Methodik der Genomsequenzierung

Transkript

1 WS2014/2015 Genomforschung und Sequenzanalyse - Einführung in Methoden der Bioinformatik- Thomas Hankeln Methodik der Genomsequenzierung

2 Meilensteine Phi X bp λ Phage bp M. genitalium bp H. influenzae bp M. jannaschii bp S. cerevisae bp E. coli bp C. elegans bp D. melanog bp A. thaliana bp H. sapiens bp Geht 2012 die > 1000genomes Ära der Genomforschung project (human) zu Ende? soon > Genome 10K (vertebrates)

3

4 How hemp got high: Cannabis genome sequenced van Bakel et al., Genome Biology 2011

5 Methodik der Genomsequenzierung zu sequenzierende DNA muss zunächst in handliche Abschnitte zerlegt und dann vermehrt werden (beim Sanger-Verfahren durch Klonierung oder bei Next-Generation Sequencing (NGS) meist durch PCR) DNA kann mit dem klassischen Sanger-Verfahren in Teilabschnitten von Bp ( long reads ) sequenziert werden. NGS-Verfahren lesen derzeit meist kurz (z.b. 50 bis 250 Bp; = short reads ) oder auch mittel-lang ( Bp)

6 Genome sequencing: Re- or de novo EX EX EX or T T A A reference genome genomic DNA reads cdna reads genome skimming SNP detection differential gene expression (RNA-Seq) Contig 1 Contig 2 NNN Scaffold genome draft de novo genome gene discovery genome evolution

7 Re- vs. de novo-sequencing Martin JA, Wang Z, Nature Reviews Genetics 2011

8 Targeted re-sequencing requires a priori knowledge of target to be sequenced (e.g. exons) similar to PCR, but based on target enrichment by hybridization

9 Transcriptome analysis (RNA-Seq) Raw read counts normalized per 1 kb exon size and 1 mio reads RPKM = reads per Kb exon sequence and 1 mio reads

10 de novo...

11 Shotgun- Strategie

12 Shotgun-Mathematik: Wieviel? Lander and Waterman 1988, nach IMB Jena

13 Genome sequencing stats Redundancy (depth of coverage) Genome coverage 10x 20x Coverage ca 90% gap Contig N50 size (bp): minimum size of the top largest contigs which cover 50% of the assembly size

14 Shotgun-Sequenzassemblierung Der klassische Ansatz de novo: ein Puzzle... Stücke anschauen, optisch vergleichen, > ausprobieren, wo sie denn passen passende Stücke zusammenfügen Overlap - Layout - Consensus

15 Assemblierung der Gesamt- sequenz aus Einzel-Reads ATGGCCTCGTCAATGCATG CCGGTGCATGCATGGCCTCGTCAA Suche nach einander überlappenden Reads = local alignment ATGCGGTTGCTACGT ATCGGTGACCA ATTCATGCGGTTGC CGTCGTATCG GACCACGGTT TCATGCGG ACGTCGT TCGGTGACCACGGTT ATTCATG GGTTGCTAC CGTATCG ACCACGG ATTCATGCGGTTGCTACGTCGTATCGGTGACCACGGTT Rekonstruktion der Gesamtsequenz = multiple sequence alignment ( contig = contiguous sequence) sieht zunächst mal einfacher aus, als es ist.

16 Assemblierung von Sequenzen: suche den shortest common superstring Sequenz-Reads als Knoten Überlappung als Kanten Hamilton-Pfad passiert jeden Knoten nur einmal! Konsensus-String aus Hamilton-Pfad ergibt die gesuchte Gesamtsequenz. Aber: Dieses traveling salesman problem ist NP-schwer!!

17 HAMILTON PFAD: Probleme durch Repeats Repeat Repeat Repeat Jeder Sequenz-Read wird durch einen Knoten repräsentiert. Knoten aus Repeats sind mit vielen anderen Knoten assoziiert. Finde den Pfad, der jeden Knoten einmal passiert

18 Umgang mit Repeats Besonders problematisch, wenn > Repeats länger als Leseweite sind > Repeats fast identisch sind falsches alignment aufgrund starker Ähnlichkeit repetitiver Sequenzkopien 10 Überproportionale Redundanz im Alignment zeigt problematische Stellen mit Repeats an 20

19 DNA hat zwei Stränge... Aufgrund der zufälligen Orientierung der DNA-Integrate im Vektor bei der Klonierung (und der Sequenzierung eines Plasmids sowohl mit dem Forward-Primer als auch mit dem Reverse-Primer) werden beim shotgun-verfahren mal der Watson-DNA-Strang, mal der Crick-DNA-Strang sequenziert. Dies gilt im Prinzip auch für die per PCR hergestellten NGS-Reads. Da jeder Read von 5 nach 3 gelesen wird, haben die assemblierten Sequenzen unterschiedliche Pfeil-Orientierungen.

20 Assemblierung bei 2 Strängen Reads = { TTACTAC, TTTTATG, GCATGCC, TAAGGTT, ACCCCAG, GCATGCA } AACCTTACTACTGGGGTTTTATGCATGCATGCC TTGGAATGATGACCCCAAAATACGTACGTACGG Der Assembly-Algorithmus muss automatisch die Reads und ihre Reverse Complements vergleichen. Er schreibt dann allerdings nur einen Strang (wählbar) auf: AACCTTACTACTGGGGTTTTATGCATGCATGCC

21 Die Abdeckung der Gesamtsequenz erfordert eine Redundanz 4-fache Redundanz 8-fache Redundanz Ideal zur Absicherung der Sequenz an jeder Position ist eine Redundanz von 10x (Sanger) bzw x (NGS)! Problem: Aufwand, Kosten! (v. a. bei Sanger)

22 Umgang mit methodischen Fehlern ATGCCTTGACTGC-TT GAC-GCGTTGCTAAATGC CGTTGCGAAACGCTCGATGC GAAACGCTGGATGCAGTCGCGCGC ATGCCTTGAC t GCGTTGC GAAA CGCT sgatgcagtcgcgcgc Einzelsequenzen enthalten üblicherweise Fehler. Der Algorithmus muss also nach definierten Kriterien Reads alignen und danach eine Konsensus-Sequenz erstellen. > PHRED-Qualitätswerte benutzen!

23 Weitere mögliche Probleme des shotgun -Verfahrens physikalische Lücken : manche Sequenzbereiche sind nicht abgedeckt andere Vektoren nehmen (Sanger) PCR statt Klonierung NGS-Verfahren: andere library Sequenzierungslücken : manche Sequenzabschnitte (z.b. inverted repeats, stark GC-reiche DNA etc) lassen sich nicht sequenzieren andere Sequenziertechnik verwenden

24 Bitte umsteigen Die Kosten für das Schließen der letzten Lücken steigen exponentiell an!!! Umsteigen auf gerichtete Strategie (Primer Walking) ab 6-8x Redundanz bei Sanger-Projekten ab 100x Redundanz bei NGS Roach, Genome Res. 5: 464

25 Weitere Probleme des klassischen shotgun -Verfahrens chimäre Matrizen: Beim Klonierungsprozess* werden eigentlich nicht-zusammenhängende Genomabschnitte artifiziell ligiert Wohin soll Sequenz 2 bei Assemblierung zugeordnet werden?? *nur relevant bei Sanger-Sequenzierung

26 Assemblierung: was tun? (OLC) 1. Vorprozessierung der Reads: Vektor-Anteile (Sanger) und schlechte Abschnitte von Reads vorab entfernen > PHRED-Bewertung kontaminierende Sequenzen (z. B. aus E. coli) erkennen/ entfernen > z. B. BLAST gegen E. coli-sequenz

27 Assemblierung: was tun? > nicht alle Reads paarweise vergleichen (N 2 /2), d. h. paarweises SW-Alignment zu aufwändig > stattdessen ähnlich FASTA vorgehen (linearer Aufwand): 1. Erstellung eines k-mer-index jeder Sequenz 2. Sortieren der identischen k-mers: > häufige k-mers (repeats?) aussortieren > Reads mit mehreren passenden k-mers identifizieren > banded SW machen > falls Min-Score überschritten, ist paarweiser overlap für weiteres Assembly festgelegt

28 Assemblierung: was tun? Greedy algorithms beginnen mit besten Alignments, dann schrittweise die schlechteren (nutzerdefiniert) dazu nehmen. Kein richtiges MSA, sondern optimalen Pfad entlang der Reads suchen! (traveling salesman-graph)

29 Dabei a priori-information nutzen!

30 Assemblierung: was tun? Assembly kontrollieren durch paired end -Information: Forward- und reverse-reads aus einem Klon oder einem PCR- Amplifikat (NGS) dürfen im Assembly nur in definiertem Abstand (= Insert- bzw. Amplikon-Größe) angeordnet sein!!! Passt dies nicht, so wird der Contig aufgelöst! Durch paired-end -Reads können zwei Contigs trotz Lücke dazwischen in korrekter Reihenfolge angeordnet werden (= scaffolding)!

31 Assemblierung: was tun? Chimäre Reads erkennen und auflösen: Chimärer Read Ein weiterer Read n existiert nicht > also Contig sicherheitshalber auflösen!!

32 Assemblierung: was tun? Fehler der Einzel-Reads automatisch korrigieren oder Contig auflösen:

33 Assemblierung: was tun? Für das Anordnen von Contigs relativ zueinander (= scaffolding) die long range -Information von sog. nutzen:

34 Ein klassisches OLC-Programm (ARACHNE, Genome Res. 12: , 2002) Test: Assembly des 120 Mb-Drosophila-Genoms aus Reads mit 10facher Abdeckung aus Sanger-Reads (ca 1.7 Mio) 98% Überdeckung, 678 Contigs > 99,99% accuracy (d.h > 1 Fehler / Bp) ca. 1 Assembly-Fehler pro 1 Mb...aber das Drosi-Genom ist klein und arm an Repeats...

35 Lander and Waterston 1988, Roach et al. 1995, Green E Genome sequencing stats C-fold coverage = Length of reads x No of reads / Genome size Mammalian genome 3Gb Illumina reads 2x150 bp 10 fold redundancy 200 mio PE reads needed (= 3600 ) Probability of a base not sequenced P = e -C

36 Illumina HiSeq2000 flowcell with 8 lanes 22. Dez 2010

37 Pevzner et al. (2001) PNAS 98: 9748 Der traveling salesman wird ein chinese postman Hamilton Geht einmal jede Kante (Strasse), darf aber Knoten mehrfach besuchen. (= Euler-Pfad: Haus vom Nikolaus ) de Bruijn Graph Hierfür gibt es effiziente Lösungen mit linearem Aufwand!

38 Euler-Pfad-Assemblierung

39 Euler-based Assembly Tools

40 Sequencing technology: A million-fold improvement! Nature 458: 719 my diploma thesis: 1kb Maxam-Gilbert, 4 weeks (day & night in the isotope lab)

41 NGS technology: How to... tedious cloning high chemical costs slow electrophoresis PCR or even single molecules extreme miniaturisation massively-parallel read-out

42 Current Technologies (2nd Gen) 454 Roche LifeTech Ion Torrent Illumina good ol Sanger DNA matrix emulsion PCR emulsion PCR bridge PCR plasmid clones, PCR sequencing method seq-by-synthesis: Pyrosequencing seq-by-synthesis: proton release seq-by-synthesis: reversible Dye- Terminators seq-by-synthesis Dye-terminator 96 capillaries read length av. 600 bp (up to 1000) up to x 100 bp (up to 2x 300) up to 1200 bp reads up to 1.5 Mio up to 11 Mio up to 6 Billion 96 per run data up to 600 Mbp up to 1 Gbp up to 600 Gbp 0.1 Mbp runtime 10 hrs 90 min 11 days 2 hrs

43 1st step: Template production Example: emulsion PCR (454, Proton/PGM & SOLiD) Fragmentation Adapter ligation Water-in-oil emulsion ~1 ssdna/bead PCR with primers A and B 28 um bead

44 2nd step: Sequencing without gel separation Example: 454 Pyro-Sequencing (Ronaghi et al. 1996, 1998) Add 1 of 4 dntps if correct > PPi release PPi + Adenosine-5- Phosphosulfate (APS) > ATP ATP > LIGHT WASHING: Apyrase cleaves dntp and ATP

45 Pyro-Sequencing: Flowgram cyclic addition of the 4 nucleotides (T > A > C > G) The sequence of this flowgram reads: 5 -TCAGTAACTTTCG.-3 Problem: homopolymer runs > 6-8 nt

46

47 Life Tech s Ion Torrent Personal Genome Machine & Proton nukleotide incorporation > proton release > change in ph

48

49 Illumina Sequencing - principle your DNA Library Preparation input: 500 ng DNA 1 ug total RNA bridge PCR on flowcell A G T T C C C G A G A G C T G T A C G A T C A C C C G A T C G A A Seq-by-synthesis light

50 Illumina Sequencing Add the 4 dye-terminators A C G T Cleave off fluorophore and terminator moiety Add fresh dye-terminators Round 1 Round 2 Signal detection 1 Signal detection 2

51 Illumina-Sequenzierung 1 Lane flowcell

52 Illumina-Sequencing 9 cycles shown, two cluster position marked... The sequence of each cluster is determined by consecutive images.

53 Real data... quality...imaging and base calling are not trivial! 1 lane > on average mio paired-end reads

54 raw data (old chemistry) Real data... Typical Run Q30 Gb / flowcell 50 nt single read % Gb 100 nt paired end % Gb A"er quality trimming 0.1 % error (Q30) 1 % error (Q20)

55 Illumina Library-Preparation gdna, cdna, plasmids, amplicons... DNA fragmentation end-repair A-tailing adapter-ligation index index up to 96 indices size selection e.g bp enrichment flow cell

56 Illumina Library-Preparation Genom-DNA oder cdna ATTGCGTAGCATCGCGATACGACGTGCTAGATGACTGATCGTACGACGATGATGATCGAGTAGCATGCTCATTGCGTAGCATCGCGATACGACGTGCTAGATGACTGATCGT TAACGCATCGTAGCGCTATGCTGCACGATCTAGTGACTAGCTAGCTGCTACTACTAGCTCATCGTACGAGTAACGCATCGTAGCGCTATGCTGCACGATCTAGTGACTAGCA Fragmentierung ATTGCGTAGCATCGCGATACGA TAACGCATCGTAGCGCTATG CTGATCGTACGAC AGTGACTAGCTAGCTG AGTAGCATGCT TCATCGTACGAGTAACGCA CGTGCTAGATGA CTGCACGATCT GATGATGATCG CTACTACTAGC CATTGCGTAGCATCGCGATACGACGTGCTAGATGACTGATCGT TCGTAGCGCTATGCTGCACGATCTAGTGACTAGCA Nach Größe sortieren CATTGCGTAGCATCGCGATACGACGTGCTAGATGACTGATCGT TCGTAGCGCTATGCTGCACGATCTAGTGACTAGCA ATTGCGTAGCATCGCGATACGA TAACGCATCGTAGCGCTATG AGTAGCATGCT TCATCGTACGAGTAACGCA CTGATCGTACGAC AGTGACTAGCTAGCTG CGTGCTAGATGA CTGCACGATCT gewünschte Fraktion extrahieren (normalerweise 150 bis 200 bp) GATGATGATCG CTACTACTAGC

57 Illumina Library-Preparation Extrahierte Fraktion AGTAGCATGCT TCATCGTACGAGTAACGCA CTGATCGTACGAC AGTGACTAGCTAGCTG CGTGCTAGATGA CTGCACGATCT Enden behandeln AGTAGCATGCTA ATCATCGTACGA CTGATCGTACGACA AGACTAGCTAGCTG CGTGCTAGAA AGCACGATCT Fragmente mit Y-Adaptern ligieren 3 -TCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC-5 CTGATCGTACGACA AGACTAGCTAGCTG PCR: Zyklus 1 ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGATCGTACGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAGACTAGCTAGCTGTCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC DNA-Strang mit 2 unterschiedlichen Enden (das reziproke Produkt des anderen Strangs ist nicht gezeigt)

58 Illumina Library-Preparation DNA-Strang mit 2 unterschiedlichen Enden ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGATCGTACGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAGACTAGCTAGCTGTCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC PCR: Zyklen 2+ AATGATACGGCGACCACCGAGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT > AATGATACGGCGACCACCGAGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGATCGTACGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTTGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAGACTAGCTAGCTGTCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC < TCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC PCR: Zyklen 2+ einzigartiger Bereich des Adapters ROT zu sequenzierender Bereich einzigartiger Bereich des Adapters GRÜN AATGATACGGCGACCACCGAGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGATCGTACGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTTGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAGACTAGCTAGCTGTCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC durch PCR angehängt (enthält Multiplex-Tag) von Y-Adapter Sequenz, die in beiden Adaptern identisch ist

59 Illumina Library-Preparation Bindestelle für Sequenzierprimer (Runde 1) AATGATACGGCGACCACCGAGAACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTGATCGTACGACAGATCGGAAGAGCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG TTACTATGCCGCTGGTGGCTCTTGTGAGAAAGGGATGTGCTGCGAGAAGGCTAGAGACTAGCTAGCTGTCTAGCCTTCTCGAGCATACGGCAGAAGACGAAC Tag Bindestelle für Sequenzierprimer Runde 2 Multiplex-Tag ist also nicht in der Sequenz enthalten Für Tags gibt es einen separaten Sequenzierlauf ausgehend vom Primer DUNKELROT

60

61 Achtung: Cleavage-Punkt des roten Primers liegt weiter oben und lässt Großteil der roten Primerseq in der flowcell intakt. Nach Seq-Runde1 kann man also erneut eine Bridge-PCR machen, dann den Strang grünen Strang durch Cleavage entfernen und den verbleibenden roten Strang mit dem grünen Primer sequenzieren (= paired end -Sequenzierung; Runde 2)

62 Illumina benchtop sequencers PCR amplicons ChIP-Seq small RNAs RNA-Seq (microbial) smaller genomes Plasmids, BAC S metagenomics library QC MiSeq 2x300 Bp in 2.5 days 15 Gbp (50 mio PE reads) NextSeq 2x150 Bp in 29 hrs 120 Gbp (800 mio PE reads)

63 Ion Torrent vs. MiSeq Loman et al. 2012; Jünemann et al. 2013

64 Ion Torrent vs. MiSeq Advantage: no light detection and optics (somewhat cheaper) Problems: homopolymers & emulsion PCR (like Roche 454)

65 Next-next generation (3rd) Pacific Bioscience Complete Genomics Oxford Nanopore DNA matrix sequencing method single-mol seq-by-synth: labeled hexaphosphate- Nt s amplification: DNA nano balls seq-by-lig read length 580 bp kb short data today: 3 Bp/sec (1 Gb/min) (20 k human genomes in 2010)

66 3rd Gen Sequencing: towards single molecule detection Pacific Biosystems read length of > 5000 Bp!! long-range sequence information!! but expensive machine low to medium throughput extreme error rate (up to 20%)

67 3rd Gen Sequencing: towards single molecule detection Oxford Nanopore MinION chip Dr. D. Jaffe, Broad Inst. (AGBP Feb. 2014) on E. coli re- 84% of reads at 5 kb or longer had at least one perfect 5