7 Anhang A. 7 Anhang A. Abbildungsverzeichnis

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1 7 Anhang A Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Allgemeine chemische Struktur von PCDDs, PCDFs und TCDD... 2 Abb. 2: AhR-Signalkaskade und Blockierung des AhR durch AhRR modifiziert nach (Mimura und Fujii-Kuriyama, 2003)... 4 Abb. 3: Sekundärstruktur der Glukosetransporter Abb. 4: Multiples Alignment aller GLUT-Isoformen als Baumstruktur (Uldry und Thorens, 2004) Abb. 5: Verschiedene physiologische Aufgaben der GLUT (Uldry und Thorens, 2004) Abb. 6: Anordnung der GLUT-Proteine in der Mäuseblastozyste (modifiziert nach Pantaleon et al. 1998) Abb. 7: Herkunft und Differenzierungspotential totipotenter/pluripotenter embryonaler Zellen der Maus: ECC, ESC und PGC/EGC (Wobus, 1997) Abb. 8: Schematische Darstellung des Kulturablaufes zur spontanen Differenzierung von D3- ES-Zellen als embryoid bodies Abb. 9: Schema der Kultivierung von P19 zur Differenzierung in myogene Zellen Abb. 10: Photochemische Reaktion beim Caspase Glow Assay (Promega Corp, Mannheim) Abb. 11: Klonierungsstrategie des AhR-full size Abb. 12: Die Reporter-Vektoren und deren entsprechende Luziferase Reaktionen (BD Bioscience, Promega) Abb. 13: Aufbau des Western Blot Abb. 14: RT-PCR-Analyse der GLUT-Expression in D3 (A) und P19 (B)-Zellen Abb. 15: Detektion von GLUT4 im Western Blot Abb. 16: Lokalisation von GLUT1- und GLUT2-Protein in spontan differenzierenden EBs Abb. 17: GLUT3-Proteinlokalisation in spontan differenzierenden EBs Abb. 18: GLUT4-Protein in spontan differenzierten EBs Abb. 19: Kolokalisation des GLUT3-Protein mit zellspezifischen Markern Abb. 20: Zellspezifische Lokalisation von GLUT4 und Kolokalisation mit zelltypspezifischen Markern in spontan differenzierten und plattierten EBs Abb. 21: GLUT4 Kolokalisation mit GLUT1 und GLUT2 im 20d kultivierten EB Abb. 22: Morphologie von EBs unter Glukosemangel und Expression von SSEA Abb. 23: Quantifizierung des Oct-4 mrna-gehaltes in EBs unter Standard-Glc (4,5g) und Glukosemangel (1g) Abb. 24: Einfluss von Glukosemangel auf die mrna- und Protein-Expression von GLUT1, 3 und Abb. 25: Zellproliferation von P19-ECC unter Zugabe von TCDD Abb. 26: Bestimmung der Kaspaseaktivität in P19-ECC Abb. 27: Schema der AhR-Signalkaskade Abb. 28: RT-PCR-Analyse der AhR-Signalmoleküle in D3- und P19-Zellen Abb. 29: Relative mrna-menge von CYP1A1 in Abhängigkeit von der TCDD-Konzentration Abb. 30: Relative CYP1A1-Transkriptmenge nach 1 bis 24h in Kultur mit 10nM TCDD in P19- ECC Abb. 31: Quantifizierung der mrna-menge von CYP1A1 nach Inhibierung des AhR mit α-nf Abb. 32: Detektion der AhR-Translokation nach TCDD-Wirkung Abb. 33: Luziferaseaktivität von TCDD stimulierten P19-ECC Abb. 34: Bestimmung der Anzahl kontraktiler Kardiomyozytenzentren während der myogenen Differenzierung von P19-ECC I

2 Abb. 35: CYP1A1 mrna-expression während der myogenen Differenzierung und unter TCDD-Einfluss...66 Abb. 36: mrna-menge von α-mhc, MyoD und Mash-1 während der myogenen Differenzierung von P19-ECC...68 Abb. 37: Expression von GLUT1-mRNA (A) und -Protein (B) in myogen differenzierenden P19-ECC...70 Abb. 38: GLUT3 mrna- und Proteinexpression während der myogenen Differenzierung...71 Abb. 39: GLUT4 mrna- und Proteinexpression während der myogenen Differenzierung...72 Abb. 40: GLUT8 mrna-expression während der myogenen Differenzierung...73 Abb. 41: Einfluss von TCDD auf die GLUT1-, GLUT3- und GLUT4-Lokalisation in 5+5d myogen differenzierten EBs...74 Abb. 42: Lokalisation von EGFP-GLUT1 nach 5h, 15h und 25h...75 Abb. 43: Insulin-Einfluss auf die Lokalisation von EGFP-GLUT1 in P19-ECC nach 25h TCDD...76 Abb. 44: α NF-Einfluss auf die Lokalisation von EGFP-GLUT1 in P19-ECC nach 25h TCDD...77 Abb. 45: Expression von GLUT4-EGFP in P19-ECC unter TCDD- und Insulin-Einfluss...77 Abb. 46: Expression von GLUT4-EGFP in P19-ECC unter TCDD- und Insulin-Einfluss...78 Abb. 47: GLUT1 Immunfluoreszenz in P19-ECC nach TCDD Inkubation...79 Abb. 48: Detektion der Phosphorylierung von Akt in P19-ECC...80 Abb. 49: Glukoseaufnahme von 2d und 5d EBs 3 H-OMG-Uptake...81 Abb. 50: Modell der GLUT-Lokalisation im 9d EB...89 Abb. 51: Sequenzierung des XRE-Elementes im ptal-luc Vektor... XII Abb. 52: pegfp-vektor mit der multiplen Klonierungsstelle (nach BD Bioscience)... XII Abb. 53: Sequenz mglut1... XIII Abb. 54: GLUT4-Sequenz... XIII Abb. 55: mahr-sequenz...xiv Abb. 56: Auftrennung der Restriktion für GLUT1, GLUT3 und GLUT8 im 2,2%igem Agarosegel...XIV Abb. 57: Auftrennung der Restriktion für CYP1A1, CYP1B1, AhR, ARNT und IR im 2,2%igem Agarosegel...XIV Abb. 58: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der GLUT4-Sequenz der Maus (Acc. No. BC014282)...XV Abb. 59: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der IGF1R Sequenz der Maus (Acc. No. NM_ )...XVI Abb. 60: Auftrennung der GLUT4-cRT-PCR auf EB im 2,2%igem Agarosegel...XVI Abb. 61: Mathematische Auswertung der GLUT4-cRT-PCR für EB 6d kultiviert mit 4,5g/l Glukose... XVII Abb. 62: Modell eines Amplifikationsdiagramms mit den Begriffen, die in der Real-Time PCR benutzt werden (nach PE Biosystems)... XVIII Abb. 63: Auftragung des Logarithmus der eingesetzten cdna Mengen (Ausgangskonzentration 2µg/100µl) gegen den CT Wert und Angabe der Geradensteigung im Rechteck... XVIII Abb. 64: Auftrennung der Real-time PCR Produkte auf einem 2%igem Agarosegel...XIX Abb. 65: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der 18S RNA Sequenz der Maus (Acc. No. BK )...XX Abb. 66: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der CYP1A1 RNA Sequenz der Maus (Acc. No. NM_ )...XX Abb. 67: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der CYP1A1 RNA Sequenz der Maus (Acc. No. NM_ )...XX Abb. 68: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der GLUT1 Sequenz der Maus (Acc. No. NM )...XX II

3 Abb. 69: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der GLUT3 Sequenz der Maus (Acc. No. X )... XX Abb. 70: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der GLUT4 Sequenz der Maus (Acc. No. XM )...XXI Abb. 71: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der GLUT8 Sequenz der Maus (Acc. No. AF202361)...XXI Abb. 72: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der Mash-1 Sequenz der Maus (Acc. No. NM_ )...XXI Abb. 73: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der α MHC Sequenz der Maus (Acc. No. NM )...XXI Abb. 74: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der MyoD1 Sequenz der Maus (Acc. No. NM_ )...XXII Abb. 75: Vergleich der Sequenz des PCR-Produktes mit der Oct-4 Sequenz der Maus (Acc. No. S78374)...XXII III

4 Tabellenverzeichnis Tab. 1: Übersicht über die GLUT-Isoformen in humanen Geweben (Brown, 2000; Uldry und Thorens, 2004)...11 Tab. 2 Primer zur Amplifikation und Klonierung von GLUT1, GLUT4 und AhR...27 Tab. 3: PCR-Primer...32 Tab. 4: Oligonukleotide zur Herstellung der Deletionsstandards für GLUT1- GLUT Tab. 5: Primersequenzen für die Real-time PCR...35 Tab. 6: Übersicht über die verwendeten Antikörper für Western Blot und IHC...45 Tab. 7: mrna Quantifizierung für GLUT1, 3, 4 und 8 unter Glukosemangel...55 Tab. 8: Vergleich der GLUT Expression in 9d D3-EBs mit der Mausblastozyste...88 Tab. 9: Expression der GLUT unter Glukosemangel in adulten Zellen/Geweben...91 Tab. 10: Beispiele für AhR/CYP1A1-Studien mit verschiedenen AhR-Liganden...95 Tab. 11: Übersicht der DNA-Fragmentgrößen bei spezifischer Spaltung der PCR-Produkte...XV Tab. 12: Berechnung von CT für CYP1A1 von P19-EC-Zellen kultiviert für 1h mit 10nM TCDD bezogen auf die Expression von ECC kultiviert unter Standardbedingungen... XVIII Tab. 13: Berechnung von CT für CYP1A1 von P19-EC-Zellen kultiviert für 1h mit 10nM TCDD bezogen auf die Expression von ECC kultiviert unter Standardbedingungen...XIX Tab. 14: Berechnung der relativen mrna-expression für CYP1A1 von P19-EC-Zellen kultiviert für 1h mit 10nM TCDD bezogen auf die Expression von ECC kultiviert unter Standardbedingungen...XIX IV

5 Abkürzungsverzeichnis 3-OMG 3-ortho-methyl D-glukose Abb. Abbildung AhR arylhydrocarbonreceptor AK Antikörper aqua dest. destilliertes Wasser ARNT arylhydrocarbonreceptor nuclear translocator AS Aminosäure ATP Adenosintriphosphat b(p) Basen(paare) ca. circa cdna komplementäre Desoxyribonukleinsäure CDS codierende Sequenz crt-pcr kompetitive Reverse Transkriptase Polymerase-Ketten-Reaktion CT cycle treshold CYP1A1 Cyptochrom P450 1A1 d Tag DEPC Diethylpyrocarbonat DNA Desoxyribonukleinsäure dntp Desoxynukleotidtriphosphat DMEM Dulbecco`s modified eagle medium DMSO Dimethylsulfoxid DTT Dithiothreitol EB Embryoidkörper (embryoid body) EDTA Ethylendiamintetraacetat ECC embryonale Karzinomzellen (embryonic carcinoma cells) EC Zellen embryonale Karzinomzellen ESC embryonale Stammzellen (embryonic stem cells) ES-Zellen embryonale Stammzellen FCS fötales bovines Serum (fetal calf serum) FL feeder layer Zellen Glc Glukose Glc - Glukosemangel GLUT diffusionsabhängige Glukosetransporter h Stunde HE-Färbung Hämalaun-Eosin-Färbung HCl Salzsäure HMIT H + -Myo-Inositol-Transporter HRP Meerrettichperoxidase IF Immunfluoreszenz IHC Immunhistochemie IPTG Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranosid KLSM Konfokales Laser Scanning Mikroskop K m Michaelis-Menten Konstante (m)m (Milli)molar (m)rna (messanger)ribonukleinsäure MTT mitochrondrialer Toxizitätstest Mtw. Mittelwert NCBI National Cancer Biology Institute V

6 OT Objektträger PAHs polycylcische aromatische Kohlenwasserstoffe (polycyclic aromatic hydrocarbons) PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung (phosphat buffered saline) PCB polychlorierte Biphenyle PCDD polycchlorierte-dibenzo-dioxine PCDF polychlorierte-dibenzo-furane PCR Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction) PFA Paraformaldehyd PP-Röhrchen 15 bzw. 50ml Polypropylenröhrchen re. E. relative Einheiten rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) RA Retinsäure RT Reverse Transkriptase Reaktion SDS Sodiumdodecylsulfat SEM. Standardfehler des Mittelwertes SGLT Natrium-abhängiger Glukosetransporter SLC2 Genname humaner GLUT sog. sogenannt Tab. Tabelle TAE tetra-aminoethylen TCDD 2,3,7,8 tetrachloro-dibenzo-p-dioxin TCDF tetrachloro-dibenzo-furane TEMED N,N,N`,N`-teramethylethylendiamin TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan U Unit vgl. vergleiche WHO Weltgesundheitsorganisation X-Gal X-Galactosamin XRE xenobiotic response element Abkürzungen der verwendeten Aminosäuren im ein und drei Buchstabencode D Asp Aspartat E Glu Glutamin V Val Valin Abkürzungen der DNA Basen im ein Buchstabencode A Adenin C Cytosin T Thymin G Guanin VI

7 Geräte- und Softwareverzeichnis Geräte ABI-PRISM 5700 Sequence Detection System Axiocam Digitalkamera Bio-Rad Gene Pulser ELISA Plattenreader Fluoreszenzmikroskop Axioplan Gelkammer Inkubatoren Kühlzentrifugen Luminometer Mikrotom Neubauer Zählkammer NOVEX Gelkammern Spektrometer Thermocycler Ultra-Turrax T25 Zentrifuge Software Bio1D Software Generunner Software 3.05 Software Axiovision 2.05 Oligo6 Primer Express Softwarev2.0 Sigma Plot Sigma STAT Applied Biosystems, Darmstadt, Zeiss, Jena, Bio-Rad Laboratories GmbH, München, SLT Labinstruments, Crailsheim, Zeiss, Jena, Biometra, Göttingen, Haereus Holding, Haereus Holding, Berthold Detection Systems, Pforzheim, Medizinische Diagnostik-Methoden GmbH, Giessen, Invitrogen, Karlsruhe, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, TRIO-Thermoblock, Biometra, Göttingen, Janke & Kunkel GmbH & Co. KG - IKA- Labortechnik, Staufen, Germany Biofuge, Haereus Holding, LTF, Wasserburg, Hastings Sofware Inc., USA Zeiss, Jena, Molecular Biology Insights, Inc., USA Applied Biosystems, Darmstadt, SPSS Inc., USA SPSS Inc., USA VII

8 Chemikalien- und Verbrauchsmaterialienverzeichnis 7-Amino-Actinomycin-D (7-AAD) Acrylamid Agarose Ammoniumpersulfat Ampicillin α-naphtoflavon APES (3-(Triethoxysilyl)-propylamin) Bakteriologische Kulturschalen 60ml Bleichlorid β-mercaptoethanol Bromphenolblau Caspase Glo 3/7 Assay System Chlorhydrat Citronensäure Coomassie Deckgläschen DEPC Di-Natriumhydrogenphosphat DMSO (Dimethlsulfoxid) DNase I dntp (100mM) DTT Dual Luciferase Assay System Dulbecco`s modified Eagel`s medium e-amino-n-capronsäure ECL-System EDTA Einwegspritze Eisessig Ethanol VIII Molecular Probes, Eugene, USA Biozym Scientific GmbH, Oldendorf Merck KGaA, Darmstadt, Serva GmbH, Heidelberg, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Merck KGaA, Darmstadt, β-me, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Fluka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz Promega GmbH, Mannheim, Merck KGaA, Darmstadt, Merck KGaA, Darmstadt, Biomol GmbH, Hamburg, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Fermentas GmbH. St. Leon-Rot, Promega GmbH, Mannheim, DMEM, Invitrogen, Karlsruhe, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Omnifix, B. Braun Melsungen AG,

9 Ethidiumbromid EZ4U Kit Formaldehyd fötales Kälberserum Gene Pulser Küvetten GFX Micro Plasmid Prep Kit 3-O-Methyl-D-Glukose 3-O-Methyl-D-[1-3 H]Glukose Glycerol Guanidiniumthiocyanat Hämatoxylin Hefe-Extrakt Igepal Ca-630 IPTG Iscove modified Dulbecco s medium Isopropanol Kaliumacetat Kalium-Aluminium-Sulfat Kaliumchlorid Kalium-di-hydrogenphosphat Kalziumchlorid L-Glutamin Magnesiumsulfat Mangan(II)chlorid-dihydrat (Manganchlorid) Methanol (100%) Mineralöl MOPS (3-[N-Morpholino]propanesulfonic acid) Natriumacetat Natriumchlorid Natriumchlorid Natriumcitrat Biomedica, Wien, Österreich Merck KGaA, Darmstadt, FCS, ausgewählte Charge Biochrom AG, Berlin, Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Serva GmbH, Heidelberg, Merck KGaA, Darmstadt, IMDM, Invitrogen, Karlsruhe, Serva GmbH, Heidelberg, Merck KGaA, Darmstadt, Serva GmbH, Heidelberg, Invitrogen, Karlsruhe, Merck KGaA, Darmstadt, IX

10 Natrium-Deoxycholat Natriumiodat Natriumlaurosylsarcosinat Nicht essentielle Aminosäuren Nylon-Membran Opti-MEM Medium Pap-Pen Paraffin Paraformaldehyde pegfp-c3 Vektor Pepton pgemt-vektor Kit Phenolgemisch (Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 ph 8.0 Pikrinsäure PP-Röhrchen steril 2ml Cryo, 15ml, 20ml Primer prl-sv40 Vector Proteinmarker: mid-range Marker ptal-luc Vektor Quia Quick Gel Extraction Kit Restriktionsenzyme RNAse-Inhibitor Rubidiumchlorid Salzsäure (36%) Sodium-dodecyl-sulfat Streptomycin/Ampicillin Sucrose Superscript II SYBR green Master Mix Taq DNA Polymerase Techn. Essigsäure TEMED (tetra-ethyl-methyl-ethylen-diamin) Tetrachlorodibenzopdioxin Tris Base Tris HCl Tris-Base X Serva GmbH, Heidelberg, Merck KGaA, Darmstadt, NEAA, Invitrogen, Karlsruhe, Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Invitrogen, Karlsruhe, DAKO Diagnotika, Hamburg, Merck KGaA, Darmstadt, Merck KGaA, Darmstadt, BD Biosciences, Franklin Lakes NJ, USA Promega GmbH, Mannheim, Merck KGaA, Darmstadt, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Promega GmbH, Mannheim, Bio-Rad Laboratories GmbH, München, BD Biosciences, Franklin Lakes NJ, USA Quiagen GmbH, Hilden, Germany Fermentas GmbH. St. Leon-Rot, Promega GmbH, Mannheim, Merck KGaA, Darmstadt, SDS, Serva GmbH, Heidelberg, Strep/Amp, 5000units/ml Amp, 5000µg/ml Strep, Invitrogen, Karlsruhe, Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Invitrogen, Karlsruhe, Applied Biosystems, Darmstadt, Invitrogen, Karlsruhe, Serva GmbH, Heidelberg, Amchro, Bad Soden, Serva GmbH, Heidelberg, Serva GmbH, Heidelberg,

11 Trypsin XGAL Zellkulturmikrotiterplatten 96er Zellkulturmultiplatten 24er Zellkulturschalen 60mm Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, TPPS Biochrom KG, Berlin, TPPS, Biochrom KG, Berlin, Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, XI