Charakterisierung von Chitosanen mittels FFF

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1 Charakterisierung von Chitosanen mittels FFF und Lichtstreumessung Thomas Jocks, Wyatt Technology Europe GmbH, Dernbach, Deutschland. Chitosane werden aus Chitin gewonnen. Chitin ist ein weit verbreitetes Biopolymer, das beispielsweise den Hauptbestandteil im Skelett von Gliederfüßern (Arthropoda), vor allem Insekten und Crustaceen, bildet. Chitosane haben auf verschiedensten Gebieten Anwendung gefunden, so etwa im Textil-, Kosmetik- oder Nahrungsmittelbereich bis hin zur Medizin. Deshalb ist es von wachsender Bedeutung, zur Kontrolle von Qualität und Herstellungsprozess eine umfassende und genaue Charakterisierung der Chitosane und ihrer hochmolekularen Komponenten zu gewährleisten. Im folgenden Beitrag wird dargestellt, wie sich dieses Ziel mithilfe der Feld-Fluss-Fraktionierung (FFF) in Kombination mit Mehrwinkel- Lictstreuungsmessung zu optimalen Ergebnissen umsetzen lässt. Chitin als Rohstoff Chitin ist ein weit verbreitetes Biopolymer und zählt neben Cellulose zu den wichtigsten nachwachsenden Rohstoffen. Chitin oder Poly(N-acetylglucosamin) ist der Hauptbestandteil des Exoskeletts von marinen Schalen- und Krustentieren sowie von Insekten, wird aber ebenso in Pilzen und Hefen gefunden. Chitosan ist das deacetylierte Chitin, das man aus Krabben- und Krebsschalen gewinnt. Es wird verwendet zur Wasseraufbereitung, in photographischen Emulsionen und zur Verbesserung der Färbefähigkeit von synthetischen Fasern und Textilien. Außerdem findet es Verwendung im medizinischen Bereich (z.b. zur Unterstützung der Wundheilung), als Bestandteil in kosmetischen Präparaten und als Lebensmittelzusatzstoff. Molmassenbestimmung wozu und wie? Die Kenntnis der Molmassenverteilung ist in vielen Fällen nützlich, um die Wirkung des Chitosans zu optimieren. 5

2 Größenausschlusschromatographie (GPC bzw. SEC) ist die gängige Methode zur Untersuchung des Chitosans, hat aber wesentliche Limitationen, besonders dann, wenn es um die Analyse hochmolekluarer Bestandteile geht. Im Folgenden wird gezeigt, dass durch die Feld-Fluss- Fraktionierung, gekoppelt mit einem Lichtstreudetektor, deutliche Fortschritte bei der Charakterisierung dieses Biopolymers erreicht werden können. Die Feld-Fluss-Fraktionierung (FFF) hat sich in den letzten Jahren als leistungsfähiges Verfahren zur Analyse von Polymeren und Partikeln etabliert. Mittels FFF können lösliche Bestandteile von Partikeln ohne vorherige Probenvorbereitung getrennt werden. Die Vorteile der Methode liegen auf der Hand: Flexible Trennung von inhomogenen Proben Enorm großer Trennbereich von einigen Nanometern bis einigen Mikrometern Fraktionen der getrennten Probe stehen für weitere Off-Line- Untersuchungen zur Verfügung (z.b. Elektronenmikroskopie, Massenspektroskopie etc.) Sie ist automatisierbar und kann auch im Routinelabor betrieben werden. Die Kopplung mit einem DAWN- Lichtstreudetektor erlaubt die absolute Bestimmung von Molmassen und Radien online, Chitin und Chitosan. Abbildung 1: Trennmechanismus der asymmetrischen Fluss-Feld Fluss Fraktionierung (afff). Das untere Bild zeigt den Kanal von der Seite. also während der Elution. Ein wichtiger Vorteil gegenüber der SEC: Der Rückgriff auf Standards oder theoretische Modelle ist hier nicht notwendig. Prinzip der FFF Bei der FFF handelt es sich um ein Verfahren, das der Flüssigkeitschromatographie ähnlich ist. Die Probe wird gelöst oder suspendiert in einen Kanal eingebracht. Die Unterseite des Kanals besteht aus einer Fritte, die mit einer Ultrafiltrationsmembran bedeckt ist. Ein Teil des Kanalflusses tritt nach unten aus und erzeugt so einen Querfluss, der in der ganzen Fläche des Kanals ein definiertes Kraftfeld senkrecht zur Transportrichtung erzeugt. Große Moleküle bzw. Partikel werden stärker als kleine an die untere Wand gedrückt und daher in den unteren Strömungsschichten nur langsam transportiert. Die kleineren Probenbestandteile, die sich höher im Kanal aufhalten, eluieren zuerst, weil ihr Transport durch den Kanal schneller verläuft (Abbildung 1). Wird in einem langen (ca. 30 cm), dünnen (ca. 300 µm) Kanal ein Fluss erzeugt, so bildet dieser ein laminares, parabolisches Flussprofil aus. Die Geschwindigkeit ist in der Mitte des Kanals am größten, an den Rändern null. Das anliegende Feld hier ein senkrecht dazu stehender Fluss übt eine Kraft auf die Teilchen im Kanal aus und bewegt diese in Richtung der Unterseite, wobei sich ihre Konzentration an der so genannten Akkumulationswand erhöht. Kleinere Teilchen befinden sich höher im Kanal, größere dagegen näher an der Akkumulationswand. Während dieses als Relaxation bzw. Fokussierung bezeichneten Prozesses findet kein Transport in Längsrichtung statt. Die Probe befindet sich am Kopf des Kanals. In der nachfolgenden Elutionsphase wird der Kanalfluss in Richtung Auslass zugeschaltet, die Trennkraft bleibt weiterhin bestehen. Die kleineren Teilchen werden wesentlich schneller transportiert als die größeren Partikel nahe der Akkumulationswand. Die Fluss-FFF ist die am weitesten verbreitete Form der FFF, da sie vergleichsweise einfach zu realisieren ist. Sie zeichnet sich durch einige Vorteile gegenüber der GPC aus: Es gibt keine obere Ausschlussgrenze; Teilchen mit einer Größe bis in den µm-bereich hinein können aufgetrennt werden. Es gibt keine Wechselwirkungen mit stationären Phasen. Die Trennleistung ist durch Variation der Flussraten einstellbar. Die Retentionszeit t r wird für die FFF durch die Flussraten und die Geometrien bestimmt: Dabei ist w die Höhe des Kanals, kt die thermische Energie, die Viskosität des Lösungsmittels, d der hydrodynamische Durchmesser des Teilchens und das Verhältnis von Quer zu Kanalfluss. Die Retentionszeit ist proportional zum Produkt aus der Teilchengröße und dem Verhältnis von Quer zu Kanalfluss. Damit ist das Elutionsverhalten über die Flussraten einstellbar. Polydisperse Proben können vermessen werden, indem der Querfluss über die Versuchszeit hinweg sukzessive reduziert wird. So lässt sich eine ausreichende Trennung für kleine Teilchen gewährleisten, und große Partikel können innerhalb tolerabler Messzeiten eluiert werden. 6 LC GC Ausgabe in deutscher Sprache Januar/Februar 2008

3 Prinzip der Lichtstreuung Statische Lichtstreuung beruht auf dem Prinzip der Dipolstrahlung. Ein einfallender Lichtstrahl regt alle Atome und die sie umgebenden Elektronenhüllen zur Schwingung an, wodurch diese Ladungsträger ihrerseits wieder Licht abstrahlen. Dieses abgestrahlte Licht aller Streuzentren interferiert und bildet so eine winkelabhängige Streuintensität. Betrachtet man die Streuung an einem Partikel, so ist das Streuverhalten von der Größe abhängig. Ist die Struktur klein gegen die Wellenlänge des einfallenden Lichtes, kann man die Phasenverschiebung des gestreuten Lichtes vernachlässigen. Die Interferenz für alle Streuzentren ist konstruktiv; das Streulicht damit winkelunanbhängig. Die Grenze dafür liegt bei einem Durchmesser d eingesetzte Wellenlänge /20. Für größere Teilchen nimmt die Lichtintensität mit zunehmendem Streuwinkel durch destruktive Interferenz ab. Je größer das Teilchen, desto größer diese Abnahme. Die Teilchengröße lässt sich also ermitteln, indem die Steigung der Intensität gegen den Streuwinkel aufgetragen wird. Die Funktion, welche die Winkelabhängigkeit mathematisch beschreibt, heißt Formfaktor und lässt sich aus der Teilchenstruktur berechnen. Für kleine Teilchen (d /20 ) ist der Formfaktor konstant gleich 1, für größere Teilchen ist er bei Streuwinkel 0 gleich 1 und nimmt danach ab. Die zeitlich gemittelte, gemessene Intensität ist proportional zum Produkt aus Molmasse, Konzentration und dem winkelabhängigen Formfaktor. Für Teilchen, die so groß sind, dass ihr Formfaktor nicht konstant ist, muss die Intensität für den Streuwinkel 0 bestimmt werden, indem der gemessene Winkelbereich auf 0 extrapoliert wird. Kopplung von FFF und Lichtstreuung Die Kopplung von FFF und Lichtstreuung ist der Kopplung von GPC mit Lichtstreuung ähnlich. Die Probe wird aufgegeben, durch die FFF getrennt und online mittels Lichtstreuung detektiert. Da zur Berechnung der Molmasse die Konzentration bekannt sein muss, wird diese in diesem Beispiel mit einem RI- Detektor gemessen (Abbildung 2). Im Gegensatz zur GPC können bei FFF-Läufen die Flussraten variiert werden, um die Probe bestmöglich aufzutrennen. Die Steuerung der Flüsse und Ventile erfolgt durch einen PC, der auch die Datenaufnahme und die Auswertung von Lichtstreuungs- und RI-Daten übernimmt. Einfluss von Zentrifugation Im Zuge der Methodenentwicklung wurde überprüft, ob die vorherige Zentrifugation der Probenlösungen das Ergebnis beeinflusst. Diagramm 1 zeigt den Vergleich zweier Experimente. Die Konzentrationssignale des RI-Detektors sind identisch, dagegen zeigt der Lichtstreudetektor im Bereich zwischen 23 ml und 44 ml eine signifikant höhere Streuintensität. Diese stammt von größeren Teilchen, deren Konzentration allerdings sehr gering ist. Die Lichtstreusignale skalieren mit Konzentration mal Molmasse oder mit der sechsten Potenz des Radius. Große Teilchen werden also schon in sehr geringer Konzentration Signale erzeugen. Aus den berechneten Molmassen lassen sich die differenziellen Verteilungen bestimmen, wie in Diagramm 2 gezeigt: Die beobachteten Molmassenverteilungen erweisen sich als nahezu identisch. Die höhermolekularen Anteile bei der unzentrifugierten Probe, die im Chromatogramm bei den Lichtstreusignalen erschienen, fallen nicht ins Gewicht, da ihre Konzentration zu gering ist. Zentrifugation ist ein geeigneter Schritt in der Probenvorbereitung, um wenige makroskopische Partikel zu entfernen, die in der Analyse der Größenverteilung ohnehin keine Rolle spielen. Der entscheidende Vorteil der FFF gegenüber der Säulenchromatographie ist aber, dass solche Partikel durchaus in das System injiziert werden können. Diagramm 1: Chromatogramm einer nicht zentrifugierten Chitosanprobe (rote Linie) und einer zentrifugierten. Die durchgezogenen Linien zeigen die Signale des 90 - Lichtstreu-Detektors, die gestrichelten die des RI-Detektors. Abbildung 2: Gesamtansicht des Wyatt Technology FFF-Systems Eclipse 3 mit Dawn HELEOS, Optilab rex und Agilent- Komponenten. Rechts ist der eigentliche Trennkanal sichtbar. Diagramm 2: Differenzielle Molmassenverteilung der zentrifugierten Probe (schwarz) und der unzentrifugierten Probe (rot). 7

4 Diagramm 3: Chromatogramme der vier verschiedenen Chitosan-Proben. Die durchgezogenen Linien zeigen das Signal des RI-Detektors, die gestrichelten die des 90 -Lichtstreudetektors. Diagramm 4: Berechnete Molmasse, aufgetragen gegen die Elutionszeit für die vier Chitosanproben. Gestrichelt unterlegt ist der Signalverlauf des RI-Detektors, der zur Konzentration proportional ist. Vergleich verschiedener Proben Die Proben wurden wie im vorherigen Abschnitt beschrieben gelöst; der Querfluss wurde ebenfalls von 1 ml/min auf 0,1 ml/min innerhalb 10 min reduziert und danach konstant gehalten. Diagramm 3 zeigt die Chromatogramme der Messungen: An den Chromatogrammen sind die unterschiedlichen Molmassen und Teilchengrößen der Proben bereits zu erkennen: Die Masse und Größe steigt bei der FFF-Separation mit steigender Elutionszeit an. Aus den Signalen von Lichtstreuung und RI-Detektor können nun für jedes Zeitintervall die Molmasse (Diagramm 4) und der Trägheitsradius (RMS, Diagramm 5) berechnet werden: Die Verläufe in Diagramm 4 und 5 sind keine Verteilungen, sondern zeigen lediglich an, wann welche Molmassen bzw. 8 LC GC Ausgabe in deutscher Sprache Januar/Februar 2008

5 Diagramm 5: Berechneter Gyrations-oder RMS-Radius, aufgetragen gegen die Elutionszeit für die vier Chitosanproben. Diagramm 6: Berechnete Molmassenverteilung der 4 Chitosanproben. Diagramm 7: Berechnete Radien-Größenverteilung der 4 Chitosanproben. Radien eluiert werden. Sie sind vergleichbar den Eichkurven zur GPC, wobei hier aber die Massen und Radien durch die Lichtstreuung direkt berechnet werden und nicht stoffabhängig sind. Aus den Informationen zu Masse, Radius und Konzentration lassen sich nun wiederum die differentiellen Verteilungen berechnen: Hier werden jetzt die Eigenschaften der verschiedenen Proben sichtbar. Probe 1 besteht nahezu ganz aus kleinen Teilchen (ca. 10 nm) mit kleiner Molmasse (ca g/mol) und einem geringen Anteil an hochmolekularen Teilchen. Die anderen Proben enthalten höhermolekulare Anteile, die über einen großen Massen- und Radienverlauf verteilt sind, dabei zeigen die Verteilungen wiederum deutliche Unterstrukturen. Die detektierten Größen erreichen bis zu 400 nm, einen Bereich, in dem eine Trennung mittels GPC nicht mehr möglich gewesen wäre. Zusammenfassung Die Kopplung von FFF und statischer Lichtstreuung ist eine optimale Methode, um die Massen und Größenverteilung von Chitosanen schnell und zuverlässig ohne Vorbehandlung zu bestimmen. Durch das automatisierte Verfahren lassen sich Einflüsse der Herstellung sofort nachweisen. Da sie keine obere Ausschlussgrenze hat, erlaubt die FFF hierbei Auftrennungen bis in den µm-bereich. Erfolgt die Analyse mittels statischer Lichtstreuung, ist keine Eichung des Systems notwendig, da Massen und Radien nach ersten physikalischen Prinzipien ermittelt werden. Bei der Auswahl des Detektors ist jedoch zu beachten, dass sowohl Anzahl der detektierten Streuwinkel als auch der Winkelbereich ausreichend groß sind, damit eine zuverlässige Vermessung gewährleistet ist. Thomas Jocks, Wyatt Technology Europe GmbH (WTE), ist Diplom-Biologe. In seiner Forschungstätigkeit befasste er sich mit der Rolle bestimmter molekularer Signalwege bei der Entstehung von Nierenkrankheiten (Promotion Hamburg 1997). Nach einigen Jahren der Labor- und Lehrtätigkeit in verschiedenen Institutionen leitet er heute das Scientific Marketing bei WTE. 9