereich gekoppelt werden. Man spricht dann von Schwingungszirkulardichroismus (VCD). VCD hat den besonderen Vorteil, dass die meisten Moleküle spezifische Schwingungsmoden mit scharfen Absorptionsbanden haben. VCD kann also bei chiralen Molekülen dazu verwendet werden, die absolute Konfiguration von Molekülen zu bestimmen und dies mit der Spezifität der IR Spektroskopie. Experimentelles:

11 Fig.2 stellt ein Blockdiagramm des in diesem Versuch verwendeten VCD Moduls dar. Der FT modulierte IR Strahl verläßt das Spektrometer durch ein Gitter (Polarisator) wodurch der Strahl linear polarisiert wird. Es entsteht eine gleiches Gemisch aus rechts und links polarisiertem Licht. Ein photoakustischer Modulator (PEM) erzeugt nun abwechselnd rechts und links zirkular polarisiertes Licht. Typische PEM Modulationsfrequenzen betragen entweder 37 oder 50 khz. Das modulierte Licht durchläuft die Probe und trifft auf einen infrarot Detektor (MCT). Das Experiment erzeugt zwei Datensätze: Ein konventionelles IR Spektrum, wo die Absorption bei jeder Frequenz einer spezifischen Molekülschwingung entspricht. Das zweite Spektrum ist das ΔA = A R - A L Signal, welches für jede Molekülschwingung anzeigt, ob vorzugsweise rechts oder links polarisiertes Licht absorbiert wird. Natürlich stimmen die Frequenzen der VCD Banden mit denen der IR Banden überein, aber es gibt im allgemeinen keine Korrelation zwischen den VCD und den IR Intensitäten. Schwache Absorptionsbanden können starke VCD Signale haben und vice versa. Aufgabenstellung: Mit Hilfe des Assistenten muss das VCD zuerst neu geeicht werden. Dazu wird nach der im Handbuch angegebenen Prozedur verfahren Es sollen das Absorptionsspektrum und die VCD Spektren (ΔA) von (+)-α-pinen und (-)-α- Pinen aufgenommen werden. Die Enantiomeren sollen in 6 verschieden Mischungsverhältnissen hergestellt werden (reines (+)), 1(-):5(+), 1(-):4(+), 1(-):3(+),1(- ):2(+) und 1:1 (Racemat). Aus der ΔA einer Bande (z.b bei 1210 cm -1 ), kann dann eine Eichgerade erstellt werden. An Hand dieser Eichgerade sollen dann zwei unbekannte Mischungsverhältnisse der Enantiomeren, die vom Assistenten verteilt werden, bestimmt werden.