MASSENSPEKTROMETRIE. gestern - heute - morgen

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1 MASSENSPEKTROMETRIE gestern - heute - morgen Dr. Stefan Schürch Departement für Chemie und Biochemie Universität Bern MASSENSPEKTROMETRIE KLASSISCHES MASSENSPEKTROMETER MAGNET DETEKTOR IONENQUELLE 100% m/z

2 MASSENSPEKTROMETRIE: GESTERN - HEUTE - MORGEN 100 JAHRE MASSENSPEKTROMETRIE O ANWENDUNGEN IN DER BIOANALYTIK PROTEOMICS NH HO O N O O OH O NH O P O O N O OH O OH O NH O P O O N O OH O BRÜCKENMUSTER VON SPINNENTOXINEN OH O O P O O N NH O OH NH2 OH O N O P O O N O OH OLIGONUCLEOTID SEQUENZIERUNG OH SIR JOSEPH JOHN THOMSON ENTDECKUNG DES ELEKTRONS (1897) AT FIRST THERE WERE VERY FEW WHO BELIEVED IN THE EXISTENCE OF THESE BODIES SMALLER THAN ATOMS. I WAS EVEN TOLD LONG AFTERWARDS BY A DISTINGUISHED PHYSICIST WHO HAD BEEN PRESENT AT MY 1897 LECTURE AT THE ROYAL INSTITUTION THAT HE THOUGHT I HAD BEEN PULLING THEIR LEGS. J.J. Thomson, Recollections and Reflections, G. Bell and Sons, London NOBELPREIS FÜR PHYSIK 1908 SCHEMA VON THOMSON S KATHODENSTRAHL RÖHRE 2

3 THOMSON S PARABEL-SPEKTROGRAPH (1910) Ne20 Ne22 CO Hg DIE 20ER JAHRE - DAS JAHRZEHNT DER ISOTOPEN MASSENSPEKTROGRAPH VON F.W. ASTON (1919), SCIENCE MUSEUM LONDON 3

4 DIE 20ER JAHRE - DAS JAHRZEHNT DER ISOTOPEN ASTON S MASSENSPEKTROGRAPH VORLÄUFER SPÄTERER HOCHAUFLÖSENDER MASSENSPEKTROMETER F.W. ASTON IM CAVENDISH LABORATORY, CAMBRIDGE (1920) ISOTOPEN SEPARATION (F.W. ASTON 1920) 4

5 DIE 30ER JAHRE - IONENOPTIKEN UND THEORIEN ERNEST LAWRENCE ENTWICKELT DAS CYCLOTRON (UC BERKELEY, 1931) HAROLD UREY ENTDECKT DAS DEUTERIUM (1932) JOSEF MATTAUCH UND RICHARD HERZOG ENTWICKELN DAS DOPPELFOKUSSIERENDE (HOCHAUFLÖSENDE) MASSENSPEKTROMETER (WIEN 1934) DER KRIEG - PRÄPARATIVE MASSENSPEKTROMETRIE DAS CALUTRON IONEN- AUFFÄNGER ( Ni-FOLIEN ) U % U % IONENQUELLE 100 g UCl 4 MAGNETSPULEN VAKUUM- PUMPEN 7500 m 3 /s STROMVERBRAUCH PRO MAGNET 4500 kw ( V) 5

6 PRÄPARATIVE MASSENSPEKTROMETRIE - DAS CALUTRON PRÄPARATIVE MASSENSPEKTROMETRIE - DAS CALUTRON 6

7 PRÄPARATIVE MASSENSPEKTROMETRIE - DAS CALUTRON MAGNETSPULEN AUS REINEM SILBER VOR DER RÜCKGABE AN DAS US DEPARTMENT OF TREASURY (ca. 1948) A TREASURY OFFICIAL WAS APPROACHED ABOUT THE POSSIBILITY OF LOANING SILVER TO A WARTIME EMERGENCY PROJECT. WHEN THE OFFICIAL ASKED ABOUT THE AMOUNT OF SILVER REQUIRED, HE WAS TOLD THAT THE PROJECT WOULD REQUIRE ABOUT TONS OF THE METAL. HIS RESPONSE WAS SIR, WE MEASURE OUR SILVER IN OUNCES, NOT TONS. DIE 5OER JAHRE - KOMMERZIALISIERUNG CEC Model Sector Field Mass Spectrometer (1950) 7

8 DIE 5OER JAHRE - KOMMERZIALISIERUNG DIE 50ER JAHRE - HOCHAUFLÖSENDE MASSENSPEKTROMETRIE MOLECULES HAVING THE SAME MASS NUMBERS BUT DIFFERING IN WEIGHT BY AN AMOUNT DETERMINED ONLY BY THE DIFFERENCE IN BINDING ENERGIES OF THE NUCLEAR PARTICLES CAN BE CLEARLY RESOLVED... ALFRED O. NIER, SCIENCE 121, 1955,

9 ACCURATE MASS DETERMINATION (PEAK MATCHING) WINDOW [ppm] INTENSITY [V] 65 ppm = Da LOW REFERENCE UNKNOWN MASS HIGH REFERENCE ACCURATE MASS DETERMINATION (PEAK MATCHING) THEORETICAL MASS ELEMENTS FOR EVALUATION EXPERIMENTAL MASS DEVIATION FROM THEORETICAL MASS ELEMENTAL COMPOSITION ERROR OF ACCURATE MASS DETERMINATION ON MICROMASS AUTOSPEC: ± 2 ppm 9

10 DIE 50ER JAHRE - QUADRUPOLE UND IONENSPEICHER WOLFGANG PAUL BESCHREIBT DAS ELEKTRISCHE MASSENFILTER (QUADRUPOL ANALYSATOR) (W. Paul, H. Steinwedel, Z. Naturforsch. 8a, 1953, 448.) PRINZIP DES IONENSPEICHERS 1958 ERSTMALS BESCHRIEBEN (W. Paul) KOMMERZIALISIERUNG DER ION TRAP 1984 (George Stafford, Finnigan Corporation) DIE 60ER JAHRE - QUADRUPOL-MS, GC/MS KOPPLUNG, TANDEM MASSENSPEKTROMETRIE KLASSISCHES MASSENSPEKTROMETER MAGNET DETEKTOR ELEKTRONENSTOSS IONENQUELLE GASPHASEN-VERHALTEN ORGANISCHER VERBINDUNGEN MS 1 Vorläufer CID MS 2 Produkte TANDEM-MASSENSPEKTROMETRIE (McLafferty, Jennings 1967) ERSTES KOMMERZIELLES GC-QUADRUPOL-MS (FINNIGAN 1968) 10

11 DIE 70ER JAHRE - KLASSISCHE ORGANISCHE MASSENSPEKTROMETRIE STRUKTURAUFKLÄRUNG ORGANISCHER VERBINDUNGEN 100% EI-MS & EI-MS/MS m/z GC/MS ZUR NATURSTOFF-ANALYSE DIE 70ER JAHRE - EXTRATERRESTRISCHE MASSENSPEKTROMETRIE : SECHS MISSIONEN ZUM MOND MIT GC/MS KEINE BEWEISE FÜR LEBEN MINIATURISIERTE MASSENSPEKTROMETER AN BORD VON SATELLITEN ZUR UNTERSUCHUNG DER ÄUSSEREN ERDATMOSPHÄRE (SEIT 1961) PIONEER 13 MISSION ZUR VENUS MIT GC/MS (NASA 1979) VIKING MISSION ZUM MARS: VIKING LANDER MIT GC/MS ZUR UNTERSUCHUNG DER MARS-ATMOSPHÄRE (NASA 1975) 11

12 DIE 80ER JAHRE - GRUNDSTEINE HEUTIGER BIOANALYTIK SANFTE IONISIERUNGSMETHODEN FAST ATOM BOMBARDMENT (BARBER 1981) MALDI (TANAKA 1988, KARAS & HILLENKAMP 1988) ELECTROSPRAY (DOLE 1984, FENN 1988) Lysozym aus Hühnereiweiss Da Koichi Tanaka Rapid Commun. Mass Spectrom. 2, 1988,

13 M. Karas and F. Hillenkamp, Anal. Chem. 60, 1988, Serum Albumin aus Rinderblut Da M. Karas und F. Hillenkamp MATRIX-ASSISTED LASER DESORPTION/IONIZATION (MALDI) Intaktes, protoniertes Biomolekül 2,5-Dihydroxy-benzoesäure und Cytochrom c [MH] Energiereicher Primärstrahl UV-LASER 337 nm, 3 ns - Desorbierte Partikel Ionen, Neutralteilchen, Elektronen Kollisionskette µj MATRIX-MOLEKÜLE µj 13

14 MALDI-TIME-OF-FLIGHT MASSENSPEKTROMETRIE LASER = START DSO PROBE DETEKTOR = ZIEL MALDI-TIME-OF-FLIGHT MASSENSPEKTROMETRIE SERUM ALBUMIN AUS RINDERBLUT SANFTE IONISIERUNG, INTAKTE MOLEKÜLIONEN EINFACH GELADENE IONEN [MH] / [M-H] - EINFACHE SPEKTREN: EIN PEAK PRO KOMPONENTE GEMISCHANALYSE IST MÖGLICH POLYETHYLEN GLYKOL

15 ELECTROSPRAY IONISIERUNG Protonen auf Tropfen- Oberfläche Verdampfen des Lösungsmittels Rayleigh-Grenze Coulomb-Explosion Desorption mehrfach geladener Ionen infolge des selbst erzeugten elektrischen Feldes ATMOSPHÄRENDRUCK MASSENANALYSATOR SPRAY DETEKTOR 5000 V 10-2 mbar 10-5 mbar TROCKNUNGSGAS ELECTROSPRAY IONISIERUNG SANFTE IONISIERUNG MEHRFACH GELADENE IONEN IONISIERUNG DIREKT AUS LÖSUNG LC/MS KOPPLUNG (GEMISCHTRENNUNG, REINIGUNG) FLUSSRATEN µl/min PROBENVOLUMEN > 2 µl KONZENTRATION > 100 fmol/µl 15

16 ELECTROSPRAY IONISIERUNG Ionen mit erhöhten Ladungszuständen [M nh] n John Fenn Horse Heart Myoglobin, 1 pmol/µl MASSENSPEKTROMETRIE HEUTE ORGANISCHE MS NIEDERMOLEKULARE ORGANIKA STRUKTURAUFKLÄRUNG, IDENTIFIZIERUNG, QUANTIFIZIERUNG SYNTHESE, NATURSTOFFCHEMIE, UMWELTANALYTIK, FOOD, TOXIKOLOGIE, KRIMINALISTIK, ARCHÄOLOGIE EI-MS, FAB, ESI-MS GC/MS, LC/MS, MS/MS MS IN DER BIOANALYTIK BIOMOLEKÜLE GROSSER MASSER LABILE VERBINDUNGEN MASSENBESTIMMUNG, SEQUENZEN, MODIFIKATIONEN, IDENTIFIZERUNGEN BIO-ORGANISCHE CHEMIE, BIOCHEMIE, BIOLOGIE, MEDIZIN ESI-MS, MALDI-MS LC/MS, MS/MS ANORGANISCHE MS METALLIONEN (ICP-MS) FESTKÖRPER-OBERFLÄCHEN (SIMS) GASANALYTIK (EI-MS & GC/MS) 16

17 DIE 90ER JAHRE - AUTOMATISIERUNG, HIGH-TROUGHPUT UND PROTEOMICS GENOMICS: PROTEOMICS: PROTEOM: DNA SEQUENZ-ANALYSE STATISCHE INFORMATION NUR CODIERTE SEQUENZINFORMATION VIELE OPEN READING FRAMES UMFASSENDE PROTEIN ANALYSE ABBILD DER ZELLE ZU BESTIMMTEM ZEITPUNKT ERFASSEN DES EXPRESSIONSMUSTERS DYNAMIK, UP/DOWN REGULIERUNG ERFASSEN VON MODIFIKATIONEN (PTMs) MEHR ALS 1 PROTEIN PRO DNA-SEQUENZ PROTEIN-PROTEIN WECHSELWIRKUNGEN TOTALER PROTEINGEHALT EINER ZELLE (M. Wilkins, 1995) PROTEIN IDENTIFIZIERUNG MIT PEPTIDE MASS MAPPING TRENNUNG 2D-PAGE IN-GEL VERDAU z.b. TRYPSIN PEPTID- MISCHUNG ZELLE: PROTEINE PROTEIN-SPOTS EXTRAKTION MALDI-TOF-MS PROTEIN- DATENBANK MASSEN DER TRYPTISCHEN PEPTIDE SIND CHARAKTERISTISCH FÜR JEDES INDIVIDUELLE PROTEIN 'PEPTIDE MASS MAP' 17

18 PROTEIN IDENTIFIZIERUNG MIT MS/MS TRENNUNG 2D-PAGE IN-GEL VERDAU z.b. TRYPSIN PEPTID- MISCHUNG EXTRAKTION ZELLE: PROTEINE PROTEIN-SPOTS 1 PEPTID AUSWÄHLEN TSYPHG CID G H P Y T S ESI-MS/MS PROTEIN- DATENBANK PRODUKT-IONEN SPEKTRUM PARTIELLE AMINOSÄUREN-SEQUENZ TANDEM-MASSENSPEKTROMETRIE MIT DEM TRIPLE-QUAD IONEN-QUELLE 1. QUADRUPOL 2. QUADRUPOL 3. QUADRUPOL DETEKTOR Q 1 q GAS 2 Q 3 VORLÄUFER-IONEN SELEKTION KOLLISIONSZELLE PRODUKT-IONEN ANALYSE VORLÄUFER-ION m P CID COLLISION INDUCED DISSOCIATION NEUTRALTEILCHEN m n PRODUKT-ION m F KOLLISIONSAKTIVIERUNG UND FRAGMENTIERUNG DES VORLÄUFER-IONS 18

19 MODERNE TANDEM-MASSENSPEKTROMETER: QqTOF Ionenquelle (Electrospray) Gepulste Ionenbeschleuigung Detektor Trocknungsgas q 0 QUADRUPOL q 0 (Ionen Fokussierung) Q 1 QUADRUPOL MASSENFILTER (Vorläuferionen Selektion) q 2 KOLLISIONSZELLE (rf-only Quadrupol) TOF Produktionen Analyse Reflektor Applied Biosystems / Sciex QSTAR Pulsar Hybrid Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer Applied Biosystems / Sciex QSTAR Pulsar Hybrid Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer 19

20 ESI-MS EINES TRYPTISCHEN PEPTID-GEMISCHES m/z ISOLATION EINES VORLÄUFER-IONS (PEPTID) ISOTOPENPEAKS all-c x C13 m/z = 0.33 [M3H] x C13 1 x S34 DREIFACH GELADENES ION x C13 m/z MINIMALE KOLLISIONSENERGIE 20

21 PEPTID-SEQUENZIERUNG MIT TANDEM-MS y 3 y 2 y 1 x 3 z 3 x 2 z 2 x 1 z 1 H - NH - CH - CO - NH - CH - CO - NH - CH - CO - NH - CH - CO - OH R 1 R 2 R 3 R 4 a 1 c 1 a 2 c 2 a 3 c 3 b 1 b 2 b 3 AMINOSÄURE 1 AMINOSÄURE 2 AMINOSÄURE 3 AMINOSÄURE 4 (FAST) JEDE AMINOSÄURE HAT IHRE CHARAKTERISTISCHE MASSE PEPTID-SEQUENZIERUNG MIT TANDEM-MS Val - Ser - Thr - Pro - Thr - Leu/Ile - Val - Glu - Val - Ser - Lys y-ionen-serie Ser 87.0 Val 99.1 Glu Val 99.1 Leu/Ile Thr Pro 97.1 Thr Ser 87.0 Val VORLÄUFER-ION m/z (3) m/z 21

22 CUPIENNIUS SALEI 22

23 DAS GIFT VON CUPIENNIUS SALEI 8-12 µl TOXIN PRO SPINNE UND MONAT HOHER SALZGEHALT FREIE AMINOSÄUREN PEPTIDE CUPIENNINE 8 PEPTIDE ~35 AMINOSÄUREN KEINE DISULPHID-BRÜCKEN CSTX - PEPTIDE CUPIENNIUS SALEI TOXINE 13 PEPTIDE AMINOSÄUREN STARK VERKNOTETES BRÜCKENMUSTER CSTX-PEPTIDE: AMINOSÄUREN-SEQUENZEN (EDMAN) CSTX-1 CSTX-9 CSTX S C I P K H E E C T N D K H N C C R K G L F K D D K N C I P K H H E C T N D K K N C C K K G L T S D C T L R N H D C T D D R H S C C R S K M F CSTX-1 K L K C Q C S T F D D E S G Q P T E R C A C G R P CSTX-9 K M K C K C F T V A D A K G A T S E R C A C D S S CSTX-13 K D V C T C F Y P S Q A K K E L C T C Q Q P CSTX-1 CSTX-9 CSTX M G H Q A I E T G L N I F R G L F K G K K K N K K T K L L Q K F G F T G L H I I K G L F K H L K Y I E K G L Q K A K D Y A T 23

24 Thr Gly Phe Gly Phe Leu Asp Asp Lys His Ile Ile Lys Lys 6 Asn Cys Ile Pro Lys His Cys Cys Asn Lys Lys Lys Lys Gly Leu TRYPTISCHER ABBAU His Glu 13 Cys Thr Asn Asp Thr Lys Met Lys Cys Lys Cys Phe Thr Lys Gln Leu Leu 48 Ser Ser Asp Cys Ala???? 46 Cys Arg Glu Ser CSTX-9 Val Ala Asp Ala Thr Ala Lys Gly Gly Leu Phe ICK-BRÜCKENMUSTER CSTX-9: CYSTINE-HALTIGE FRAGMENTE AUS TRYPTISCHEM ABBAU 6 Asn -Cys-Ile-Pro-Lys 13 His His Glu Cys Thr Asn Asp Lys? Asn - Cys - Cys - Lys 30 Cys Lys Cys 13 -Cys 30? Cys - Ala - Cys - Asp - Ser - Ser - Leu - Leu - Gln - Lys? 32 Cys -Phe-Thr-Val-Ala-Asp-Ala-Lys 27 AMINOSÄUREN 3 DISULPHIDE-BRÜCKEN MASSE Da 24

25 NANO-ELECTROSPRAY IONENQUELLE FÜR GERINGSTEN PROBENVERBRAUCH PROBENVOLUMEN µl FLUSSRATE nl/min NADELÖFFNUNG 1 µm MECHANISMUS WIE ESI EFFIZIENTE IONISIERUNG NUR OFF-LINE BETRIEB! Nanospray Ionenquelle 25

26 MS/MS DES TRYPTISCHEN CSTX-9 FRAGMENTS Asn - Cys - Ile - Pro - Lys S S Asn -Cys -Cys-Lys S S Cys - Ala - Cys - Asp - Ser - Ser - Leu - Leu - Gln - Lys S S Cys - Phe - Thr -Val -Ala -Asp -Ala -Lys all y 1 Ions Lys Lys Lys Pro Ile Ala Asp Gln Leu Ala Val Leu Thr Ser Ser Precursor Ion [M5H] 5 m/z Asp CID (N 2 ) 30 ev m/z MS/MS DES TRYPTISCHEN CSTX-9 FRAGMENTS DISULPHID-DEFINIERENDE y m/z FRAGMENT IONEN y 3 m/z B y 3 m/z A 6 Asn -Cys-Ile-Pro-Lys S E S Asn -Cys -Cys-Lys S D C S Cys - Ala - Cys - Asp - Ser - Ser - Leu - Leu - Gln - Lys S A B S 32 Cys -Phe-Thr-Val-Ala-Asp-Ala-Lys y m/z b 4 m/z E Precursor [M5H] 5 26

27 INHIBITOR CYSTINE KNOT (ICK) STRUCTRUAL MOTIF VI II I Cys II Cys III Cys I V IV Cys VI Cys IV III Cys V GENERELLE DISULPHID-ANORDNUNG IM ICK-MOTIV Cys(I-IV) Cys(II-V) Cys(III-VI) DANK THE PROTEIN SEQUENCING PEOPLE PD DR. JOHANN SCHALLER URS KÄMPFER THE SPIDER PEOPLE DR. LUZIA KUHN-NENTWIG PROF. DR. WOLFGANG NENTWIG BENNO WULLSCHLEGER THE OLIGONUCLEOTIDE PEOPLE PROF. DR. CHRISTIAN LEUMANN DR. ELOY BERNAL-MENDEZ THE MASS SPEC PEOPLE JAN TROMP SELINA MONN KAROL KROCKA MARKUS STADLER 27