Diagnostik und molekulare Epidemiologie multiresistenter Gram-negativer Bakterien

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1 Fachtagung Krankenhaushygiene, Halle/Saale, 13. April 2011 Diagnostik und molekulare Epidemiologie multiresistenter Gram-negativer Bakterien E. coli P. aeruginosa K. pneumoniae A. baumannii Dr. rer. nat. Yvonne Pfeifer Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt

2 NDM-1 Hype oder Bedrohung? Gegen fast alle Antibiotika resistent Britische Wissenschaftler warnen vor neuem Superbakterium Es wurde durch Schönheitsoperationen aus Indien eingeschleppt Deutschland: Neuer Supererreger NDM-1 breitet sich in Europa aus Bakterium NDM-1 Das Ende der Antibiotika Belgien Superkeim NDM-1 fordert erstes Todesopfer in Europa NDM-1 = New Delhi Metallo-β-Lactamase NDM-1 ist ein von Gram-negativen Bakterien gebildetes Enzym, dass alle β-lactam Antibiotika zerstört NDM-1 ist übertragbar Das NDM-1 Gen liegt auf einem Plasmid und kann sehr leicht in andere Gram-negative Spezies übertragen werden NDM-1 produzierende Bakterien sind zumeist multiresistent, da sie viele weitere z.t. übertragbare esistenzgene besitzen oft ist Colistin die einzige Therapieoption

3 NDM-1 in Deutschland und der Welt Ende 2008: erste Identifikation von NDM-1 in K. pneumoniae bei einem schwedischen Patienten indischer Abstammung (Yong D. et al. AAC. 2009) August 2010: vielfaches Auftreten von NDM-1 in K. pneumoniae, E. coli u.a. Enterobacteriaceae in Indien/Pakistan und Großbritannien (Kumarasamy KK. et al. Lancet Infect. Dis. 2010) Seit Ende 2009: vereinzeltes Auftreten von NDM-1 in Enterobacteriaceae und Nonfermentern in Deutschland und weltweit (KI, Epidemiol. Bulletin Nr. 33/2010) Bisher wurden bei 13 Patienten in Deutschland NDM-1-bildende Bakterien nachgewiesen Identifikation eines NDM-1-bildenden E. coli im Trachealsekret (Kolonisation) Patient nach Unfall in Indien 2009 querschnittsgelähmt und Beatmung erforderlich Erneutes NDM-1 Screening vor Entlassung negativ Pfeifer et al. AAC Identifikation eines NDM-1-bildenden Stammes durch retrospektive Analyse multiresistenter A. baumannii Isolate aus einer deutschen Klinik in 2007 Patient zuvor in Serbien hospitalisiert Wundinfektion Transfer nach Deutschland Sepsis 10 Tage nach Aufnahme verstorben Göttig et al. THE LANCET Inf. Dis. 2010

4 β-lactam Antibiotika 1960er Jahre er Jahre Ampicillin Piperacillin Cefuroxim Cefotaxim Ceftazidim Cefepim 1980er Jahre Aztreonam 1990er Jahre Imipenem Meropenem Ertapenem Doripenem

5 Häufigkeit multiresistenter Erreger auf deutschen Intensivstationen Infektionen pro Patiententage Meyer et al. 2010, Crit. Care Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MSA) 3.-Gen.-Cephalosporin-resistente Escherichia coli 3.-Gen.-Cephalosporin-resistente Klebsiella pneumoniae Vancomycin-resistente Enterokokken Carbapenem- (Imipenem-) resistente Acinetobacter baumannii

6 3. Gen. Cephalosporinresistenz bei Enterobacteriaceae EASS - European Antimicrobial esistance Surveillance System No data* < 1% 1-5% 5-10% 10-25% 25-50% > 50 Abb: Anteil invasiver Escherichia coli Isolate mit esistenz gegenüber 3. Gen. Cephalosporinen ( on 31th March 2010) *keine Daten übermittelt oder Daten von weniger als 10 Isolaten

7 3. Gen. Cephalosporinresistenz in Enterobacteriaceae AS: Antibiotikaresistenz-Surveillance Deutschland ( Kontinuierliche Erfassung von esistenzdaten aller relevanten nosokomialen Erreger aus 250 Kliniken und > 3500 Arztpraxen über elektronische Schnittstelle von 13 Laboren Intensivstationen (Cefotaximresistenz E. coli) Intervall n % Total n Alle Stationen (Cefotaximresistenz E. coli) Intervall n % Total Halbjahr 2, % Halbjahr 1, % Halbjahr 2, % Halbjahr 1, % Halbjahr 2, % Halbjahr 1, % Ambulante Versorgung Intervall Total n % n n Halbjahr 2, % 1588 Halbjahr 2, % Halbjahr 1, % 1467 Halbjahr 1, % Halbjahr 2, % 1568 Halbjahr 2, % Halbjahr 1, % 1454 Halbjahr 1, % Halbjahr 2, % 1074 Halbjahr 2, % Halbjahr 1, % 1151 Halbjahr 1, % 13513

8 β-lactamresistenz und β-lactamverbrauch SAI esistenz 3.Gen. Cephalosporine (E. coli) Einsatz (Verbrauch) Carbapeneme isiko: Selektion Carbapenem-resistenter (multiresistenter) Erreger

9 Carbapenemresistenz bei Gram-negativen Bakterien Carbapeneme: Meropenem, Imipenem, Ertapenem, Doripenem GEMAP 2008 Enterobacteriaceae esistenzrate: < 1 % Pseudomonas aeruginosa esistenzrate: 7-25 % Acinetobacter baumannii esistenzrate: 7-15 % esistenztrend: langsam ansteigend!

10 Mechanismen derβ-lactamresistenz Beta-Lactam Hydrolyse Enterobacteriaceae 3. Loss of porins 2. Abb. sitemaker.umich.edu/.../files/resistance.gif P. aeruginosa

11 Spezies-spezifische β-lactamasen Spezies Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Citrobacter freundii Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter baumannii β-lactamase AmpC - K1 (OXY) AmpC AmpC AmpC - AmpC AmpC, OXA Harnwegsinfektionen Urosepsis Wundinfektionen, Bakteriämie, Sepsis Atemwegsinfektionen, Nosokomiale Pneumonie Veränderungen in den egulationsmechanismen (Promoter-Mutationen, SNPs, Insertionsequenzen) resultieren in der High-Level Expression der chromosomalkodierten Beta-Lactamasen β-lactamresistenz erhöhte Mortalität

12 Einteilung der β-lactamasen β-lactamase- Klasse β-lactamasen Beispiele elevante Spezies esistenzen 1 Breitspektrumβ-Lactamasen TEM-1, TEM-2 SHV-1, SHV-11 Ampicillin, Cephalotin ESBL TEM TEM-3, TEM-52 A ESBL SHV SHV-5, SHV-12 Enterobacteriaceae und Nonfermenter 2 Penicilline, 3. Gen. Cephalosporine ESBL CTX-M CTX-M-1, CTX-M-15 Serinβ-Lactamasen C Carbapenemasen Cephamycinasen Chromosomal kodiert Cephamycinasen Plasmid-kodierte AmpC KPC AmpC CMY, DHA, FOX, ACC Enterobacter spp. Citrobacter spp. alle β-lactame 3 Cephamycine (Cefoxitin), 3. Gen. Cephalosporine Cephamycine (Cefoxitin), 3. Gen. Cephalosporine Breitspektrumβ-Lactamasen OXA-1, OXA-9 Enterobacteriaceae Oxacillin, Ampicillin, Cephalotin D ESBL OXA OXA-2, OXA Gen. Cephalosporine Carbapenemasen OXA Carbapenemasen OXA OXA-48 OXA-23,-24,-58 Enterobacteriaceae A. baumannii Ampicillin, Imipenem alle β-lactame 3 Metalloβ-Lactamasen B Metallo-β-Lactamasen (Carbapenemasen) VIM, NDM-1 IMP, GIM Enterobacteriaceae und Nonfermenter alle β-lactame 3 Abbildung: Vereinfachte Darstellung der Einteilung der β-lactamasen. 1, angegeben sind charakteristische esistenzen, die z.t. für die Diagnostik genutzt werden; 2, die Breitspektrum-β-Lactamase TEM-1 findet man auch bei Nonfermentern (P. aeruginosa, A. baumannii) häufig; 3, breites Hydrolysespektrum inklusive der Carbapeneme

13 Verbreitung von β-lactamasen Klonale Verbreitung: Verbreitung bestimmter resistenter Stämme in der Klinik (Ausbruch) Verbreitung bestimmter europäischer klonaler Linien Verbreitung des esistenzgens Horizontaler Gentransfer HGT Lage der esistenzgene (Carbapenemase-Gene) auf Plasmiden, die leicht übertragbar sind innerhalb der Spezies/in andere Spezies A B Ausbreitung von esistenz- Plasmiden zwischen verschiedenen Spezies A Donor B ezipient! Oft liegen verschiedene esistenzgene auf einem Plasmid; dessen! Weitergabe führt zur Entstehung multiresistenter Erreger (ME)

14 Klasse A β-lactamasen 1960 Aminobenzyl-Penicilline; Cephalosporine 1./2. Gen. e.g. Ampicillin, Mezlocillin, Cefotiam esistenz durch die Breitspektrum Beta-Lactamasen TEM-1 und SHV neuere Cephalosporine 3. Gen. e.g. Cefotaxim, Ceftazidim, Cefpodoxim 1980 esistenz durch Extended-Spectrum Beta-Lactamasen TEM-type ESBL SHV-type ESBL CTX-M-type ESBL n > 170 n > 111 n > 100 klassische ESBL

15 Strategie: ESBL Inhibitoren Wirkweise: kovalente Bindung im katalyt. Zentrum derβ-lactamase keine/sehr geringe antibiotische Wirkung Anwendung in Kombination mit einemβ-lactam Antibiotikum β-lactamase-inhibitoren β-lactam-antibiotika Clavulansäure Sulbactam! Inhibitor-esistenz durch: β-lactamase-überexpression Inhibitor-resistente β-lactamasen! Verlust der Porine Efflux-Mechanismen

16 Phänotypischer ESBL-Nachweis (TEM, SHV, CTX-M, OXA) ESBL- Phänotyp: esistenz gegen Penicilline und 3./4. Gen. Cephalosporine Hemmbar durch β-lactamase Inhibitoren (CLV, SUL) Automaten-interne Tests ESBL- Bestätigungstests Ceftazidim Cefotaxim Cefpodoxim Cefepim + Sulbactam + Clavulansäure Agardiffusionstests Etest CLV CTX CAZ

17 Beispiel: Phänotypischer ESBL/AmpC-Nachweis D68C ESBL/AmpC ID (Mast) A Cefpodoxim B Cefpodoxim + ESBL-Inhibitor C Cefpodoxim + AmpC-Inhibitor D Cefpodoxim + ESBL- und AmpC-Inhibitor ESBL-negativ AmpC-negativ ESBL-positiv AmpC-positiv ESBL-positiv AmpC-positiv Aber: Wird nur sehr wenig β-lactamase oder werden verschiednene β-lactamasen gebildet, kann es zu falsch positiven/negativen Ergebnissen kommen

18 Carbapenemasen Definition: β-lactamasen, die Cephalosporine und Carbapeneme hydrolysieren Klasse A Carbapenemasen KPC erstmals 2008 in Deutschland nachgewiesen (C. Wendt, EpiBull, 22/2008) Import aus Endemiegebieten (z.b. Griechenland, Israel) einzelne Ausbruchsgeschehen in deutschen Kliniken Klasse B Carbapenemasen (Metallo-Beta-Lactamasen = MBL) VIM Import aus Mittelmeerregion (Italien, Spanien) in Deutschland z.t. regionale Verbreitung NDM-1 Import aus Indien/Pakistan (bisher 13 Fälle in Deutschland bekannt) Klasse D Carbapenemasen OXA-48 in Enterobacteriaceae (Import überwiegend aus Türkei) OXA-58/23/24 in Acinetobacter baumannii aus Mittelmeerregion in Deutschland jährlich Ausbruchsgeschehen

19 S S S S S S Colistin S S - S/I S/I S/I Tigecyclin negativ negativ negativ negativ positiv positiv MBL-Etest (IP/IPI) Ertapenem I/ Imipenem I/ Meropenem SXT Ciprofloxacin Nalidixinsäure Chloramphenicol Oxytetrazyclin S Amikacin Kanamycin S/I Gentamicin Cefoxitin S Ceftazidim S Cefotaxim Cefotiam Ampicillin OXA-48 E. coli OXA-48 + ESBL K. pneumoniae OXA-23 A. baumannii KPC-2 K. pneumoniae VIM-1 K. oxytoca NDM-1 E. coli Antibiotika [mg/ml]

20 Phänotypischer Carbapenemase-Nachweis Phänotyp: esistenz gegen Penicilline und 3./4. Gen. Cephalosporine esistent/ intermediär gegenüber Carbapenemen Hemmbar durch verschiedene Carbapenemase Inhibitoren

21 Phänotypischer Nachweis: Carbapenemasen Modified Hodge Test K. pneumonia Carbapenemase Bildner K. pneumonia ATCC Carbapenem-sensitiv E. coli ATCC Carbapenem-sensitiv Anwendung: - allg. Nachweis von Carbapenemase-Bildung (KPC, MBL, OXA) - für epidemiologische Zwecke und Infektionskontrolle - falsch positive Ergebnisse (z.b. bei AmpC-Bildung) möglich

22 Beispiel: Phänotypischer Carbapenemase-Nachweis KPC/MBL/AmpC ID-Test (Alere Diagn.) MP Meropenem M+DP Meropenem + MBL-Inhibitor M+BO Meropenem + KPC-Inhibitor M+CL Meropenem + AmpC-Inhibitor KPC-positiv Borsäure = KPC-Inhibitor MBL-positiv (VIM, NDM-1) EDTA = MBL-Inhibitor

23 Beispiel: MBL oder Nicht-MBL? P. aeruginosa P. aeruginosa P. aeruginosa

24 Molekulare Diagnostik Warum? Bsp. : Produktion von β-lactamase in geringer Menge Falsch-negative phänotypische Testergebnisse Bsp. : Produktion mehrerer unterschiedlicher β-lactamasen Unspezifische/nicht auswertbare phänotypische Tests Bsp. : sehr geringe β-lactamase-bildung niedrige MHK (scheinbar sensitives Isolat) ungeeignete antibiotische Behandlung Erhöhung der β-lactamase-bildung (egulationsmechanismen) Therapieversagen durch (spontan) resistenten Erreger Nachweis des esistenzgens mit molekularen Methoden Nutzung molekularer Methoden in der Epidemiologie

25 Molekulare Methoden zur β-lactamase Detektion PC-Amplifikation und Sequenzierung der β-lactamase (bla) Gene ESBL-Multiplex-PC M MP CTX-M-Multiplex-PC M MP AmpC-Multiplex-PC M MP bla TEM bla SHV bla CTX-M CTX-M-14 spez. CTX-M-9-type CTX-M-2-type CTX-M-1-type MOX A.h. EBC E.cl. ACC H.a. DHA M.m. CMY C.f. Oligonukleotid-Microarray für schnelle β-lactamase Identifizierung 1,00 schnell sensitiv spezifisch teuer! rel. intensity (I) 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 S163 S163.2 S180 S182 S194 S194.2 S202 S216 S235 S235.2 S236 S236.2 S237 S241 S241.2 S258 S261 S264 S271 S272 S276 S241: agc Ser A G C T

26 Molekulare Epidemiologie: AS-ESBL-Studie ESBL-positive Einsendungen E. coli n = 156 K. pneumoniae n = 65 K. oxytoca n = 6 P. mirabilis n = 3 Anteil der Isolate aus: E. coli Klebsiella spp. P. mirabilis BK E. coli 38 % Klebsiella spp. 31 % WA 49 % 48 % Weitere esistenzen: > 70 % der E. coli sind resistent gegen Fluorchinolone und Sulfonamide

27 Molekulare Epidemiologie: AS-ESBL-Studie no. of strains no. of hospitals E. coli n = 156 n = 150 Klebsiella spp. no. of strains n = 65 no. of hospitals n = 56 Anzahl ESBL-positiver Isolate % CTX-M % CTX-M-15! E. coli Klebsiella spp % CTX-M 33 TEM-ESBL SHV-ESBL CTX-M CTX-M-15 Dominanz der CTX-M-ESBL durch HGT und Verbreitung epidemischer Klone (CTX-M-E. coli ST131) Cullik et al. JMM 2010

28 ESBL und (flouro)quinolone resistance in Enterobacteriaceae ESBL bei Tieren & Tierprodukten Übertragung von ESBLbildenden Stämmen oder ESBL-Plasmiden ESBL im Krankenhaus ESBL in der Community Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

29 Molekulare Epidemiologie: KPC Carbapenemase KPC = Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Seit 2008 wenige Ausbrüche aber viele Einzelnachweise mit KPC-Klebsiellen (Index)patienten kommen oft aus Griechenland oder Israel Beispiel: PFGE-Analyse KPC-bildendender K. pneumoniae ST258 (MLST) Hospital Year Country** KPC-type F 2009 D KPC-2 F 2009 D KPC-2 D 2009 D KPC-2 E 2009 G KPC-2 D 2009 D KPC-2 C 2009 D KPC-3 C 2009 D KPC-3 C 2008 D KPC-3 B 2009* D KPC-3 B 2009* IL KPC-3 A 2008* D KPC-2 A 2008* G KPC-2 *, outbreak isolates; **, nationality of the patient or previous visit abroad; IL, Israel; G, Greece; D, Germany; Dice (Tol 1.0%-1.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] Pfeifer Y, ECCMID 2010 Poster 736

30 Bsp. OXA-Carbapenemase bildende A. baumannii jährlich mehrere Ausbrüche mit OXA-23 und OXA-58 bildenden A. baumannii (Untersuchungen von Isolaten ) in Deutschland Häufung der A. baumanni Nachweise in den Sommermonaten Viele Patienten sind nur besiedelt aber auch schwere Infektionen, (Todesfälle) treten auf Number of cases Patienten kommen aus Südeuropa, Ägypten oder dem arabischen aum ( Iraqibacter ) 0 January February March April May Month June BY T SA LS BY BB BB July August September October November December Year 2008 Behandlung nur noch mit Colistin erfolgreich Pfeifer et al. ECCMID 2010 Poster P797

31 Fazit Carbapenem-esistenzraten bei Enterobacteriaceae noch unter 1 % Langsamer Anstieg der Nachweiszahlen von multiresistenten Erregern (ME), z.b. Ausbrüche mit Carbapenemase-bildenden A. baumannii ME sind oft Einzelfälle, viele Patienten besiedelt, wenige Infektionen KPC-Bildner > 50 Nachweise/Jahr OXA-48-Bildner > 50 Nachweise/Jahr VIM-MBL-Bildner > 40 Nachweise/Jahr NDM-1-Bildner ca. 20 Nachweise/Jahr NZ, Bochum 2-Monatsberichte im Epidemiolog. Bulletin ME-Infektionen sind oft schwerwiegend und kaum therapierbar (hohe Mortalität) Das Einschleppen multiresistenter Erreger ins Krankenhaus kann man nicht verhindern aber eine schnelle Diagnostik und strenge Hygienemaßnahmen verhindern die Weiterverbreitung von ME Bsp. Konsensusempfehlung Baden-Württemberg: Umgang mit Patienten mit hochresistenten Enterobakterien inklusive ESBL-Bildnern

32 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit! KI Wernigerode Prof. Dr. Wolfgang Witte Sibylle M.-Bertling Christine Günther Dr. habil. Guido Werner Dr. B. Strommenger Dr. F. Layer Dr. habil. G. Wilharm Dr. L. Poirel (Paris) Dr. P. Higgins (Köln) Herzlichen Dank an alle Einsender!