Modulation der Intensität durch Modulation von α. sukzessive Kopplung der Nachbarmoden: Nur Moden mit richtiger Phasenlage

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1 Aktive Modenkopplung Modulation der Intensität durch Modulation von α sukzessive Kopplung der Nachbarmoden: Nur Moden mit richtiger Phasenlage haben kleines α moduliertes α gewissermassen Taktgeber für die Moden Nachteil: Länge des Resonators muss genau mit der Modulationsrate korrelieren Passive Modenkopplung Sättigbare Absorber oder andere optisch nichtlineare Effekte Hohe Abschwächung für kleine Intensität Hohe Intensitäten werden nicht abgeschwächt α0 α0/2 Is Intensität Zufällige Fluktuation wird verstärkt Intensitätsmodulationsrate stellt sich von selbst auf die Resonatorlänge ein Noch kürzere Pulse: chirp mit anschliessender Kompression 31

2 4 Mikroskopie ist die Abbildung kleiner Strukturen Abbildung ist eine Transformationsvorschrift, die einem Punkt im Objekt einen Punkt im Bild zuordnet Ideal: Eineindeutige Transformation, dann lässt sich Objekt genau rekonstruieren 4.1 Eigenschaften dünner sphärischer Linsen Wir betrachten zunächst nur Strahlen, die nahe der optischen Achse (Achse senkrcht zur Linsenebene durch deren Mittelpunkt) verlaufen Dann gilt: alle einfallende Strahlen parallel zur optischen Achse werden zu einem und demselben Punkt auf selbiger, dem Brennpunkt, gebrochen Demzufolge werden alle Strahlen, die aus dem Brennpunkt kommen, zu parallelen Strahlen Strahlen durch den Mittelpunkt der Linse werden nicht abgelenkt Die Linse hat auf beiden Seiten die gleiche Brennweite (Abstand Linse Brennpunkt) Bild eines Gegenstandspunktes: Ort, an dem sich alle Strahlen eines Gegenstandspunktes treffen G F f F g b B 4.2 Abbildungsfehler Monochromatische Abbildungsfehler Sphärische Aberrationen 32

3 Treten bei achsfernen Strahlen auf Je weiter ein Strahl von der Achse entfernt, desto kürzer die Brennweite nicht alle Parallelstrahlen treffen sich in einem Punkt Koma Tritt auf, wenn Parallelstrahlbündel nicht parallel zur optischen Achse einfällt Brennweite umso kleiner, je grösser der Auftreffwinkel des Lichtes ist Astigmatismus Tritt auf, wenn Parallelstrahlbündel nicht parallel zur optischen Achse einfällt, bzw. die Linse unterschiedliche Krümmungsradien in senkrechten Ebenen hat Unterschiedliche Brennweiten für Strahlen in verschiedenen Ebenen Beim Fokussieren erhält man ja nach Ebene einen horizontalen oder senkrechten Strich, dazwischen einen Kreis 33

4 4.2.2 Chromatische Aberrationen Aufgrund der Dispersion ist die Brennweite von der Wellenläne des Lichts abhängig 4.3 Strahlengang im optischen Mikroskop Klassisches Mikroskop Gegenstand zwischen doppelter und einfacher Brennweite des Objektivs reeles Zwischenbild 16 cm hinter Objektiv Okular betrachtet Zwischenbild als Lupe: Zwischenbild innerhalb der einfachen Brennweite 34

5 Unendlich (infinity) Mikroskop Gegenstand exakt im Brennpunkt des Objektivs Parallelstrahlen nach Objektiv Weitere Linse (sog. Tubuslinse) erzeugt Zwischenbild Danach Okular/Kamera Vorteil: Grössere Flexibilität (Abstand Objektiv Tubuslinse kann variiert werden) 4.4 Auflösungsvermögen Mindestabstand zweier Punkte, so dass Sie im Bild noch als zwei Punkte unterscheidbar sind Geometrischer Optik: aus einem Gegenstandspunkt wird immer ein Bildpunkt Wellenoptik: Die Kugelwelle, die von einem Gegenstandspunkt ausgeht, wird durch die Öffnung der Linse abgeschnitten: Beugungseffekte Aus Punkt wird Beugungsmuster (der englische Begriff dafür ist Point Spread Function, PSF) 35

6 PSF bei kreisförmiger Apertur: Airy-Muster Mathematische Beschreibung in radialer (quer zur optischen Achse) und longitudinaler (längs der optischen Achse in z) Richtung: [ ( ) J1 2πN.A. r λ I(r) =I 0 πn.a. r λ [ ( sin z π 2λn I(z) = N.A.2) z π 2λn N.A.2 Nach Rayleigh-Kriterium sind zwei Punkte auflösbar, wenn das erste Beugungsminimum des einen mit dem Beugungsmaximum nullter Ordnung des anderen zusammenfällt ] 2 ] 2 36

7 Das führt zu einem Abstand der Punkte d: λ d =0.61 n sin Θ =0.61 λ N.A. n: Brechungsindex des Mediums zwischen Gegenstand und Objektiv Θ: Halber Öffnungswinkel des Objektivs Anderes Kriterium: Sparrow-Kriterium: Zwei Punkte werden aufgelöst, wenn es einen Sattelpunkt in der Addition der PSF s gibt 5 Hochauflösende Fernfeldmikroskopie Fernfeldmikroskopie: Bild entsteht aus Licht, dass einen Weg zurückgelegt hat, der grösser als die Wellenlänge ist Hochauflösend: Höhere Auflösung als konventionelles Mikroskop 5.1 Konfokalmikroskopie Konfokales Prinzip Konventionelles Mikroskop: Der gesamte Gegenstand wird beleuchtet, Lichtquelle in zu Gegenstand konjugierter Ebene 37

8 x (nm) x (nm) Abbildung 2: Links Rayleigh, rechts Sparrow-Kriterium. Gezeigt ist ein Schnitt durch die PSFs entlang der Verbindungslinie der Punkte Konfokalmikroskop: Beleuchtung eines Punktes Detektion ebenfalls in Punkt Abbildung und Beleuchtung in einem Fokus: daher konfokal Gemeinsamer Fokus von Detektion und Beleuchtung: konfokaler Punkt (engl. spot) Fluoreszenzmikroskop: Licht vom Objekt (Fluoreszenz) spektral von Beleuchtung (Anregung) getrennt Epifluoreszenz: Beleuchtung und Abbildung durch Objektiv Trennung von Beleuchtung und Fluoreszenz durch dichroischen Strahlteiler 38

9 Bildebene Tubuslinse dichroischer Strahlteiler Objektiv Gegenstand Kondensor Leuchtfeldblende Kollimator Lichtquelle Signal nur von einem Punkt Bild durch rastern (scanning), entweder Gegenstand oder konfokaler Punkt Scanmodi Proben (Sample-) Sanning Dreidimensionale Bewegung der Probe Vorteile: Scanbereich nur durch Probenscanner begrenzt Nur achsparallele Strahlen Nachteile: langsam 39

10 teuer nicht in jeder Umgebung einfach realisierbar (tiefe T, Ultrahochvakuum) Strahl (Beam-, Laser-) Scanning Parallelstrahlbündel muss um Objektiv gedreht werden Telezentrisches Linsensystem: Spiegel wird in hinteren Brennpunkt des Objektivs abgebildet Kippung des Spiegels Verschiebung des Punktes f1 f1 f2 f2 f3 f3 Bild Lichtquelle/Detektor Bild des Spiegels Scanspiegel Vorteile: billig schnell Abbildungsmasstab kann durch verschiedene Objektive verändert werden Probe und Scaneinheit getrennt: UHV und Tief-T kompatibel Nachteile: Sichtfeld durch Objektiv beschränkt Abbildungsfehler durch nichtachsparallele Strahlen 40

11 5.1.3 Auflösungsvermögen Anregungs-Licht- Punkt durch Beugung auch Airy-Muster Gesamt-PSF des Systems ist Produkt aus Anregungs-PSF und Detektions- PSF Unter Vernachlässigung des Stokes-Shifts: Anregungs-PSF ˆ= Detektions- PSF Gesamt-PSF=PSF 2 klass Gesamt-PSF also Airy 2 Auflösung im Vgl. zum klass. Mikroskop um Faktor 2 besser Zusätzlich Unterdrückung der Nebenmaxima der Airy-Scheibe Experimentelle Aspekte Punktlichtquelle Fokussierung des Lasers auf eine kleine Blende, ein sog. Pinhole Vorteile: Polarisation bleibt erhalten 41

12 Verschiedene Grössen des Pinholes möglich Nachteile: Schlechte Transmission Strahlprofil i.d.r. nicht Gaussförmig Einkopplung des Lasers in eine Einzelmode-Lichtleitfaser (single mode fiber) Vorteile: ideales Strahlprofil Laser kann von Mikroskop getrennt sein Nachteile: Polarisation i.d.r. nicht erhalten Faser nur für bestimmten Wellenlängenbereich single mode Scanning Probenscanning meist durch Piezo-Scanner realisert Piezoelektrischer Effekt: Längenänderung bei Anlegen einer Spannung Längenänderung nicht proportional zur Spannung, zusätzlich Hysterese l l U U 42

13 Regelkreis (closed loop) mit kapazitiver Längenmessung ermöglicht Linearisierung (Spannung wird so geregelt, dass Sollposition erreicht wird) Für Laserscanning werden meist elektromagnetische Spiegel-Scanner (auch Galvo-Scanner genannt) verwendet Detektoren Photomultiplier, Detektionseffizienz bis 40%, im Analog- oder Photonenzählmodus grosse Aktive Fläche Avalanche Photodioden (APDs), Detektionseffizienz bis 80%, im Photonenzählmodus kleine aktive Fläche 43

14 Optik Hochwertige Spiegel, Linsen: Wellenfront-Verzerrung < λ/10, hohe Transmission/Reflexion Objektive mit hoher numerischer Apertur: z.b. Luft, N.A. =0.95, Ölimmersion, N.A. = 1.2, Wasserimmersion, N.A. = 1.2 (für Abbildung in wässriger Umgebung) Farbkorrektur Achromat: 2 Wellenlängen mit gleicher Brennweite Apochromat: 3 Wellenlängen mit gleicher Brennweite Filter für Fluoreszenzanwendungen Dielektrische Schichtsysteme 44

15 Holographische Filter π Mikroskopie Konfokalmikroskopie: Detektion im besten Fall in einem Halbraum (Raumwinkel 2π) Anregung und Detektion im gesamten Raum (Raumwinkel 4π): 4π-Mikroskopie Realisierung durch zwei Objektive, damit natürlich nicht wirklich 4π Exakte Phasenanpassung der beiden Lichtwege notwendig Reduktion der PSF hauptsächlich in z-richtung 45

16 Jedoch Entstehung von ausgeprägten Neben-Maxima 5.3 Zwei-Photonen-Mikroskopie Anregung der Fluoreszenz über 2-Photonenprozess Wahrscheinlichkeit dass ein Photon in Zeitintervall τ eintrifft sei p Dann ist WK, dass zwei Photonen innerhalb τ eintreffen p 2 : Nichtlinearer Prozess Anregungswahrscheinlichkeit für 2-Photonenprozess also proportional zum Quadrat der Anregungs-Intensität Anregungs-WK-PSF damit Quadrat der Anregungs-Intensitäts-PSF Führt zu einer weiteren Verbesserung der Auflösung aufgrund eines spektroskopischen Mechanismus Weitere Vorteile Weniger Streulicht (geht 1/λ 4 ) 46

17 i.d.r. weniger Hintergrund-Fluoreszenz (kleine π-elektronensysteme häufiger) Nachteile: Andere Auswahlregeln: Einphotonendrehimpuls ist, damit l = ±1 Im Fokus des Objektivs Mischung der Polarisationszustände Zweiphotonendrehimpuls kann sehr komplex sein, damit u.u. l = 0; ±2 Dadurch sonst verbotene Übergänge möglich 5.4 STED-Mikroskopie Ebenfalls nichtlinearer Prozess ausgenutzt Normaler Anregungspuls wird von einem rotverschobenen Puls gefolgt, der das Fokalvolumen wie eine Hülle umschliesst 47

18 Stimulierte Emission führt zu Reduktion der Fluoreszenz Sättigung ist nicht-linearer Effekt Nicht-Linearität führt zu Verschmälerung des Anregungsprofils Intensität (bel. Einh.) Anregungspuls STED-Puls Verbleibende Anregung Verbleibende Anregung (bel. Einh.) x (nm) STED-Intensität (bel. Einh.) 1.0 Problem: Photodestruktion des Farbstoffs Anwendung 48

19 6 Nahfeldmikroskopie 6.1 Das optische Nahfeld z E(x,y,z) Probe E(x,y,0) Darstellung des elektrischen Feldes am Ort der Probe durch seine Fourierkomponenten: E(x, y, 0) = 1 A 0 (k x,k y )e i(kxx+kyy) dk x dk y 2π Wellengleichung der in Richtung z propagiernden Welle: E(x, y, z) = E(x, y, 0)e ikzz Darstellung des elektrischen Feldes durch Fourierkomponenten: E(x, y, z) = 1 A z (k x,k y )e i(kxx+kyy) dk x dk y 2π Einsetzen der Wellengleichung und von E(x, y, 0) ergibt: E(x, y, z) = 1 A 0 (k x,k y )e ikzz e i(kxx+kyy) dk x dk y 2π sowie A z (k x,k y )= A 0 (k x,k y )e ikzz Letzter Ausdruck wird als Propagator bezeichnet Transport der Information über E 0 mit z 49

20 Mit ( ) 2 2πn k 2 = = kx 2 + ky 2 + kz 2 λ folgende Fälle k 2 x + k 2 y > ( 2πn λ k 2 x +k 2 y < ( 2πn λ ) 2, damit k 2 z negativ, k z imaginär, e ikzz fällt expentiell ab ) 2, damit k 2 z positiv, k z reell, e ikzz ist periodische Funktion k x und k y sind Raumfrequenzen, je kleiner die Struktur, desto grösser k x,y Raumfrequenzen grösser als reziproke Wellenlänge gehören zu Strukturen kleiner als Wellenlänge Raumfrequenzen grösser als reziproke Wellenlänge werden exponentiell mit dem Abstand von der Probe gedämpft Nahfeld Raumfrequenzen kleiner als reziproke Wellenlänge werden über grosse Entfernung transportiert Fernfeld Strukturen kleiner als Wellenlänge abbilden: Nahfeld nutzen Unerlässlich: Sonde nahe ( λ) an Gegenstand heranbringen 6.2 Realisation von Nahfeldmikroskopen Apertur-Nahfeldmikroskop Öffnung (Apertur) kleiner als Wellenlänge wird ins Nahfeld gebracht Umwandlung der Nahfeldkomponenten in propagierende Wellen an der Apertur Detektion im Fernfeld Umgekehrt: Beleuchtung durch Apertur, erzeugt Nahfeld Detektion im Fernfeld Vorteil: wenig Hintergrund Nachteile: Realisierung der Apertur sehr schwierig Licht dringt auch in gute Leiter wie Al einige nm ein: Apertur nicht beliebig klein 50