Molekularbiologische Methoden - Einsatzmöglichkeiten und Grenzen
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- Gundi Bayer
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1 Molekularbiologische Methoden - Einsatzmöglichkeiten und Grenzen Kirby-Bauer meets Watson-Crick, ASM News Peter Heisig Universität Hamburg PH2004, UniHH 1
2 Einsatzmöglichkeiten für molekulargenetische Methoden zur Resistenzbestimmung Bei langsam wachsenden oder nicht kultivierbaren Erregern M. tuberculosis, HCV Bei variabel exprimiertem Resistenzphänotyp MRSA, β-lactamase, vana Bei lebensbedrohlichen Infektionen Sepsis Bei molekularepidemiologischen Fragestellungen PH2004, UniHH 2
3 Wodurch kommt es zur Resistenz? Veränderung der Zielstruktur Bakterien, Pilze, Viren Inaktivierung des Wirkstoffs Bakterien, (Pilze) Einschränkung des Zugangs zur Zielstruktur Bakterien, Pilze PH2004, UniHH 3
4 Was muß detektiert werden? Veränderung in vorhandener genetischer Information DNA: Punktmutation, Deletion, Rekombination, Insertion RNA: Veränderte Quantität Aufnahme neuer genetischer Information DNA: Plasmid, Genfragment, Rekombination, Insertion Induktionsphänomene ohne genetische Veränderung RNA: Veränderte Quantität PH2004, UniHH 4
5 Resistenz durch Veränderung vorhandener genetischer Information Änderung einzelner Codons in spezifischem Target Serin-83 in gyra Inaktivierung eines Gens durch diverse Mutationen acrr (Thr) A (Ala) G (Pro) C (Stop) A T C G (Trp) G (Leu) T (Ser) A (Ser) C (Ser) T Relative Häufigkeit (Mutationsfrequenz zur Fluorchinolonresistenz) punktuell Verteilung im Genom Austausch Deletion Insertion breit PH2004, UniHH 5
6 Auswirkungen von Punktmutationen reduzierte Empfindlichkeit der Zielstruktur rpob (Asp-516 Tyr): rpsl (Lys-42 Asn): gyra (Ser-83 Leu) : Veränderung des Substratspektrums TEM-2 (Arg-164 ) : TEM-7 (Ser-164 ) : aaca-i (Leu-119) : aaca-ii (Ser-119) : MHK-Anstieg für Rifampicin: fach MHK-Anstieg für Streptomycin: fach MHK-Anstieg für Nalidixinsäure: 250-fach MHK CAZ: 0,2 µg/ml MHK CAZ. 32 µg/ml MHK Gen: 0,25 µg/ml Ami: 16 µg/ml MHK Gen: 8 µg/ml Ami: 1 µg/ml Erhöhte Resistenzgenexpression durch Deregulation Repressorinaktivierung (marr, mexr, acrr, meci, ampd, tetr) Promotoraktivierung (pmeca, pbla-k1) PH2004, UniHH 6
7 Variabler Phänotyp als Folge von Punktmutationen Genlocus Expressionsstatus Äußere Membran Cytoplasmamembran Resistenzgenotyp MHK Cip [µg/ml] acrab acref acrr acra acrb tolc acrs acre acrf tolc schwach konstitutiv acrr - 0,015 0,06 nalb mexr mexa mexb oprm schwach konstitutiv mexr - 0,125 0,5 nfxb nfxc nfxb mexc mexd oprj + mext mexe mexf oprn reprimiert nicht aktiviert nfxb - PH2004, UniHH 7? 0, ,125 1
8 Aufnahme von Resistenzgenen Molekulare Epidemiologie von Resistenzeigenschaften Konjugation (Multiresistenzplasmide Enterobakterien) Transduktion chromosomale Fragmente (Pseudomonas) Transformation chromosomale Fragmente ( Pneumokokken) PH2004, UniHH 8
9 Erwerb neuer genetischer Information Erwerb eines resistenten Allels meca: dfr,sul: neues PBP2a neue DHFR, DHPS Alleler Austausch von Genfragmenten pbpx: Mosaik-Gene in S. pneumoniae Erwerb eines Resistenzgenclusters für enzymatische Targetmodifikation vana: D-Ala-D-Lac-Ligase PH2004, UniHH 9
10 Übertragung von Genfragmenten β-lactamresistenz bei S. pneumoniae S. pneumoniae S. oralis PBP2 Mutation PBP2-analog Mutation Mutation Transformation resistentes PBPX Mosaikgen Penicillinresistenter S. pneumoniae PH2004, UniHH 10 Hakenbeck, 1995
11 Spezifische Gensequenzen für Integron-vermittelte Resistenzgenmobilisierung R-Gen R-Gencassetten: aada, aadb, aaca, aacc, catb, cmla, dfra, dfrb sat qace Isoliertes R-Gen wird von Integron aufgenommen 59be IntI Integron-codierte Integrase schneidet R-Gen aus IntI pinti Integron atti pant Integron mit R-Gen Multiresistenz durch R-Gen-Kombinationen PH2004, UniHH 11
12 Molekulare Epidemiologie der vanr-gene bei Glycopeptidresistenten Enterokokken R-Gen- Mobilisierung intrazellulär natürliches vanr- Genreservoir 1. Genaustausch interzellulär 2. Selektion durch Futtermittelzusatz chromosomal.. Kontamination 1. Genaustausch interzellulär 2. Selektion durch Therapie 1. Aufnahme 2. Besiedlung PH2004, UniHH 12
13 Mechanismen induzierbarer Genexpression Über Attenuation (cis-elemente) ermc: erm-genexpression durch Makrolide Über Signaltransduktionwege (trans-elemente) mecr: vans/r: tetr, marr: Signal-transduzierendes PBP für PBP2a Zwei-Komponenten Signal-Transduktion für vana Effektorbindung an Repressor Über Genamplifikation (cis-elemente) bla, dfr: Erhöhung der Kopienzahl des Gens oder des Plasmids PH2004, UniHH 13
14 Welche genetischen Veränderungen sind mit welcher Technik nachzuweisen? Genetisches Ereignis Nachweismethode (Beispiele) Neue DNA - PCR mit spezifischen Primern RT-PCR (Taqman, Light-Cycler) Denaturierende HPLC-Detektion Massenspektrometrie Punktmutationen in residenter DNA Sequenzhomologie - Gewinnung von Template DNA wenige Hotspots - SNP-Nachweistechniken breite Distribution - Multiplex-PCR, Array-Techniken erhöhte Expression - mrna-quantifizierungstechniken Array-Techniken PH2004, UniHH 14
15 Molekulare Detektion von Resistenz z.b. β-lactamresistenz S. aureus: Pen R Nachweis des β-lactamasegens PCR Oxa R Nachweis des meca-gens PCR Nachweis des meca-expressionsstatus RT-PCR E. coli: Amp R Nachweis des β-lactamasegens PCR Typisierung des β-lactamasegens PCR, Array, Sequencing Nachweis des bla-expressionsstatus RT-PCR PH2004, UniHH 15
16 Vor- und Nachteile genetischer Resistenzbestimmung schneller Befund kombinierte Mechanismen erfassbar epidemiologisch verwertbare Aussage parallele Speciesidentifizierung unabhängig von der Kultivierbarkeit eines Erregers einsetzbar Nachweis neuartiger Mechanismen nicht gesichert Korrelation Phäno- Genotyp nicht vorhersagbar geringe Datenbasis Höhere Kosten (noch?) PH2004, UniHH 16
17 Ziele der PEG-Arbeitsgruppe Molekulare Methoden der Resistenzbestimmug Überblick über derzeit verfügbare genetische Methoden welche? Einsetzbarkeit? Standardisierbarkeit? Aufgaben zur Erreichung der Ziele Grundlagenforschung Methoden-(weiter)entwicklung Datenbankerstellung für Resistenzgene und -mutationen Definition von Anwendungsbereichen (Auswahlkriterien) klinische, diagnostische, epidemiologische Fragestellung Definition von Grenzwerten und Interpretationen Klinische Forschung Konsequenz aus Nachweis, Korrelation Genotyp-Resistenz Erarbeitung international kompatibler Daten PH2004, UniHH 17
18 Cases of therapeutic failure due to salmonella isolates with high ciprofloxacin resistance (MIC >4µg/ml) Patient, 39y, watery diarrhoea S. typhimurium DT204c cip R! co-amoxiclav! S. tym. cip R no prior quinolone treatment, S. Tym. eliminated! recovery MICcip pre > 32 µg/ml to post > 32 µg/ml (gyrase, perm. n.t.) Lontie et al., 1994 Patient, wound sepsis, nosocomial S. typhimurium DT204c cip R! cefotaxim! S. tym. cip R no prior quinolone treatment S. Tym. eliminated! recovery MICcip pre 32 µg/ml to post 32 µg/ml (gyrase, topoiv?) Heisig et al., 1995 PH2004, UniHH 18
19 Trends in low-level fluoroquinolone resistance of different salmonellae from human sources in UK [% isolates with MIC Cip >0.125µg/ml] S.enteritidis S.typhimurium S.hadar S.virchow Frost et al., 1996; Threlfall et al., 2000 PH2004, UniHH 19
20 Cases of therapeutic failure due to salmonella isolates with low-level fluoroquinolone resistance (MIC CIP >0.125µg/ml) Patient, 52y, aortic aneurism surgery, wound infection S.Typhimurium cip S! 200mg cip bid 10 d! S.Tym. cip IR persistence, azthreonam iv eliminated S.Tym.! recovery MICcip pre 0.03 µg/ml to post µg/ml (gyrase; perm?) Piddock et al., 1990; Gensberg et al., 1996 Patient, 61 y, chronic renal failure, diarrhoea, dehydration S.Typhimurium PT204 cip S! 100mg cip bid 8d! S.Tym. cip IR elimination at 6 d, return at 8 d! therapy stop! recovery MICcip pre 0.03 µg/ml to post 2 µg/ml (OmpF";gyrase?) Howard et al., 1990 Patient, 62 y, diarrhoea for 9 d, intestinal perforation, surgery S.Typhimurium DT104 cip IR! 250mg cip bid 5d! S.Tym. cip IR ctx/gen 4 d, cip 5 d! dead due to multi-organ failure MICcip pre 0.06 µg/ml to post µg/ml (gyrase) PH2004, UniHH 20 Mølbak et al., 1999
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