Multiple Antibiotikaresistenz durch MDR-Effluxpumpen bei Enterobacteriaceae

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1 Multiple Antibiotikaresistenz durch MDR-Effluxpumpen bei Enterobacteriaceae Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Anja Schumacher aus Starnberg 2006

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3 Dekan: Vorsitzender des Promotionsausschusses: Referent: Korreferent: Drittprüferin: Prof. Dr. A. Bechthold Prof. Dr. G. E. Schulz Prof. Dr. W. V. Kern Prof. Dr. A. Bechthold Prof. Dr. I. Merfort Tag der mündlichen Prüfung: 19. Juni 2006 Tag der Verkündung des Prüfungsergebnisses 06. Juli 2006

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5 Mein erster Dank gilt meinem Doktorvater Prof. Dr. Winfried Kern für die wissenschaftliche Betreuung der Arbeit. Insbesondere bin ich dankbar für die vielen wertvollen Ratschläge und die häufigen Diskussionen, die mir stets weitergeholfen haben. Herrn Professor Dr. A. Bechthold danke ich für die freundliche Aufnahme am Institut für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie und für die Bereitschaft, mich als externe Doktorandin zu begleiten. Der Landesstiftung Baden-Württemberg danke ich für die Finanzierung des Projektes. Besonders bedanken möchte ich mich bei: Dr. Dennis Mlangeni, Dr. Daniel Jonas, Dr. Heike von Baum und Dr. Murat Akova für die zur Verfügung gestellten klinischen Isolate Dr. Rainer Trittler für die Untersuchung der Linezolid-Proben und sein großes Interesse an meiner Arbeit Dr. Dirk Wagner und Dr. Jürgen Bohnert, Laura Dreiser, Matthias Osthoff, Stefanie Pannek, Petra Steinke und Jens Stolte für die gute Zusammenarbeit im Labor, sowie auch Ebru Cankaya und allen anderen Mitarbeitern der Abteilung Infektiologie für die freundschaftliche Atmosphäre, die auch durch gemeinsame Fahrten und Feiern geprägt wurde Sabine Schuster speziell für die Einführung in das Red/ET-System und die geduldige Hilfe bei der homologen Rekombination Mein herzlichster Dank geht an: Martina Vavra und Eva Fähnrich für zahlreiche, lustige aber auch konstruktive Diskussionen im Labor oder in der Kaffeepause und tausend hilfreiche Kleinigkeiten Die Mädels für die liebevolle Aufnahme und Unterstützung beim Zusammenschreiben und die gemeinsamen Koch-Abende Meine Eltern und Brüder für den liebevollen Halt, den sie mir geben Nicht zuletzt danke ich meinem Freund Uli für seine Unterstützung, seinen Optimismus, und soviel mehr

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7 Für meine Großmütter Was wir wissen ist ein Tropfen, was wir nicht wissen ein Ozean Isaac Newton

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9 Inhaltsverzeichnis i Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Antibiotika und Resistenz Resistenzmechanismen Effluxpumpen Effluxpumpensysteme mit RND-Transportern Aufbau und Funktion von RND-Pumpen Regulation von RND-Pumpen Hemmung von RND-Pumpen Enterobacteriaceae und Effluxpumpen Escherichia coli Citrobacter Spezies Enterobacter Spezies Klebsiella Spezies Serratia marcescens Problemstellung und Ziele dieser Arbeit Material und Methoden Bakterienstämme und Lösungen Laborstämme Klinische Isolate Nährmedien, Puffer und sonstige Lösungen Mikrobiologische Methoden Kultivierung und Lagerung Selektionierung Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration Standard-MHK-Platte MHK-Bestimmung von sonstigen Substanzen Einfluss von putativen Effluxpumpeninhibitoren und Polymyxin B- Nonapeptid Bestimmung der intrazellulären Konzentration verschiedener Substrate Uptake-Assay mit Antibiotika Farbstoff-Akkumulationsassays... 35

10 ii Inhaltsverzeichnis 2.3 Molekularbiologische Methoden Primer DNA-Isolierung Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Sequenz-Analyse Genexpressionsanalyse RNA-Isolierung cdna-synthese Aufbau und Funktionsweise des LightCycler -Systems Durchführung und Auswertung der Real-Time PCR Gen-Inaktivierung durch Red /ET -Rekombination Transformation Insertion Ergebnisse und Diskussion Laborstämme Selektionsmutanten Mutationen in den Zielstrukturen der Chinolone Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Antibiotika Zusammenfassung Selektionsmutanten Knockout-Mutanten und andere untersuchte Laborstämme Gen-Inaktivierung durch Red /ET -Rekombination bei C. freundii Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Antibiotika Wirkung von Effluxpumpeninhibitoren und permeabilisierenden Substanzen auf die Antibiotika-MHK MHK von Levofloxacin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Oxacillin und Linezolid mit PAN und NMP MHK von Rifapicin, Clarithromycin sowie Streptomycin mit PAN und NMP Veränderung der MHK-Werte durch Polymyxin B-Nonapeptid und Zusammenfassung Relative Expression von Pumpen- und Regulatorgenen Intrazelluläre Akkumulation von Antibiotika und Farbstoffen Uptake-Assays mit Antibiotika Levofloxacin Linezolid... 72

11 Inhaltsverzeichnis iii Farbstoff-Akkumulationsassays Ethidiumbromid-Assays Pyronin Y-Assays Zusammenfassung Klinische Isolate Effluxleistung Escherichia coli Einfluss von Effluxpumpeninhibitoren auf die MHK EPI-Wirkung auf Farbstoff-Akkumulation Zusammenhang von Effluxleistung und Levofloxacin-Empfindlichkeit Citrobacter freundii Einfluss von Effluxpumpeninhibitoren auf die MHK EPI-Wirkung auf Farbstoff-Akkumulation Zusammenhang von Effluxleistung und Levofloxacin-Empfindlichkeit Enterobacter aerogenes Einfluss von Effluxpumpeninhibitoren auf die MHK EPI-Wirkung auf Farbstoff-Akkumulation Zusammenhang von Effluxleistung und Levofloxacin-Empfindlichkeit Klebsiella pneumoniae Einfluss von Effluxpumpeninhibitoren auf die MHK EPI-Wirkung auf Farbstoff-Akkumulation Zusammenhang von Effluxleistung und Levofloxacin-Empfindlichkeit Serratia marcescens Einfluss von Effluxpumpeninhibitoren auf die MHK Zusammenhang von Effluxleistung und Levofloxacin-Empfindlichkeit Zusammenfassung klinische Isolate Beurteilung der Wirkung der Effluxpumpeninhibitoren Beurteilung von Effluxleistung und Antibiotikaempfindlichkeit Zusammenfassung Literatur

12 iv Abkürzungen Abkürzungen 1-CF 1-DC14 1-EA 1-KP 1-SM 2-CF 2-DC14 2-EA 2-KP 2-SM 3-AG100 3-AG100MK* ABC AcrA, AcrB, AcrR AG100 ATCC ATP bp Erstschrittmutante von CF8090 (C. freundii) Erstschrittmutante von E. coli acrab-knockout-mutante Erstschrittmutante von EA13048 (E. aerogenes) Erstschrittmutante von KP13883 (K. pneumoniae) Erstschrittmutante von SM14756 (S. marcescens) Zweischrittmutante von CF8090 (C. freundii) Zweischrittmutante von E. coli acrab-knockout-mutante Zweischrittmutante von EA13048 (E. aerogenes) Zweischrittmutante von KP13883 (K. pneumoniae) Zweischrittmutante von SM14756 (S. marcescens) Drittschrittmutante von AG100 (E. coli) Drittschrittmutante von E. coli mar-knockout-mutante ATP-binding-cassette (Name einer Transporterfamilie) Membranfusionsprotein, RND-Transporter, Regulator (E. coli) E. coli Laborstamm American Type Culture Collection Adenosintriphosphat Basenpaare CCCP Carbonylcyanid-m-chlorophenylhydrazon (Entkoppler des Protonengradienten) CF CF8090 Chlora/Cha Clari DHFS EA EA13048 EARSS EC Citrobacter freundii C. freundii ATCC Referenzstamm Chloramphenicol Clarithromycin Dihydrofolsäure Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes ATCC Referenzstamm European Antimicrobial Resistance Surveillance System Escherichia coli

13 Abkürzungen v EmrE EPI SMR-Transporter (E. coli) Effluxpumpeninhibitor ESBL extended spectrum beta-lactamase (β-lactamasen mit erweitertem Spektrum EtBr Ile IQR Kan kb KP KP13883 LB Leu Lev(o) Line LmrA MarRAB Ethidiumbromid Isoleucin Interquartilsabstand = Abstand zwischen 1. und 3. Quartil, enthält 50% der Werte Kanamycin Kilo-Basenpaare Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae ATCC Referenzstamm Nährmedium nach Luria-Bertani Leucin Levofloxacin Linezolid ABC-Transporter (Lactococcus lactis) Operon, auf dem sich u. a. Regulatoren von Genen befinden, die multiple Antibiotikaresistenz verursachen (E. coli) MATE multidrug and toxic compound extrusion (Name einer Transporterfamilie) MDR MexAB MFP MFS MHK MHK 50 micf MRSA n.b. NMP multi drug resistance = multiple Antibiotikaresistenz Membranfusions- bzw. RND-Protein (P. aeruginosa) Membranfusionsprotein (z. B. AcrA) major facilitator superfamily (Name einer Transporterfamilie) minimale Hemmkonzentration Konzentration einer Substanz, welche die Vermehrung von mindestens 50 % der gestesteten Stämme hemmt Antisense-RNA, beeinflusst Porin-Expression (E. coli) Methicillin-resistente Staphylococcus aureus nicht bestimmt Naphthyl-methyl-piperazin

14 vi Abkürzungen NorA NorM OD Ofl OMP OprM Oxa PABS PAN PBP MFS-Transporter (Staphylococcus aureus) MATE-Transporter (Vibrio parahaemolyticus) optische Dichte Ofloxacin outer membrane protein (äußeres Membranprotein, z. B. TolC) äußeres Membranprotein (P. aeruginosa) Oxacillin p-aminobenzoesäure Phenylalanin-arginyl-β-naphthylamid penicillin-bindende Proteine PBS phosphate buffered saline (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) PCR PEG PMBN PmrA QRDRs Rifa RND Rob rpm RT SARI Ser SM SM14756 SMR SoxS Stre(pto) polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) Paul-Ehrlich-Gesellschaft Polymyxin B-Nonapeptid MFS-Transporter (Streptococcus pneumoniae) quinolone resistance determining regions (Abschnitt in Gyrase und Topoisomerase IV, in dem Mutationen auftreten, die eine spezifische Resistenz gegen Chinolone bewirken) Rifampicin resistance-nodulation-division (Name einer Transporterfamilie) Regulatorprotein (E. coli) round per minute (Umdrehungen pro Minute) Reverse Transkriptase Surveillance der Antibiotika-Anwendung und der bakteriellen Resistenzen auf Intensivstationen Serin Serratia marcescens Serratia marcescens ATCC Referenzstamm small multidrug resistance (Name einer Transporterfamilie) Regulatorprotein (E. coli) Streptomycin

15 Abkürzungen vii T Tet(ra) THFS TMS TolC VRE WK Teile Tetracyclin Tetrahydrofolsäure transmembrane segment äußeres Membranprotein (E. coli) Vancomycin-resistente Enterokokken Wachstumskontrolle

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17 Einleitung 1 1 Einleitung Weltweit sind Infektionskrankheiten zusammen mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen die häufigste Todesursache (WHO, 1998). Vor diesem Hintergrund stellt die wachsende Zahl an multiresistenten Erregern, bei denen verfügbare Antibiotika nicht mehr wirken, eine besondere Bedrohung dar. Um neue Antiinfektiva zu entwickeln, sind umfassende Kenntnisse über Resistenzmechanismen und -entwicklung erforderlich (Putman et al., 2000). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Multiresistenz verschiedener Enterobacteriaceae durch Multi-Drug-Resistance (MDR)-Effluxpumpen untersucht. In den letzten Jahre wurde deutlich, dass die Aktivierung dieser Pumpen einen erheblichen Teil zur Resistenz der Bakterien beiträgt, und deren Hemmung folglich ein attraktiver Angriffspunkt für neue Pharmaka sein könnte (Li und Nikaido, 2004). In dieser Arbeit wurde zunächst die Effluxleistung von Referenzstämmen und multiresistenten Selektionsmutanten diverser Enterobacteriaceae mit verschiedenen Methoden untersucht. Die Befunde wurden mit der Expression von Pumpengenen korreliert und in ausgewählten Fällen durch Gen-Inaktivierungsstudien (Knockout-Mutanten) bestätigt. Darüber hinaus wurde geprüft, welche Pumpen hauptsächlich für Multiresistenz verantwortlich sind, und ob diese mit Effluxpumpeninhibitoren gehemmt werden können. Schließlich wurden ähnliche Untersuchungen an einer großen Anzahl klinischer Isolate durchgeführt und geprüft, inwiefern eine signifikante Effluxhemmung auch hier möglich ist. 1.1 Antibiotika und Resistenz Mit der Entwicklung von Salvarsan durch Paul Ehrlich und Sahachiro Hata im Jahr 1909 stand erstmals ein wirksames Medikament gegen eine bakterielle Infektionskrankheit, die Syphilis, zur Verfügung (Ehrlich, 1910). In den folgenden Jahren wurden das Antibiotikum Penicillin (1929), die Sulfonamide (1935) und Streptomycin (1943) entdeckt. Viele durch Bakterien verursachte, zuvor oft tödliche Krankheiten konnten nun erfolgreich behandelt werden, z. B. Diphtherie, Lepra, Tuberkulose, Scharlach und Cholera (Porter, 2003). Seitdem wurden weitere zahlreiche Arzneimittel gegen bakterielle Infektionen entdeckt und weiterentwickelt: Tetracycline (1949), Aminoglykoside (1950), Makrolide (1952), Glykopeptide (1958), Chinolone (1962), Oxazolidinone (2000) (Holzgrabe, 2006).

18 2 Einleitung Die Antiinfektiva wirken an unterschiedlichen Stellen, z. B. durch Hemmung der Zellwandsynthese, der Proteinsynthese, der Nukleinsäuresynthese oder des Folsäurestoffwechsels, wie in Abbildung 1 dargestellt. Viele dieser Zielstrukturen liegen intrazellulär. Zellwand Penicilline Cephalosporine Polymyxin B THFS DNA mrna Nukleinsäure- Synthese Chinolone Rifampicin Folsäure- Synthese Sulfonamide Trimethoprim PABS DHFS Ribosomen Protein- Synthese Aminoglykoside Makrolide Tetracycline Oxazolidinone Abbildung 1 Angriffsorte von verschiedenen Antiinfektiva (PABS = p-aminobenzoesäure, DHFS = Dihydrofolsäure, THFS = Tetrahydrofolsäure) (Neu, 1992) Die Erfolge bei der Bekämpfung von Infektionskrankheiten werden durch die zunehmende Resistenz der Erreger gefährdet. Ein bakterieller Infektionserreger gilt als resistent gegen ein Chemotherapeutikum oder Antibiotikum, wenn dessen Konzentration am Wirkort nicht ausreicht, um seine Vermehrung zu hemmen oder um ihn abzutöten (Kresken, 2003). Die Entwicklung einer Antibiotikaresistenz bei Bakterien wird durch mehrere Faktoren begünstigt. Da die Generationszeit von Bakterien im Vergleich zu anderen Organismen kurz ist (z. B. E. coli: 20 min bei 37 C, H. sapiens: Jahre), können sich Bakterien schneller an veränderte Bedingungen anpassen, z. B. durch Mutationen, die Resistenzen verursachen. Durch das haploide Chromosom können Mutationen sofort zur phänotypischen Ausprägung kommen. Darüber hinaus verfügen Bakterien über effiziente Übertragungsmechanismen von Resistenzfaktoren z. B. auf Plasmiden durch Transduktion, Konjugation oder Transformation (Heisig und Wiedemann, 2001). Nach Einführung eines Antibiotikums entwickeln sich daher je nach Stoffklasse und Erregerspezies unterschiedlich schnell resistente Bakterienstämme. Zum Beispiel waren 1948 bereits 60% der im Krankenhaus isolierten Staphylococcus aureus Stämme resistent gegen Penicillin, nur sieben Jahre nach der Martkteinführung (Kresken, 2003).

19 Einleitung 3 Ein weiteres Beispiel ist die Verbreitung von Stämmen, welche gegen die in den 80er Jahren eingeführten Fluorchinolone resistent sind. Abbildung 2 zeigt die Zunahme von Ciprofloxacinresistenz bei verschiedenen Erregern in Deutschland. Anteil resistenter Stämme [%] Entwicklung Ciprofloxacin-Resistenz Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Abbildung 2 Zunahme an ciprofloxacin-resistenten klinischen Isolaten in deutschsprachigen Ländern (Paul-Ehrlich-Gesellschaft (PEG), Arbeitsgemeinschaft Empfindlichkeitsprüfungen und Resistenz) Besondere Gefahr geht von multiresistenten Erregern aus, die gegen mehrere Antiinfektiva oder sogar verschiedene Antibiotikaklassen unempfindlich sind (Dennesen et al., 1998; Poole et al., 2005). Anfangs wurden solche Problemkeime vor allem in Kliniken isoliert, als Auslöser von nosokomialen Infektionen, u. a. bei immunsupprimierten oder älteren Patienten, Neugeborenen, Transplantations- und Dialysepatienten (Witte und Klare, 1999). Mittlerweile kommen multiresistente Erreger jedoch auch im ambulanten Bereich vor (Alanis, 2005). In Tabelle 1 wird eine Auswahl an bedeutenden Problemkeimen vorgestellt. Im Zusammenhang mit mehrfach resistenten Bakterien steigen nicht nur die Kosten für die Behandlung von Infektionen, sondern auch die Morbidität und Mortalität (Livermore, 2003a; Cohen, 1992). Die Situation könnte kritisch werden, da kaum noch neue Antibiotika von der pharmazeutischen Industrie entwickelt werden, im Gegensatz zu den 80er Jahren, in denen resistente Bakterien mit immer wieder neuen Antiinfektiva behandelt werden konnten (Clarke, 2003; French, 2005).

20 4 Einleitung Tabelle 1 Bedeutende multiresistente bakterielle Krankheitserreger (Gould und Wise, 1985; Gibbons, 1992; Cohen, 1992; Bergogne-Berezin und Towner, 1996; Siegrist, 1996; Siegrist, 2000; Dye et al., 2002; Livermore et al., 2002; Gould, 2005) Staphylococcus aureus 1944 Penicillinresistenz, 1961 Methicillin-Resistenz (MRSA), außerdem resistent gegen Fluorchinolone, Makrolide, Rifampicin und Gentamicin, Glykopeptide bisher i. d. R. wirksam (3 vancomycinresistente Fälle bekannt), PEG-Studie: Oxacillin-resistente Stämme 1990 = 1,7%, 2004 = 22,6% Übertragung über Hände und kontaminierte Gegenstände Enterokokken 1988 erstmals vancomycin-resistente E. faecium isoliert (VRE), PEG- Studie 2004: 13,5% der E. faecium-stämme vancomycin-resistent, außerdem resistent gegen Cephalosporine, Penicilline, Erythromycin, Aminoglykoside, Lincosamide und Clindamycin (Therapie mit Linezolid) Streptococcus pneumoniae Mycobacterium tuberculosis überleben mittelfristig in der Umwelt, häufigste Übertragung wahrscheinlich durch Pflegepersonal penicillinresistente Isolate (PNSP = penicillin-nonsusceptible S. pneumoniae): 1967 in Australien, 1977 in Südafrika, Ausbreitung unterliegt starken lokalen Schwankungen (PEG-Studie 2004: 1,2% resistent gegen Penicillin G), oft auch resistent gegen Tetracycline, Chloramphenicol, Erythromycin und Cefotaxim Ausbreitung durch breite Antibiotikaanwendung in der Pädiatrie begünstigt (S. pneumoniae: u. a. Erreger von Mittelohrentzündungen) resistent gegen Rifampicin und Isoniazid, weltweit auf dem Vormarsch Mortalität von 60 bis 80%, besonders problematisch bei HIV-Patienten Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumanii andere gramnegative Bakterien (MDR-GNB) (s. a. Kapitel 1.5) resistent gegen Imipenem durch Permeabiltätsverminderung, resistent gegen Penicilline und Aminoglykoside durch modifizierende Enzyme verursacht schwere nosokomiale Erkrankungen opportunistischer Krankheitserreger, verursacht Atemwegsinfekte, Bakteriämie und Meningitis häufig resistent gegen β-lactamantibiotika und Aminoglykoside, z. T. auch gegen Cephalosporine der 3. Generation, Fluorchinolone und Imipenem (Therapie mit Polymyxin B) E. coli, Enterobacter spp., Citrobacter spp, Serratia spp: resistent gegen Aminoglykoside und Cephalosporine, Resistenz gegen Fluorchinolone ansteigend, verursachen nosokomiale Infektionen Klebsiella pneumoniae: resistent gegen Cephalosporine der 3. Generation (durch extendend-spectrum-beta-lactamases = ESBLs, erstmals 1983 in Deutschland, PEG 2004: 4,9% resistent gegen Ceftriaxon) Haemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Neisseria gonorhoeae, Salmonella spp.: Problemkeime im ambulanten Bereich

21 Einleitung 5 Der inadäquate Einsatz von Antibiotika in der Humanmedizin (falsche Indikation, Dosis, Therapiedauer etc.) und die unkontrollierte Anwendung in der Tiermast fördern die Resistenzentwicklung (Rice, 2005; Alanis, 2005). Daher veröffentlichte die WHO Richtlinien zur Kontrolle von Antibiotikagebrauch und -resistenz, welche folgende Punkte umfasst (Finch, 2004): Überwachung der Resistenzlage Erfassung des Antibiotikaverbrauchs Förderung von umsichtigen Verschreibungen Aufklärung von Bevölkerung und Fachwelt Förderung von Infektionskontrolle und Hygiene Entwicklung neuer Antibiotika und Impfstoffe 1.2 Resistenzmechanismen Bakterien haben vielfältige Strategien entwickelt, um sich der Wirkung von Antibiotika zu entziehen (Muhlemann, 2002). Da eine Resistenz gegen eine bestimmte Substanz durch mehrere unterschiedliche Mechanismen verursacht werden kann, ist der Hintergrund einer verminderten Empfindlichkeit eines Erregers oft sehr komplex (Alanis, 2005). Im Folgenden werden verschiedene Resistenzmechanismen vorgestellt. Inaktivierung oder Veränderung eines Antibiotikums durch Enzyme Das bekannteste Beispiel für inaktivierende Enzyme sind die β-lactamasen, welche den β-lactam-ring der Penicilline oder der Cephalosporine hydrolytisch spalten. Die Gene für diese Enzyme können chromosomal kodiert sein, werden aber auch durch Plasmide übertragen und sind daher weit verbreitet. Es sind ein Vielzahl dieser Enzyme bekannt: sie unterscheiden sich u. a. in ihrer Wirkungsweise, ihrem Wirkspektrum (z. B. Hydrolyse von Penicillinen oder Cephalosporinen oder mit erweitertem Spektrum) und der Empfindlichkeit auf Inhibitoren (z. B. Clavulansäure) (Wright, 2005; Muhlemann, 2002; Wiegand, 2003). Aminoglykoside und Chloramphenicol können durch bestimmte Transferasen so modifiziert werden, dass die Affinität zu ihrem Wirkort, den Ribosomen, deutlich abnimmt. Auch die Wirkung von Rifampicin und Makroliden kann durch Enzyme beeinträchtigt werden (Wright, 2005). Veränderung der Zielstruktur

22 6 Einleitung Durch die Veränderung der Zielstruktur wird die Affinität gegenüber Hemmstoffen vermindert und ein Bakterium kann resistent werden. Zum Beispiel führen Punktmutationen in den so genannten quinolone resistance determining regions (QRDRs) von DNA Gyrase (gyra, gyrb) und Topoisomerase IV (parc, pare) zur Resistenz gegen Fluorchinolone (Hooper, 2000; Weigel et al., 1998). Bei Pneumokokken und anderen Erregern kommt es durch Modifikation der Penicillinbindenden Proteine (PBP) zu einer verringerten Empfindlichkeit gegenüber β-lactamen. Auch die Methicillin-Resistenz von Staphylococcus aureus (MRSA) beruht auf einer vermehrten Expression eines minderaffinen Penicillin-bindenden Proteins (PBP2a). Vancomycin-Resistenz wird durch Veränderungen in der Peptidoglykan-Struktur hervorgerufen. Ein weiteres Bespiel ist die Methylierung einer Base in der ribosomalen RNA, die ebenfalls über verminderte Affinität zur Kreuzresistenz gegen Makrolide, Ketolide, Lincosamide und Streptogramine führt (Muhlemann, 2002; Lambert, 2005). Reduzierte Aufnahme oder vermehrter Efflux Die Anreicherung von Antibiotika in der Bakterienzelle ist sowohl von der Expression von Effluxpumpen, welche die Wirkstoffe aus der Zelle transportieren (s. 1.3), als auch von der Membranpermeabilität abhängig, die u. a. durch Porine bestimmt wird (Poole, 2002). Im Vergleich zu gram-positiven Erregern weisen viele gram-negative Erreger eine intrinsische Resistenz gegen eine Vielzahl von Antiinfektiva auf, d. h. sie sind unempfindlich gegen einen Wirkstoff, ohne vorher Kontakt mit diesem gehabt zu haben. Dies ist auch auf die unterschiedliche Permeabilität der Zellwand zurückzuführen (s. Abbildung 3) (Vaara, 1992). LPS Porin Peptidoglykan Periplasma Cytoplasma- Membran Gram-Positiv Gram-Negativ Abbildung 3 Schematischer Aufbau der Zellwand bei Bakterien (Nikaido, 1994)

23 Einleitung 7 Während die gram-positiven Bakterien außer der Cytoplasma-Membran eine relativ dicke Peptidoglykan-Schicht besitzen, die für kleinere Moleküle (z. B. einige Antibiotika) durchlässig ist, werden gram-negative Bakterien zusätzlich von einer zweiten Membran umschlossen. Diese ist auf der äußeren Seite aus Phospholipiden und Lipopolysacchariden (LPS) aufgebaut, welche die Permeabilität der Membran stark beeinträchtigen. Die Diffusionsrate durch die äußere Membran beträgt nur 1 / 50 bis 1 / 100 der Rate durch die Cytoplasma-Membran (Nikaido, 1994). Lipophile Wirkstoffe gelangen daher nur sehr langsam in die Zelle. Hydrophile Antibiotika werden bei gram-negativen Bakterien hauptsächlich über kleine wassergefüllte Transmembrankanäle, so genannte Porine, aufgenommen. Die Anzahl und Beschaffenheit der Porine kann die Empfindlichkeit eines Erregers stark beeinflussen (Poole, 2002). Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass die geringe Permeabilität häufig nicht alleine für die intrinsische Resistenz von gram-negativen Erregern verantwortlich ist, sondern klinisch relevante Werte nur in Kombination mit einem Effluxpumpen- System oder anderen Resistenzmechanismen erreicht werden (Nikaido, 1994; Poole, 2002). Die Effluxpumpen werden im folgenden Kapitel vorgestellt. 1.3 Effluxpumpen Effluxsysteme haben die Aufgabe, Moleküle (u. a. sekundäre Stoffwechselprodukte und toxische Stoffe) aktiv aus der Zelle in die Umgebung zu transportieren. Sie kommen in der Natur ubiquitär vor und sind zum größten Teil im Genom eines Organismus kodiert (Saier, Jr. et al., 1998). Die Transporter sind entweder spezifisch für ein Substrat oder eine Substratklasse oder besitzen ein sehr breites Substratspektrum, diese werden als Multi-Drug-Resistance (MDR)-Pumpen bezeichnet (Borges-Walmsley und Walmsley, 2001). Effluxsysteme wurden beim Menschen, bei Pilzen, bei Parasiten und auch bei Bakterien entdeckt (van Bambeke et al., 2003a; van Bambeke et al., 2003b). Die bakteriellen Proteine, welche Antibiotika transportieren, werden folgenden Familien zugeordnet: ATP-Binding-Cassette (ABC) Transporter, Major Facilitator Superfamily (MFS), Multidrug and Toxic Compound Extrusion (MATE) Transporter, Small Multidrug Resistance (SMR) Transporter und Resistance-Nodulation-Division (RND) Transporter (Kumar und Schweizer, 2005; Lewis und Lomovskaya, 2001). Der unterschiedliche Aufbau der Transporter ist in Abbildung 4 schematisch dargestellt.

24 8 Einleitung Substrat TolC Äußere Membran Substrat H + H + Substrat Substrat Na + H + AcrA Substrat NorA EmrE NorM AcrB LmrA Plasmamembran Substrat H + Substrat H + Substrat Na + H + Substrat Substrat ATP ADP + Pi MFS SMR MATE RND ABC Abbildung 4 Schematischer Aufbau der unterschiedlichen Transporterfamilien. Dargestellt sind NorA (Staphylococcus aureus, MFS), EmrE (E. coli, SMR), NorM (Vibrio parahaemolyticus, MATE), AcrAB-TolC (E. coli, RND) und LmrA (Lactococcus lactis, ABC). Die Substrate werden chemisch unverändert, in Abhängigkeit vom Protonengradienten oder ATP, aus der Zelle gepumpt (Kumar und Schweizer, 2005) Mit Ausnahme der ABC-Transporter, welche die benötigte Energie durch Hydrolyse von ATP erhalten, sind alle anderen Systeme von Protonen- oder anderen elektrochemischen Gradienten abhängig. Da Entkoppler, z. B. Carbonylcyanid-mchlorophenylhydrazon (CCCP), diese Gradienten zerstören, kann mit diesen nachgewiesen werden, dass die verminderte Aufnahme einer Substanz, und die damit verbundene Resistenz, durch protonengradientenabhängige Effluxpumpen verursacht wird (Nikaido, 1996). ABC-Transporter Die ABC-Superfamilie umfasst sowohl Aufnahme- als auch Effluxsysteme, mit denen eine Vielzahl von Substraten durch die Membran transportiert wird, z. B. Zucker, Aminosäuren, Ionen, Proteine und Arzneistoffe (van Veen und Konings, 1998). Die ABC-Transporter kommen bei Menschen, Archeae und Bakterien vor und werden in 28 Unterfamilien eingeteilt (Saier, Jr. et al., 1998). Die meisten ABC-Pumpen in Bakterien sind substratspezifisch, z. B. vermittelt die MsrA-Pumpe in Staphylokokken Resistenz gegen Makrolide. Eine Ausnahme ist das LmrA-Protein von Lactococcus lactis, welches eng verwandt ist mit dem P-Glykoprotein des Menschen und ein ähnlich breites Substratspektrum besitzt, u. a. Zytostatika, Hormone, HIV- Therapeutika, Opioide und Antibiotika (Bolhuis et al., 1996).

25 Einleitung 9 MFS-Transporter Diese große Familie von Transportern mit über 1000 sequenzierten Vertretern aus Bakterien, Pflanzen, niedrigen Eukaryonten und Säugetieren ist die so genannte Major Facilitator Superfamily (MFS) (Kumar und Schweizer, 2005). Sie beinhaltet ein Kollektiv von 17 Transporterfamilien, die als Uniporter, Symporter oder Antiporter fungieren und so unterschiedliche Substrate wie Antibiotika, Zucker und Anionen transportieren (Pao et al., 1998). In Abbildung 5 sind einige MFS-Transporter in einem phylogenetischen Baum dargestellt. Es sind sowohl spezifische als auch Multi-Drug-Resistance (MDR) Pumpen bekannt. In gram-negativen Bakterien bildet das Transporterprotein z. T. mit einem Membranfusions- und einem äußeren Membranprotein eine Multikomponenten-Pumpe (z. B. EmrAB-TolC in E. coli). Üblicherweise bestehen MFS-Transporter aber nur aus dem Membranprotein (z. B. Bmr in Bacillus subtilis, NorA in Staph. aureus) (Paulsen et al., 1996a). OPA SP MHS OHS DHA12 DHA14 Abbildung 5 Phylogenetischer Baum von bedeutenden MFS-Transporterfamilien (Saier, Jr. et al., 1998), u. a. sind der Tetracyclin-Transporter TetB (E. coli) und die MDR-Pumpen Bmr (Bacillus subtilis) und EmrB (E. coli) abgebildet, welche zur DHA12- bzw. zur DHA14-Familie (Drug:H + Antiporter mit 12 bzw. 14 TMS) gehören (Pao et al., 1998). Weitere Familien (deren Vertreter keine Antibiotika transportieren): OHS (Oligosaccharide:H + Symporter), OPA (Organophosphate:P i Antiporter), SP (Sugar Porter), MHS (Metabolite:H + Symporter)

26 10 Einleitung MATE-Transporter Die Familie der MATE-Proteine ist aus den MFS-Transportern hervorgegangen. Sie haben ebenfalls eine Transmembrandomäne mit 12 Helices (wie die DHA12- Familie), sind aber von einem Na + -Gradienten abhängig (MFS: H + -Gradient). Auch besteht keine Sequenzhomologie zwischen beiden Familien (Brown et al., 1999). Die bisher bekannten MATE-Transporter NorM (Vibrio parahaemolyticus) und YdeH (E. coli) vermitteln Resistenz gegen kationische Farbstoffe, Fluorchinolone und Aminoglykoside (Morita et al., 1998). Die klinische Bedeutung der MATE-Pumpen ist bisher nicht erforscht (Lewis und Lomovskaya, 2001) SMR-Transporter Die Vertreter der SMR-Familie bestehen aus ungefähr 110 Aminosäuren und bilden in der Membran vermutlich Tetramere mit je vier α-helices (Paulsen et al., 1996b). Die Smr Pumpe (S. aureus) und der EmrE Transporter (E. coli) sind gut charakterisiert. Beide transportieren Farbstoffe, kationische Antiseptika und Antibiotika (Kumar und Schweizer, 2005). Unter gram-negativen Bakterien weit verbreitet ist ein Transporter, qaceδ1, welcher sich auf einem Integron befindet und von qace abstammt, einem SMR Transporter von Klebsiella pneumoniae (Paulsen et al., 1996a). RND-Transporter bilden in gram-negativen Bakterien mit zwei weiteren Proteinen einen Komplex, welcher sich über die innere und äußere Membran erstreckt. Diese Transporterfamilie wird ausführlich in Kapitel 1.4 vorgestellt. Inwieweit Effluxpumpen klinisch relevante unspezifische Resistenz verursachen, ist schwer einzuschätzen. Die Verbreitung von Effluxpumpen und das Ausmaß ihrer Leistung sind im Vergleich zu anderen Resistenzmechanismen nicht gut dokumentiert (van Bambeke et al., 2000). Das Effluxverhalten von Isolaten kann bisher nicht routinemäßig untersucht werden (Fluit et al., 2001). Es wurde jedoch nachgewiesen, dass Isolate verschiedener Spezies deutlich empfindlicher auf entsprechende Antibiotika (z. B. Aminoglykoside, β-lactame, Fluorchinolone, Makrolide) reagieren, wenn ihre Effluxpumpen pharmakologisch gehemmt oder ausgeknockt werden (Poole, 2000; Sulavik et al., 2001). Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die parallele Expression einer spezifischen und einer Multi-Drug- Resistance (MDR)-Pumpe zu einer deutlich verminderten Empfindlichkeit führt, als die jeweiligen Pumpen einzeln (Lee et al., 2000).

27 Einleitung 11 Es wird vermutet, dass Effluxpumpen neben der unspezifischen eine wichtige Rolle bei der spezifischen Resistenzentwicklung eines Stammes spielen (Webber und Piddock, 2003). Durch verminderte Antibiotika-Konzentration am Wirkort kann die Selektion von Mutanten gefördert werden, die dann über spezfische Mechanismen resistent gegen das entsprechende Antibiotikum sind. (Ryan et al., 2001). Ein Beispiel ist der Synergismus zwischen Punktmutationen in den Zielproteinen der Fluorchinolone und gesteigertem Efflux bei hochgradig chinolonresistenten Isolaten (Oethinger et al., 2000). 1.4 Effluxpumpensysteme mit RND-Transportern Von RND-Transportern, die zunächst in gram-negativen Bakterien nachgewiesen wurden (Saier, Jr. et al., 1994), sind mittlerweile auch Vertreter in grampositiven Bakterien, Archeae und Eukaryonten bekannt. Sie werden in sieben Familien eingeteilt. Die für die Multiresistenz von Enterobacteriaceae wichtigen Pumpen gehören zur Gruppe der hydrophoben/amphiphilen Efflux-1-Familie (HAE1) (Tseng et al., 1999). Am besten untersucht sind bisher die Effluxsysteme von Pseudomonas aeruginosa (MexAB/OprM) und E. coli (AcrAB/TolC) (Poole et al., 1993; Ma et al., 1993). Hier bildet das RND-Transporterprotein (MexB bzw. AcrB) eine Multikomponentenpumpe mit einem Membranfusions- (MexA bzw. AcrA) und einem äußeren Membranprotein (OprM bzw. TolC). Versuche mit Knockout-Mutanten diverser Transporter der unterschiedlichen Familien deuten darauf hin, dass die bereits konstitutiv exprimierte AcrAB/TolC-Pumpe bei E. coli für Multiresistenz gegen Antibiotika am wichtigsten ist (Sulavik et al., 2001; Okusu et al., 1996). Anhand dieses Beispiels sollen der Aufbau und die Funktion (1.4.1) sowie die Regulation (1.4.2) und mögliche Hemmung (1.4.3) der RND-Effluxpumpen vorgestellt werden.

28 12 Einleitung Aufbau und Funktion von RND-Pumpen Um die Substrate durch die innere und äußere Membran in den extrazellulären Raum zu transportieren, ist der komplexe dreiteilige Aufbau der RND-Pumpen essentiell (Lomovskaya et al., 2002). In Abbildung 6 ist das Transportsystem schematisch dargestellt. Die Substrate, die durch das RND-Protein in den periplasmatischen Raum gepumpt werden können, würden ohne das äußere Membranprotein wieder ins Innere der Zelle aufgenommen. Außerdem wurde durch Versuche mit verschiedenen Knockout-Mutanten bewiesen, dass der Efflux von Substanzen nur stattfindet, wenn alle drei beteiligten Proteine ausgebildet werden, ansonsten reagiert der entsprechende Stamm empfindlich auf Antibiotika, Farbstoffe, Gallensalze etc. (Zgurskaya und Nikaido, 2000; Fralick, 1996; Ma et al., 1995). Periplasma Äußere Membran TolC AcrA AcrA AcrB Innere Membran Abbildung 6 Schematischer Aufbau bzw. Röntgenstrukturmodell einer RND-Pumpe: die Substrate werden vom Cyto- oder Periplasma über AcrB (RND-Transporterprotein, weiß) und TolC (äußeres Membranprotein, grün) in das Medium transportiert. Das Membranfusionsprotein (AcrA, blau) hält vermutlich die beiden Komponenten zusammen (Higgins et al., 2004; Murakami et al., 2002).

29 Einleitung 13 Die RND-Proteine bestehen aus zwölf membranspannenden α-helices und zwei hydrophilen periplasmatischen Domänen (Lewis und Lomovskaya, 2001). Die Sequenzen der ersten Hälfte ähneln denen der zweiten Hälfte, wahrscheinlich ist der Transporter durch Genduplikation entstanden (Borges-Walmsley und Walmsley, 2001). Es wird vermutet, dass die periplasmatischen Schleifen zwischen der ersten und zweiten, und zwischen der siebten und achten Helix für die Substraterkennung zuständig sind, da durch Mutationen in diesen Bereichen die Substratspezifität verändert wird (Mao et al., 2002). Der Transporter liegt als Trimer vor, dessen obere periplasmatische Domäne einen Trichter formt, der an das untere Ende des Membranproteins TolC passt, s. Abbildung 6. Dieser Trichter mündet in eine Pore, welche sich wiederum zu einem Hohlraum öffnet. Wahrscheinlich gelangen die Pumpensubstrate sowohl vom Cytoplasma als auch vom Periplasma in diesen Hohlraum, um über den Trichter in das äußere Membranprotein und anschließend weiter ins Medium transportiert zu werden (Murakami et al., 2002). Das Membranfusionsprotein (MFP) ist ein Lipoprotein, welches über den N-terminalen Lipidrest in der inneren Membran verankert ist. Es enthält zwei weitere Subdomänen: eine haarnadelförmige α-helix und eine β-barrel Struktur. Aufgrund der Röntgenstrukturanalyse von MexA, ein Membranfusionsprotein von P. aeruginosa, wird vermutet, dass ein ringförmiges MFP-Nonamer die beiden anderen Pumpenkompenenten umschließt, um den durch RND-Transporter und äußeres Membranprotein gebildeten Kanal abzudichten und zu stabilisieren (Higgins et al., 2004). Die dritte Komponente der RND-Pumpen ist das äußere Membranprotein, bei E. coli z. B. TolC, welches Substrate auch unabhängig von AcrAB transportieren kann (Sulavik et al., 2001). Substrate von TolC sind neben Antibiotika, Farbstoffen und Gallensalzen auch Proteine, z. B. Hämolysin. TolC bildet einen Trimer mit einer β-barrel-struktur in der äußeren Membran, welche zum Medium hin geöffnet ist. Die untere α-barrel-struktur ist zum periplasmatischen Raum eigentlich geschlossen, kann aber durch Aufdrehen der α-helix vorübergehend geöffnet werden, wobei dieser Zustand eventuell durch Interaktion mit einem Membranfusionsprotein stabilisiert wird (Koronakis et al., 2004).

30 14 Einleitung Wie die MDR-Pumpen der anderen Transporterfamilien transportieren auch die RND-Systeme ein sehr breites Spektrum an unterschiedlichen Substraten. Neben diversen Antibiotikaklassen (β-lactamantibiotika, Makrolide, Fluorchinolone, Tetracycline, Chloramphenicol) werden auch Desinfektionsmittel (z. B. Benzalkoniumchlorid, Triclosan) und Farbstoffe (z. B. Ethidiumbromid, Pyronin Y, Acriflavin), sowie Lösungsmittel, Tenside und Gallensäuren aus der Zelle gepumpt (Nikaido, 1996; Poole, 2000; Sulavik et al., 2001; Mao et al., 2002). Daher wird auch über die physiologische Rolle dieser Transporter weiterhin diskutiert, die vermutlich im Export von Metaboliten oder toxischen Substanzen liegt (Grkovic et al., 2002). Die genaue Funktionsweise dieser Pumpen inklusive der Erkennung und Bindung der strukturell sehr unterschiedlichen Pumpensubstrate ist nicht bekannt. Mehrere Gruppen versuchen durch Röntgenstrukturanalyse der Transporter mehr über die Bindungsstellen verschiedener Liganden zu erfahren (Murakami et al., 2002; Elkins und Nikaido, 2003; Yu et al., 2003; Pos et al., 2004) Regulation von RND-Pumpen Bei E. coli erfolgt die Regulation der Genexpression von den Pumpenbestandteilen acrab und tolc durch lokale und globale Transkriptionsfaktoren, s. Abbildung 7. Auch die Expression des Porins OmpF wird z. T. von diesen Faktoren beeinflusst. Die Genexpression kann in den verschiedenen Wachstumsphasen, unter bestimmten Stressbedingungen, sowie in Anwesenheit bestimmter Substrate verändert sein (Kumar und Schweizer, 2005). Das acrab-operon wird lokal durch den Repressor AcrR kontrolliert, dieser ist im Genom vor acra kodiert. Wird AcrR durch Mutationen verändert, kommt es zur Überexpression von AcrAB, und dadurch zu einer gesteigerten Antibiotikaresistenz (Wang et al., 2001). Es wird vermutet, dass der lokale Regulator zur Feinabstimmung dient, während globale Transkriptionsfaktoren die Hauptrolle bei der Regulation spielen (Grkovic et al., 2002).

31 Einleitung 15 Inaktivierung durch Salicylate Inaktivierung durch Oxidation (-) Induziert durch: Gallensalze, Fettsäuren, Dipyridyl Global Substrat Lokal Äußere Membran weniger OmpF Innere Membran Abbildung 7 Bedeutende lokale und globale Regulationsfaktoren der Expression von der AcrAB- TolC-Pumpe bei E. coli. Die Transkription des acrab-operons wird lokal durch einen Repressor (acrr) negativ beeinflusst. Global aktivieren die Transkriptionsfaktoren MarA, SoxS und Rob die Bildung der Pumpenbestandteile AcrAB und TolC. Außerdem fördern sie die Transkription von dem Repressor micf, welcher die Translation von dem Porin OmpF reguliert. Weitere Einzelheiten werden im Text erläutert (Kumar und Schweizer, 2005). Bekannte globale Transkriptionsfaktoren sind MarA, SoxS und Rob, Aktivatoren des AcrAB-TolC-Effluxsystems. MarA ist Teil des Mar- (multiple Antibiotika-Resistenz) Regulons. Dieses enthält außerdem einen Repressor (marr) und zwei weitere Gene (marb, marc), deren Funktion bisher unbekannt ist. Es fördert neben der eigenen Transkription u. a. die Expression von acrab und tolc sowie micf. Durch die Antisense-RNA micf wird die Expression von OmpF, einem Porin der äußeren Membran, gehemmt. Durch Überexpression von MarA kommt es also zu einer erhöhten Resistenz u. a. gegen Antibiotika infolge von verringerter Permeabilität und gesteigertem Efflux (Oethinger et al., 1998; Alekshun und Levy, 1999). Die Expression von AcrAB, TolC und micf wird auch durch die Regulatoren SoxS und Rob aktiviert, welche MarA-Homologe sind.

32 16 Einleitung Die Expression von MarA und SoxS wird über die entsprechenden Repressoren MarR und SoxR reguliert, der Aktivator Rob dagegen wird konstitutiv exprimiert, entwickelt seine Wirkung aber erst nach Induktion durch Substanzen wie Gallensalze oder Fettsäuren. Die Repressoren MarR und SoxR können durch verschiedene Stressfaktoren inaktiviert werde, z. B. 4% Ethanol, 0,4 M NaCl, Salicylate, Sauerstoffradikale (Cohen et al., 1993). Auch in der stationären Phase kommt es über die Regulationskaskade zu einer erhöhten Expression von Effluxpumpen und zu einer verminderten Expression von Porinen (Ma et al., 1994) Hemmung von RND-Pumpen Über 90% der neu entdeckten natürlichen Antibiotika sind gegen gram-positive Erreger aktiv, zeigen aber keine Wirksamkeit gegen gram-negative Bakterien aufgrund des Synergismus zwischen geringer Membranpermeabilität und Efflux durch Transporterproteine (s. Kapitel 1.2) (Nikaido, 1998; Lomovskaya und Bostian, 2006). Die Hemmung dieser Effluxpumpen oder die Kompensation ihrer Wirkung ist daher ein pharmakologisch interessantes Ziel (Pages et al., 2005; Lomovskaya und Watkins, 2001b). Mögliche Ansatzpunkte sind die Steigerung des Influx durch permeabilitätsfördernde Substanzen, die Hemmung der Transkriptionsfaktoren, welche die Expression der Effluxpumpen fördern, und die Entwicklung von Wirkstoffen, die nicht von der Pumpe transportiert werden (z. B. Tigecyclin, wird von den tetracyclin-spezifischen Pumpen TetA-D, TetK und TetM nicht erkannt) (Fritsche et al., 2005). Auch durch die Veränderung der Stoffeigenschaften kann die Aufnahme einer Substanz so gesteigert werden, dass der Transport aus der Zelle nur noch ein geringe Rolle spielt, z. B. wird die Aktivität der neueren hydrophoben Chinolone (z. B. Gatifloxacin, Moxifloxacin) durch die MFS-Effluxpumpen NorA und PmrA (Staphylococcus aureus bzw. Streptococcus pneumoniae) nicht beeinflusst (Hooper, 2000). Eine weitere Möglichkeit ist die Blockade von spezifischen oder Multidrug-Drug-Resistance- Pumpen durch Effluxpumpeninhibitoren (EPIs) (Ryan et al., 2001; Lomovskaya und Bostian, 2006).

33 Einleitung 17 Es wird vermutet, dass durch den Einsatz von EPIs in Kombination mit Antiinfektiva sowohl die intrinsische als auch erworbene Resistenz von Bakterien verringert werden kann. Zusätzlich könnte die Rate der spezifischen Resistenzentwicklung herabgesetzt werden (Lomovskaya et al., 2001). Da das Ausmaß der MHK- Reduktion jedoch sowohl vom Antibiotikum als auch von der behandelten Spezies abhängig ist, muss genau geprüft werden, bei welchen Bakterienspezies mit welchen Antibiotika die Hemmung von Effluxpumpen möglich und sinnvoll ist. Beispielsweise könnte durch Hemmung von Effluxpumpen die Wirksamkeit folgender Antibiotikaklassen gegen P. aeruginosa verstärkt werden: Makrolide, Tetracycline, β-lactamantibiotika und besonders Fluorchinolone (Lomovskaya und Watkins, 2001a). Ein idealer Effluxpumpeninhibitor sollte folgende Kriterien erfüllen: Bei effluxkompetenten Stämmen sollte die Wirksamkeit von Antiinfektiva durch den EPI erhöht werden, nicht jedoch bei Stämmen mit fehlender Pumpleistung. Die Aktivität von Wirkstoffen, die nicht Substrate der Effluxpumpe sind, sollte nicht beeinflusst werden. Der EPI sollte eine höhere intrazelluläre Konzentration der Pumpensubstrate bewirken, jedoch nicht über eine Entkopplung des Protonengradienten wirken (Lomovskaya et al., 2001). Da sich viele bakterielle Effluxpumpen in ihrer Struktur ähneln, wird nach Inhibitoren gesucht, die gegen diverse Transporter bei verschiedenen Spezies aktiv sind. (Webber und Piddock, 2003). In dieser Arbeit wurde die Wirkung von zwei putativen Breitspektrum-Effluxpumpeninhibitoren, Phenylalanin-arginyl-β-naphthylamid (PAN) und Naphthyl-methyl-piperazin (NMP), auf E. coli, C. freundii, E. aerogenes, K. pneumoniae und S. marcescens untersucht. Die Strukturformeln sind in Abbildung 8 dargestellt. PAN NMP Abbildung 8 Strukturformeln der putativen Effluxpumpeninhibitoren Phenylalanin-arginyl-βnaphthylamid (PAN) und Naphthyl-methyl-piperazin (NMP)

34 18 Einleitung Das Dipeptidyl-naphthylamid PAN wurde 1999 als erster Inhibitor von RND-Pumpen vorgestellt. Es bewirkt eine verbesserte Levofloxacinaktivität in resistenten Pseudomonas aeruginosa-stämmen (Renau et al., 1999; Renau und Lemoine, 2001). Darüber hinaus wurde ein Effekt auf die Effluxpumpen anderer Spezies, z. B. E. aerogenes, K. pneumoniae und S. enterica nachgewiesen (Pages et al., 2005). Allerdings wird für PAN auch eine permeabilisierende Aktivität diskutiert, welche von den effluxhemmenden Effekten schlecht unterschieden werden kann (Lomovskaya et al., 2001). Das Alkylpiperazin NMP wurde durch Screening einer Substanzbibliothek entdeckt (Bohnert und Kern, 2005). Es bewirkt eine MHK-Reduktion diverser Antibiotika bei E. coli, E. aerogenes, C. freundii, K. pneumoniae und Acinetobacter baumanii (Kern et al., 2006; Schumacher et al., 2006; Pannek et al., 2006). Darüber hinaus wird durch NMP die Ethidiumbromid-Akkumulation bei Stämmen erhöht, die RND- Pumpen überexprimieren (Bohnert und Kern, 2005). Andere beschriebene Inhibitoren von RND-Pumpen umfassen 3-Arylpiperidine, Alkoxy- und Alkylaminochinoline, deren Aktivität bei E. coli, E. aerogenes oder K. pneumoniae nachgewiesen wurde (Thorarensen et al., 2001; Mallea et al., 2003; Chevalier et al., 2004). Im August 2005 veröffentlichte Mpex Pharmaceuticals eine Pressemitteilung, in welcher erstmals die klinische Prüfung (Phase I) eines Effluxpumpeninhibitors (MP-601,205) angekündigt wurde. Der EPI soll in Kombination mit Fluorchinolonen zur inhalativen Behandlung von Atemwegsinfektionen bei Mukoviszidose-Patienten angewendet werden (Mpex Pharmaceuticals, 2005; Lomovskaya und Bostian, 2006)

35 Einleitung Enterobacteriaceae und Effluxpumpen Enterobacteriaceae sind eine große Gruppe innerhalb der Eubakterien. Der Name kommt vom griechischen Enteron (Darm), denn viele Enterobacteriaceae sind Teil der gesunden Darmflora des Menschen und von Tieren. Sie kommen jedoch auch auf Pflanzen, in Gewässern, Abwässern, Lebensmitteln und ubiquitär an anderen Plätzen unserer Umwelt vor. Angehörige der Familie der Enterobacteriaceae sind 2 6 µm lange, teils bewegliche, teils unbewegliche, sporenlose gramnegative Stäbchen, die Glucose und andere Kohlenhydrate unter Säure- und Gasbildung metabolisieren. Sie sind fakultative Anaerobier und auf den üblichen Nährmedien leicht anzüchtbar. Da sie mikroskopisch nicht unterschieden werden können, dienen zur Klassifizierung vorwiegend biochemische Merkmale: Vergärung von Glucose, Lactose und anderen Zuckern, Citratverwertung, Indol und H 2 S-Bildung, Abbau von Phenylalanin, Ornithin, Lysin oder Harnstoff (Brandis und Pulverer, 1988; Farmer, 2003). Die Familie der Enterobacteriaceae kann hinsichtlich ihrer Pathogenität in zwei Gruppen eingeteilt werden. Eine Gruppe bilden die obligat pathogenen Arten wie Salmonellen, Shigellen und Yersinien. Die zweite Gruppe wird als fakultativ pathogen bezeichnet (opportunistische Krankheitserreger), d. h. nur unter bestimmten Wirtsund Bakterien-spezifischen Voraussetzungen kann eine Erkrankung erfolgen (Brandis und Pulverer, 1988). Zu dieser Gruppe gehören u. a. die Spezies Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae und Serratia marcescens, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Erreger dieser Spezies verursachen häufig nosokomiale Infektionen, d.h. Erkrankungen die während eines Krankenhausaufenthalts erworben werden. Bei Escherichia coli gibt es sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Stämme, die durch den Besitz besonderer Virulenzfaktoren Durchfallerkrankungen verursachen (u. a. enteropathogene, enterotoxische und invasive E. coli-stämme) (Hart et al., 1993). Der Anteil der einzelnen Spezies als Ursache von klinischen Infektionen betrug 2001 bei einer Multicenterstudie in Deutschland für E. coli ca. 16%, für K. pneumoniae und Enterobacter-Spezies ungefähr 5%, während S. marcescens und Citrobacter- Spezies nur 1-2% ausmachten (Stock et al., 2001). In diesem Zusammenhang ist das vermehrte Auftreten von multiresistenten Erregern durch Efflux besonders problematisch. Es wird vermutet, dass u. a. der Einsatz von Fluorchinolonen die

36 20 Einleitung Aktivierung von Effluxpumpen fördert (Nikaido, 1998; Poole, 2000). Durch Selektionierung mit Wirkstoffen dieser Substanzklasse können in vitro Mutanten verschiedener Enterobacteriaceae isoliert werden, die unempfindlich gegen verschiedene Antibiotika sind (Kern et al., 2000; Tavio et al., 2000; Deguchi et al., 1997). Im Folgenden werden die untersuchten Spezies vorgestellt Escherichia coli Escherichia coli ist ein säurebildendes und peritrich begeißeltes Colibakterium, das im menschlichen und tierischen Darm vorkommt. Benannt wurde es 1919 nach seinem Entdecker, dem Kinderarzt Theodor Escherich. Es gehört zu den am besten untersuchten Organismen der Welt und ist ein wichtiger Modellorganismus der Genetik und Biochemie sowie der Mikrobiologie. Einige Stämme von E. coli sind für den Menschen darmpathogen, wie bereits erläutert. Außerhalb des Darms ist E. coli als Erreger bei Harnwegsinfektionen, Gallenblasen- und Gallenwegsentzündungen, Appendizitis, Peritonitis, Wundinfektionen und Sepsis bekannt (Brandis und Pulverer, 1988). Die zunehmende Resistenz von E. coli Isolaten erschwert die Therapie von Infektionen. Neben der Produktion von β-lactamasen mit erweitertem Spektrum (ESBLs), den Targetmutationen in den QRDRs, der Ausbildung von tetracyclinspezifischen Effluxpumpen, der enzymatischen Inaktivierung von Aminoglykosiden und einer veränderten Porin-Expression, spielt die bereits vorgestellte AcrAB-TolC RND-Pumpe (s ) eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Multiresistenz (von Baum und Marre, 2005). Im E. coli Genom wurden insgesamt 37 Kodierungen für Transporter der verschiedenen Familien entdeckt (7 ABC, 19 MFS, 1 MATE, 3 SMR, 7 RND), für einige wurde auch die Funktion nachgewiesen (Nishino und Yamaguchi, 2001). Durch die Vielzahl an Transportern mit überlappenden Substratspektren ist sicher gestellt, dass toxische Substanzen weiterhin aus der Zelle entfernt werden können, auch wenn ein oder mehrere Systeme nicht mehr funktionsfähig sind (Pages et al., 2005). Neben der bedeutenden AcrAB-TolC-Effluxpumpe sind vier weitere RND- Effluxsysteme charakterisiert: AcrEF, AcrD, YhiUV und MdtABC. Knockoutexperimente mit diesen Pumpen ergaben jedoch keine MHK- Veränderungen in einem E. coli-wildtyp-stamm, daher ist ihre Bedeutung in der

37 Einleitung 21 Vermittlung von Multiresistenz eher als gering einzuschätzen (Sulavik et al., 2001; Kumar und Schweizer, 2005). In E. coli Isolaten, bei denen acrab inaktiviert wurde, wurde das AcrEF-System aktiviert und bewirkte eine verminderte Empfindlichkeit u. a. gegen Fluorchinolone, Tetracyclin, Chloramphenicol, Clarithromycin und Oxacillin (Jellen-Ritter und Kern, 2001). Für AcrD wurde nachgewiesen, dass diese Pumpe u. a. am Transport von Aminoglykosiden beteiligt ist (Rosenberg et al., 2000). Wird YhiUV überexprimiert, kommt es zur Resistenz z. B. gegen Doxorubicin, Erythromycin, Deoxycholat und Kristallviolett, während das MdtABC-System eine verminderte Empfindlichkeit gegen Gallensalze und Novobiocin vermittelt (Nagakubo et al., 2002) Citrobacter Spezies Die Citrobacter-Arten können ausschließlich Citrat als Kohlenstoffquelle nutzen, Glucose und andere Kohlenhydrate werden jedoch ebenfalls fermentiert. Verbreitet sind sie in beinahe allen Lebensräumen, wie etwa dem Boden, im Wasser und in Abwässern. Außerdem kommen sie als Teil der Darmflora im Magen-Darm-Trakt des Menschen vor. Als Krankheitserreger spielt C. freundii vor allem eine Rolle bei Wundinfektionen, Infektionen des Respirationstraktes, Septikämien, Meningitis, Otitis und Harnwegsinfektionen (Brandis und Pulverer, 1988). Es gibt darüber hinaus Hinweise, dass durch wenig virulente, jedoch gut kolonisierende Citrobacter Spezies eine Vielzahl von Resistenzfaktoren, z. B. β-lactamasen (extended spectrum β- lactamases = ESBL), an andere Bakterien weitergegeben werden können (Pepperell et al., 2002). Im Zusammenhang mit Chinolonresistenz wird vermutet, dass neben Mutationen in Gyrase und Topoisomerase protonengradientenabhängige Effluxpumpen an der verminderten Empfindlichkeit klinischer C. freundii Isolaten beteiligt sind (Nishino et al., 1997; Navia et al., 1999; Tavio et al., 2000) wurden Teile der Sequenzen der RND-Pumpenbestandteile acra und acrb bei der GenBank, einer Datenbank aller öffentlich verfügbaren DNA-Sequenzen, eingereicht (Nr. AY bzw. AY886899). Es wurden jedoch bisher keine Artikel über diesen Transporter oder seine Regulatoren veröffentlicht.

38 22 Einleitung Enterobacter Spezies Die Vertreter der Gattung Enterobacter sind peritrich begeißelt und kommen in fast allen Lebensräumen einschließlich des menschlichen Darmes vor. Dort gehören sie zur normalen Darmflora. Die Erreger Enterobacter aerogenes und Enterobacter cloacae treten im Hospitalbereich als Erreger von Wund-, Atemwegs-, Harnwegsinfektionen, Hirnhautentzündung oder Sepsis auf. Besonders betroffen sind immunsupprimierte Patienten (Brandis und Pulverer, 1988). Auch bei der in dieser Arbeit untersuchten Spezies E. aerogenes ist eine zunehmende Resistenz gegen Antibiotika zu beobachten, die durch enzymatische Inaktivierung, Targetmutationen oder verringerte Akkumulation der Substanz verursacht wird (Chollet et al., 2002). Bei mehreren klinischen Isolaten mit einem multiresistenten Phänotyp wurde der Verlust oder der veränderten Aufbau von Porinen im Zusammenhang mit gesteigerter Effluxleistung nachgewiesen (Mallea et al., 1998; Gayet et al., 2003). Das RND-Effluxsystem AcrAB-TolC von E. aerogenes transportiert u. a. Fluorchinolone, Tetracyclin, Chloramphenicol und Makrolide, nicht aber das Ketolid Telithromycin (Pradel und Pages, 2002; Chollet et al., 2004b). Die Regulation erfolgt durch die Transkriptionsfaktoren AcrR, MarA und RamA (Chollet et al., 2002; Chollet et al., 2004a; Pradel und Pages, 2002). Bei auf Imipenem oder Chloramphenicol selektionierten Mutanten wurde eine erhöhte Expression von AcrAB-TolC festgestellt (Bornet et al., 2003; Ghisalberti et al., 2005). Kürzlich wurde bei E. aerogenes ein weiteres Pumpensystem, EefABC, entdeckt, welches bei den untersuchten Laborbedingungen jedoch nicht exprimiert wurde (Masi et al., 2005) Klebsiella Spezies Bakterien der Gattung Klebsiella wurden nach dem ostpreußischen Bakteriologen Edwin Klebs benannt. Sie sind unbeweglich und von einer dicken Polysaccharidkapsel umgeben, die die Kolonien schleimig erscheinen lässt. Die Klebsiella Spezies kommen ubiquitär vor und sind Bestandteil der physiologischen Darmflora. Gelangen sie in andere Organe, verursachen sie Infektionen der Atemwege (Friedländer-Pneumonie), Meningitis, Sepsis, Enteritis, Harnwegs- und Wundinfektionen. Am häufigsten verbreitet sind die Spezies K. pneumoniae und K. oxytoca (Brandis und Pulverer, 1988; Farmer, 2003).

39 Einleitung 23 Die steigende Resistenz gegen Fluorchinolone und neuere Cephalosporine wird bei Klebsiella Spezies häufig auf Targetmutationen bzw. β-lactamasen mit erweitertem Spektrum zurückgeführt. Durch Untersuchungen von klinischen Isolaten wurde auch die Beteiligung von Effluxpumpen und der Verlust von Porinen nachgewiesen (Hernandez-Alles et al., 1999; Chevalier et al., 2000; Martinez-Martinez et al., 2002; Mazzariol et al., 2002). Bei der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Spezies K. pneumoniae wurden mit verschiedenen Antibiotika (z. B. Fluorchinolone, Chloramphenicol) Mutanten mit einem multiresistenten Phänotyp selektioniert, welcher mit aktivem Efflux assoziiert war (George et al., 1995; Deguchi et al., 1997). Die Sequenz des AcrAB- Effluxsystems, welches homolog zum E. coli Transporter ist und durch den Transkriptionsfaktor RamA reguliert wird, wurde 2001 veröffentlicht (Domenech- Sanchez et al., 2001; Schneiders et al., 2003). RamA kontrolliert ferner die Expression von Porinen, ist mit den E. coli Regulatoren MarA oder SoxS aber nur entfernt verwandt (George et al., 1995) Serratia marcescens Zur Art Serratia marcesc ens gehören nicht-sporenbildende, sich aktiv mit peritrich angeordneten Geißeln bewegende Bakterien. Einige Stämme synthetisieren ein rotes Pigment (Prodigiosin, von lateinisch prodigium = Wunderzeichen), wodurch die Kolonien rot gefärbt sind (Brandis und Pulverer, 1988). Das Genom von Serratia marcescens wurde vom Sanger Institute (Cambridge, Großbritannien) vollständig sequenziert. Es besteht aus einem einzigen in sich geschlossenen DNA-Strang ( Bakterien-Chromosom ) und hat eine Länge von 5,1 Mega-bp (Sanger Institute, 2004). Die Bakterien kommen ubiquitär im Boden und im Wasser, auf Tieren und Pflanzen vor und sind in der Regel harmlose Saprobionten (Destruenten organischer Stoffe). Früher wurde das Bakterium als vollständig apathogen betrachtet, erst in den letzten Jahrzehnten wurde die zunehmende Bedeutung als Erreger nosokomialer Infektionen erkannt. Es kann Sepsis, Endokarditis, Meningitis, Wund-, Harnwegsund Atemwegsinfektionen verursachen und ist häufig multiresistent (Chen et al., 2003b). Auch bei dieser Spezies wird Antibiotikaresistenz durch verschiedene Mechanismen (s. 1.2) verursacht, u. a. auch durch den Transport von Substanzen aus der Zelle. Drei RND-Effluxsysteme, sdeab, sdecde und sdexy, sind bei S. marcescens

40 24 Einleitung bekannt (Kumar und Worobec, 2005a; Chen et al., 2003a). Das äußere Membranprotein dieser Systeme ist bisher unbekannt, kürzlich wurde jedoch für ein TolC-Homolog, HasF, nachgewiesen, dass es an protonengradientenabhängigen Effluxvorgängen beteiligt ist (Kumar und Worobec, 2005b). Die Regulatoren für diese Systeme sind bisher nicht identifiziert. 1.6 Problemstellung und Ziele dieser Arbeit Multiple Antibiotikaresistenz wird, neben dem Auftreten bei pathogenen Erregern wie Salmonella, Shigella und E. coli, auch zunehmend bei Vertretern der Enterobacteriaceae beobachtet, welche nosokomiale Infektionen verursachen, z. B. Serratia marcescens und Enterobacter aerogenes (Cohen, 1992). Häufig wird in diesem Zusammenhang auch die Aktivität von Fluorchinolonen beeinträchtigt, die ihrerseits das Auftreten (multi)resistenter Mutanten zu begünstigen scheinen (Poole, 2000; Pantosti und Moro, 2005). Neben der Akkumulation von Resistenzgenen ist eine der wichtigsten Ursachen für bakterielle Multiresistenz die Aktivierung von Multi Drug Resistance (MDR)-Effluxpumpen, die chemisch nicht verwandte, antibiotisch wirksame Substanzen aus der Zelle und damit dem Wirkort heraustransportieren (Fluit et al., 2001). Das Gesamtziel dieser Arbeit besteht in der Charakterisierung von Resistenzen durch MDR-Effluxpumpen und deren mögliche Hemmung bei einer Auswahl an Laborstämmen und klinischen Isolaten der Spezies E. coli, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae und Serratia marcescens. Die Laborstämme sollten neben Referenzstämmen und multiresistenten Mutanten, die durch Anzucht auf Fluorchinolonen selektioniert werden, auch Knockout-Mutanten umfassen, welche mithilfe von homologer Rekombination gewonnen werden. Die Ergebnisse der klinischen Isolate sollten in Abhängigkeit von der Chinolonempfindlichkeit beurteilt werden. Mit quantitativer Real-Time-PCR sollte die Expression von Pumpengenen und Regulatoren untersucht werden. Die Effluxleistung der untersuchten Isolate soll durch die Untersuchung der intrazellulären Aufnahme von Antibiotika bzw. Farbstoffen eingeschätzt werden. Zusätzlich wird die Wirkung der putativen Breitspektrum-Effluxpumpeninhibitoren Phenylalanin-arginyl-β-naphthylamid (PAN) und Naphthyl-methyl-piperazin (NMP) geprüft.

41 Material und Methoden 25 2 Material und Methoden 2.1 Bakterienstämme und Lösungen Laborstämme Neben den aus ATCC-Stämmen (ATCC = American Type Culture Collection) durch Selektionierung (s und 3.1.1) gewonnenen Mutanten wurden, so weit wie möglich, Knockout-Mutanten der verschiedenen Spezies untersucht. Von Citrobacter freundii wurden acrb-knockout-mutanten (CFAS0 und CFAS0II) mit Red /ET - Rekombination (s und 3.1.2) hergestellt. Außerdem wurde eine tolc-knockoutmutante (EAEP298) und der entsprechende Wild-Typ (EAEP289) von Enterobacter aerogenes untersucht (Pradel und Pages, 2002), welche freundlicherweise von Jean- Marie Pagès (Faculté de Médecine, Université de la Méditerranée, Marseille) zur Verfügung gestellt wurden. Zum Vergleich mit Escherichia coli wurden die bereits im Labor etablierten Stämme AG100 (Wildtyp) und 3-AG100 (Selektionsmutante), sowie 1-DC14 (acrab-knockout), 2-DC14 (Überexpression von acref) und 3-AG100MK* (mar-knockout, Überexpression von acrab) in die Untersuchungen einbezogen (Kern et al., 2000; Jellen-Ritter und Kern, 2001). Tabelle 2 In der Arbeit untersuchte Laborstämme Spezies Name Beschreibung Herkunft Escherichia AG100 K-12 arge3 thi-1 rpsl xyl mtl Stammsammlung coli Δ(gal-uvrB)supE44 Labor AG Kern 3-AG100 aus AG100 mit 8,0 µg/ml Stammsammlung Ofloxacin selektioniert (3. Schritt) Labor AG Kern 1-DC14 aus AG100 ΔacrAB::Kan r mit Stammsammlung 0,031 µg/ml Ofloxacin Labor AG Kern selektioniert 2-DC14 aus 1-DC14PS mit 0,5 µg/ml Stammsammlung Ofloxacin selektioniert Labor AG Kern 3-AG100MK* aus AG100 mara::kan r mit 4,0 µg/ml Ofloxacin selektioniert (3. Schritt) Stammsammlung Labor AG Kern

42 26 Material und Methoden Spezies Name Beschreibung Herkunft Citrobacter freundii CF8090 ATCC Stamm, Nr.8090 GeneScan 1-CF aus CF8090 mit 0,25 µg/ml Selektionierung Ofloxacin selektioniert 2-CF aus 1-CF mit 2,0 µg/ml Levofloxacin selektioniert Selektionierung CFAS0 CF8090 ΔacrB::Kan r Red /ET - Rekombination CFAS0II 2-CF ΔacrB::Kan r Red /ET - Rekombination Enterobacter aerogenes EA13048 ATCC Stamm, Nr GeneScan 1-EA aus EA13048 mit 0,5 µg/ml Selektionierung Ofloxacin selektioniert 2-EA EAEP298 EAEP289 aus 1-EA mit 4,0 µg/ml Levofloxacin selektioniert EAEP289 ΔtolC::Kan r (pep786 integration) Kan s Mutante von EA27 (klinisches Isolat, MDR: Kan r Amp r Chl r Nal r Str r Tet r ) Selektionierung J.-M. Pagès, Marseille J.-M. Pagès, Marseille Klebsiella pneumoniae KP13883 ATCC Stamm, Nr GeneScan 1-KP aus KP13883 mit 0,5 µg/ml Selektionierung Ofloxacin selektioniert 2-KP aus 1-KP mit 2,0 µg/ml Levofloxacin selektioniert Selektionierung Serratia marcescens SM14756 ATCC Stamm, Nr GeneScan 1-SM aus SM14756 mit 0,5 µg/ml Selektionierung Levofloxacin selektioniert 2-SM aus 1-SM mit 8,0 µg/ml Levofloxacin selektioniert Selektionierung

43 Material und Methoden Klinische Isolate Die klinischen Isolate wurden freundlicherweise von Dr. D. Mlangeni (Bakteriologisches Labor) und Dr. D. Jonas (SARI-Projekt, Institut für Umweltmedizin und Krankenhaushygiene, Freiburg) sowie von Dr. H. v. Baum (Institut für Mikrobiologie und Immunologie, Ulm) und Dr. M. Akova (Department of Medicine, Hacettepe University, Ankara) zur Verfügung gestellt. Tabelle 3 Anzahl und Herkunft der klinischen Isolate Spezies Anzahl Herkunft E. coli 60 Freiburg (Bakteriologisches Labor), Ulm C. freundii 34 Freiburg (Bakteriologisches Labor, SARI-Projekt) E. aerogenes 25 Freiburg (Bakteriologisches Labor, SARI-Projekt) K. pneumoniae 38 Freiburg (Bakteriologisches Labor, SARI-Projekt), Ulm, Ankara S. marcescens 70 Freiburg (Bakteriologisches Labor, SARI-Projekt) Nährmedien, Puffer und sonstige Lösungen Alle Nährmedien, Puffer und sonstigen Lösungen wurden nach der Herstellung autoklaviert oder sterilfiltriert (FP 30/0,2 CA-S, Schleicher & Schuell, Dassel). LB- Agarplatten wurde nach dem Autoklavieren unter sterilen Bedingungen in Petrischalen gegossen, teilweise nach Zugabe von Antibiotika. Tabelle 4 Zusammensetzung der Nährmedien, Puffer und sonstiger Lösungen Bezeichnung Bestandteile Menge/l (H 2 O) Hersteller LB-Medium (Miller) Trypton 10,0 g Gibco, Life Technologies Hefeextrakt 5,0 g (Mischung) NaCl 10,0 g LB-Agarplatten Trypton 10,0 g Gibco, Life Technologies (Miller) Hefeextrakt 5,0 g (Mischung) NaCl 10,0 g Agar 15,0 g PBS KH 2 PO 4 2,31 g Cambrex (10X Lsg.) (phosphate Na 2 HPO 4 x7h 2 O 13,94 g buffered saline) NaCl 87,7 g

44 28 Material und Methoden Bezeichnung Bestandteile Menge/l (H 2 O) Hersteller PBS + 0,4% KH 2 PO 4 2,31 g Cambrex (10X Lsg.) Glucose Na 2 HPO 4 x7h 2 O 13,94 g NaCl 87,7 g Glucose-Lsg (25%) 16 ml Fluka 0,9% NaCl NaCl 9 g Roth 0,1 M Glycin-HCl Glycin 7,51 g Merck (ph 3) HCl 5M einige Tropfen Fluka TBE (10X) Tris-Base 108 g Sigma Borsäure 55 g Bio-Rad EDTA 9,3 g Roth 3 M Na-Acetat- Natriumacetat x 3H 2 O 408,24 g Merck Lsg. (ph = 5,3) Essigsäure enige Tropfen Merck 10 mm Tris-HCl Tris-HCl 1,576 g Merck (ph = 8,0) NaOH einige Tropfen Roth L-Arabinose-Lsg (10%) L-Arabinose 100 g Sigma Tabelle 5 Antibiotika- und Farbstofflösungen Lösung Konz. der Stammlsg. Lösungsmittel (T = Teile) Hersteller PAN 10 mg/ml H 2 O Sigma NMP 10 mg/ml 2 T DMSO, 2 T 0,25 M HCl, 6 T H 2 O Chess GmbH Pyronin Y 10 mg/ml H 2 O Sigma EtBr 1% H 2 O Merck Levofloxacin 5 mg/ml H 2 O Roussel Uclaf Linezolid 2 mg/ml Zyvoxid -Infusionslösung Pharmacia Ofloxacin 2 mg/ml H 2 O Sigma Tetracyclin 10 mg/ml Ethanol USB Kanamycin 30 mg/ml H 2 O Sigma PMBN 5 mg/ml H 2 O Sigma

45 Material und Methoden Mikrobiologische Methoden Kultivierung und Lagerung Alle Stämme wurden in Luria-Bertani-(LB)-Medium oder auf LB-Agarplatten angezüchtet, gegebenenfalls mit Antibiotikum. Die Inkubation erfolgte in der Regel bei 37 C (Brutschrank Typ B5050E, Heraeus), Flüssigkulturen wurden bei 200 rpm im Schüttelinkubator bebrütet (Aerotron, Infors HT, Schweiz). Zur Lagerung der Stämme wurde das Cryobank TM System (MAST Diagnostica GmbH, Reinfeld) verwendet. Dazu wurden die Cryoröhrchen mit Kolonien einer frischen Reinkultur angeimpft, das Röhrchen verschlossen und vorsichtig geschüttelt. Die Mikroorganismen binden dabei an die poröse Oberfläche der enthaltenen Glasperlen. Anschließend wurde soviel wie möglich von der hypertonischen Cryo- Konservierungslösung abpipettiert, bevor das Röhrchen bei -80 C eingefroren wurde. Für jeden Stamm wurden zwei Röhrchen eingefroren. Zur Rekultivierung wurde ein Glaskügelchen unter sterilen Bedingungen entnommen und in flüssiges Medium oder auf eine Agarplatte gegeben. Um währenddessen das Auftauen des Röhrchens zu verhindern, wurde es im Cryoblock aufbewahrt. Die Stämme wurden vor der Durchführung von Versuchen mindestens ein weiteres Mal überimpft Selektionierung Es wurden Stämme der American Type Culture Collection (ATCC) von Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae und Serratia marcescens auf Fluorchinolon-haltigen LB-Agarplatten angezüchtet, um multiresistente Mutanten zu erhalten, wie für E. coli und andere Enterobacteriaceae bereits beschrieben (Kern et al., 2000; Deguchi et al., 1997; Tavio et al., 2000). Die Übernachtkultur (5 ml LB-Medium, 37 C) eines Stammes wurde in 200 ml LB- Medium überimpft und anschließend für 24 h bei 37 C im Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet ( rpm, 10 min, RT), und das Pellet in 800 µl 0,9% NaCl-Lösung resuspendiert. Jeweils 100 µl dieser hochkonzentrierten Zellsuspension wurden auf je zwei LB-Agarplatten mit steigender Chinolonkonzentration (s. u.) mithilfe eines Trigalskispatels ausplattiert. Bei den ersten Versuchen wurde Ofloxacin verwendet, später dessen aktives Enantiomer Levofloxacin.

46 30 Material und Methoden Die Chinolonkonzentration entsprach der ein- bis achtfachen minimalen Hemmkonzentration (MHK), s. Tabelle 6. Die Agarplatten wurden für h bei 37 C bebrütet. Ein Teil der gewachsenen Klone, welche bei der entsprechend höchsten Konzentration gewachsen waren, wurde mit einem Zahnstocher gepickt und auf eine LB-Agarplatte mit der entsprechenden Konzentration des Antibiotikums überimpft. Am nächsten Tag wurden einzelne Klone auf LB-Platten ohne Antibiotikum ausgestrichen, um anschließend eingefroren bzw. charakterisiert zu werden. Tabelle 6 Eingesetzte Konzentrationen bei der Selektionierung Stamm Antibiotikum Konzentration [µg/ml] CF8090 Ofloxacin 0,031; 0,063; 0,125; 0,25 1-CF Levofloxacin 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 EA13048 Ofloxacin 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 1-EA Levofloxacin 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 KP13883 Ofloxacin 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 1-KP Levofloxacin 1,0; 2,0; 4,0; 8,0 SM14756 Levofloxacin 0,125; 0,25; 0,5; 1,0 1-SM Levofloxacin 1,0; 2,0; 4,0; 8, Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration Zur Charakterisierung des Resistenzprofils der Stämme wurde mithilfe des Reihenverdünnungstests die minimale Hemmkonzentration (MHK) von unterschiedlichen Stoffen (Antibiotika, Farbstoffe) bestimmt. Die MHK wird definiert als die Konzentration (µg/ml) eines Wirkstoffs, bei der nach Stunden kein sichtbares Wachstum zu beobachten ist. Die Tests wurden nach den Richtlinien des National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) für Mikrodilutionsverfahren durchgeführt (NCCLS, 2004).

47 Material und Methoden Standard-MHK-Platte Zur Bestimmung der MHKs von folgenden Antibiotika wurden industriell gefertigte 96-well Mikrotitrationsplatten genutzt (Micronaut-S, Merlin Diagnostika, Bornheim- Hersel): Levofloxacin (Lev), Tetracyclin (Tet), Chloramphenicol (Cha), Rifampicin (Rif), Oxacillin (Oxa), Streptomycin (Stre), Linezolid (Line) und Clarithromycin (Clari) (s. Abbildung 9). Dadurch konnten gleichzeitig acht Antibiotikaklassen untersucht werden. Die Antibiotika sind in den Wells der Platte gefriergetrocknet enthalten und werden durch Zugabe einer standardisierten Bakteriensuspension rehydriert. Abbildung 9 Schema der Standard-MHK-Platte (Konzentration [µg/ml], WK = Wachstumskontrolle) Lev A 0,016 0,031 0,063 0,125 0,25 0, Tet B 0,063 0,125 0,25 0, Cha C 0,063 0,125 0,25 0, Rif D 0,063 0,125 0,25 0, Oxa E 0, Stre F WK Line G 0, Clari H 0, Von einer frischen Bakterienkultur (max. 24 h) auf einer Agarplatte wurden einige Kolonien abgenommen und in 5 ml 0,9%iger NaCl-Lösung resuspendiert. Die Suspension wurde gemischt und auf den McFarland-Standard 0,5 eingestellt (ATB 1550, api BioMérieux, Nürtingen), dies entspricht ungefähr Zellen/ml. Für das Inokulum wurden 13 µl der McFarland-Suspension zu 13 ml LB-Medium gegeben und gut gemischt. Anschließend wurden jeweils 100 µl des Inokulums in ein Well der 96-well-Mikrotitrationsplatte pipettiert. Die mit einem Deckel verschlossene Platte wurde für h bei 37 C im Brutschrank inkubiert. Die Auswertung erfolgte am nächsten Tag visuell mithilfe eines Spiegels (Abbildung 10). Die Konzentration des Wells, in dem kein Wachtum sichtbar war, wurde als MHK protokolliert.

48 32 Material und Methoden A B Abbildung 10 A: Standard-MHK-Platte nach Inkubation, z. B. wurde in der ersten Reihe im 8. Well (von links) kein Wachstum beobachtet (Levo-MHK = 2 µg/ml) B: Spiegel-Apparatur zum Ablesen der MHK-Werte MHK-Bestimmung von sonstigen Substanzen Für Substanzen, die nicht auf der Standard-MHK-Platte enthalten waren, wurden die Mikrotitrationsplatten selbst hergestellt, u. a. für die putativen Effluxinhibitoren PAN (Phenylalanin-arginyl-β-naphthylamid) und NMP (Naphthyl-methyl-piperazin). Dabei wurde in das 1. Well einer Verdünnungsreihe die doppelte gewünschte Endkonzentration in 100 µl LB-Medium vorgelegt, während in die anderen Wells 50 µl LB-Medium vorgelegt wurden. Anschließend wurden 50 µl aus dem ersten Well in das zweite Well pipettiert und gemischt, dann 50 µl vom 2. in das 3. Well u.s.w.. Aus dem vorletzten Well wurden 50 µl der Mischung entnommen und verworfen, da das letzte Well als Wachstumskontrolle diente. Für das Inokulum wurden nun 2 µl des McFarland Standards pro ml LB-Medium verwendet. Davon wurden jeweils 50 µl/well in die vorbereitete Platte pipettiert. Die in dieser Weise getesteten Substanzen sind in Tabelle 7 aufgeführt. Tabelle 7 Konzentrationen zur MHK-Messung anderer Substanzen Substanz PAN NMP EtBr Pyronin Y Ofloxacin Polymyxin B-Nonapeptid Konzentration µg/ml µg/ml 0,5-512 µg/ml 0, µg/ml 0, µg/ml 0,5-512 µg/ml

49 Material und Methoden Einfluss von putativen Effluxpumpeninhibitoren und Polymyxin B-Nonapeptid Um die Wirkung der putativen Effluxpumpeninhibitoren (EPIs) und einer permeabilisierenden Substanz auf die MHK der verschiedenen Substanzen zu prüfen, wurden die MHK-Tests zusätzlich mit Phenylalanin-arginyl-β-naphthylamid (PAN), Naphthyl-methyl-piperazin (NMP) und Polymyxin B-Nonapeptid (PMBN) durchgeführt. Dabei wurden die Effluxpumpeninhibitoren in den Konzentrationen 25 und 100 µg/ml zum Inokulum zugesetzt, PMBN wurde mit 1 µg/ml getestet. Die Auswertung erfolgte wie bereits beschrieben (vgl ). Eine Veränderung wurde als signifikant bewertet, wenn sich der MHK-Wert um mindestens zwei Titerstufen ( 4-fach) verändert hatte Bestimmung der intrazellulären Konzentration verschiedener Substrate Uptake-Assay mit Antibiotika Mit dem Uptake-Assay wurde die Aufnahme der Antibiotika Levofloxacin und Linezolid in Abhängigkeit vom Effluxverhalten untersucht. Nach der Trennung von dem antibiotikahaltigen Medium wurden die Zellen lysiert und die Konzentration des Antibiotikums im Überstand bestimmt. Außerdem wurde geprüft, welchen Einfluss der Entkoppler CCCP (s. 1.3) und die putativen Effluxpumpeninhibitoren PAN und NMP (s ) auf die Antibiotika-Aufnahme haben. Von dem zu untersuchenden Stamm wurde eine Übernachtkultur (5 ml LB-Medium, 37 C) angesetzt. Am nächsten Tag wurden 300 ml LB-Medium mit der Übernachtkultur angeimpft, so dass eine OD 600 ~ 0,05 entstand. Die Kultur wurde anschließend im Schüttelbrutschrank bei 37 C bis zur midlogarithmischen Phase (OD 600 ~ 0,6) inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren geerntet (50 ml Reaktionsgefäß, 5000 bzw rpm für K. pneumoniae Isolate, 10 min, RT) und mit PBS-Lösung gewaschen. Das Pellet wurde in 30 ml PBS-Lösung + 0,4% Glucose resuspendiert (OD 600 ~ 1,6) und je 7 ml der Suspension in 15 ml Reaktionsgefäße verteilt.

50 34 Material und Methoden Alle Ansätze wurden nun bei 37 C inkubiert. Nach 10 Minuten wurde von jedem Ansatz 1 ml entnommen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert (Nullwert), in dem bereits 500 µl Silikonöl (AR µl, AK µl; Wacker-Chemie GmbH, München) vorgelegt war. Zu den restlichen 6 ml wurde das Antibiotikum gegeben (Endkonzentration: Levofloxacin 10 µg/ml, Linezolid 20 µg/ml) und der Ansatz weitere 10 Minuten bei 37 C inkubiert. Währendessen wurden die Reaktionsgefäße bei 4 C und rpm fünf Minuten zentrifugiert. Dabei wurden die Zellen durch das Silikonöl vom wässrigen Medium getrennt und bildeten ein Pellet. Die wässrige und die ölige Phase wurden soweit wie möglich abpipettiert, bevor erneut eine Minute zentrifugiert wurde, um den Rest der öligen Phase ohne Zellen besser abnehmen zu können. Anschließend wurde das Zellpellet in 300 µl (Levofloxacin) oder 500 µl (Linezolid) 0,1 M Glycin-HCl-Lösung (ph3) resuspendiert. Nach zehn Minuten Inkubation mit Antibiotikum wurde wieder 1 ml entnommen (1. Messwert) und in ein Reaktionsgefäß mit Silikonöl gegeben. Zu den verbliebenen 5 ml wurden NMP, PAN oder CCCP in den erforderlichen Konzentrationen pipettiert, eine Probe blieb ohne Zusatz. Nach einer weiteren Inkubation von zehn Minuten wurde wiederum 1 ml entnommen (2. Messwert). Die Proben für den 1. und 2. Messwert wurden wie oben beschrieben weiterbehandelt. Das beim 1. Messwert entnommene Volumen wurde bei der Auswertung des 2. Messwertes korrigierend berücksichtigt. Die Zellsuspensionen wurden über Nacht lysiert, am nächsten Tag wurde der Überstand abzentrifugiert und im Mikroplatten-Reader gemessen (Levofloxacin: Anregung = 292 nm, Emission = 496 nm) oder eingefroren (Linezolid). Die eingefrorenen Linezolid-Proben wurden in Kooperation mit Dr. R. Trittler (Apotheke des Universitätsklinikums Freiburg) mittels einer LC/MS-Methode gemessen (Ehrlich et al., 2001). Da sich die Klebsiella-Stämme nicht durch das Silikonöl zentrifugieren ließen, vermutlich aufgrund der dickeren Schleimkapsel, wurde der Versuch mit dieser Spezies folgendermaßen abgeändert. Die Proben wurden in ein kaltes 1,5 ml Reaktionsgefäß ohne Silikonöl gegeben und zentrifugiert, anschließend wurde das Pellet mit eiskalter PBS-Lösung gewaschen, bevor die Zellen nach einer weiteren Zentrifugation in 0,1 M Glycin-HCl-Lösung (ph 3) resuspendiert wurden.

51 Material und Methoden Farbstoff-Akkumulationsassays Mit ausgewählten Stämmen wurden Akkumulationsassays mit den Fluoreszenzfarbstoffen Ethidiumbromid (EtBr) und Pyronin Y durchgeführt. Beide Substanzen interkalieren in Nukleinsäuren. Während sich die Fluoreszenz von EtBr durch den Einbau in DNA deutlich erhöht (Lambert und Le Pecq, 1984), wird die Fluoreszenz von Pyronin Y beim Einbau in RNA gequencht, d.h. erniedrigt (Crissman et al., 1985). Da beide Farbstoffe Substrate der RND-Pumpen sind, können durch die Assays Rückschlüsse auf das Aufnahmeverhalten der Stämme gezogen werden (Mao et al., 2002), s. auch In Abbildung 11 ist beispielhaft ein Verlauf eines Akkumulationsassays von Stämmen mit unterschiedlicher Effluxleistung dargestellt. Weiterhin wurde der Einfluss der putativen Effluxinhibitoren Phenylalanin-arginyl-βnaphthylamid (PAN) und Naphthyl-methyl-piperazin (NMP) oder des Entkopplers des Protonengradienten (Carbonylcyanid-m-chloro-phenylhydrazon, CCCP, s. a. 1.3) auf die Aufnahme untersucht. Akkumulation Effluxleistung rel. Fluoreszenz Zeit [min] Knockoutmutante Knockout Wildtyp Pumpenüberexprimierer MDR Stam Abbildung 11 Repräsentativer Verlauf eines Akkumulationsassays mit Referenzstämmen. Die Knockout-Mutante, bei der die Pumpe inaktiviert wurde, nimmt den Farbstoff rasch auf, während der Wildtyp, bei dem die Pumpe konstititiv exprimiert ist, weniger Farbstoff akkumuliert. In dem multiresistenten Stamm, welcher die Pumpe vermehrt exprimiert, wird der Farbstoff kaum angereichert.

52 36 Material und Methoden Von dem zu untersuchenden Stamm wurde eine Übernachtkultur in 5 ml LB-Medium angesetzt (37 C). Am nächsten Tag wurden 25 ml LB-Medium in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit der Übernachtkultur versetzt, so dass sich eine OD 600 von 0,05 ergab (Novaspec II, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg). Die Kultur wurde im Schüttelbrutschrank inkubiert, bis die midlogarithmische Phase erreicht wurde (OD 600 ~ 0,6). Die Kultur wurde abzentrifugiert (50 ml Reaktionsgefäß, 10 min, 5000 rpm, 8000 rpm für K. pneumoniae Stämme) und mit 10 ml PBS-Lösung gewaschen. Anschließend wurde der Stamm in PBS-Lösung + 0,4% Glucose resuspendiert und die Suspension auf OD 600 = 1,0 eingestellt. Je 200 µl dieser Bakteriensuspension wurden in ein Well einer 96-well-Platte (schwarz, flacher Boden, Greiner BioOne, Frickenhausen) gegeben. Je nach Versuchsaufbau wurden nun Effluxpumpeninhibitoren oder CCCP in den gewünschten Konzentrationen zugesetzt, pro Probe wurden drei Wells gemessen. Zum Schluss wurde der Farbstoff hinzugefügt: EtBr 1 µg/ml, Pyronin Y 5 oder 10 µg/ml. Die Fluoreszenz wurde nun im Mikroplatten-Reader (Safire, Tecan, Crailsheim) 30 min lang alle fünf Minuten gemessen, die genauen Einstellungen des Gerätes sind in Tabelle 8 aufgelistet. Zum Vergleich der Akkumulation zwischen verschieden Stämmen bzw. zur Bewertung der EPI- oder Entkopplerwirkung wurden in der Regel die Akkumulationswerte nach 30 Minuten verwendet. Tabelle 8 Einstellungen vom Safire Mikroplatten-Reader für die Akkumulationsassays EtBr Pyronin Y Betriebsart Fluorescence Top Wellenlänge/Bandbreite (Exzitation) 518/5 nm 545/2,5 nm Wellenlänge/Bandbreite (Emission) 605/5 nm 570/2,5 nm Verstärkung (gain) Anzahl der Blitze 10 Z-Position 8000 µm Anzahl/Dauer Zyklen 7/300 sec Rütteln (vor der Messung) 10 sec (5 sec Warten) Rütteln zwischen den Messungen 60 sec (10 sec Warten) Temperatur 37 C

53 Material und Methoden Molekularbiologische Methoden Primer Die in dieser Arbeit verwendeten Primer wurden in der Regel mit einem Online- Programm ( entworfen und bei verschiedenen Anbietern (Hermann GbR Synthetische Biomoleküle, Denzlingen; Operon, Köln oder MWG Biotech, Ebersberg) bestellt. Die lyophilisierten Primer wurden in H 2 O aufgenommen (100 pmol/µl) und verdünnt (10 pmol/µl). Die Stammlösungen wurden bei -20 C aufbewahrt. Tabelle 9 Verwendete Primer bei Sequenz-Analyse (2.3.4), Genexpressionanalyse (2.3.5) und Red /ET -Rekombination (2.3.6): CF = C. freundii, EA = E. aerogenes, EC = E. coli, KP = K. pneumoniae, SM = S. marcescens Name Sequenz Produktgröße Anwendung (Spezies) gyra-f gyra-r parc-f parc-r EA parc-f EA parc-r SM parc-f SM parc-r gapa-r gapa-l CF acrb-r CF acrb-l CF acra-r CF acra-l EA acra II-F EA acra II-R EA acrb II-F EA acrb II-R cga cct tgc gag aga aat gtt cca tca gcc ctt caa tgt atg cga tgt ctg aac tg cag gtt atg cgg tgg aat at tca tca tgg aca ggg cat ta gtg gta ccg ttc agc agg at gta caa cgc cgc atc atc ta acg ttg tga ggc gga ata tc cca gaa ctt tgt tgg agt aac c aga aca tca tcc cgt cct cta cc tta tcc caa tgg cgt tct tc gcc ttt agc aat cgg ttt ga tgc gtt tcg tat tgc tga ag cat aag cgg cct ggt agg ta tgc tta tcg tgt cgc aga ag ggt gcc aac cag ttt ctg at tcg cgt gaa gaa agt gta cg aga cgc ggt gaa cca tat tc ~ 350 bp Sequenzierung (CF, EA, EC, KP, SM) (1) ~ 420 bp Sequenzierung (CF, EC, KP) 436 bp Sequenzierung (EA) 434 bp Sequenzierung (SM) ~ 350 bp LightCycler (CF, EA, EC, KP) (2) 134 bp LightCycler (CF) 134 bp LightCycler (CF) 223 bp LightCycler (EA) 150 bp LightCycler (EA)

54 38 Material und Methoden Name Sequenz Produktgröße Anwendung (Spezies) EC acra-f EC acra-r EC mara-f EC mara-r KP acrb-l KP acrb-r KP ompk35-f KP ompk35-r KP ompk36-f KP ompk36-r KP rama-f KP rama-r KP rama II-F KP rama II-R SM gapa-f SM gapa-r SM sdex-f SM sdex-r SM sdey-f SM sdey-r SM adea-f SM adea-r SM adeb-f SM adeb-r CF acrb Red/ET upper CF acrb Red/ET lower tca ccc tac gcg cta tct tc acc ttc tgt cac cag cca ct aaa ccg gtc att cat tag gc gta ttt atg cgg cgg aac at gct ggt tta acc gca tgt tt cat cca gca ctt tct gcg ta aaa acg gca aca aac tgg ac cga aga agt cgg agt tac gg acc tgt acg gca aaa tcg ac atc gct gga gct ttc agt gt taa gcg cca gtg cag tat ca acg gtg ctg ttt tgt ctg tg ctg caa cgg ctg ttt tta ca agg tct gtt gcg aat cga ag cgt gtt acc gca gag aaa gac c gca ctt cgc cgt tga aat cg cgt atc gta tcg ccg aag tt tgt cgt agt cct gct tgc tg aaa agg aca acg tgg ttt cg gtt gcg gta ccg agt tca at atc aga acc gca agt tcg tt gtt aag tgc gga agc ggt ag ctg cag acc tac ctc ggt tc aag tgg tgc cta tgc tga cc acg atg ttc ggg atg gtg ctc gccatc ggcctg ctg gtg gat gac gcc atg gcc tgg tga tga tgg cgg gat cg ccc tga atc tgg ccc atg gat ttt cgc gtt gct tcc ttc ggc ggt agt cct cag aag aac tcg tca aga agg cg 236 bp LightCycler (EC) 176 bp LightCycler (EC) 237 bp LightCycler (KP) 402 bp LightCycler (KP) 176 bp LightCycler (KP) 488 bp LightCycler (KP) 151 bp LightCycler (KP) 650 bp LightCycler (SM) (2) 249 bp LightCycler (SM) 229 bp LightCycler (SM) 218 bp LightCycler (SM) 184 bp LightCycler (SM) 1420 bp Red /ET - Rekombination (1) (Weigel et al., 1998) (2) (Wertz et al., 2003)

55 Material und Methoden DNA-Isolierung Mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden) wurde die genomische DNA einzelner Bakterienstämme isoliert, um Sequenzierungen durchzuführen und Primer zu testen. Die Durchführung erfolgte gemäß den Herstellerangaben. Allerdings wurde die Lyse der Zellen z. T. über Nacht ausgedehnt, und eine zusätzliche Zentrifugation zur Beseitigung von Resten des Waschpuffers wurde durchgeführt. Die Elution der DNA erfolgte mit 200 µl AE-Puffer nach drei Minuten Inkubation bei Raumtemperatur. Mit dem Biophotometer (Eppendorf, Hamburg) wurde die Quantität (10-30 µg/ansatz) und Qualität (A 260/280 = 1,7-1,9) der DNA überprüft. Die isolierte DNA, gelöst im Elutionspuffer, wurde bei -20 C gelagert Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion wurden durch Primer definierte DNA- Bereiche amplifiziert, z. B. als Vorbereitung zur Sequenz-Analyse (2.3.4), zur Überprüfung von Transformationen ( ) und zur Herstellung der rpsl-neo- Kassette (Red /ET -Rekombination, ). Darüber hinaus wurde z. T. die optimale Annealing-Temperatur von Primern für die Genexpressionsanalyse (2.3.5) durch Gradienten-PCR bestimmt. Alle PCR-Reaktionen wurden im Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) durchgeführt. Als Enzyme wurden die Phusion High-Fidelity Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finnland) für die rpsl-neo-kassette und ansonsten die Taq-Polymerase (Eppendorf, Hamburg) entsprechend den Herstellerangaben verwendet. Das Reaktionsvolumen betrug 25 µl (50 µl für rpsl-neo-kassette). Als Template wurden isolierte DNA oder im Reaktionsmix suspendierte Bakterienkolonien verwendet (Kolonie-PCR). Die Temperaturprofile entsprachen den in Tabelle 10 aufgeführten Bedingungen. Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch mit einem 1,5%igen Agarosegel und einem geeigneten Marker (1 kb DNA Ladder, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA; peqgold DNA-Sizer III, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen; GenLadder 100bp, Genaxxon BioScience, Biberach) überprüft.

56 40 Material und Methoden Tabelle 10 PCR-Temperaturprofile Taq-Polymerase Phusion-Polymerase 1. Denaturierung 4 min bei 94 C (8 min bei Kolonie-PCR) 1 min bei 98 C Zyklen (Denaturierung, Annealing, Elongation) 45 sec bei 94 C, 45 sec bei C, 1 min bei 72 C 10 sec bei 98 C, 30 sec bei 55 C 1 min, 30 sec bei 72 C 3. Abschließende Elongation 10 min bei 72 C 10 min bei 72 C Sequenz-Analyse Die durch PCR erhaltenen Produkte wurden zunächst mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) gemäß den Herstellerangaben gereinigt, dadurch wurden die im PCR-Reaktionsmix enthaltenen Salze und Primer entfernt. Zur Elution wurden 30 µl H 2 O (ph = 7,1) verwendet. Die Konzentration des gereinigten PCR- Produktes wurde mit dem Biophotometer (Eppendorf, Hamburg) bestimmt. Je nach Größe des zu untersuchenden DNA-Abschnitts wurden ng PCR- Produkt mit einem geeigneten Primer und dem Reaktionsmix BigDye 2.0 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) versetzt. Anschließend erfolgte die Amplifizierung im Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) mit folgendem Temperaturprofil: Denaturierung (1 min 96 C), 25 Zyklen (30 sec, 96 C; 30 sec, 54 C; 4 min, 60 C). Die eigentliche Sequenzierung wurde in der Core Facility von Dr. M. Hoffmann (Abteilung Klinische Chemie, Medizinische Klinik, Freiburg) in einem MegaBACE TM 500 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England) durchgeführt. Die erhaltenen Sequenzen wurden mithilfe des Computerprogramms BioEdit ( ausgewertet. Auf diese Weise wurden u.a. die Quinolone Resistance Determining Regions (QRDRs) von gyra und parc, den Targetgenen der Chinolone, untersucht.

57 Material und Methoden Genexpressionsanalyse Die Untersuchung der Genexpression verschiedener Pumpen- und Regulatorgene wurde mit dem LightCycler -System (Roche Diagnostics, Mannheim) durchgeführt. Nach Isolierung der RNA der entsprechenden Stämme (s ) wurde diese durch reverse Transkriptase in cdna umgeschrieben (s ). Anschließend wurde mit der cdna eine Real-Time-PCR im LightCycler durchgeführt (s und ). Die LightCycler -Versuche wurden mit mindestens zwei unabhängig voneinander gewonnenen RNA-Isolierungen durchgeführt RNA-Isolierung Für jeden Stamm wurde eine Übernachtkultur (5 ml LB-Medium, 37 C) angesetzt. Am nächsten Tag wurden 25 ml LB-Medium in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit der Übernachtkultur angeimpft, so dass ein OD 600 ~ 0,05 entstand. Die Kultur wurde anschließend im Schüttelbrutschrank bei 37 C bis zur midlogarithmischen Phase inkubiert. Währenddessen wurden pro Stamm 1000 µl RNAprotect (Qiagen, Hilden) in 2,0 ml Reaktionsgefäßen vorgelegt. Sobald die Kultur eine OD 600 = 0,6 erreichte, wurden 500 µl der Bakteriensuspension in das vorbereitete Gefäß gegeben und gut gemischt. Nach Inkubation bei Raumtemperatur (5 min) wurde zehn Minuten bei 7300 rpm zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die Zellen bei -80 C eingefroren oder gleich weiter behandelt. Nun erfolgte die Isolierung der RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden). Dazu wurden die Zellen zunächst fünf Minuten mit Lysozym in TE-Puffer (400 µg/ml, 100 µl) behandelt, um die Zellwand der gram-negativen Bakterien zu beschädigen, bevor die Zellen mit 350 µl RLT-Puffer weiter lysiert wurden. Nach dem Zusatz von 250 µl Ethanol wurde die Mischung auf eine Säule mit einer Silika-Gel-Membran gegeben, an welche die RNA bindet. Nach einem Waschschritt mit 350 µl RW1- Puffer erfolgte der DNA-Verdau auf der Säule mit dem RNase-Free DNase Set (Qiagen, Hilden) in 15 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die Membran wiederholt mit RW1- und RPE-Puffer (350 bzw. 500 µl) gewaschen. Die Elution wurde mit 50 µl RNase freiem Wasser durchgeführt.

58 42 Material und Methoden Die Qualität (A 260/280 ~2,0, A 260/230 > 2,0) und Quantität (ca µg) der erhaltenen RNA wurde photometrisch (1:25 mit 10 mm Tris-HCl verdünnt, Biophotometer, Eppendorf, Hamburg) und elektrophoretisch (s. Abbildung 12) bestimmt. Die gelöste RNA wurde bei -80 C aufbewahrt bp 947 bp Abbildung 12 Agarose-Gel (1,5%) mit RNA-Proben (1 und 5: peqgold DNA-Sizer III, 2-4: RNA- Proben (1:10, 5 µl), 6-8: RNA-Proben (1:10, 2,5 µl) cdna-synthese Um die isolierte RNA in cdna umzuschreiben, wurde das iscript TM cdna Synthesis Kit (Bio-Rad, München) verwendet. Die 1 µg entsprechende Menge an gelöster RNA wurde mit 4 µl 5X iscript Reaction Mix, 1 µl iscript Reverse Transcriptase und nuklease-freiem Wasser versetzt, das Endvolumen betrug 20 µl. Ein zweiter Ansatz nur mit RNA und Wasser wurde zur Kontrolle der DNA-Kontamination ebenfalls vorbereitet. Die Ansätze wurden nach 5 Minuten bei Raumtemperatur 60 Minuten lang bei 42 C inkubiert, bevor die Transkription durch Erhitzen auf 85 C (5 min) gestoppt wurde. Die cdna wurde bei -20 C aufbewahrt Aufbau und Funktionsweise des LightCycler -Systems Mit dem LightCycler -System ist es möglich, den Verlauf einer PCR zu verfolgen und Aussagen über die Menge der eingesetzten DNA zu treffen. Der LightCycler besteht aus einem PCR-Cycler und einem Fluorimeter, welche an einen Computer angeschlossen sind. Der Aufbau des Geräts ist schematisch in Abbildung 13 dargestellt.

59 Material und Methoden 43 Kapillare Heizwendel Abluft Rotor Kapillare Stepper Radial Bewegung Stepper Tangential Bewegung (Rotor) Ventilator Temperierkammer Kühlkörper LED- Beleuchtung Photohybrid- Detektoren Abbildung 13 Aufbau des LightCyclers : In der Probenkammer befinden sich die Glaskapillaren im Rotor. Die Luft wird über eine Heizwendel erwärmt und mit dem Ventilator verteilt. Für die Fluoreszenzmessung werden die einzelnen Proben im Rotor mittels eines Stepper-Motors über die optische Einheit gebracht (unten rechts). Die Daten werden an die LightCycler Software weitergeleitet (Schneider, 2002). Der Aufheiz- und Abkühlprozeß wird durch wechselnde Zufuhr von heißer bzw. kalter Luft gesteuert. Im Fluorimeter wird das Licht gefiltert und über eine Linse fokussiert. Die von der markierten Probe ausgesandte Fluoreszenz wird dann von derselben Linse wieder gesammelt, über dichromatische Filter spezifisch gefiltert und an Photohybrid-Detektoren weitergeleitet. Die optische Einheit enthält drei Filter in den Wellenlängen 530, 640 und 710 nm, so dass die Detektion von Fluoreszenz- Farbstoffen, deren Emissionsmaxima bei den entsprechenden Filtern liegen, möglich ist (Schneider, 2002). Mithilfe des LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Kits (Roche Diagnostics, Deutschland) wurde die Expression der Zielgene in Bezug zu einem Housekeeping-Gen (gapa = Glycerinaldehyd 3-phosphat Dehydrogenase A) bestimmt. SYBR Green lagert sich in doppelsträngige DNA ein, wodurch die emittierte Fluoreszenz bei gleicher Anregungsintensität um ein vielfaches verstärkt wird. Dieses Signal ist direkt proportional zu der Zahl der vorhandenen Doppelstränge.

60 44 Material und Methoden Abbildung 14 Verlauf einer Real-Time- PCR im LightCycler : In Probe 2 waren weniger Ausgangskopien als in Probe 1 Mit dem LightCycler kann die Fluoreszenz nach jedem Zyklus bestimmt werden. Abhängig von der Anzahl der Ausgangskopien wird dieses Signal nach einer bestimmten Zahl von Zyklen messbar (CP = crossing point) und steigt, wie die Menge an DNA, exponentiell bis zum Erreichen eines Plateaus an, welches erreicht wird, wenn einzelne Reaktionskomponenten verbraucht sind (Abbildung 14) Durchführung und Auswertung der Real-Time PCR Die in der RT-Reaktion erhaltene cdna (1 µl) wurde in den Glaskapillaren (LightCycler Capillaries, Roche Diagnostics) mit dem Mastermix (9 µl) versetzt. Dieser besteht aus folgenden Komponenten: 5,8 µl H 2 O (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I, Gefäß 3) 1,2 µl MgCl 2 (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I, Gefäß 2) 0,5 µl Primer (forward) 0,5 µl Primer (reverse) 1,0 µl LC-Mix (LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I, Gefäß 1) Für jeden Stamm wurden im selben Lauf das Ziel-Gen und das Housekeeping-Gen bestimmt.

61 Material und Methoden 45 Die Glaskapillaren wurden in das LightCycler Sample Carousel gesteckt und kurz zentrifugiert (LightCycler Centrifuge), anschließend wurde das Probenkarussell in den LightCycler gestellt und das gewünschte Programm gestartet. Der Lauf bestand aus drei Teilen. Nach einer initialen Denaturierung (10 min bei 95 C) folgte der PCR- Teil mit Denaturierung, Anlagerung und Elongation (30-40 Zyklen: 10 sec bei 95 C, 5 sec bei 55 C, 10 sec bei 72 C), nach jedem Zyklus wurde die Fluoreszenz gemessen. Anschließend folgte die Bestimmung der Schmelzkurve mit kontinuierlicher Fluoreszenzmessung (Start bei 95 C, 15 sec bei 60 C, schrittweiser Anstieg mit 0,5 C/sec bis 95 C), bevor der Lauf nach Abkühlung auf 40 C beendet wurde Der Verlauf der Fluoreszenzintensität konnte auf dem angeschlossenen Computer verfolgt werden. Nach dem Ende des Laufes wurden die Daten im Data Analysis Programm (LightCycler Software, Version 3.5) angezeigt, hier können zum einen die Crossing Points (CP-Werte) abgelesen werden, zum anderen kann man anhand der Schmelzkurve die Spezifität der PCR-Produkte überprüfen. Die ermittelten CP-Werte wurden mit dem Relative Expression Software Tool (REST ) ausgewertet, wobei von einer PCR-Effizienz = 2,0 ausgegangen wurde (Pfaffl et al., 2002). Dabei wird die Expression des Zielgens (target) von einem Stamm (sample) relativ zu einem Referenzstamm (control), bezogen auf das Housekeeping-Gen (reference), bestimmt. Der Berechnung liegt folgende Formel zugrunde: ratio = (E target ) ΔCP target (MEAN control - MEAN sample ) (E reference ) ΔCP reference (MEAN control - MEAN sample ) Zur Kontrolle liefen Negativ- (H 2 O) und DNA-Kontaminationskontrollen (s ) mit. Beträgt der Abstand zwischen dem CP-Wert der Probe und dem der DNA- Kontrolle mehr als 3,0 Zyklen, kann die in der RNA enthaltene DNA als nicht signifikant eingestuft werden.

62 46 Material und Methoden Gen-Inaktivierung durch Red /ET -Rekombination Durch homologe Rekombination wurden acrb-knockout-mutanten von Citrobacter freundii hergestellt. Dazu wurde das Counter-Selection BAC Modification Kit (Gene Bridges, Heidelberg) verwendet. Dieses Kit beruht auf dem Red /ET -System, welches durch das redγβα-operon die homologe Rekombination fördert (Zhang et al., 1998). Das temperatursensitive Plasmid psc101-bad-gba tet (s. Abbildung 15) enthält zum einen das redγβα-operon, welches durch den L-Arabinose induzierbaren pbad-promoter kontrolliert wird, und vermittelt außerdem eine Tetracyclin-Resistenz. Abbildung 15 Plasmidkarte von psc101-bad-gba tet Nach der Transformation des Plasmids psc101-bad-gba tet in den Ausgangsstamm CF8090 oder die Selektionsmutante 2-CF (vgl ) folgte die Insertion eines PCR-Produktes in acrb (vgl ). Dieses PCR-Produkt besteht neben acrb- Homologiearmen aus der rpsl-neo-kassette, die neben einer Neomycin/Kanamycin- Resistenz eine Streptomycin-Sensitivität vermittelt.

63 Material und Methoden Transformation Die Herstellung von elektrokompetenten Zellen erfolgte im Mikromaßstab. Dazu wurden 30 µl einer Übernachtkultur (1 ml LB-Medium, 37 C, 1000 rpm; Thermomixer, Eppendorf, Hamburg) in 1,4 ml LB-Medium überimpft und anschließend weiter inkubiert. Wenn eine OD 600 von 0,4 erreicht wurde, wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (30 sec, rpm, 2 C) und zweimal mit eiskaltem Wasser gewaschen. Dabei wurden je zwei Ansätze vereint. Nach dem letzten Waschschritt wurde wieder zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Proben auf Eis gelagert. Nun wurde 1 µl der Plasmid-Lösung (psc101-bad-gba tet, Konz. 1 µg/µl) zu den Zellen gegeben und 30 µl der Mischung in eine gekühlte Küvette (E. coli Pulser Cuvette, Bio-Rad, München) pipettiert. Die Elektroporation erfolgte bei 1350 V für ~ 5 msec (E. coli Pulser, Bio-Rad, München). Die Zellen wurden sofort in 1000 µl LB- Medium aufgenommen und für 70 min bei 30 C und 1000 rpm inkubiert. Bei einer höheren Temperatur würde das temperatursensitive Plasmid verloren gehen. Anschließend wurden je 100 µl der unverdünnten oder 100 µl der mit 0,9% NaCl- Lösung 1:10 verdünnten Bakteriensuspension auf LB-Agarplatten mit 3 µg/ml (CF8090) bzw. 8 µg/ml Tetracyclin (2-CF) ausplattiert. Zur Kontrolle wurden außerdem 100 µl einer 1:10000 verdünnten Suspension auf LB-Agarplatten ohne Antibiotikum ausplattiert. Nach h Inkubation im Brutschrank (30 C für Platten mit Tetracyclin, 37 C die anderen) wurden die Klone gezählt und ein Teil der auf Tetracyclin gewachsenen Klone mit einem Zahnstocher gepickt und auf antibiotikahaltigen Platten ausgestrichen. Am nächsten Tag wurden zwei der Klone über Nacht in LB-Medium mit Tetracyclin angezüchtet, um zur Kontrolle das Plasmid mit dem Qiaprep Kit (Qiagen, Hilden) zu isolieren. Die Isolierung erfolgte entsprechend den Herstellerangaben, die Elution des Plasmids wurde mit 30 µl des EB-Puffers durchgeführt. Das isolierte Plasmid wurde elektrophoretisch überprüft (s. Abbildung 16). Einer der Klone, bei dem auf diese Weise das Plasmid nachgewiesen wurde, wurde mit dem Cryobank TM System eingefroren (s ).

64 48 Material und Methoden 3,0 kb 1,0 kb Abbildung 16 Agarosegel (1,5%): 1: 1 kb DNA ladder, 2 und 3: isolierte supercoiled bzw. opencircle Plasmid-DNA, 4: PEQgold DNA-Sizer III) Insertion Das PCR-Produkt, welches durch homologe Rekombination in das acrb-gen inseriert wurde, bestand aus der rpsl-neo-kassette (s. Abbildung 17) und Homologiearmen des acrb-gens. Dafür wurden speziell aufgereinigte 70 Basenpaare-lange Primer verwendet (s. Tabelle 9), die sowohl die Homologiearme als auch die Primersequenz für die rpsl-neo-kassette enthielten. Die Neomycin/Kanamycin-Resistenz dient zur Identifizierung der Klone, welche die PCR- Kassette eingebaut haben. Mithilfe der durch die PCR-Kassette vermittelten Streptomycin-Sensitivität (rpsl) ist es möglich in einem weiteren Schritt die PCR- Kassette durch eine veränderte Sequenz (z. B. Deletion oder Punktmutation einzelner Basen) des ursprünglichen Gens auszutauschen. Die erhaltenen Klone wachsen darauf hin wieder auf Streptomycin. So kann die Sequenz eines Gens gezielt verändert werden, z. B. um Substratbindungsstellen zu identifizieren. Promoter rpsl-gen Neomycin/Kanamycin Abbildung 17 Die PCR-Kassette, die in das auszuschaltende Gen eingebaut wurde

65 Material und Methoden 49 Nach der PCR-Reaktion mit der Phusion-Polymerase (s ) wurde die Größe des Produktes (1420 bp) elektrophoretisch überprüft (s. Abbildung 18), bevor es durch Zusatz von 3 M Natriumacetet-Lsg. (ph 5,3) und Ethanol bei -80 C gefällt wurde. Nach Zentrifugation (13200 rpm, 10 min, 2 C) wurde das Pellet mit 70%igen Ethanol gewaschen und bei 37 C getrocknet (ca. 5 min). Anschließend wurde es in 10 mm Tris-HCl-Lsg. (ph 8) aufgenommen. Die Konzentration wurde photometrisch bestimmt und auf ~0,5 µg/ml eingestellt. Abbildung 18 Agarosegel (1,5%) als Kontrolle der PCR (1: 1 kb DNA Ladder, 2: Kontrolle, 3: Produkt, 4: Negativkontrolle) Für die Insertion wurde der Klon mit dem Plasmid psc101-bad-gba tet in 1 ml LB- Medium mit Tetracyclin angeimpft und über Nacht bei 30 C bebrütet (1000 rpm, Thermomixer). Je 30 µl dieser Kultur wurden in 1,4 ml LB-Medium mit Tetracyclin überimpft und bis zu einer OD 600 ~ 0,2 inkubiert. Dann wurden 20 µl einer 10%igen L-Arabinose-Lsg. zugesetzt, um die Expression der Red /ET -Rekombinationsproteine zu induzieren. Die Zellen wurden nun bei 37 C inkubiert bis eine OD 600 von 0,4 erreicht wurde. Die Ernte erfolgte durch Zentrifugation (30 sec, rpm) bei 2 C. Die Zellen wurden zweimal mit eiskaltem Wasser gewaschen und anschließend auf Eis gehalten, dabei wurden je zwei Ansätze vereint. Nach dem Zusatz von 1 µl des PCR- Produktes wurden 30 µl der Suspension elektroporiert (1350 V, ~ 5 msec) und sofort mit 1000 µl LB-Medium versetzt. Die Zellsuspension wurde nun 70 min bei 37 C inkubiert, während dieser Zeit findet die homologe Rekombination statt.