Diagnostik von Mykobakterien mittels Polymerase-Kettenreaktion: Nachweis aus Patientenmaterial und Erweiterung der Speziesdiagnostik

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1 Aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover Diagnostik von Mykobakterien mittels Polymerase-Kettenreaktion: Nachweis aus Patientenmaterial und Erweiterung der Speziesdiagnostik INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Antje Bohrßen aus Hannover Hannover 2003

2 Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Achim Gruber, Ph. D. PD Dr. Franz-Christoph Bange 1. Gutachter: Prof. Dr. Achim Gruber, Ph. D. 2. Gutachter: Prof. Dr. Gerald-F. Gerlach Tag der mündlichen Prüfung:

3 Teile der hier vorliegenden Arbeit wurden wie folgt vorab veröffentlicht: LACHNIK, J., B. ACKERMANN, A. BOHRSSEN, S. MAASS, C. DIEPHAUS, A. PUNCKEN, M. STERMANN u. F.-C. BANGE (2002): Rapid-cycle PCR and fluorimetry for detection of mycobacteria. J. Clin. Microbiol. 40 (9): STERMANN, M., A. BOHRSSEN, C. DIEPHAUS, S. MAASS u. F.-C. BANGE (2003): A polymorphic nucleotide within the promotor of nitrate reductase (NarGHJI) is specific for M. tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 41 (7):

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5 I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis VI VIII X 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht Taxonomie und allgemeine Eigenschaften von Mykobakterien Vorkommen und Bedeutung Der M. tuberculosis-komplex M. tuberculosis M. africanum M. microti M. canetti M. bovis M. bovis BCG Tuberkulose beim Menschen Epidemiologie und Bedeutung Ätiologie und Pathogenese Nichttuberkulöse Mykobakterien Einteilung nichttuberkulöser Mykobakterien Mykobakteriosen Diagnostik von Mykobakterien Probenentnahme Aufbereitung von Patientenmaterial Mikroskopischer Nachweis Kultureller Nachweis Biochemische Differenzierung Niacin-Test Nitratreduktase-Test Pyrazinamidase-Test Molekularbiologische Nachweismethoden von Mykobakterien Kommerzielle Testsysteme Molekularbiologische Differenzierung des M. tuberculosis-komplexes 26

6 II Inhaltsverzeichnis 2.6 Diagnostik von Mykobakterien an der Medizinischen Hochschule Hannover Polymerase-Kettenreaktion im real time-modus Prinzip der Amplifikation und Schmelzpunktanalyse am LightCycler Grundlagen für das Design von Primern Grundlagen für das Design von Sonden Zielsetzung der Arbeit 34 3 Material und Methoden Erstellung der Inhibitionskontrolle Verwendete Plasmide Verwendete Bakterien Plasmidkonstruktion Mini-Präparation von Plasmid-DNA Midi-Präparation von Plasmid-DNA Restriktionsenzymverdau Dephosphorylierung Agarosegelelektrophorese Isolation und Aufreinigung von DNA-Banden aus dem Gel Aufreinigung von DNA aus Lösungen Ligation Herstellung elektrokompetenter Bakterienzellen Transformation von Escherichia coli mit Plasmid-DNA Amplifikation mit der konventionellen Polymerase-Kettenreaktion Amplifikation und Schmelzpunktanalyse Untersuchung von kulturellen Patientenmaterialien Kulturen Isolierung der genomischen DNA Amplifikation und Schmelzpunktanalyse Aufreinigung der Amplifikate zur Sequenzierung Direktnachweis von Mykobakterien-DNA aus Patientenproben Titerbestimmung von Bakterienkulturen Dekontamination von Patientenmaterial Präparation von genomischer DNA aus Patientenmaterial Quantifizierung von DNA Gelelektrophorese mit Hilfe eines Größenstandards Quantifizierung von DNA mit Hilfe des Pico-Green Kits Bestimmung der Kopienzahl 46

7 III Inhaltsverzeichnis Berechnung der Sensitivität und Spezifität Amplifikation und Schmelzpunktanalyse Unterscheidung innerhalb des M. tuberculosis-komplexes Verwendete Bakterienstämme des M. tuberculosis-komplexes Verwendete Bakterienstämme nichttuberkulöser Mykobakterien Kulturbedingungen Kulturkonservierung Präparation genomischer DNA Amplifikation und Schmelzpunktanalyse DNA-Amplifikation und Schmelzpunktanalyse Alignment von Primern und Sonden Primer Sonden Ansetzen von Template und Mastermix LightCycler-Programmierung Sequenzierungen Unterstützende Software Sonstige Materialien 54 4 Ergebnisse Erstellung einer Inhibitionskontrolle für die Polymerase-Kettenreaktion Versuche mit der Inhibitionskontrolle pjl Klonierungsstrategie Restriktionsverdau der Inhibitionskontrollen mit EcoNI Subklonierung des Inserts von pjl6 in den Vektor von pjl Klonierung der neuen Inhibitionskontrolle Vergleich der Inhibitionskontrollen in der PCR-Reaktion Versuche mit der neuen Inhibitionskontrolle pab Untersuchung von kulturellen Patientenproben Pilotstudie ( ) Bestimmung einer neuen Kopienanzahl der Inhibitionskontrolle für die Untersuchung kultureller Patientenisolate Spezifische Detektion des M. chelonae-abscessus-komplexes Hauptstudie I ( ) Hauptstudie II ( ) Untersuchung von Proben aus dem Klinikum Hannover Nordstadt Abschnitt I ( ) Abschnitt II ( ) 80

8 IV Inhaltsverzeichnis 4.3 Direktnachweis von mykobakterieller DNA aus Patientenproben Präparation von Mykobakterien-DNA aus Patientenmaterial Titerbestimmung einer Bakterienkultur Überprüfung der Kreuzkontamination im King-Fisher-Automaten Verbesserung der Sensitivität bei der Präparation von Mykobakterien-DNA aus Patientenmaterial Verwendung von Lysozym zur Lyse der Zellwand Anwendung von Proteinase K Reduktion der Inkubationszeit bei paralleler Verwendung von Lysozym und Proteinase K Anwendung der Inhibitionskontrolle beim Direktnachweis Anwendung des Direktnachweisformats Interpretation der Ergebnisse der Schmelzpunktanalyse Anwendung an Proben mit tuberkulösen Mykobakterien Anwendung an Proben mit nichttuberkulösen Mykobakterien Unterscheidung innerhalb des M. tuberculosis-komplexes Identifizierung von M. tuberculosis Entwicklung einer Sonde zur Detektion des T/C-Polymorphismus Spezifität der neuen M. tuberculosis-sonde LC Identifizierung von bovinen Mykobakterien Identifizierung von M. bovis BCG Entwicklung einer Sonde zur Identifizierung von M. bovis BCG am 3` Übergang der RD1-Region Entwicklung einer Sonde zur Identifizierung von M. bovis BCG am 5` Übergang der RD1-Region Anwendung an Kulturisolaten aus Patientenproben Diskussion Zusammenfassung / Summary Literaturverzeichnis Anhang Sequenzvergleiche Weitere Differenzierung der kulturellen Patientenisolate Versuch zur Kreuzkontamination im KingFisher ml Partikelprozessor Wiederholungsversuche zur Präparation von Mykobakterien-DNA direkt aus Patientenmaterial Nährmedien und Zusätze 151

9 V Inhaltsverzeichnis 8.6 Lösungen und Puffer Allgemein verwendete Lösungen und Zusätze Lösungen und Puffer für die Dekontamination Lösungen und Puffer für die Untersuchung von Kulturisolaten Lösungen und Puffer für die Aufbereitung von Patientenmaterialien Kits Enzyme Restriktionsenzyme Weitere Enzyme Chemikalien Geräte Verbrauchsmaterialien 155

10 VI Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abb. 2.1: Übersicht der Mykobakterien-Diagnostik der Medizinischen Hochschule Hannover 28 Abb. 4.1: Genusspezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pjl6 im F2-Kanal 57 Abb. 4.2: TBC-spezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pjl6 im F3-Kanal 57 Abb. 4.3: 16S rrna-gen von M. tuberculosis subkloniert in pjl6 59 Abb. 4.4: Verändertes 16S rrna-gen von M. tuberculosis im neuen Konstrukt 59 Abb. 4.5: Gelansicht: Plasmide pjl6 und pjl8 nach EcoNI-Verdau 60 Abb. 4.6: Vektorkarte von pab1 61 Abb. 4.7: Vektorkarte von pab2 62 Abb. 4.8: Vergleich der Inhibitionskontrolle pjl6 mit pab2 in der PCR-Reaktion 63 Abb. 4.9: Genusspezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pab2 im F2-Kanal 64 Abb. 4.10: TBC-spezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pab2 im F3-Kanal 64 Abb. 4.11: Spezifität der M. chelonae/abscessus-sonde LC86 71 Abb. 4.12: Überprüfung der Positivkontrollen hinsichtlich der Kreuzkontamination 84 Abb. 4.13: Überprüfung der Negativkontrollen hinsichtlich der Kreuzkontamination 84 Abb. 4.14: Verschiedene Inkubationszeiten mit Lysozym bei 50 Bakterien BCG 87 Abb. 4.15: Verschiedene Inkubationszeiten mit Lysozym bei 25 Bakterien BCG 87 Abb. 4.16: Verschiedene Inkubationszeiten mit Lysozym bei 10 Bakterien BCG 88 Abb. 4.17: Auswirkung beim Einsatz von Proteinase K bei 50 Bakterien BCG 89 Abb. 4.18: Auswirkung beim Einsatz von Proteinase K bei 25 Bakterien BCG 90 Abb. 4.19: Auswirkung beim Einsatz von Proteinase K bei 10 Bakterien BCG 90 Abb. 4.20: Kombinierte Anwendung von Lysozym und Proteinase K bei 50 Bakterien BCG 91 Abb. 4.21: Kombinierte Anwendung von Lysozym und Proteinase K bei 25 Bakterien BCG 92 Abb. 4.22: Kombinierte Anwendung von Lysozym und Proteinase K bei 10 Bakterien BCG 92 Abb. 4.23: Sensitivität der Proben-DNA beim Einsatz von 200 Kopien pab2 94 Abb. 4.24: Sensitivität der Proben-DNA beim Einsatz von 100 Kopien pab2 94 Abb. 4.25: Sensitivität und Spezifität für die Untersuchung tuberkulöser Proben 97 Abb. 4.26: Sensitivität und Spezifität für alle untersuchten Proben 98 Abb. 4.27: Sensitivität und Spezifität für alle untersuchten Proben, die säurefeste Stäbchen im Direktausstrich zeigen 99 Abb. 4.28: Sequenzvergleich vom Promotorbereich narghji von tuberkulösen und bovinen Mykobakterien (Ausschnitt) 100

11 VII Abbildungsverzeichnis Abb. 4.29: Promotorsonde LC65 zur Identifizierung von M. tuberculosis 101 Abb. 4.30: Promotorsonde LC64 zur Identifizierung von M. tuberculosis 102 Abb. 4.31: Spezifität der M. tuberculosis-sonde LC64 mit nichttuberkulösen Mykobakterien 103 Abb. 4.32: Sequenzvergleich vom oxyr-gen von tuberkulösen und bovinen Mykobakterien (Ausschnitt) 104 Abb. 4.33: Bovine Sonde LC94 zur Identifizierung von bovinen Mykobakterien 105 Abb. 4.34: Darstellung der RD1-Region am 3` Übergang mit der BCG-Sonde LC Abb. 4.35: BCG-Sonde LC79 zur Identifizierung von M. bovis BCG 108 Abb. 4.36: Darstellung der RD1-Region am 5` Übergang mit der BCG-Sonde LC Abb. 4.37: BCG-Sonde LC85 zur Identifizierung von M. bovis BCG 110 Abb. 4.38: Gelansicht: Amplifikate der Spezies des M. tuberculosis-komplexes vom Promotor- und RD1-Fragment 111 Abb. 4.39: Übersicht der Differenzierung des M. tuberculosis-komplexes 112 Abb. 8.3: Versuch der Fa. THERMOLABSYSTEMS zur Kreuzkontamination 149

12 VIII Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tab. 2.1: Einteilung nichttuberkulöser Mykobakterien nach RUNYON 13 Tab. 2.2: Nitratreduktase-Aktivität der Spezies des M. tuberculosis-komplexes 20 Tab. 3.1: Verwendete Plasmide zur Erstellung der neuen Inhibitionskontrolle 35 Tab. 3.2: Verwendete Primer für die konventionelle Polymerase-Kettenreaktion 39 Tab. 3.3: Programm für die konventionelle Polymerase-Kettenreaktion 39 Tab. 3.4: Verwendete Primer für die Polymerase-Kettenreaktion im real-time Modus 39 Tab. 3.5: Verwendete Sondenpaare für die Polymerase-Kettenreaktion im real-time Modus 40 Tab. 3.6: Untersuchte Probenmaterialien der Pilotstudie 41 Tab. 3.7: Patientengruppen der Pilotstudie 41 Tab. 3.8: Untersuchte Probenmaterialien der Hauptstudie I 41 Tab. 3.9: Patientengruppen der Hauptstudie I 42 Tab. 3.10: Untersuchte Probenmaterialien der Hauptstudie II 42 Tab. 3.11: Patientengruppen der Hauptstudie II 42 Tab. 3.12: Verwendete Primer für die Untersuchung von Kulturisolaten 43 Tab. 3.13: Verwendete Sondenpaare für die Untersuchung von Kulturisolaten 43 Tab. 3.14: Verwendete Primer für den Direktnachweis von mykobakterieller DNA 47 Tab. 3.15: Verwendete Sondenpaare für den Direktnachweis von mykobakterieller DNA 48 Tab. 3.16: Aufstellung der verwendeten nichttuberkulösen Mykobakterien 49 Tab. 3.17: Verwendete Primer zur Unterscheidung innerhalb des M. tuberculosis- Komplexes 50 Tab. 3.18: Programm für die Amplifikation und anschließende Sondenhybridisierung am LightCycler 53 Tab. 4.1: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Pilotstudie 68 Tab. 4.2: Nachweisgrenze der Inhibitionskontrolle in kulturellen Patientenisolaten 70 Tab. 4.3: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Hauptstudie I 74 Tab. 4.4: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Hauptstudie II 76 Tab. 4.5: Ergebnisse des Abschnitts I der Studie Nordstadtkrankenhaus 79 Tab. 4.6: Ergebnisse des Abschnitts II der Studie Nordstadtkrankenhaus 81 Tab. 4.7: Interpretation der Ergebnisse der Schmelzpunktanalyse aus Direktmaterial 96 Tab. 4.8: Unterscheidung des M. tuberculosis-komplexes an klinischen Patientenmaterialien 113 Tab. 4.9: Schmelzpunkt-Profil der Mykobakterien des M. tuberculosis-komplexes 113 Tab. 8.1: Isolierte Mykobakterien-Spezies mit Hilfe der PCR in der Pilotstudie 148 Tab. 8.2: Isolierte Mykobakterien-Spezies mit Hilfe der PCR in der Hauptstudie I 148

13 IX Tabellenverzeichnis Tab. 8.3: Isolierte Mykobakterien-Spezies mit Hilfe der PCR in der Hauptstudie II 149 Tab. 8.4: Vergleich: Auswirkung auf die Präparationausbeute bei verschiedenen Inkubationszeiten mit Lysozym 150 Tab. 8.5: Vergleich: Auswirkung auf die Präparationsausbeute mit und ohne Proteinase K 150 Tab. 8.6: Vergleich: Auswirkung auf die Präparationsausbeute bei gleichzeitigem Einsatz von Proteinase K für verschieden Lysozyminkubationszeiten 151 Tab. 8.7: Verwendete Kits 153 Tab. 8.8: Verwendete Restriktionsenzyme 154 Tab. 8.9: Weitere verwendete Enzyme 154 Tab. 8.10: Verwendete Chemikalien 154 Tab. 8.11: Verwendete Geräte 155 Tab. 8.12: Verbrauchsmaterialien 155

14 X Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis A Base Adenin Abb. Abbildung AIDS Erworbenes Immundefizienz Syndrom (engl. acquired immune deficiency syndrome) AFB säurefeste Stäbchen (engl. acid fast bacilli) AG Arbeitsgruppe ATCC Amerikanische Kulturensammlung (engl. American Type Culture Collection) Aqua dest. Aqua destillata BCG Bacillus Calmette Guérin BgVV Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin BSA Bovines Serum Albumin bp Basenpaare (engl. base pairs) C Base Cytosin CF Cystische Fibrose CGD Chronische granulomatöse Erkrankung (engl. chronic granulomatous disease) DNA Desoxyribonukleinsäure (engl. deoxyribonucleic acid) dntp Desoxyribonukleotidtriphosphat DR Direkte Wiederholung (engl. direct repeat) DSMZ Deutsche Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (engl. ethylene diamine tetra acetate) ELISA Enzym-Immunoassay (engl. enzyme linked immunosorbent assay) Fa. Firma FDA Amerikanische Aufsichtsbehörde für Nahrungs- und Arzneimittel (engl. Food and Drug Administration) FITC Fluoreszenz-Isothiocyanat FRET Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer G Base Guanin x g Gravitätskonstante (9,81 m/sec²) gyrb Gen für die Gyrase h Stunde (engl. hour)

15 XI Abkürzungsverzeichnis He-La Helene Lang Zellen HIV Humanes Immundefizienz Virus hsp Gen für ein Hitzeschockprotein HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chromatography) ID Identität IS Insertionssequenz ITS Sequenzen zwischen transkribierten Sequenzen (engl. internal transcribed spacer) KBE Kolonie bildende Einheit KF KingFisher ml Gerät kb Kilobasenpaare LB Medium Luria-Bertani Medium (Lennox L Broth) LC LightCycler LCR Ligase-Kettenreaktion (engl. ligase chain reaction) M. Mycobacterium MAC Mycobacterium avium-intracellulare-complex MGIT Indikatorröhrchen für mykobakterielles Wachstum (engl. mycobacterial growth indicator tube) MHH Medizinische Hochschule Hannover mrna Boten-Ribonukleinsäure (engl. messenger ribonucleic acid) NALC N-Acetyl-L-Cystein narghji Gene für die anaerobe Nitratreduktase NCBI Nationales Zentrum für biotechnologische Information (engl. National Center for Biotechnology Information) NAD Nicotinamidadenindinukleotid NADP Nicotinamidadenindinukleotid-phosphat NRZ Nationales Referenzzentrum für Mykobakterien NTM Nichttuberkulöse Mykobakterien OD (x) ori oxyr PANTA PCR Pfu ph PZA Optische Dichte, gemessen bei einer Wellenlänge von x nm Startpunkt der Replikation (engl. origin of replication) Gene für die oxidative Stressantwort Polymixin B, Amphotericin B, Nalixinsäure, Trimethoprim, Azlocillin Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction) Pyrococcus furiosus negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionen-Konzentration Pyrazinamid

16 XII Abkürzungsverzeichnis RD RFLP rrna rpm RT RV S SCID SD SDA SDS ssp. T TAE Taq TBC TE TRIS U UV WHO ZN Region mit unterschiedlichen Sequenzen (engl. region of differences) Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (engl. restriction fragment lenght polymorphism) ribosomale Ribonukleinsäure (engl. ribosomal ribonucleic acid) Umdrehungen pro Minute (engl. rounds per minute) Reverse Transkriptase Ringversuch Sedimentationskonstante in Svedberg Schwerer kombinierter Immundefekt (engl. severe combined immunodeficiency) Standardabweichung (engl. standard deviation) Stangverdrängungsamplifikation (engl. strand displacement amplification) Natriumdodecylsulfat (engl. sodiumdodecylsulfate) Subspezies Base Thymin TRIS-Acetat-EDTA Thermus aquaticus M. tuberculosis-complex TRIS-EDTA Tris(hydromethyl)aminoethan Einheit der Enzymaktivität (engl. unit) Ultraviolett Weltgesundheitsorganisation (engl. world health organisation) Ziehl-Neelsen

17 1 Einleitung 1 Einleitung Die Tuberkulose verschuldet jährlich zwei bis drei Millionen Todesfälle beim Menschen. Weltweit ist sie die häufigste bakteriell bedingte Todesursache, etwa ein Drittel der Weltbevölkerung ist mit dem Tuberkulose-Erreger infiziert. In Folge der Verbreitung des Humanen Immundefizienz Virus (HIV), mehrfach-resistenten Bakterienstämmen und erhöhtem internationalen Reiseverkehr wird von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) angenommen, dass zwischen 2002 und 2020 ca. eine Milliarde Menschen neu infiziert, 150 Millionen an Tuberkulose erkranken und 36 Millionen an Tuberkulose sterben werden (WHO 2003). Laut Mitteilung des Robert-Koch-Instituts ist die Tuberkulose nach den Virushepatitiden vom Typ B und C, sowie dem erworbenen Immundefizienz Syndrom (AIDS) die vierthäufigste infektionsbedingte Todesursache in Deutschland (ROBERT-KOCH-INSTITUT 2003). Unterschieden wird zwischen den klassischen Tuberkulosen, die beim Mensch hauptsächlich durch Mycobacterium (M.) tuberculosis und beim Rind hauptsächlich durch M. bovis verursacht werden, und den Mykobakteriosen, die durch fakultativ pathogene Mykobakterien (sog. nichttuberkulöse oder atypische Mykobakterien) ausgelöst werden. Die Bedeutung der Mykobakteriosen, vor allem bedingt durch den M. avium-intracellulare-komplex, ist durch die Verbreitung von HIV und AIDS in den letzten Jahren drastisch gestiegen (METCHOCK et al. 1999). Die Diagnostik gestaltet sich aufgrund des langsamen Wachstums von Mykobakterien schwierig und zeitaufwendig. Der klassische mikrobiologische Nachweis umfasst die Färbung auf Säurefestigkeit und die anschließende Detektion in der Kultur. Um den langen Zeitraum bis zum endgültigen Nachweis aus der Kultur zu überbrücken, sollte ein Direktnachweis aus Patientenmaterial, der zwischen tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien unterscheiden kann, mit Hilfe weiterer Methoden erfolgen. In den letzten Jahren wurden dafür verstärkt molekularbiologische Nachweismethoden entwickelt, die vor allem auf der Grundlage der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basieren (VAN SOOLINGEN 2001). Die spezifische Identifizierung erfolgt anschließend mit Hilfe von Gensonden, Restriktionsenzymen oder der Sequenzanalyse. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, im ersten Abschnitt ein in vitro entwickeltes Nachweisformat für Mykobakterien mit Hilfe der PCR und anschließender Schmelzpunktanalyse an Patientenisolaten aus der Kultur zu testen. Dabei sollte durch den Einsatz von verschiedenen spezifischen Sonden eine Unterscheidung von tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien im Rahmen einer Multiplex-PCR

18 2 Einleitung ermöglicht werden. Als Zielstruktur diente das 16S rrna-gen. Von den nichttuberkulösen Mykobakterien sollten außerdem die im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) nach dem M. tuberculosis-komplex (TBC) am häufigsten nachgewiesenen Erreger, M. avium ssp. avium und der M. chelonae-abscessus-komplex, weiter differenziert werden. Die arbeits- und kostenintensive Sequenzierung von mykobakterieller Desoxyribonukleinsäure (DNA) aus der Kultur könnte damit in den meisten Fällen durch die Amplifikation mit anschließender Schmelzpunktanalyse ersetzt werden. Um die Mykobakterien-Diagnostik noch weiter zu optimieren, sollte in einem weiteren Abschnitt ein Nachweis von Mykobakterien-DNA aus Direktmaterial erfolgen. Dafür musste eine Präparationsmethode zur Isolierung von genomischer mykobakterieller DNA aus Patientenmaterial entwickelt werden, die eine anschließende Amplifikation mittels PCR ermöglichte. Die Methode sollte sensitiv, spezifisch und wenig zeitaufwendig für die Anwendung in der klinischen Diagnostik sein. Zudem sollte eine Unterscheidung und Identifizierung der wichtigsten Spezies des TBC, M. tuberculosis, M. bovis und dem attenuierten M. bovis-stamm, Bacillus Calmette Guérin (BCG), aus Kulturisolaten mit Hilfe der PCR erfolgen. Dafür mussten andere Zielstrukturen verwendet werden, da alle Spezies des TBC in ihrer Sequenz auf dem 16S rrna-gen identisch sind. Der Arbeitsaufwand und Zeitbedarf in der Mykobakteriendiagnostik würde durch den Einsatz der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse deutlich reduziert werden. Dies bedeutet einen enormen Fortschritt für die klinische Praxis, da Therapie- und Isolierungsmaßnahmen schneller und gezielter eingeleitet werden können.

19 3 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Taxonomie und allgemeine Eigenschaften von Mykobakterien Mykobakterien gehören zur Familie der Mycobacteriaceae und leben als Saprophyten, opportunistische und obligate Krankheitserreger. Sie sind schlanke, gerade bis leicht gekrümmte Stäbchen mit 0,2-0,6 µm Breite und 1 bis 10 µm Länge. Sie wachsen unter aeroben bis mikroaerophilen Bedingungen (5-10% CO 2 ), sind unbeweglich und bilden keine Sporen (SALFINGER u. KAFADER 1992). Die Zellwand hat einen hohen Lipidgehalt, der aus Wachsen und charakteristischen Mykolsäuren mit langen Seitenketten besteht. Aufgrund der Wachshülle sind Mykobakterien mit den üblichen Anilinfarbstoffen nicht anfärbbar. Sie werden jedoch als grampositiv eingestuft. Für den Nachweis von Mykobakterien werden besondere Färbemethoden (z.b. nach Ziehl-Neelsen, Auramin-Färbung) angewendet. Dabei zeigt sich nach der Entfärbung mit salzsaurem Alkohol die typische Resistenz, der Farbstoff bleibt in der Lipidschicht der Zellwand, was als Säurefestigkeit bezeichnet wird (HAHN 1999). Die Genomgröße eines Mykobakteriums beträgt etwa 4,4 Millionen Basenpaare (COLE et al. 1998). Der hohe G/C-Gehalt der DNA (62-70%) ist den anderen mykolsäurehaltigen Bakterien wie Nocardien (60-69%), Rhodokokken (59-69%) und Corynebakterien (51-59%) sehr ähnlich (METCHOCK et al. 1999). Um dem Genus Mycobacterium zugeschrieben zu werden, muss ein neues, langsam wachsendes Bakterium folgende Anforderungen erfüllen (LEVY-FREBAULT u. PORTALES 1992): Säurefestigkeit, Anwesenheit von Mykolsäuren bestehend aus Kohlenstoffatomen, die durch Pyrolyse in Fettsäuremethylester mit Kohlenstoffatomen gespalten werden können und G/C-Gehalt der DNA von mindestens 61-71%. Diese Minimalanforderungen gelten lediglich für langsamwachsende Mykobakterien, für schnellwachsende Spezies gelten diese Kriterien bis zum heutigen Tage nicht. Primär können Mykobakterien in zwei Gruppen eingeteilt werden: Gruppe 1: alle Spezies des TBC Gruppe 2: alle Spezies, die nicht dem TBC angehören

20 4 Literaturübersicht Letztere werden auch als atypische oder nichttuberkulöse Mykobakterien bezeichnet. Die Bakterien des TBC sind genetisch so eng miteinander verwandt, dass man eher von Subspezies als von Spezies sprechen kann (VAN SOOLINGEN et al. 1997). Eine weitere Einteilung der Mykobakterien beruht auf der Wachstumsgeschwindigkeit. Schnellwachsende Mykobakterien benötigen weniger als sieben Tage, um sichtbare Kolonien auf Festmedien zu formen, während langsamwachsende Mykobakterien unter vergleichbaren Bedingungen mehr als sieben Tage benötigen. Die Koloniemorphologie variiert unter den verschiedenen Spezies, sie reicht von rauen bis glatten Kolonien, die pigmentiert oder unpigmentiert sein können. Als Wachstumssubstrate werden Stickstoff und Ammoniumquellen benötigt, zusätzlich Mineralsalze. Eine Ausnahmestellung gegenüber allen anderen Mykobakterien nimmt M. leprae ein, welches nicht in vitro angezüchtet werden kann (METCHOCK et al. 1999). Weiterhin können Mykobakterien auch nach dem Pathogenitätspotential eingeteilt werden (BÖTTGER 1991): Risikogruppe I: beinhaltet alle saprophytären Mykobakterien, deren Nachweis nur in Ausnahmefällen eine klinische Relevanz besitzt Risikogruppe II: beinhaltet die fakultativ pathogenen Mykobakterien, deren Nachweis bei immunsupprimierten Patienten von hoher Bedeutung ist Risikogruppe III: beinhaltet alle obligat pathogenen Mykobakterien 2.2 Vorkommen und Bedeutung Die meisten Mykobakterien sind ubiquitär vorkommende Umweltkeime, vor allem im Erdboden und Wasser, die saprophytär leben. Sie konnten in Ackerböden, Staub (v.a. M. fortuitum), Klärschlamm, Aquarien, natürlichen und künstlichen Gewässern, Schwimmbädern (v.a. M. marinum) und in Wasserleitungen (v.a. M. gordonae, M. kansasii) nachgewiesen werden (DEDIE 1993). Ausschließlich pathogene Keime, wie M. tuberculosis und M. leprae, welche sich in der unbelebten Umwelt nicht vermehren können und rein parasitär leben, stellen die Ausnahme in der Gattung Mycobacterium dar (SCHULE-RÖBBECKE 1993). 2.3 Der M. tuberculosis-komplex Der klassische TBC beinhaltet die Spezies M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. canetti und M. bovis. M. bovis BCG ist ein attenuierter Stamm vom virulenten

21 5 Literaturübersicht Stamm M. bovis und wird in vielen Ländern als Impfstoff gegen die Tuberkulose verwendet (TALBOT et al. 1997b). Die einzelnen Spezies sind sich in ihrem Erscheinungsbild sehr ähnlich und können aufgrund des identischen 16S rrna-gens mit Hilfe kommerziell erhältlicher Kits zum Nachweis von tuberkulösen Mykobakterien nicht weiter differenziert werden. Eine Differenzierung innerhalb des TBC ist jedoch für die Behandlung der erkrankten Patienten und für epidemiologische Zwecke, v.a. dort, wo die Tuberkulose endemische Proportionen erreicht hat, oder wo die Übertragung von M. bovis zwischen Mensch und Tier eine grosse Rolle spielt, nötig (PARSONS et al. 2002). Zudem kann es insbesondere bei immunsupprimierten Patienten wichtig sein, M. bovis BCG als Erreger zu identifizieren bzw. auszuschließen, da diese Personengruppen an M. bovis BCG induzierten Krankheiten erkranken können (TALBOT et al. 1997b). Eine Differenzierung erfolgt zumeist durch phänotypische Charakterisierung, wie Koloniemorphologie, Wachstumsgeschwindigkeit oder durch biochemische Tests. Dabei treten jedoch bei einzelnen Spezies aufgrund abweichenden Verhaltens Schwierigkeiten in der Differenzierung auf und können so zu einer falschen Klassifizierung führen M. tuberculosis M. tuberculosis, 1886 von Robert Koch entdeckt, ist der klassische Erreger der humanen Tuberkulose. Infektionen bei Tieren mit diesem Erreger sind äußerst selten und werden in der Regel durch den Menschen übertragen. Es wird davon ausgegangen, dass sich M. tuberculosis, der weltweit am meisten verbreitete Erreger der humanen Tuberkulose, aus M. bovis, dem Erreger der bovinen Tuberkulose, durch Adaption des tierischen Agens an den menschlichen Wirt entwickelt hat (BROSCH et al. 2002). Etwa 95% der in der MHH isolierten Spezies des TBC sind M. tuberculosis zuzuweisen. Virulente Stämme von M. tuberculosis zeigen in der Kultur ein zopf- bzw. strangartiges Wachstum, was durch den sog. Cordfaktor verursacht wird. Dieser Cordfaktor wird durch das Trehalose-6,6-Dimykolat, ein besonderes Lipid, gebildet. Nach Extraktion dieses Cordfaktors geht die Virulenz von M. tuberculosis verloren (HAHN 1999). Die Identifizierung von M. tuberculosis aus dem TBC erfolgt im Routinelabor häufig über die Bestimmung der Nitratreduktaseaktivität (SREEVATSAN et al. 1996).

22 6 Literaturübersicht M. tuberculosis ist im Gegensatz zu den anderen TBC-Spezies in der Lage, sehr schnell und in großen Mengen aus Nitrat Nitrit zu bilden. Diese Eigenschaft macht man sich zunutze und misst die Nitritproduktion in einer Diazo-Reaktion (vgl. Kapitel ) M. africanum Erste Beschreibungen von diesem Erreger des TBC stammen von CASTETS und Mitarbeitern (1968). M. africanum wird als Erreger der humanen Tuberkulose in bestimmten Regionen Afrikas angesehen. Dort werden mehr als 60% der Tuberkulose-Fälle nicht M. tuberculosis, sondern M. africanum zugeschrieben. Allerdings gibt es eine sehr hohe Variabilität in der Prävalenz innerhalb unterschiedlicher Regionen Afrikas (KALLENIUS et al. 1999; BONARD et al. 2000). M. africanum wird aufgrund der biochemischen Eigenschaften als eine Zwischenform von M. tuberculosis und M. bovis angesehen. Im Gegensatz zu M. tuberculosis und M. bovis zeigt M. africanum eine höhere Variabilität in der Phänotyperscheinung, was zu einer erschwerten Diagnose und teilweise zu einer falschen Klassifizierung führt (VAN SOOLINGEN 2001; NIEMANN et al. 2002). Aufgrund der biochemischen Charakterisierung kann M. africanum in zwei Subtypen eingeteilt werden. Stämme, die in Westafrika isoliert werden konnten, wurden dem Subtyp I zugeordnet, während Stämme aus dem Osten Afrikas dem Subtyp II zugeordnet wurden. Die biochemische Charakterisierung dieser Subtypen zeigte, dass Subtyp I eher zu den Eigenschaften von M. bovis passt, während Subtyp II M. tuberculosis ähnlicher ist (NIEMANN et al. 2002). Das Erscheinungsbild der Tuberkulose bedingt durch M. africanum unterscheidet sich nicht von den durch M. tuberculosis hervorgerufenen Symptomen M. microti M. microti wurde zum ersten Mal 1937 als Erreger der Tuberkulose bei Wühlmäusen beschrieben (WELLS u. OXON 1937) und trägt daher auch die Bezeichnung VoleTB. Aufgrund von molekularbiologischen Untersuchungen kann man M. microti in die Subspezies Vole-Typ und Ilama-Typ einteilen (VAN SOOLINGEN et al. 1998, 2001). Charakteristische Erscheinungsbilder einer Infektion sind die typischen Hautläsionen und Lymphadenitiden.

23 7 Literaturübersicht M. microti zeigt unter dem Mikroskop eine pleomorphe, charakteristische Morphologie. Die säurefesten Stäbchen sind s-förmig, manchmal spiralförmig oder sichelförmig im Frischmaterial zu sehen. Dieses typische kurvige Erscheinungsbild geht jedoch bei der in vitro Kultur verloren (CAVANAGH et al. 2002). Typisch für den Erreger ist das besonders langsame Wachstum in der Kultur von mindestens acht Wochen (VAN SOOLINGEN et al. 1998). Lange Zeit galt M. microti als nicht pathogen für den Menschen. HORSTKOTTE und Mitarbeiter (2001) beschrieben die erste pulmonale Infektion mit M. microti Ilama Typ I bei HIV-positiven Patienten. In den Niederlanden wurden vier Fälle von Infektionen mit M. microti beim Menschen beschrieben (VAN SOOLINGEN et al. 1998; KREMER et al. 1998). Die aus diesen Patienten isolierten Erreger zeigten Ähnlichkeiten mit den zuvor aus Frettchen und Schwein isolierten Erregern von M. microti. Eine der beschrieben Personen war nicht immunsupprimiert. Drei weitere Fälle wurden für immunkompetente Personen in der Schweiz und in Deutschland beschrieben (NIEMANN et al. 2000b). Bei allen beschriebenen Erkrankungen bedingt durch M. microti handelte es sich um pulmonale oder generalisierte Formen der Tuberkulose. Die Detektion von M. microti wird durch das besonders langsame Wachstum dieser Spezies behindert. Auf festen Nährböden benötigt der Erreger mindestens 6 bis 12 Wochen, um sichtbare Kolonien auszubilden (CAVANAGH et al. 2002). In flüssigen Nährböden erfolgt das Wachstum schneller. In vielen Routinelaboratorien werden die Kulturen jedoch nicht lange genug inkubiert, um ein Wachstum dieser Spezies nachzuweisen. Vor allem in Gebieten mit hoher Prävalenz an Nagern wird angenommen, dass es weit mehr Infektionen mit M. microti gibt, als nachgewiesen wurden (VAN SOOLINGEN 2001) M. canetti M. canetti wurde 1997 erstmalig als neue Spezies des TBC beschrieben (VAN SOOLINGEN et al. 1997). Bei diesem Erreger handelt es sich um eine selten vorkommende Variante von M. tuberculosis. Dieser vermutlich ausschließlich die humane Tuberkulose hervorrufende Erreger wurde von Patienten aus Afrika isoliert, bzw. von Patienten, die Kontakt dorthin hatten (BROSCH et al. 2002). Der Erreger verhält sich in biochemischen Tests ähnlich wie M. tuberculosis. Im Gegensatz zu den anderen Mitgliedern des TBC bildet M. canetti auf festen Nährböden jedoch glatte, glänzende Kolonien, was einen sehr auffälligen

24 8 Literaturübersicht Unterschied darstellt. Einige dieser Kolonien können sich unwiderruflich in rauhe Formen umwandeln. Beide Formen sind hoch infektiös im Meerschweinchen- Versuch. Weiterhin hat M. canetti eine wesentlich kürzere Generationszeit als M. bovis und M. tuberculosis, Unterschiede im Lipidgehalt der Zellwand (charakteristische Glykolipide und Lipooligosaccharide) und Unterschiede im Polymorphismus der Insertionssequenz (IS) IS1081 (VAN SOOLINGEN et al. 1997). Das charakteristische Glykolipid wurde erstmals in einer Variante von M. tuberculosis bei einem französischen Bauern 1969 von Georges Canetti isoliert (GOH et al. 2001). Alle bekannten, neueren Fälle von M. canetti stammen von Patienten aus Afrika. Es ist demzufolge möglich, dass die Region um Ostafrika das geographische Zentrum für M. canetti darstellt. VAN SOOLINGEN und Mitarbeiter (1997) beschrieben zwei Fälle einer Lymphknoten-Tuberkulose, deren Stämme eindeutig als M. canetti identifiziert werden konnten. In den von MILTGEN und Mitarbeitern (2002) beschriebenen Fällen lag eine Lungentuberkulose bei immunkompetenten Personen vor M. bovis M. bovis gilt als der klassische Erreger der bovinen Tuberkulose. Infektionen mit M. bovis beim Menschen entstehen zumeist über den Verzehr roher Milch von infizierten Kühen. Eine Übertragung von Mensch zu Mensch ist mit diesem Erreger selten (VAN SOOLINGEN 2001). Auch andere Tiere, wie Hunde, Katzen, Schweine und einige Vogelarten können sich mit M. bovis infizieren. Im Vergleich zu Infektionen mit M. tuberculosis ist das klinische Erscheinungsbild von M. bovis häufiger extrapulmonal. Das Hauptkriterium für die Differenzierung von M. bovis ist die Pyrazinamid (PZA)- Resistenz. Allerdings zeigten Studien, dass nicht alle M. bovis-stämme dieses Merkmal aufwiesen. Einige Stämme waren PZA sensibel (COLLINS et al. 1981; WAYNE et al. 1991; NIEMANN et al. 2000b). Aufgrund der erfolgreichen Rindertuberkulosebekämpfung in Deutschland, die durch die Verordnung zum Schutz gegen die Tuberkulose des Rindes geregelt wird, kommt die Erkrankung nur noch sehr selten vor. Laut Tierseuchenbericht gab es im Jahr 2003 im ersten Quartal drei Fälle von Rindertuberkulose in Deutschland (BUNDESMINISTERIUM FÜR VERBRAUCHERSCHUTZ 2003).

25 9 Literaturübersicht Infektionen mit M. bovis beim Wildtier sind bekannt (NOLAN u. WILESMITH 1994; DE LISLE et al. 2002). Weltweit verursacht M. bovis in der Veterinärmedizin einen wirtschaftlichen Schaden von drei Millionen Dollar (GARNIER et al. 2003). Der größte Anteil der Tuberkulose beim Tier wird durch M. bovis verursacht. Stämme, die aus Ziegen isoliert wurden, zeigten genetische Unterschiede, die bei den herkömmlichen M. bovis-stämmen nicht gefunden werden konnten. Eine neue Bezeichnung für diesen Stamm als M. bovis ssp. caprae (im folgenden M. bovis caprae genannt) wurde von ARANZAZ und Mitarbeitern (1999) vorgeschlagen. PRODINGER und Mitarbeiter (2002) beschrieben zwölf Fälle von M. bovis caprae in Österreich seit 1994, bei denen Rinder, Hirsche, aber auch Menschen betroffen waren. Der Kontakt mit Rindern, nicht aber mit Ziegen, war bei drei der vier infizierten Menschen gegeben M. bovis BCG Von 1908 bis 1921 wurde der virulente Stamm von M. bovis 231 mal im Institut Pasteur von Albert Calmette und Camille Guèrin auf verschiedenen Nährböden passagiert. Seit 1921 wird dieser attenuierte M. bovis-stamm als Lebendvakzine gegen die Tuberkulose in der ganzen Welt eingesetzt. Die meisten Personen tolerieren den Impfstoff ohne Komplikationen und bilden eine spezifische Immunität gegen Infektionen mit dem TBC aus. Die WHO empfiehlt noch heute in endemischen Tuberkulose-Gebieten eine einmalige Vakzination von allen Kindern, die keine Symptome einer HIV-Infektion zeigen. Treten nach der Impfung Komplikationen auf, so handelt es sich meistens um lokale Infektionen in Form von eitrigen Lymphadenitiden. Allerdings gibt es Berichte (CASANOVA et al. 1995, 1996; TALBOT et al. 1997a, 1997b; ANTAYA et al. 2001), in denen von Personen berichtet wird, die schwere Infektionen durch die Vakzination mit dem attenuierten M. bovis-stamm zeigen. Dabei handelt es sich um Patienten, die eine geschwächte zelluläre Immunität besitzen. Es traten neben lokal begrenzten Infektionen an der Impfstelle auch systemische Infektionen mit hoher Mortalität auf. 50% der disseminierten BCG-Infektionen traten bei Kindern mit einem festgestellten immundefizienten Syndrom auf, wie dem schweren kombinierten Immundefekt (SCID), den chronisch granulomatösen Erkrankungen (CGD) oder HIV. Die restlichen 50% werden als idiopathisch angesehen, allerdings wird ein nichtdiagnostizierter, genetisch bedingter Immundefekt vermutet (CASANOVA et al. 1995).

26 10 Literaturübersicht TALBOT und Mitarbeiter (1997a) untersuchten 28 veröffentlichte Fälle von generalisierten BCG-Erkrankungen und kamen dabei zu zwei neuen Erkenntnissen: während früher die generalisierte BCG-Erkrankung als eine Erkrankung von Kleinkindern angesehen wurde, treten seit einiger Zeit Fälle auf, bei denen ältere Kinder und auch Erwachsene betroffen sind, die mit dem HI-Virus infiziert sind. Die beobachteten Fälle traten nach einer erneuten Vakzination mit dem BCG-Stamm auf. Heutzutage scheinen die größten Risikogruppen immunsupprimierte Kinder und Personen im fortgeschrittenen Stadium von AIDS zu sein. M. bovis BCG ist weiterhin als effektive Immuntherapie bei verschiedenen Krebserkrankungen (z.b. Behandlung von Harnblasenkarzinomen) bekannt (BROSMAN 1992). Allerdings treten auch bei diesen Personen Komplikationen bedingt durch den M. bovis BCG-Stamm auf, wie z. B. lokale Entzündungen und eine generalisierte BCGitis (LAMM et al. 1992) Tuberkulose beim Menschen Epidemiologie und Bedeutung Die Tuberkulose ist seit Jahrhunderten diejenige bakterielle Infektionskrankheit, an der weltweit die meisten Menschen sterben. Inzidenz und Prävalenz der Erkrankung sind in den letzten 15 Jahren, bedingt durch zunehmenden internationalen Reiseverkehr, ansteigende Migration und das gehäufte Auftreten von HIV-Patienten, insbesondere in den Entwicklungsländern, stark gestiegen (STOKSTAD 2000; NAKATANI et al. 2002). Etwa ein Drittel der Weltbevölkerung ist latent mit M. tuberculosis infiziert, von denen nach Expertenschätzungen etwa 10% im Laufe ihres Lebens erkranken werden. In den Entwicklungsländern sterben jährlich zwei bis drei Millionen Menschen an Tuberkulose (WHO 2003). Im Jahr 2000 hatte ein Drittel aller HIV-Infizierten eine Koinfektion mit Tuberkulose. Für diese ist die Tuberkulose die häufigste Todesursache. Weltweit treten etwa 95% aller Tuberkulosefälle in Entwicklungsländern auf. Besonders stark betroffen sind Südostasien, Afrika und lateinamerikanische Staaten. In Europa ist die Sterblichkeitsrate an Tuberkulose in Russland am höchsten (YEROKHIN et al. 2001). Betroffen sind dort v.a. Gefängnisinsassen, mit Inzidenzen von 7.000/ Insassen (DEUTSCHES ZENTRALKOMMITEE ZUR BEKÄMPFUNG DER TUBERKULOSE 2003).

27 11 Literaturübersicht Die Tuberkulosesituation in Deutschland wird laut HAHN (1999) als nicht bedrohlich angesehen, allerdings gehört Deutschland nicht zu den sog. low incidence countries. Die Zahl der gemeldeten Neuerkrankungen an aktiver Tuberkulose im Jahr 2002 betrug Das entspricht einer Inzidenz von 9,4 Erkrankungen auf Einwohner. Der Anteil an erkrankten Ausländern beträgt 33,6% (ROBERT- KOCH-INSTITUT 2003). Die Inzidenzraten lagen im Jahr 2000 bundesweit zwischen 17,2 Erkrankungen pro Einwohner in Hamburg, 9,1 in Niedersachsen und 7,6 in Sachsen. Niedersachsen und das Saarland haben steigende Inzidenzen zu verzeichnen, während sie in den anderen Bundesländern auf gleichem Niveau liegen. Durch das Auftreten von multiresistenten Stämmen von M. tuberculosis ist die Anwendung von Therapeutika gegen die Tuberkulose ein Problem geworden (NOLAN 1997). Laut WHO ist die Anzahl an multiresistenten Stämmen in Deutschland und Dänemark seit 1996 um 50% auf 10,3% bzw. 13,1% angestiegen (STOKSTAD 2000). In Russland sind 7%, in bestimmten Regionen von Indien 14% und in Estland 22% aller Stämme von M. tuberculosis resistent gegen Rifampicin und Isoniacid Ätiologie und Pathogenese Die Tuberkulose wird durch Erreger des TBC hervorgerufen. Infektionsquellen sind erkrankte und infizierte Menschen. Der häufigste Übertragungsweg ist die Aerosolinfektion von Infizierten mit offener Tuberkulose, von untergeordneter Bedeutung bei der Übertragung sind Infektionen durch Staub, Nahrungsmittelinfektionen (Rohmilch, Fleisch) und Laborinfektionen. Das Sputum erkrankter und unbehandelter Personen enthält in jedem Tropfen große Mengen Mykobakterien. Ansteckungsfähigkeit besteht, solange säurefeste Stäbchen im Direktpräparat nachweisbar sind. Die ausgeworfenen Partikel sind 1-5 µm groß und können ein anderes Individuum beim Einatmen infizieren. Dabei reichen für gewöhnlich geringe Mengen an infektiösem Material aus, häufig ist aber auch die Resistenzlage der exponierten Person, die Häufigkeit und Dichte des Kontakts und die Virulenz des Erregers von Bedeutung (ROBERT-KOCH-INSTITUT 2003). Von extrapulmonalen Tuberkulosen geht kein nennenswertes Infektionsrisiko aus. Voraussetzung für eine Erkrankung ist die Infektion mit großen Bakterienmengen und darauffolgender Erregervermehrung und ausbreitung.

28 12 Literaturübersicht Charakteristische Ausbreitungswege sind (nach MATTHIESSEN 1992): lymphogene Streuung, hämatogene Aussaat nach Einbruch in das Gefäßsystem oder nach lymphogener Ausbreitung über den Angulus venosus, örtliche Ausbreitung (Organtuberkulose) sowie kanalikuläre Aussaat bei verkästen und eingeschmolzenen Prozessen. An der Eintrittspforte entwickelt sich ein entzündlicher Primärherd, von dem durch die Ausbreitung der Entzündung über die Lymphgefäße zu den regionären Lymphknoten der sog. Primärkomplex entsteht (DEDIE 1993). In 96-98% der Fälle kommt es in der Folge zum Stillstand der Entzündung und vorübergehenden oder dauerhaften Ausheilung. Im Verlauf der Tuberkulose treten typische Erscheinungen einer chronischspezifischen Entzündung auf. Die zelluläre Immunantwort bewirkt die Einwanderung von Epitheloidzellen, Langhans-Riesenzellen, Lymphozyten und Makrophagen, die einen Abwehrwall für die zentral gelegenen Mykobakterien darstellen (FRIEDLAND 1999). Eine exsudative Entzündung geht mit einer Infiltration polymorphkerniger Leukozyten, Makrophagen und Lymphozyten einher. Bei der produktiven und granulomatösen Entzündung bilden sich charakteristische Tuberkel oder Granulome aus. Im Zentrum dieser befinden sich Epitheloidzellen und Riesenzellen vom Langhanstyp. Das Zentrum kann verkäsen und verkalken. Die Mykobakterien persistieren in diesen Herden und bleiben über Jahrzehnte virulent. Von ihnen geht ständig die Bedrohung einer postprimären Erkrankung aus. Eine lymphogene und / oder hämatogene Ausbreitung der Bakterien vor Eintritt einer zellulären Immunantwort führt zu einer Frühgeneralisation. Diese verläuft als Miliartuberkulose oder in Form einer protrahierten Generalisation (MATTHIESEN 1992). Kommt es mehr als zwei Jahre nach einer Infektion mit Mykobakterien zu einer Reaktivierung der alten Herde, entwickelt sich eine postprimäre Lungentuberkulose (MATTHYS 2000). Solche Verlaufsformen zeigen sich in einer chronischen Organtuberkulose, die durch kanalikuläre oder direkte Ausbreitung auf einen großen Teil oder auf das gesamte Organ entstanden ist (MATTHIESEN 1992). Durch Einschmelzungsprozesse kommt es zur Kavernenbildung und / oder zu Einbrüchen in bestehende Hohlraumsysteme, z.b. den Bronchialbaum, wodurch eine offene Tuberkulose entsteht (MATTHYS 2000). Bei schlechter Resistenzlage des Wirtes können persistierende Mykobakterien ein Wiederaufbrechen der Infektion bewirken. In diesem Fall spricht man von einer Spätgeneralisation (MATTHIESEN 1992).

29 13 Literaturübersicht 2.4 Nichttuberkulöse Mykobakterien Einteilung nichttuberkulöser Mykobakterien Der Begriff nichttuberkulöse Mykobakterien (NTM) beinhaltet alle Spezies, die nicht Mitglieder des TBC sind. Die klassische, von RUNYON (1959) erstellte Einteilung der NTM, basiert auf den charakteristischen Anzeichen Wachstumsgeschwindigkeit, Koloniemorphologie und Pigmentierung. Demnach lassen sich bei den atypischen, für den Menschen pathogenen Mykobakterien vier Gruppen einteilen (vgl. Tab. 2.1). Tab. 2.1: Einteilung nichttuberkulöser Mykobakterien nach RUNYON Langsamwachsende Mykobakterien Schnellwachsende Mykobakterien Runyon Gruppe I Runyon Gruppe II Runyon Gruppe III Runyon Gruppe IV Photochromogen Scotochromogen Nonchromogen Nonchromogen M. kansasii M. marinum M. gordonae M. scrofulaceum M. avium Komplex M. terrae Komplex M. fortuitum M. chelonae M. abscessus Die Runyon-Gruppen I bis III werden als langsam wachsende Mykobakterien betrachtet, wobei die Wachstumsgeschwindigkeit von M. tuberculosis als Maßstab benutzt wird. In der Gruppe IV sind die schnell wachsenden Mykobakterien, die in weniger als sieben Tagen in den verwendeten Routinemedien wachsen Mykobakteriosen Die NTM sind gewöhnlich ubiquitär in der Umwelt vorhanden, v.a. in Wasser (Trinkwassersysteme) und Schmutz. Für den immunkompetenten Menschen sind sie wenig infektiös. Die Übertragung von Mensch zu Mensch ist selten, die meisten Infektionen beruhen auf Kontakt mit kontaminiertem Umweltmaterial. Erkrankungen, die auf NTM beruhen, werden als Mykobakteriosen bezeichnet und können in vier klinische Syndrome eingeteilt werden: Lungenerkrankungen, Lymphadenitiden, Hauterkrankungen und generalisierte Erkrankungen (SALFINGER u. KAFADER 1992; KOH et al. 2002). Die Vermehrung der NTM findet wie bei der Tuberkulose primär intrazellulär statt. Bakterielles Überleben, Infektion und Erkrankung gelingen meisten nur, wenn die T- Zell-abhängige Makrophagenaktivierung gestört ist. Werden die Makrophagen aktiviert, können die NTM meistens rasch und vollständig eliminiert werden. Gelingen Infektionen mit NTM bei generell funktionierendem T-Zellsystem, liegt häufig eine

30 14 Literaturübersicht lokale Schädigung vor (Lunge, Haut oder Bindegewebe). Bei ausreichendem Immunstatus entstehen am Ort der bakteriellen Besiedlung Granulome, in denen der Erreger abgekapselt wird. Bei mäßig geschwächter T-Zellaktivierung oder lokaler Schädigung kann die Infektion zur Krankheit führen, bleibt aber lokal begrenzt. Bei stark geschwächter T-Zellfunktion sammeln sich Makrophagen diffus am Absiedlungsort. Die Erregerabwehr gelingt nicht mehr, der Keim kann sich ausbreiten und andere Organe befallen. Dies ist v. a. der Fall bei einer Defizienz der CD4 T- Zellen, welche die Makrophagenaktivierung kontrollieren. So erklärt sich die Häufigkeit von mykobakteriellen Infektionen bei AIDS-Patienten und anderen Patienten mit T-Zelldefekten (KAUFMANN 1994; ANTAYA 2001). Bevor es zum Auftreten von AIDS kam, waren die Erkrankungen beim Menschen mit NTM überwiegend auf Erkrankungen der Lunge, Lymphknoten und Haut limitiert (FALKINGHAM III1996). Dies galt auch für immunkompetente Personen. Betroffen waren zumeist Männer ab einem Alter von 60 Jahren. Die meisten Patienten hatten prädisponierende Faktoren (Pneumoconidiosis, Raucherlunge) oder haben unter Bedingungen gearbeitet, in denen sie Staub ausgesetzt waren (sog. Farmer Lung ). Die pulmonale Infektion mit NTM beruht in den meisten Fällen auf einer Infektion mit dem M. avium-intracellulare-komplex (MAC), gefolgt von M. kansasii (FALKINHAM III 1996). Die Hautinfektionen bei immunkompetenten Personen gehen zumeist mit einem Trauma oder einer Injektion mit Kortikosteroiden einher. Der MAC tritt als häufigste Ursache von Lymphadenitiden bei Kindern im Alter von ein bis fünf Jahren auf. Generalisierte Infektionen mit diesem Erreger sind bei immunkompetenten Personen eher selten. Mit dem Auftreten von AIDS hat sich das Bild der NTM Erkrankungen radikal verändert % der Patienten in Europa und den USA, die mit AIDS infiziert sind, haben eine Infektion mit NTM, v.a. MAC-Infektionen (FALKINHAM III 1996). Bei AIDS-Patienten und anderen immundefizienten Personen verlaufen die Infektionen mit NTM meistens generalisiert. Die Inzidenz der Infektion mit NTM wird erwartungsgemäß ansteigen, da es bedingt durch AIDS und andere immunsupprimierende Krankheiten einen ständig wachsenden Anteil an gefährdeten Personen gibt (FALKINHAM III 1996). NTM werden auch mit einer steigenden Häufigkeit von Patienten mit cystischer Fibrose isoliert. Eine wichtige Rolle spielen hier die Erreger M. abscessus, M. chelonae und M. fortuitum, wobei auch Erreger des MAC und M. kansasii isoliert werden konnten (BANGE et al. 1999). Der M. chelonae-abscessus-komplex wird am häufigsten aus dem respiratorischen Trakt von Patienten mit cystischer Fibrose

31 15 Literaturübersicht isoliert (BOXERBAUM 1980; KILBY et al. 1992; AITKEN et al. 1993; EBERT u. OLIVIER 2002). Die meisten veröffentlichten Studien haben keine weitere Unterscheidung zwischen den beiden auf dem 16S rrna-gen sequenzgleichen Spezies gemacht, sondern beide Erreger als M. chelonae-abscessus-komplex zusammengefasst. Nach Beschreibungen von GRIFFITH und Mitarbeitern (1993) war der am häufigsten nachgewiesene Erreger aus dem Komplex M. abscessus. Für die Diagnose Mykobakteriose reicht der einmalige Nachweis aus Patientenmaterial nicht aus. Vielmehr müssen hierfür mehrere Bedingungen erfüllt sein. Nach SALFINGER und KAFADER (1992) müssen entweder eines der folgenden Hauptoder drei der folgenden Nebenkriterien gegeben sein: Hauptkriterien: Nachweis von mehr als 100 Kolonien derselben Keimart in mindestens vier Proben bei einem Krankheitsbild, das dem Keim zugeordnet werden kann Isolierung von NTM aus einer Läsion, deren Histopathologie für eine Beteiligung von Mykobakterien spricht Nebenkriterien: mindestens viermalige Isolierung derselben Erregerart oder Wachstum von mehr als 100 Kolonien in einer Probe Zeitlicher Zusammenhang zwischen Krankheit und Keimisolierung Isolierung des Keimes aus einem Organ oder Gewebe, das zuvor unbekannte histopathologische Veränderungen aufwies Neben den genannten Erregern besitzen weiterhin M. kansasii, M. malmoense, M. marinum, M. scrofulaceum, M. haemophilum und M. ulcerans eine klinische Signifikanz (SALFINGER u. KAFADER 1992), wobei M. kansasii und M. marinum als häufig pathogen eingestuft werden können (METCHOCK et al. 1999). Die meisten der genannten Erreger verursachen chronische Lungeninfektionen. M. marinum ist insbesondere für Hautinfektionen verantwortlich, v.a. nach Kontakt mit kontaminiertem Wasser (sog. Schwimmbadgranulom ). Ebenfalls chronische Hautinfektionen, einhergehend mit schweren Nekrosen, verursacht M. ulcerans (HAHN 1999). Von diesem Erreger sind v.a. tropische Gebiete und Australien betroffen. In der MHH wurden im Jahr 2000 neben den Spezies des TBC, der MAC, M. abscessus, M. marinum, M. fortuitum, M. haemophilum, M. simiae, M. xenopi, M. gordonae, M. vaccae und M. terrae aus Patientenmaterial nachgewiesen.

32 16 Literaturübersicht 2.5 Diagnostik von Mykobakterien Probenentnahme Die Auswahl der Proben richtet sich nach der Organmanifestation. Die meisten Proben werden aus dem Respirationstrakt gewonnen (Sputum, Bronchialsekret, Bronchiallavage). Besonders günstig für die Mykobakteriendiagnostik aus dem Respirationstrakt sind Morgensputen, da hier die Konzentration an Erregern gewöhnlich besonders hoch ist. Aber auch Urin, Magensekret, Gewebe, Liquor, Punktate und Abstrichproben können zur Diagnostik verwendet werden. Blut- und Stuhlproben werden zumeist von Patienten mit AIDS eingesendet. Die ersten Proben sollten nach Möglichkeit vor Einleitung einer Chemotherapie gewonnen werden. Sofern möglich, sollten Proben an mindestens drei aufeinanderfolgenden Tagen entnommen und untersucht werden. Untersuchungen zur Behandlungskontrolle sollten im Abstand von zwei bis vier Wochen durchgeführt werden. Um das Überwachsen von anderen Bakterien in der Probe zu verhindern, muss die versandte Probe so schnell wie möglich in das Labor gelangen. Grundsätzlich sollten die Proben so steril wie möglich entnommen werden, um Kontaminationen mit anderen Erregern oder Mykobakterien, die in der Umwelt leben, zu vermeiden (METCHOCK et al. 1999) Aufbereitung von Patientenmaterial Viele der eingesendeten Patientenproben sind kontaminiert mit der Normalflora der entsprechenden Entnahmestelle. Da Mykobakterien langsam wachsen und eine lange Inkubationszeit benötigen, können sie leicht von Begleitflora überwuchert werden, die mit dem Probenmaterial mit angelegt wird. Deshalb sind Vorbehandlungen des eingesendeten Materials vor dem Anlegen zum Nachweis von Mykobakterien notwendig. Die Vorbehandlung des zu untersuchenden Materials bewirkt eine Homogenisierung der Probe (z.b. bei Geweben), eine Dekontamination der Begleitflora und eine Anreicherung der Mykobakterien durch Zentrifugation. Biopsieproben, Liquor und Blut brauchen nicht dekontaminiert werden, da sie primär steril sind. Eine weit verbreitete und anerkannte Möglichkeit der Vorbehandlung zum kulturellen Nachweis von Mykobakterien ist die Natriumhydroxid-N-Acetyl-L-Cystein- (NaOH- NALC) Methode (WHITTIER et al. 1993, 1997). Auch eine Kurzzeitbehandlung der Proben mit NaOH zur Dekontamination in Kombination mit Natrium-Laurylsulfat (SDS-Methode) ist geeignet (SALFINGER u. KAFADER 1992).

33 17 Literaturübersicht Mikroskopischer Nachweis Für die Diagnose von Mykobakterien mittels Mikroskopie wird die Eigenschaft der Säurefestigkeit ausgenutzt. Dieses Screening hat den Vorteil, dass es eine sehr schnelle und einfache Möglichkeit ist, säurefeste Bakterien in der Probe nachzuweisen (SALFINGER u. KAFADER 1992). Allerdings gibt es auch andere Erreger, die in der Färbung ebenfalls säurefest erscheinen (Rhodokokken, Nocardien, Corynebakterien, Cryptosporidien etc.) und so nicht von Mykobakterien unterschieden werden können. Ferner kann man nicht zwischen Erregern des TBC und atypischen Mykobakterien unterscheiden und auch die Sensitivität von 40% ist im Vergleich zur Kultur niedrig. Als Minimum müssen 5 x 10 3 bis 10 4 säurefeste Stäbchen pro Milliliter in der Probe vorhanden sein, um ein positives Ergebnis in der Färbung zu erreichen, wobei die Mengen für einen Nachweis in der Kultur bei 10 1 bis 10 2 Erregern liegen (METCHOCK et al. 1999). Auch die Erfahrenheit des Untersuchers ist von großer Bedeutung bei der mikroskopischen Beurteilung. Die gebräuchlichste und spezifischste Methode der Färbung ist die Färbung nach Ziehl-Neelsen (ZN). Säurefeste Bakterien erscheinen dabei als rotgefärbte Stäbchen auf blauem Hintergrund. Neben der Färbung kann ein geübter Untersucher auch anhand der Anordnung oder dem Aussehen der säurefesten Stäbchen zwischen einzelnen Mykobakterien-Spezies unterscheiden bzw. einen Verdacht äußern. So bestimmt der Cordfaktor von M. tuberculosis eine bestimmte Anordnung der Stäbchen, die V-förmig oder palisadenartig sein kann und auch als zopfförmig bezeichnet wird. M. kansasii erscheint meistens gebändert und die Stäbchen sind länger als die von M. tuberculosis. M. xenopi zeigt lange schlanke Stäbchen mit unregelmäßiger Lagerung, die an Vogelnester erinnern (SALFINGER u. KAFADER 1992). Als Übersichtsfärbung hat sich die Fluoreszenzmikroskopie mittels Auramin gefärbter Präparate bewährt. Auramin ist ein Fluorochrom, das, wenn es an Mykolsäuren bindet, fluoresziert und resistent gegenüber der Entfärbung mit Alkohol ist. Aufgrund der Fluoreszenz kann das Präparat bei gleichbleibender Sensitivität durch eine geringere Anzahl an Gesichtsfeldern als nach der ZN-Färbung beurteilt werden, um die Diagnose negativ für säurefeste Stäbchen zu stellen. Geringerer Zeitaufwand und größere Nachweisraten sind die Folge. Im Gegensatz zur ZN-Färbung ist bei der Auraminfärbung jedoch die Morphologie nicht so gut zu beurteilen, so dass im Zweifelsfall eine nachfolgende Bestätigung mit der ZN-Färbung erforderlich ist (DEDIE 1993).

34 18 Literaturübersicht Kultureller Nachweis Die Untersuchung auf Mykobakterien in der Kultur wird als Goldstandard in der bakteriologischen Diagnostik betrachtet (TAYLOR et al. 2001). Das angereicherte, homogenisierte und bei Bedarf dekontaminierte Material wird auf verschiedene Nährböden überimpft. Dabei sollten flüssige und feste Nährböden, die selektiv für Mykobakterien sind, kombiniert werden. Feste Medien basieren auf der Grundlage von Ei oder Agar, wobei alle Malachitgrün enthalten, ein Farbstoff, der das Wachstum der Kontaminationsflora hemmt. Die koagulierten Eiernährböden in den Modifikationen nach Löwenstein-Jensen, Stonebrink, Gottsacker, etc. besitzen eine gute Pufferkapazität und können toxische Stoffe im Untersuchungsmaterial inaktivieren. Die Agarnährböden 7H10 und 7H11 nach Middlebrook eignen sich gut für die Differenzierung und Vereinzelung von Mykobakterien. Agarnährböden inaktivieren die toxischen Stoffe nur wenig, deshalb sind sie nur nach Vorbehandlungen mit SDS oder der NaOH-NALC-Methode geeignet (SALFINGER u. KAFADER 1992; DEDIE 1993). Die Kulturen werden für sechs bis acht Wochen bebrütet und im wöchentlichen Abstand abgelesen. Eine erhöhte CO 2 -Spannung (5-10%) wirkt sich positiv auf das Wachstum aus. Von bewachsenen Kulturen ist ein ZN-Präparat anzufertigen, um zu überprüfen, ob es sich um säurefeste Stäbchen handelt. Der Vorteil fester Kulturmedien gegenüber der Flüssigkultur liegt darin, dass eine makroskopische Beurteilung der Kolonien möglich ist. Die Selektivität ist bei Festmedien höher und die Kontaminationsrate geringer. Als flüssige Kulturmedien eignen sich die 7H9-Bouillon nach MIDDLEBROOK, die Tb-Bouillon nach DUBOS-MIDDLEBROOK und das Substrat 30 nach KIRCHNER. Auch automatische Kultursysteme der Fa. BECTON-DICKINSON eignen sich für den Nachweis von Mykobakterien. Das radiometrische BACTEC -AFB System erlaubt den Nachweis von Mykobakterien in einem sehr frühen Stadium. Die durchschnittliche Detektionszeit wird für NTM mit einer Dauer von sieben Tagen angegeben, für M. tuberculosis neun bis vierzehn Tage. Um das Wachstum der Kontaminanten zu unterdrücken und gleichzeitig das Wachstum zu beschleunigen, wird dem BACTEC 12B Medium ein Gemisch aus antimikrobiellen Stoffen (PANTA) zugefügt (METCHOCK et al. 1999). Der Gebrauch dieser automatischen Kultursysteme hat die Nachweisrate und Detektionszeit von Mykobakterien deutlich verbessert (METCHOCK et al. 1999). Vor allem die im Direktausstrich negativen Proben für säurefeste Stäbchen und Proben von bereits behandelten Patienten mit chronischen Erkrankungen können mit diesen Systemen besser erfasst werden.

35 19 Literaturübersicht Limitierend beim BACTEC -System ist die Unfähigkeit, die Kolonienmorphologie zu beurteilen, Mischinfektionen zu erkennen, das Überwachsen von Kontaminanten, hohe Kosten und die Verwendung von radioaktivem Material. Das BACTEC -MGIT TM -960-System der Fa. BECTON DICKINSON ist nicht radiometrisch und eignet sich für alle klinischen Materialien. Eingebettet in Silikon am Boden des Nachweisröhrchens befindet sich eine fluoreszierende Verbindung. Diese Verbindung spricht auf das Vorliegen von gelöstem Sauerstoff in der Bouillon an. Anfänglich ist nur wenig Fluoreszenz nachweisbar, da die große Menge an aufgelöstem Sauerstoff die Emission der fluoreszierenden Verbindung absorbiert. Später nehmen die wachsenden, aktiv aspirierenden Mikroorganismen den Sauerstoff auf und die steigende Fluoreszenz kann vom Gerät gemessen werden. Die in das Gerät eingegebenen Röhrchen werden fortwährend bei 37 C inkubiert und die Fluoreszenz jede Stunde vom Gerät gemessen. Positive Röhrchen werden vom Gerät angezeigt. Ein positives Röhrchen enthält etwa 10 5 bis 10 6 koloniebildende Einheiten (KBE) pro Milliliter (BECTON DICKINSON 1999). Die Sensitivität und die durchschnittliche Detektionszeit entsprechen den Angaben für das BACTEC -AFB System. Allerdings sind die Kontaminationsraten mit diesem System deutlich höher (METCHOCK et al. 1999). Die Flüssigkultur besitzt im Gegensatz zu den festen Kulturmedien eine höhere Sensitivität und eine kürzere Wachstumszeit. Allerdings ist die Kontaminationsrate höher und auch der höhere Kostenfaktor ist zu berücksichtigen (SALFINGER u. KAFADER 1992) Biochemische Differenzierung Nachdem die Mykobakterienisolate in eine erste Gruppe aufgrund ihrer Wachstumsgeschwindigkeit, der Pigmentierung, ZN-Färbung etc. differenziert wurden, findet in der traditionellen Diagnostik mit Hilfe von biochemischen Tests eine weitere Differenzierung der Spezies bzw. des Spezies-Komplex statt. Mykobakterien sollten stets so weit wie möglich innerhalb der Spezies differenziert werden (BROSCH et al. 2002). Es sollen hier nur einige, wichtige Verfahren aufgeführt werden, die sich im Wesentlichen auf die Unterscheidung innerhalb des TBC beziehen.

36 20 Literaturübersicht Niacin-Test Niacin (Nikotinsäure) fungiert als Vorstufe in der Biosynthese der Coenzyme Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) und Nicotinamidadenindinucleotid-phosphat (NADP). Der Test basiert auf dem Nachweis von Niacin im Medium. Alle Mykobakterien produzieren Niacin, allerdings kommt es durch Fehlen eines Enzyms zu einer Blockierung bei der Umwandlung von Nicotinsäure in Nicotinsäuremononukleotid bei M. tuberculosis, einigen M. bovis BCG-Stämmen und verschiedenen, schnell-wachsenden Mykobakterien. Dies führt zur Akkumulation von Niacin und zur Abgabe des wasserlöslichen Nebenproduktes in das umgebende Medium. Um M. tuberculosis eindeutig von den anderen Spezies des TBC und NTM unterscheiden zu können, sollte dieser Test immer mit einem anderen, z.b. dem Nitratreduktase-Test oder Katalase-Test, kombiniert werden (METCHOCK et al. 1999) Nitratreduktase-Test Mit diesem Test wird die Fähigkeit der Mykobakterien untersucht, mit Hilfe der Nitratreduktase organisches Nitrat zu Nitrit zu reduzieren. Das gebildete und im Medium akkumulierte Nitrit kann dann in einer Diazo-Reaktion als Farbumschlag von farblos nach rot sichtbargemacht werden. Mykobakterien des TBC unterscheiden sich quantitativ in der Fähigkeit, aus Nitrat Nitrit zu bilden. Die Referenzmethode wurde von VIRTANEN (1960) vor mehr als 40 Jahren etabliert. Da die Reaktion ausschließlich Nitrit nachweist, kann bei Stämmen, die Nitrat über Nitrit hinaus reduzieren, eine negative Nitratreduktion vorgetäuscht werden. Aus diesem Grund wird zu dem Reaktionsansatz Zinkstaub gegeben, welches vorhandenes Nitrat zu Nitrit reduziert. Tritt erst nach der Zugabe von Zinkstaub die Verfärbung ein, war der Test Nitratdeduktase negativ. Bleibt die Probe farblos, ist der Stamm Nitratreduktase positv (SALFINGER u. KAFADER 1992). Tab. 2.2: Nitratreduktase-Aktivität der Spezies des M. tuberculosis-komplexes Spezies Aktivität M. tuberculosis ++++ M. africanum +/- M. microti +/- M. canetti +/- M. bovis +/- M. bovis caprae +/- M. bovis BCG +/-

37 21 Literaturübersicht Der Nitratreduktasetest ist in vielen klinischen Diagnostiklaboren die Methode der Wahl zur Unterscheidung von M. bovis und M. tuberculosis bei TBC-positiven Proben. Allerdings gibt es einige Stämme des TBC, die sich nicht eindeutig durch den Test einstufen lassen und falsch differenziert werden (NIEMANN et al. 2000b) Pyrazinamidase-Test Das Enzym Pyrazinamidase hydrolysiert Pyrazinamid (PZA) zu Pyrazinsäure und Ammonium. Die vom Enzym gebildete Säure kann durch Zugabe von Eisen- Ammonium-Sulfat nachgewiesen werden. Dieser Test ist v.a. sinnvoll für die Unterscheidung von M. tuberculosis und M. bovis. M. tuberculosis wird in diesem Test innerhalb von vier Tagen positiv, wobei M. bovis innerhalb von mindestens sieben Tagen negativ bleibt. Die PZA Resistenz ist charakteristisch für M. bovis. Weiterhin kann das Ergebnis für die Bewertung der PZA-Resistenz von M. tuberculosis genutzt werden. Ein Pyrazinamidase negativer M. tuberculosis- Stamm wird als PZA resistent bewertet (METCHOCK et al. 1999) Molekularbiologische Nachweismethoden von Mykobakterien Der bereits erwähnte Goldstandard für die Diagnostik von Mykobakterien beruht auf dem kulturellen Nachweis (TAYLOR et al. 2001). Die Mikroskopie des Direktmaterials dient als ein Screening und ist sehr einfach und schnell durchzuführen. Allerdings ist diese Methode nicht sehr sensitiv (mindestens Keime pro Milliliter Sputum), um ein positives Präparat zu ergeben, und eine Speziesdiagnose ist nicht möglich. Die Kulturverfahren sind hochsensitiv ( lebende Keime pro Milliliter sind ausreichend, um ein positives Ergebnis zu erzielen), aber sie sind sehr langwierig und erfordern mindestens zwei bis acht Wochen bis zur endgültigen Diagnose (METCHOCK et al. 1999). Ein idealer diagnostischer Test würde Mykobakterien direkt aus Patientenmaterial detektieren und differenzieren, um die lange Zeit bis zur endgültigen Diagnose aus der Kultur zu verkürzen (METCHOCK et al. 1999). Die Entwicklung molekularbiologischer Techniken ermöglichte es nicht nur, Mykobakterien wesentlich schneller zu differenzieren, sondern auch ihre Verwandtschaften aufzudecken und phylogenetische Untersuchungen durchzuführen (BROSCH et al. 2002). Bis heute gibt es keine Methode, die als allgemein anerkannter Standard in der molekularbiologischen Mykobakteriendiagnostik gilt.

38 22 Literaturübersicht In den letzten Jahren wurden verstärkt Amplifikationstechniken von DNA oder Ribonukleinsäure (RNA) mit anschließender Sequenzierung oder Hybridisierung zur Identifizierung und Differenzierung von Mykobakterien eingesetzt. Dabei wurde Kulturmaterial, aber auch Direktmaterial von Patienten verwendet. Häufig basiert die Nachweismethode auf der PCR, wobei sich die Zielstrukturen unterscheiden und abhängig von der jeweiligen Fragestellung (Speziesidentifikation, Resistenzbestimmung etc.) sind (VAN SOOLINGEN 2001). Neben der PCR werden auch andere Amplifikationsmethoden, wie z.b. die Ligasekettenreaktion (LCR) oder die isothermale transkriptionsvermittelte Amplifikation (TMA) von RNA zur Diagnostik der Mykobakterien genutzt (PFYFFER et al. 1996; LINDBRATHEN et al. 1997; MOORE u. CURRY 1998) Bei der LCR binden Sondenpaare komplementär und in unmittelbarer Nähe zueinander an einzelsträngige Zielsequenzen. Die Lücke wird mit Hilfe einer thermostabilen Ligase verknüpft. Der neu entstandene Komplementärstrang dient in den weiteren Amplifikationszyklen als Matrize (MOORE u. CURRY 1998). Die isothermale TMA beruht auf einer Vervielfältigung von RNA mit Hilfe der reversen Transkriptase (RT) und RNA-Polymerase. Die RT stellt von der Ziel-RNA einen komplementären DNA-Strang her, die entstehenden RNA-DNA-Hybride werden durch das Enzym RNase abgebaut, es entsteht somit einzelsträngige DNA. Aus dieser wird mit Hilfe der RT doppelsträngige DNA hergestellt. Die RNA- Polymerase synthetisiert von dieser wiederum ein RNA-Amplikon, das wieder in den TMA-Zyklus eintritt und vermehrt wird. (PFYFFER et al. 1996; SCARPARO et al. 2000). Bei der isothermalen Strand Displacement Amplifikation (SDA) wird mit Hilfe von spezifischen Primern, die eine entsprechende Schnittstelle für ein Restriktionsenzym enthalten, einer Polymerase und einem Restriktionsenzym eine Amplifikation der entsprechenden Zielsequenz durchgeführt (LITTLE et al. 1999). Eine häufig verwendete Zielsequenz für die Amplifikation ist das 16S rrna-gen. Dieses eignet sich besonders gut, da es sich in jedem zellulärem Organismus befindet (WOESE 2003). Es besitzt hochkonservierte Sequenzbereiche (d.h. Sequenzbereiche völlig verschiedener Mikroorganismen sind weitgehend identisch) sowie genusspezifische und speziesspezifische Bereiche, die zur Identifizierung der einzelnen Spezies genutzt werden können (BÖDDINGHAUS et al. 1990). Die Identifizierung ist mit dieser Methode schneller und zuverlässiger als die Differenzierung mit Hilfe biochemischer Tests (TROESCH et al. 1999). Häufig wird daher das 16S rrna-gen zum Nachweis des Genus Mycobacterium und zur

39 23 Literaturübersicht weiteren Identifizierung auf Speziesebene, v.a. bei langsamwachsenden Mykobakterien, genutzt (RINGUET et al. 1999). Ein Nachteil bei der Identifizierung von Mykobakterien über das 16S rrna-gen ist, dass einige Spezies gleiche Sequenzen besitzen und so nicht weiter voneinander differenziert werden können. Dazu gehören v.a. die klinisch bedeutsamen Spezies des TBC, M. abscessus und M. chelonae, M. marinum und M. ulcerans sowie M. gastri und M. kansasii. Für die Unterscheidung der sequenzgleichen Spezies müssen andere Zielstrukturen genutzt werden (SOINI u. MUSSER 2001). Für diesen Zweck stehen weitere Zielsequenzen zur Verfügung, die eine Unterscheidung der meisten sequenzgleichen Spezies ermöglichen. Das 32-kDa Protein-Gen (SOINI et al. 1994), das 65 kda-hitzeschockprotein (hsp65)-gen (KAPUR et al. 1995) und repetitive Elemente auf der DNA, wie die 16S- 23S rrna ITS (internal transcribed spacer) Region (ROTH et al. 1998; RINGUET et al. 1999), enthalten genügend Sequenzunterschiede zur Unterscheidung der bedeutenden pathogenen Mykobakterien, ausgenommen dem TBC. Für jede Zielstruktur gibt es Vor- und Nachteile, jedoch eignen sich einige als sinnvolle Ergänzung, um auf weiterer Speziesebene zu differenzieren. Das hsp65- Gen eignet sich insbesondere aufgrund der Variabilität zur Unterscheidung bei schnellwachsenden Mykobakterien, wie M. chelonae und M. abscessus (YAKRUS et al. 2001). Die Identifizierung der Insertionselemente IS986 und IS6110 brachte den Durchbruch in der molekularen Diagnostik des TBC. Die Analyse des IS6110 wird als Standard- Zielsequenz zur Unterscheidung innerhalb des TBC verwendet (vgl. Kapitel 2.5.8). Für die weitere Differenzierung und Identifizierung der Amplifikate wurde eine große Anzahl an DNA Fingerprint-Methoden zur Diagnostik von Mykobakterien entwickelt. Anfangs nutzte man die Analyse mittels Restriktionsendonukleasen. Eine von TELENTI und Mitarbeitern (1993) beschriebene Identifizierung klinisch relevanter und häufig isolierter Mykobakterien beruht auf der Verwendung von zwei verschiedenen Restriktionsenzymen nach der PCR. Anhand der unterschiedlichen Fragmentgrößen kann eine Identifizierung erfolgen. Beim Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus (RFLP) wird genomische DNA aus der Kultur isoliert und mit einem Restriktionsenzym verdaut. Die Fragmente werden anschließend mit einer spezifischen Sonde hybridisiert (VAN SOOLINGEN 2001). Später wurden spezifische DNA Sequenzen als Sonden verwendet, die zu der gesuchten Sequenz homolog waren. Die Sichtbarmachung der Sonden erfolgte nach

40 24 Literaturübersicht dem Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)-Prinzip, radioaktiv oder durch Fluoreszenz (PATEL et al. 1997). Die Spoligotyping-Methode basiert auf der Sichtbarmachung von bestimmten DNA Sequenzdistanzen auf dem Direct Repeat-Genabschnitt (DR) der genomischen DNA. Die Region enthält eine unterschiedliche Anzahl dieser DR sowie verschiedene Sequenzdistanzen innerhalb der DR. Durch Amplifizierung und anschließende Hybridisierung mit spezifischen Sonden entstehen je nach Spezies unterschiedliche Muster, die als Spoligotypes bezeichnet werden (NIEMANN et al. 2002). Die auf der PCR basierende Sequenzierung von bestimmten Mykobakterien-DNA- Abschnitten gilt als Methode der Wahl für die Identifizierung der einzelnen Mykobakterienspezies (SOINI u. MUSSER 2001). Sie ist sowohl aus Kulturmaterial als auch direkt aus klinischen Proben möglich. Die Methode beruht auf der Amplifikation der DNA mit genusspezifischen Primern mittels PCR und anschließender Sequenzierung der Amplikons. Die Nukleotidsequenz des sequenzierten Organismus wird mit Referenzsequenzen verglichen. Die dabei am häufigsten verwendete Zielsequenz ist das 16S rrna-gen. Eine weitere Möglichkeit zum Nachweis von Mykobakterien ist die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Anhand der charakteristischen Mykolsäuren werden die Mykobakterien mit bereits erstellten Mustern aus Sputumproben identifiziert. Nachteilig ist allerdings die niedrige Sensitivität, es können nur Sputumproben verwendet werden, die mikroskopisch positiv für säurefeste Stäbchen sind (JOST et al. 1995). Außerdem zu bedenken sind sowohl der hohe Kostenfaktor als auch der hohe Arbeitsaufwand Kommerzielle Testsysteme Kommerziell erhältliche Tests sind meistens auf die Identifizierung des TBC beschränkt. Man unterscheidet zwischen Testsystemen, die die Detektion direkt aus Patientenmaterial ermöglichen und Testsystemen, die den Nachweis aus der Kultur möglich machen. Von der Fa. ROCHE wurde der Amplicor M. tuberculosis Test (AMPLICOR MTB) entwickelt (TEVERE et al. 1996), der standardisierte Reagenzien und die Verwendung von Desoxy-Uridintriphosphat (dutp) und Uracil-N-Glykosylase zur Verhinderung von Kreuzkontaminationen (LONGO et al. 1990) benutzt. Als Zielsequenz dient das 16S rrna-gen, welches mit mykobakterienspezifischen Primern mittels PCR amplifiziert und im Anschluss mit einer TBC-spezifischen Sonde hybridisiert wird. Durch das ELISA-Prinzip wird ein positives Ergebnis sichtbar

41 25 Literaturübersicht gemacht. Beim Vergleich der AMPLICOR MTB-PCR mit den Ergebnissen aus der Kultur ergab sich eine Sensitivität von 79,4-91,9% und eine Spezifität von 99,6-99,8% (SOINI u. MUSSER 2001). Mit diesem Test können TBC-positive Patientenproben innerhalb von 48 Stunden identifiziert werden (TEVERE et al. 1996). Die Differenzierung innerhalb des TBC ist nicht möglich. Eine Weiterentwicklung dieses Tests ist der CORBAS AMPLICOR MTB, ebenfalls von der Fa. ROCHE, der ein automatisiertes Testsystem darstellt und einen höheren Probendurchsatz in kürzerer Zeit erlaubt. Der Amplified M. tuberculosis Direct Test (AMDT II) der Fa. GEN-PROBE nutzt zur Targetamplifikation die isothermale TMA von RNA mit anschließender Hybridisierung (SCARPARO et al. 2000; O`SULLIVAN et al. 2002). Die Food and Drug Administration (FDA) in den USA hat den Amplicor M. tuberculosis Test von ROCHE und den AMDT II Test der Fa. GEN-PROBE als die beiden Testverfahren zum Direkt-Nachweis von Mykobakterien aus klinischem Material zugelassen (SOINI u. MUSSER 2001). Beide Verfahren zeigen keine Unterschiede in der Sensitivität und Spezifität. Bei dem LCx M. tuberculosis Assay der Fa. ABOTT LABORATORIES wird die LCR zur Amplifikation und zum Nachweis des TBC genutzt. Zielsequenz ist das Gen für das Protein Antigen B. Die Sensitivität für dieses Testsystem wird mit 74% für alle untersuchten kulturell positiven Proben angegeben, während sie für Proben, die gleichzeitig im Direktpräparat säurefeste Stäbchen zeigten, bei 100% lag. Die Spezifität lag bei 98% (MOORE u. CURRY 1998). Die Verbindung von zwei diagnostischen Zielsequenzen zum Nachweis des TBC wird beim automatisierten BDProbe-Tec ET der Fa BECTON DICKINSON angewendet. Mit der isothermalen Strand Displacement Amplifikation (SDA) werden von den beiden Zielsequenzen IS6110 und dem 16S rrna-gen die entstandenen Doppelstränge mit Hilfe eines Restriktionsenzyms und der Polymerase-Exonuklease- Aktivität wieder getrennt. Das Produkt kann mit Hilfe des Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfers (FRET) sichtbar gemacht werden. Die erreichten Sensitivitäten und Spezifitäten liegen bei 87,5% und 99,0% (BERGMANN et al. 2000). Häufig angewendete Testsysteme zum Nachweis von Mykobakterien aus der Kultur sind die ACCUPROBE Assays der Fa. GEN-PROBE, die sich auf die Detektion der klinisch wichtigsten Mykobakterien (TBC, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae) beschränken. Die speziesspezifischen DNA-Sonden binden spezifisch an isolierte rrna der Mykobakterien. Das Ergebnis der Chemilumineszenz-markierten Sonden wird mit einem Luminometer gemessen.

42 26 Literaturübersicht Diese Methode ist sehr einfach und schnell durchzuführen. Die Sonden wurden in der Routinediagnostik gründlich getestet und sind sensitiv und spezifisch (SOINI u. MUSSER 2001). Der Test kann außerdem mit automatischen Flüssigkultursystemen, wie MGIT, BACTEC, kombiniert werden und so eine schnellere Diagnose aus der Kultur ermöglichen. Allerdings sind nicht für alle pathogenen Spezies Detektionssonden vorhanden, so dass die restlichen, nicht mit diesem Test zu identifizierenden Proben mit anderen Methoden getestet werden müssen. Zusätzlich kann mit diesem Testsystem ebenfalls, wie auch bei den Testverfahren für den Direktnachweis, nicht zwischen den einzelnen Spezies des TBC unterschieden werden Molekularbiologische Differenzierung des M. tuberculosis- Komplexes Eine Unterscheidung innerhalb des TBC ist mit den kommerziell erhältlichen Testsystemen nicht möglich, die weitere Differenzierung findet meistens in Speziallaboren statt (PARSONS et al. 2002). Es wurden eine Vielzahl von PCR-Assays basierend auf genetischen Unterschieden zwischen den einzelnen Spezies entwickelt, keine kann jedoch zwischen allen Spezies des TBC unterscheiden (NIEMANN et al. 2000a). Die standardisierte und am meisten angewendete Methode für die Differenzierung des TBC (v. a. zur Unterscheidung von M. tuberculosis und M. bovis) ist die Analyse des Insertionselements IS6110 mittels RFLP (VAN SOOLINGEN 2001). Genomische DNA wird dabei mit dem Restriktionsenzym Pvu II verdaut und die einzelnen Fragmente werden in einer Southernblotanalyse mit einer IS6110 spezifischen Sonde hybridisiert. Die Methode basiert auf Unterschieden in der Anzahl der Kopien des IS6110 bei den jeweiligen Spezies und auf einer Variabilität in der chromosomalen Position dieser Sequenz. Stämme von M. bovis besitzen weniger Kopien als Stämme von M. tuberculosis (YEBOAH-MANU et al. 2001). Das Insertionselement ist jedoch nicht in allen Stämmen konstant anwesend, außerdem kann sich das charakteristische Bandenmuster im Laufe der Zeit auch verändern (NIEMANN et al. 1999a, 1999b). Ein weiterer Nachteil der RFLP-Methode ist die große Menge an DNA, die man zur Untersuchung benötigt. Zwei µg DNA sind nur durch Anzucht des Erregers aus Patientenmaterial in der Kultur zu erreichen. Dies führt zu einer zeitlichen Verzögerung der Diagnose. Zudem ist diese Technik aufwendig und teuer.

43 27 Literaturübersicht Um die mit der RFLP-Methode nicht immer eindeutige Diagnose abzusichern, gibt es verschiedene Methoden, die zusätzlich durchgeführt werden können. Relativ einfache Methoden sind das Spoligotyping und der Fluoreszenz-markierteamplifizierte-Fragment-Längenpolymorphismus (FAFLP). Beim Spoligotyping der DR-Region wird zwischen M. tuberculosis und M. bovis aufgrund der An- oder Abwesenheit bestimmter DR-Regionen unterschieden (YEBOAH-MANU et al. 2001). Einer der größten Vorteile des Spoligotypings gegenüber dem RFLP ist, dass das Spoligotyping gleichzeitig für die Detektion und die Differenzierung des TBC verwendet werden kann. Außerdem kann diese Methode an nicht mehr lebenden Kulturen, auf ZN-gefärbten Objektträgern und an Materialien, die bereits in Paraffin eingebettet sind, angewendet werden. Probleme treten bei der Anwendung an klinischen Materialien auf. Inhibitionsfaktoren können die Amplifikationsreaktion hemmen und somit die für die einzelne Bakterienspezies typische Anzahl an Spoligotypes verfälschen. NIEMANN und Mitarbeiter (2000a) beschrieben einen Sequenz-Polymorphismus auf dem gyrb-gen, mit dessen Hilfe mit der PCR-RFLP gekoppelten Methode die Spezies des TBC unterschieden werden konnten. In einer Studie von KREMER und Mitarbeitern (1999) wurden die bekanntesten molekularbiologischen Methoden im Hinblick auf ihre Reproduzierbarkeit, Spezifität und ihr Differenzierungsvermögen untersucht. Verschiedene TBC-Isolate wurden dabei mit Hilfe fünf verschiedener RFLP Methoden und sieben PCR-basierenden Methoden untersucht. Als Zielstruktur dienten repetetive DNA Sequenzen. Für epidemiologische Untersuchungen sind demnach die Differenzierung mittels RFLP des IS6110 oder die mixed-linker PCR Methoden der Wahl. 2.6 Diagnostik von Mykobakterien an der Medizinischen Hochschule Hannover Da in dieser Arbeit als Vergleichsmethoden die Ergebnisse der mikrobiologischen Routinediagnostik der MHH verwendet werden, soll hier etwas genauer auf den Ablauf der Untersuchung einer Patientenprobe eingegangen werden. Eine in der MHH eingesendete Probe zum Nachweis von Mykobakterien geht folgenden Weg:

44 28 Literaturübersicht Probe Dekontamination (NaOH-NALC) Ausnahmen: Blut, Liquor, Knochenmarkaspirat, Knochenmarkbiopsie Ausstrich Auraminfärbung Anlage in flüssigem Nährmedium MGIT Anlage auf festem Nährmedium 1. Löwenstein-Jensen 2. Stonebrink Direkt-PCR (ausgewählte Fälle) - AFB + AFB Signal vom Automat kein Signal nach 8 Wochen - AFB + AFB + Genus Mycobacterium - Genus Mycobacterium AFB im Direktausstrich nicht nachgewiesen Umfärben auf Ziehl-Neelsen Ziehl-Neelsen Färbung Mykobakterien kulturell nicht nachgewiesen Mykobakterien kulturell nicht nachgewiesen weitere Differenzierung Differenzierung TBC von NTM Mykobakterien in der Direkt-PCR nicht nachgewiesen + AFB - AFB kontaminiert mit anderen Bakterien Sequenzierung Erneute Inkubation neue Einsendung von Material; Ausnahme CF-Patienten Abb. 2.1: Übersicht der Mykobakterien-Diagnostik der Medizinischen Hochschule Hannover Probenmaterial aus Gewebe, Haut, Lymphknotenbioptate, Sputum, Bronchiallavagen, Punktate, Stuhl, Urin und Magensaft wird vor der weiteren Verwendung mit der beschriebenen NaOH-NALC-Methode dekontaminiert, um störende Begleitflora zu eliminieren. Ausnahmen bilden hier primär sterile Materialien wie Blut, Liquor, Knochenmarkaspirat und Knochenmarkbiopsien. Nach der Dekontamination wird die Probe für die weitere Diagnostik aufgeteilt. Zum mikroskopischen Nachweis von Mykobakterien aus Direktmaterial wird ein Ausstrichpräparat angefertigt, mit Auramin gefärbt und im Fluoreszenzmikroskop beurteilt (Ausnahme: Blut). Sollte das Präparat positiv für säurefeste Stäbchen (in der Abb. 2.1 als AFB bezeichnet, für engl. acid fast bacilli) sein, wird mit dem gleichen Präparat eine ZN-Färbung durchgeführt, um eine genauere Beurteilung zu ermöglichen. 0,5 ml jeder Probe werden für die Beimpfung in einem Indikatorröhrchen für mykobakterielles Wachstum (MGIT-Röhrchen) benötigt und dann bei 37 C für maximal acht Wochen im MGIT-Kulturautomaten inkubiert. Blut, Knochenmarkaspirat und Knochenmarkbiopsien werden in speziellen MGIT- Blutkulturflaschen bei 35 C für maximal 12 Wochen inokuliert. Das Gerät meldet automatisch jede positiv gewordene Kultur. Von diesem Röhrchen wird ein Ausstrich angefertigt, nach ZN gefärbt und mikroskopisch auf säurefeste Stäbchen untersucht. Bei einem positiven Befund für säurefeste Stäbchen werden 0,5 ml vom Kulturmaterial abgefüllt und zur weiteren Speziesdiagnostik in die Sequenzierung gegeben.

45 29 Literaturübersicht Bei einem negativen Befund für säurefeste Stäbchen wird das MGIT-Röhrchen für weitere maximal acht Wochen zurück in den Automaten gestellt. Sind in der ZN-Färbung andere Bakterien zu sehen und keine säurefesten Stäbchen, so gilt diese Probe als kontaminiert mit Begleitflora. Es wird um eine Neueinsendung von Material gebeten. Ausnahme von dieser Regelung bilden Proben von Patienten mit Cystischer Fibrose (CF). Sind diese Proben nach der ersten Dekontamination mit der NaOH-NALC- Methode in der MGIT-Kultur von Begleitflora überwuchert, so wird eine erneute Dekontamination mit 5%iger Oxalsäure durchgeführt. Das Probenmaterial von diesen CF-Patienten ist sehr häufig mit Pseudomonaden (v.a. Pseudomonas aeruginosa) kontaminiert. Bis zu 80% der CF-Patienten sind mit diesem Erreger infiziert (BANGE u. BÖTTGER 2002). Typischerweise überstehen die Pseudomonaden die Dekontamination mit NaOH-NALC. Der Nachweis von Mykobakterien wird damit aufgrund der das Medium schnell überwuchernder Pseudomonadenflora nahezu unmöglich. WHITTIER und Mitarbeiter (1993) zeigten, dass mit einer kombinierten Dekontamination mit NaOH-NALC und Oxalsäure das Überwuchern der Kultur mit Pseudomonas aeruginosa deutlich reduziert werden konnte. Laut BANGE und BÖTTGER (2002) können mit der an der MHH praktizierten Oxalsäure-Methode eine 25% höhere Sensitivität bei Proben von CF- Patienten erreicht werden. Jeweils 0,2 ml der dekontaminierten Probe werden auf einem Löwenstein-Jensen- Schrägagar und auf einem Nährboden nach Stonebrink ausgestrichen und für maximal acht Wochen bei 37 C im Brutschrank inkubiert. Ausgenommen ist Blut. Die Kontrolle erfolgt einmal wöchentlich durch Ablesen der Kultur. Weiterhin werden von ausgewählten Patientenproben 0,5 ml des dekontaminierten Materials in die Direkt-PCR gegeben. Nicht geeignet sind Blut, Knochenmark- und Lymphknotenaspirate sowie Stuhl, Urin und Magensaft, da in diesen Materialien zu viele Inhibitoren enthalten sind, die die Amplifikation hemmen. Dabei werden die Mykobakterien aus dem dekontaminierten Material isoliert. Von diesem Material wird anschließend in einer PCR das 16S rrna-gen von Mykobakterien mit Hilfe eines universellen und eines genusspezifischen Primers amplifiziert. In einer weiteren Reaktion werden die amplifizierten DNA-Stränge mit einer Sonde, die spezifisch für Mykobakterien in der Genusregion II auf dem 16S rrna-gen detektiert, hybridisiert. In einer weiteren Reaktion werden die Proben auf die Anwesenheit des TBC untersucht (KIRSCHNER et al. 1996). Bei Verdacht auf den TBC (Cordfaktor in der ZN-Färbung, positives Ergebnis aus der Direkt-PCR für den TBC) wird zur weiteren Differenzierung zwischen M. tuberculosis,

46 30 Literaturübersicht M. bovis und M. bovis BCG der Nitratreduktase-Test (aus MGIT-Material oder vom Löwenstein-Jensen-Material) und der Niacin-Test (nur vom Material des Löwenstein- Jensen möglich) durchgeführt. Zweifelhafte oder mit diesen beiden Tests nicht differenzierbare Proben des TBC werden zur weiteren Diagnose in das Referenzzentrum für Mykobakterien nach Borstel geschickt. Bei der Sequenzierung wird die DNA aus MGIT-Material in einer Kurzpräparation mit Glasperlen isoliert, oder es wird amplifiziertes Material aus der Direkt-PCR verwendet. Das 16S rrna-gen von Mykobakterien wird gegebenenfalls amplifiziert und anschließend der hypervariable Bereich auf diesem Gen sequenziert. Das Ergebnis der Sequenzierung für einen Patienten ist für eine maximale Dauer von drei Monaten gültig, falls danach erneut positive Proben vom gleichen Patienten anfallen, wird erneut sequenziert (MEDIZINISCHE HOCHSCHULE HANNOVER 2003). 2.7 Polymerase-Kettenreaktion im real time-modus Prinzip der Amplifikation und Schmelzpunktanalyse am LightCycler Der LightCycler der Fa. ROCHE wurde erstmals von WITTWER und Mitarbeitern (1997) beschrieben. Dabei handelt es sich im Gegensatz zu den herkömmlichen Blockcyclern um ein Gerät, welches die Temperatur mit Hilfe von Luft bis zu 20 C pro Sekunde auf die entsprechende Temperatur bringen kann. Die Proben sind in verschlossenen Glaskapillaren in einem Rotor angeordnet. Ein Ventilator sorgt für die gleichmäßige Verteilung der Luft. Aufgrund des großen Verhältnisses von der Oberfläche der Kapillaren zum Volumen wird die Temperatur sehr schnell auf den Inhalt der Kapillaren übertragen. Die für die Denaturierung und das Annealing erforderlichen Zeiten können damit minimal gehalten werden, was die Qualität der Amplifikation verbessert (WITTWER et al. 1997). PCR-Produktkontaminationen sind aufgrund des geschlossenen Systems praktisch ausgeschlossen (ESPY et al. 2001). Nach einer Amplifikation der DNA mit Hilfe der PCR erfolgt sofort im Anschluss eine Detektion der PCR-Produkte durch eine DNA-DNA-Hybridisierung. In jedem Reaktionsansatz sind Sondenpaare enthalten, welche in unmittelbarer Nähe zueinander an die Zielstruktur binden. Beide Sonden sind mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert. Die Ankersonde trägt am 3`Ende das Fluoreszein, welches von

47 31 Literaturübersicht einer Lichtquelle im Gerät mit einer Wellenlänge von 470 nm angeregt wird. Die unmittelbar in der Nähe bindende Detektionssonde ist am 5`Ende mit dem Farbstoff LCRed markiert. Kommt es zur Bindung beider Sondenpaare am PCR-Produkt, so regt die von der Ankersonde abgestrahlte Fluoreszenz den LCRed-Farbstoff an, welcher dann ebenso Licht emittiert. Dieser Vorgang wird auch als Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) bezeichnet. Die abgestrahlte Fluoreszenz wird vom Gerät nach jedem PCR-Zyklus gemessen. Die Fluoreszenzdaten werden sofort auf dem Bildschirm sichtbar, man kann während der gesamten PCR den Verlauf beobachten ( real-time PCR ). Die Fluoreszenzdaten werden in drei verschiedenen Kanälen, in denen jeweils Licht mit unterschiedlicher Wellenlänge gemessen wird, aufgenommen. Der F1-Kanal misst Licht mit einer Wellenlänge von 530 nm, der F2-Kanal bei einer Wellenlänge von 640 nm und der F3-Kanal bei einer Wellenlänge von 710 nm (BELLIN et al. 2001). Die Funktion Color Compensation ermöglicht eine Messung von zwei Farbstoffen in zwei Kanälen gleichzeitig, in dem sie Fluoreszenzüberschneidungen zwischen den Kanälen verrechnet. Bei der anschließenden Schmelzpunktanalyse wird die Temperatur langsam erhöht. Bei einer bestimmten, für die jeweilige Sonde spezifischen Temperatur (Schmelzpunkt) kommt es zum Abschmelzen der Sonde von der Zielstruktur. Wählt man die Schmelzpunkte von Anker- und Detektionssonde unterschiedlich (Ankersonde 5-10 C höher), so kommt es durch das Abschmelzen der Detektionssonde zu einem abrupten Fluoreszenzabbruch, welcher vom Gerät gemessen wird. Dieser wird durch die Berechnung der ersten negativen Ableitung des Kurvenverlaufs als Peak bei einer bestimmten Temperatur vom Gerät dargestellt. Die kontinuierliche Messung der Fluoreszenz während der Schmelzpunktanalyse erlaubt eine rein qualitative Aussage über die Sequenz der Zielstruktur, während die Einzelmessungen der PCR-Zyklen unterdessen quantitative Informationen über die Menge der in der Probe enthaltenen Zielstruktur liefern. Bei wenigen Fehlbasen zwischen Zielsequenz und Detektionssonde kommt es zu einer Destabilisierung der Bindung und somit zu einem Abschmelzen der Sonde bei einer niedrigeren Temperatur. Ist die Anzahl der Fehlbasen zu groß, kommt es unter Umständen zu gar keiner Bindung mit der Zielsequenz und ein Fluoreszenzsignal bleibt aus. Eine LightCycler-Reaktion dauert etwa eine Stunde und beinhaltet die Amplifikation und Sondenhybridisierung, was ein großer Zeitvorteil gegenüber der herkömmlichen PCR in Blockcyclern ist.

48 32 Literaturübersicht Grundlagen für das Design von Primern Die Sequenz der Primer sollte möglichst spezifisch für das gewünschte Amplifikationsprodukt sein, damit der Primer an der richtigen Stelle bindet. Am 3`Ende sollten ein bis zwei Basen Guanin oder Cytosin sitzen, um eine bessere Bindung und Elongation zu erhalten. Andererseits sollten höchstens drei Basen Guanin oder Cytosin an das 3`Ende platziert werden, weil sonst fehlhybridisierende Primer stabilisiert werden und damit die Gefahr von unspezifischen Amplifikations-produkten erhöht würde. Die Primer sollten keine internen Sekundärstrukturen wie Haarnadeln bilden, weil diese die Wahrscheinlichkeit des Hybridisierens mit der Template-DNA reduzieren. Weiterhin dürfen die Primer nicht miteinander hybridisieren und sollten eine möglichst geringe Komplementarität an ihrem 3`Ende besitzen, um die Bildung von Primerdimeren zu verhindern. Die Schmelzpunkttemperatur beider Primer (forward und reverse) sollte in etwa gleich sein, um ein gleichmäßiges Annealing zu ermöglichen (ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS 2000) Grundlagen für das Design von Sonden Für das Design der Sonden nach dem FRET-Prinzip wurden die Empfehlungen des ROCHE MOLECULAR BIOCHEMICALS (2000) berücksichtigt. Die beiden Sonden sollten so auf einem Strang angeordnet sein, dass sie den Bereich der Primer nicht überlappen. Dies ermöglicht Zeit für eine Hybridisierung und Fluoreszenzmessung, bevor die Primer komplett verlängert werden und die Sonden durch die Taq-Polymerase verdrängt werden. Die Sonden sollten eine Länge von 23 bis 30 bp haben und sich in ihrer Schmelztemperatur deutlich von denen der Primer unterscheiden (5-10 C). Weiterhin sollten sie keine Wiederholungssequenzen zu sich selbst- oder zu den Primern komplementäre Sequenzen, extrem purinreiche Sequenzen oder mehr als drei Basen Guanin oder Cytosin an einem Ende haben. Die Ankersonde (Donorsonde) wird am 3`Ende mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) markiert. Die Detektionssonde (Akzeptorsonde) wird am 3`Ende mit einer Phosphatgruppe versehen und am 5`Ende mit dem LCRed-Farbstoff 640 oder 705 markiert. Anker- und Detektionssonde sollten so konstruiert sein, dass sie mit einem Basenpaar Abstand voneinander an die Template DNA binden können. Dies erzeugt ein optimales Fluoreszenzsignal. Falls nötig, kann der Abstand auf bis zu zehn Basenpaare vergrößert werden.

49 33 Literaturübersicht Die Schmelztemperatur der Ankersonde sollte 5-10 C höher liegen, als die der Detektionssonde, um einen klaren Fluoreszenzabbruch bei der späteren Schmelzpunktanalyse zu erreichen. Die Ankersonde sollte dabei stets eine vollständige Homologie zur Zielsequenz besitzen, um eine möglichst hohe Spezifität und Stabilität zu erreichen. Die Detektionssonde sollte immer an den Bereich mit der zu detektierenden Variabilität binden. Der Schmelzpunkt der Sonden kann durch verschiedene Modelle berechnet werden. Die von KIDD und RUANO (1991) beschriebene 2+4 Regel basiert auf der Tatsache, dass die Basen Adenin und Thymin mit jeweils zwei Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert werden, während die Basen Guanin und Cytosin mit drei Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert werden und damit stabiler sind. Für ein Guanin bzw. Cytosin in der Sondensequenz werden demnach 4 C für die Schmelztemperatur berechnet, während für ein Adenin bzw. Thymin in der Sequenz 2 C berechnet werden. Die thermodynamische Berechnung stellt die genaueste Bestimmung der Schmelztemperatur dar (ALLAWI u. SANTALUCIA 1998). Dabei wird das Nearest- Neighbor -Modell verwendet, welches aussagt, dass die thermodynamischen Parameter einer Base von den angrenzenden Nachbarbasen abhängig sind. Mit einer Formel kann die Temperatur bestimmt werden.

50 34 Literaturübersicht 2.8 Zielsetzung der Arbeit Der Nachweis von Mykobakterien aus Patientenmaterialien gestaltet sich aufgrund des langsamen Wachstums von Mykobakterien und aufgrund von Inhibitoren, die in den Proben vorhanden sind, schwierig und zeitaufwendig. Eine schnelle und spezifische Diagnose würde verbesserte Therapie- und Isolierungsmaßnahmen in der Klinik ermöglichen. In dieser Arbeit soll im ersten Abschnitt ein in vitro entwickeltes Nachweisformat für Mykobakterien, welches tuberkulöse und NTM unterscheidet, an Patientenmaterialien aus der Kultur getestet werden. Dabei sollen respiratorische Proben und nichtrespiratorische Proben untersucht werden. Es soll geklärt werden, wie spezifisch und robust die Methode in der Anwendung am Patientenmaterial ist, und ob sie die bisher an der MHH durchgeführte Sequenzierung des 16S rrna-gens von Kulturisolaten ersetzen kann. Um die lange Zeitdauer bis zum Nachweis aus der Kultur zu überbrücken, soll in einem weiteren Abschnitt der Nachweis aus respiratorischem Direktmaterial von Patienten erfolgen. Dafür muss nach einer Präparationsmethode gesucht werden, die sowohl die Isolierung mykobakterieller DNA ermöglicht und gleichzeitig Inhibitoren aus den Proben eliminiert. Die Sensitivität und Spezifität des Direktnachweises muss anschließend ermittelt werden. Gleichzeitig sollte das Verfahren zeit- und damit kostensparend für die Anwendung in der klinischen Diagnostik sein. Um eine verbesserte Speziesdiagnostik innerhalb des TBC zu erreichen, soll im letzten Abschnitt ein molekularer Nachweis für M. tuberculosis entwickelt werden, der für die Routine-Diagnostik spezifisch, schnell durchführbar und einfach in der Anwendung ist.

51 35 Material und Methoden 3 Material und Methoden Die verwendeten Materialien und Methoden werden getrennt nach der Anwendung in den entsprechenden Kapiteln des Ergebnisteils aufgeführt. 3.1 Erstellung der Inhibitionskontrolle Verwendete Plasmide Die verwendeten Plasmide pjl6 und pjl8 stammen aus der Stammsammlung der Arbeitsgruppe (AG) Bange und sind in der Tab. 3.1 aufgeführt. Tab. 3.1: Verwendete Plasmide zur Erstellung der neuen Inhibitionskontrolle Plasmid repliziert in E. coli Selektionsmarker Herkunft pjl6 + Ampicillin AG Bange pjl8 + Ampicillin AG Bange Verwendete Bakterien Zur Erstellung der Inhibitionskontrolle wurden die Stämme Staphylococcus aureus (ATCC 25923) und E. coli (HB101) verwendet Plasmidkonstruktion Mini-Präparation von Plasmid-DNA Zur Präparation der DNA aus Plasmiden wurde das Puffersystem QIAamp Plasmid Mini Kit von der Fa. QIAGEN angewendet. 3 ml einer Übernachtkultur in LB-Medium wurden bei x g für 7 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 200 µl Resuspensionspuffer (P1) gelöst und mit 200 µl Lysispuffer (P2) für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 200 µl Neutralisationspuffer (P3) wurde der Ansatz für 15 Minuten auf Eis gestellt. Die Zelltrümmer wurden bei x g für 5 Minuten herunterzentrifugiert und der Überstand in ein neues Mikroschraubgefäß überführt. Es folgte eine Phenol/Chloroformfällung durch Zugabe der gleichen Menge an Phenol/Chloroform/ Isoamylalkohol im Verhältnis von 25:24:1. Die Phasen wurden gemischt und dann zentrifugiert. Aus der wässrigen Phase wurde die DNA durch Zugabe von 1 ml 96%igem Ethanol auf Eis gefällt. Anschließend wurde das Pellet bei x g für

52 36 Material und Methoden 5 Minuten zentrifugiert und mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Das Pellet wurde bei 37 C getrocknet und in 30 µl sterilem Aqua dest. aufgenommen Midi-Präparation von Plasmid-DNA Zur Midi-Präparation der DNA aus Plasmiden wurde der GenElute TM Plasmid Midiprep Kit von der Fa. SIGMA angewendet. Zur Präparation wurden 40 ml einer Übernachtkultur in LB-Medium verwendet. Die Durchführung der Präparation erfolgte strikt nach Angaben des Herstellers. Die im Eluat gelöst vorliegende DNA wurde bei 4 C gelagert Restriktionsenzymverdau Das Reaktionsvolumen betrug zwischen 10 und 15 µl, es wurden 1-3 Einheiten Enzym pro µg DNA verwendet und anschließend bei 37 C für eine Stunde verdaut. Die in dieser Arbeit verwendeten Enzyme und ihre Puffer sind im Anhang aufgeführt Dephosphorylierung Um bei der anschließenden Ligation den Ringschluss des Plasmidvektors ohne Insert zu vermeiden, wurde vor der Ligation der Vektor enzymatisch mit Hilfe der alkalischen Phosphatase dephosphoryliert. Der Ansatz wurde mit einem Volumen von max. 50 µl durchgeführt: x µl DNA x µl Aqua dest. 1 µl alkalische Phosphatase (1 U/µl) µl AP-Puffer (10-fach) Die Reaktion wurde für eine Stunde bei 37 C inkubiert Agarosegelelektrophorese Bei der Agarosegelelekrophorese werden DNA-Fragmente nach ihrer Größe getrennt. Aufgrund der negativ geladenen Phosphatgruppen wandert die DNA in Richtung Anode. Durch den Farbstoff Ethidiumbromid, der in der DNA interkaliert, werden die DNA-Banden im Gel unter UV-Licht sichtbar gemacht.

53 37 Material und Methoden Die Elektrophorese wurde je nach Agarosekonzentration und erwarteter DNA- Fragmentgröße bei einer Spannung von V für 1-2 Stunden in einer Elektrophoresekammer durchgeführt. Dazu wurde die jeweilige Menge an Agarose in 100 ml Aqua dest. und 2 ml TAE-Puffer (50-fach) in der Mikrowelle vollständig gelöst und auf einen Gelträger gegossen. Nach Erstarren des Gels wurden die Geltaschen mit einem Größenstandard und den DNA-Proben beladen. Zur Beschwerung der DNA wurde 1/10 des Volumens an Bromphenolblau-DNA-Farbmarker mit Glycerin zuvor zu den DNA-Proben hinzugefügt. Als Laufpuffer wurde TAE-Puffer (1-fach) benutzt. Nach 20 minütiger Färbung in der Ethidiumbromidlösung (0,8 mg/l) wurde das Gel unter UV-Licht beurteilt und fotografiert Isolation und Aufreinigung von DNA-Banden aus dem Gel Die Isolierung und Aufreinigung von einzelnen DNA-Banden erfolgte nach der Auftrennung im Elektrophorese-Gel. Das Gel wurde unter einer UV-Lampe betrachtet und die entsprechende Bande mit einem Skalpell ausgeschnitten und in einem Mikroschraubgefäß gewogen. Die Aufreinigung der DNA erfolgte mit dem GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit der Fa. AMERSHAM. Die Durchführung erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers Aufreinigung von DNA aus Lösungen Die Aufreinigung aus Lösungen erfolgte mit dem gleichen Kit wie die Aufreinigung aus dem Gel. Im Unterschied dazu wurden hier Bindungspuffer und Probe direkt auf die Säule aufgetragen. Der Inkubationsschritt bei 60 C entfiel Ligation Bei der Ligation werden kompatible DNA-Enden mit Hilfe der T4-DNA-Ligase kovalent miteinander verknüpft. Die Ligation wurde in einem Volumen von 20 µl durchgeführt: x µl Vektor-DNA x µl Insert-DNA 4 µl Ligase-Puffer (5-fach) 1-2 µl T4-Ligase

54 38 Material und Methoden Die Substanzen wurden gemischt und nach Zugabe der T4-Ligase wurde die Reaktion über Nacht bei 15 C im Wasserbad inkubiert. Die Menge des Insert richtete sich nach der Menge der Vektor-DNA und dem optimalen molaren Verhältnis von Vektor und Insert, das bei Enden mit Überhang (sticky ends) bei 1:1 und bei Enden mit glatten Enden (blunt ends) bei 1:3 liegt. Als Positivkontrolle wurde das ungeschnittene Vektorplasmid verwendet. Um eine Religation des Vektors ohne Insert zu erkennen, wurde in einem Parallelansatz Wasser statt des Inserts verwendet Herstellung elektrokompetenter Bakterienzellen Als Escherichia (E.) coli Stamm wurde HB101 verwendet. 2,5 ml einer Übernachtkultur in LB-Medium wurden in 500 ml LB-Medium inokuliert und bei 37 C und 300 rpm bis zum Erreichen einer OD 600 von 0,5 bebrütet. Die Kultur wurde dann für 15 Minuten auf Eis gestellt und anschließend bei x g für 20 Minuten bei 4 C zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit eiskaltem Aqua dest. und anschließend mit eiskaltem Glycerin (10%) gewaschen. Die Zellen wurden in 6 ml 10%igem Glycerin gelöst und aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei 70 C gelagert Transformation von Escherichia coli mit Plasmid-DNA Die bei 70 C gefrorenen Zellen wurden auf Eis aufgetaut. 30 µl der kompetenten Zellen und 1 µl DNA wurden gemischt und auf Eis in eine Elektroporationsküvette (Elektrodenabstand 2mm) gegeben. Die Elektroporation erfolgte im Gene-Pulser der Fa. BIORAD bei 2,5 kv, 25 µf und 200 Ohm. Der Elektroporationsansatz wurde in 1 ml LB-Medium überführt und bei 37 C für eine Stunde im Schüttler inkubiert, um eine Expression der Antibiotikaresistenz zu ermöglichen. Anschließend wurde auf ampicillinhaltigen LB-Agarplatten (100µg/ml) ausplattiert Amplifikation mit der konventionellen Polymerase-Kettenreaktion Mittels konventioneller Block-PCR wurde ein 350 bp Fragment vom 16S rrna-gen von Staphylococcus aureus amplifiziert. Die DNA war zuvor, wie in Kapitel beschrieben, aus einer LB-Kultur isoliert worden.

55 39 Material und Methoden Als Primerpaar wurden die in Tab. 3.2 dargestellten universellen Primer LC1 und AB1 verwendet. Die in dieser Arbeit für die Primer angegebenen Schmelztemperaturen wurden von der Fa. MWG berechnet. Tab. 3.2: Verwendete Primer für die konventionelle Polymerase-Kettenreaktion Name amplifiziertes Fragment Richtung Sequenz Schmelztemperatur LC1 16S rrna-gen forward 5`-GAG TTT GAT CCT GGC TCA GGA-3` 59,8 C AB1 16S rrna-gen reverse 5`-ACT GCT GCC TCC CGT AGG AG-3` 63,5 C Das Gesamtvolumen für den Reaktionsansatz betrug 100 µl. 1 µl Primer LC1 (100 pmol/µl) 1 µl Primer AB1 (100 pmol/µl) 0.5 µl Pfu Turbo Polymerase 5 µl dntps (4 mm) 10 µl Puffer (10-fach Pfu-Polymerase Reaktionspuffer) 72.5 µl Aqua dest. 10 µl DNA-Template Tab. 3.3: Programm für die konventionelle Polymerase-Kettenreaktion Zyklen Temperatur Zeit Zykluszahl [ C ] [ min. ] 1. Denaturierung Annealing 56 1 Extension Denaturierung Annealing Extension Die Lagerung des PCR-Produktes erfolgte bei 4 C im Kühlschrank Amplifikation und Schmelzpunktanalyse Die verwendeten Primersequenzen zur Amplifikation des bp Fragmentes auf dem 16S rrna-gen von Mykobakterien sind in Tab. 3.4 aufgelistet. Für die Entwicklung der Primer und Sonden in dieser Arbeit wurden veröffentlichte Sequenzen aus der Gendatenbank verwendet (vgl. Kapitel 3.5.1). Tab. 3.4: Name amplifiziertes Fragment Verwendete Primer für die Polymerase-Kettenreaktion im real-time Modus Richtung Sequenz Schmelztemperatur LC1 16S rrna-gen forward 5`-GAG TTT GAT CCT GGC TCA GGA-3` 59,8 C LC4 16S rrna-gen reverse 5`-TGC ACA CAG GCC ACA AGG GA-3` 61,4 C

56 40 Material und Methoden Die verwendeten Sequenzen für die Sondenpaare in diesem Kapitel sind in Tab. 3.5 aufgeführt. Detektionssonden, die im F2-Kanal gemessen werden, sind mit dem Farbstoff LCRed 640 markiert, Detektionssonden für den F3-Kanal mit dem Farbstoff LCRed 705. Die aufgezeigten Schmelztemperaturen wurden nach der thermodynamischen Methode von der Fa. TIB MOLBIOL berechnet. Tab. 3.5: Verwendete Sondenpaare für die Polymerase-Kettenreaktion im real-time Modus Name Nachweis LCRed Sequenz Schmelztemperatur LC39 Mycobacterium - 5`-GCA ACG CGA AGA ACC TTA CCT GG-3` 65,0 C LC40 Mycobacterium 640 5`-TTT GAC ATG CAC AGG ACG-3` 54,2 C LC11 TBC - 5`-CGC GGG CTC ATC CCA CAC CG-3` 71,4 C LC12 TBC 705 5`-TAA AGC GCT TTC CAC CAC AAG A-3` 60,1 C Der Ansatz des Mastermixes und die Durchführung der PCR-Reaktion werden in Kapitel 3.4 beschrieben, die Quantifizierung der Plasmid-DNA in Kapitel Die genomische DNA der verwendeten Mykobakterien (M. tuberculosis und M. gordonae) stammte aus der Stammsammlung der AG Bange und ist in Kapitel und näher beschrieben. 3.2 Untersuchung von kulturellen Patientenmaterialien Kulturen Die in diesem Kapitel untersuchten Proben stammten von eingesendeten respiratorischen und nichtrespiratorischen Patientenmaterialien der MHH und dem Klinikum Hannover Nordstadt. Sie wurden nach der Dekontamination mit NaOH- NALC im MGIT-Automaten kulturell angezüchtet und nach der Abfüllung für die Studie für 15 Minuten bei 80 C inaktiviert. Die Lagerung bis zur weiteren Verarbeitung erfolgte für maximal eine Woche bei 4 C. Die weitere Differenzierung der Probenmaterialien der MHH-Patienten ist in den folgenden Tabellen aufgeführt. Für die Materialien des Klinikum Hannover Nordstadt konnte keine weitere Differenzierung erfolgen, da keine Angaben über das Patientengut vorlagen. In der Pilotstudie wurden im Zeitraum vom bis insgesamt 120 Proben von 91 Patienten untersucht. Die Materialien und die Patientengruppen sind in Tab. 3.6 und Tab. 3.7 aufgeführt:

57 41 Material und Methoden Tab. 3.6: Untersuchte Probenmaterialien der Pilotstudie Probenmaterial Anzahl respiratorisch 104 Sputum 75 Bronchoalveolarlavage 14 Bronchialsekret 15 nichtrespiratorisch 16 Blut 6 Magensaft 4 Knochenmarkbioptat 2 Liquor 1 Mittelstrahlurin 1 Stuhl 1 Perikardpunktat 1 Summe 120 Tab. 3.7: Patientengruppe Patientengruppen der Pilotstudie Anzahl der Patienten Anzahl der untersuchten Proben HIV CF Transplantation 9 18 Übrige Summe In der Hauptstudie I wurden im Zeitraum vom bis insgesamt 530 Proben von 258 Patienten untersucht. Die Materialien und die Patientengruppen sind in Tab. 3.8 und Tab. 3.9 mit der jeweiligen Anzahl aufgeführt: Tab. 3.8: Probenmaterial Untersuchte Probenmaterialien der Hauptstudie I Anzahl respiratorisch 416 Sputum 272 Bronchoalveolarlavage 70 Bronchialsekret 70 Trachealsekret 4 nichtrespiratorisch 114 Stuhl 31 Blut 26 Mittelstrahlurin 20 Magensaft 9 Gewebe 6 Punktat 5 Liquor 4 Bioptat 3 Lymphknotenbioptat 3 Knochenmarkbioptat 2 Wundabstrich 4 Sektionsmaterial 1 Summe 530

58 42 Material und Methoden Tab. 3.9: Patientengruppe Patientengruppen der Hauptstudie I Anzahl der Patienten Anzahl der untersuchten Proben HIV CF Transplantation Übrige Summe In der Hauptstudie II wurden im Zeitraum vom bis insgesamt 54 Proben von 42 Patienten untersucht. Die Materialien und die Patientengruppen sind in Tab und Tab aufgeführt: Tab. 3.10: Probenmaterial Untersuchte Probenmaterialien der Hauptstudie II Anzahl respiratorisch 46 Sputum 37 Bronchoalveolarlavage 2 Bronchialsekret 7 nichtrespiratorisch 8 Lymphknotenbioptat 4 Stuhl 3 Blut 1 Summe 54 Tab. 3.11: Patientengruppe Patientengruppen der Hauptstudie II Anzahl der Patienten Anzahl der untersuchten Proben HIV 4 5 CF Transplantation 2 2 Übrige Summe Isolierung der genomischen DNA Die Isolierung der DNA aus diesen Kulturen erfolgte wie in Kapitel beschrieben Amplifikation und Schmelzpunktanalyse Die verwendeten Primersequenzen für die für die Untersuchung von Kulturisolaten aus Patientenmaterialien sind in Tab aufgeführt.

59 43 Material und Methoden Tab. 3.12: Verwendete Primer für die Untersuchung von Kulturisolaten Name amplifiziertes Fragment Richtung Sequenz Schmelztemperatur LC1 16S rrna-gen forward 5`-GAG TTT GAT CCT GGC TCA GGA-3` 59,8 C LC4 16S rrna-gen reverse 5`-TGC ACA CAG GCC ACA AGG GA-3` 61,4 C LC66 Promotor narghji forward 5`-AAC CGA CGG TGT GGT TGA C-3 58,8 C LC67 Promotor narghji reverse 5`-ATC TCG ATG GAT GGG CGT C-3` 58,8 C Die verwendeten Sondensequenzen für die Untersuchung von Kulturisolaten aus Patientenmaterialien sind in Tab aufgeführt. Tab. 3.13: Verwendete Sondenpaare für die Untersuchung von Kulturisolaten Name Nachweis LCRed Sequenz Schmelztemperatur LC39 Mycobacterium - 5`-GCA ACG CGA AGA ACC TTA CCT GG-3` 65,0 C LC40 Mycobacterium 640 5`-TTT GAC ATG CAC AGG ACG-3` 54,2 C LC61 TBC - 5`-GCG GGC TCA TCC CAC ACC GCT A-3` 69,5 C LC62 TBC 705 5`-AGC GCT TTC CAC CAC AAG AC-3` 58,5 C LC25 M. avium - 5`-CGC GGG CCC ATC CCA CAC CG-3` 74,9 C LC26 M. avium 640 5`-AAA AGC TTT CCA CCA GAA GAC-3 53,6 C LC26 M. avium 705 5`-AAA AGC TTT CCA CCA GAA GAC-3` 53,6 C LC68 M. chel. / absc. - 5`-GGC CGC GGG CCC ATC CCA CAC-3` 76,3 C LC86 M. chel. / absc `-CAA AAG CTT TGC ACC ACT CAC-3` 58,4 C LC63 M. tuberculosis - 5`-GTC GCC ACG CGT CCA GAA AAC C-3` 68,7 C LC64 M. tuberculosis 640 5`-CGT GAT CGC TAC GGG CAT-3` 59,7 C Der Ansatz des Mastermixes und die Durchführung der PCR-Reaktion werden in Kapitel 3.4 beschrieben Aufreinigung der Amplifikate zur Sequenzierung Bevor die PCR-Produkte sequenziert wurden, mussten diese aufgereinigt werden, um Überlagerungen von Fluoreszenzen der markierten Detektionssonden mit denen der Sequenzierung zu vermeiden. Die Aufreinigung erfolgte mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Fa. QIAGEN, das Protokoll wurde in einigen Punkten leicht verändert. 20 µl (10 µl Mastermix und 10 µl Probe) aus der Reaktionskapillare wurden mit 30 µl sterilem Aqua dest. in einem Mikroschraubgefäß für 10 Minuten bei 95 C erhitzt, um die Sonden von der DNA zu lösen. Danach wurden die Gefäße sofort auf Eis gestellt. Die Probe wurde mit 250 µl eiskaltem Puffer PB gemischt, auf die Säule aufgetragen und sofort für eine Minute bei x g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die Säule mit 750 µl Puffer PE beladen und für eine Minute bei x g zentrifugiert.

60 44 Material und Methoden Nach Entfernen des Durchflusses wurde die Säule ein weiteres Mal für eine Minute bei x g zentrifugiert, um alle Reste des Puffers zu entfernen. Zum Eluieren der DNA wurde die Säule mit 30 µl Aqua dest. beladen und nach einer Inkubationszeit von einer Minute bei x g zentrifugiert. Die aufgereinigte DNA befand sich im Eluat und wurde bei 20 C gelagert. 3.3 Direktnachweis von Mykobakterien-DNA aus Patientenproben Titerbestimmung von Bakterienkulturen Aus einer Kultur mit einer OD 600 von 0,5 wurde jeweils 1 ml in Mikroschraubgefäße abgefüllt und anschließend bei x g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml 7H9- Medium + 0,9% Glycerol resuspendiert und bei 70 C eingefroren. Zur Bestimmung der Bakterienanzahl wurde ein Gefäß auf Eis aufgetaut und für 3 x 30 Sekunden mit jeweils einer Minute Pause in einem Wasserbad mit Ultraschallwellen behandelt, um ein Verklumpen von Bakterien zu verhindern. Mit 7H9-Medium wurden verschiedene 10er-Verdünnungsstufen hergestellt, diese auf 7H10-Platten ausplattiert und anschließend für mehrere Wochen bei 37 C im Brutschrank inkubiert. Um ein Austrocknen der Platten zu verhindern, wurden diese in Alufolie eingewickelt. Die gewachsenen Kolonien wurden gezählt und der Titer in KBE pro Milliliter berechnet Dekontamination von Patientenmaterial Eingesandtes Patientenmaterial wurde nach der Ankunft bis zur weiteren Bearbeitung im Kühlschrank bei 4 C gelagert, bzw. bei längerer Lagerungszeit (>2 Stunden) bei 20 C eingefroren. Vom Material wurde maximal 1 ml abgefüllt und für die Dekontamination verwendet. Das Patientenmaterial wurde mit der gleichen Menge an NaOH-NALC- Dekontaminationslösung versetzt und für 20 Minuten auf einem Rüttler geschüttelt. Anschließend wurde das Gemisch mit PBS-Puffer auf 30 ml aufgefüllt und für 15 Minuten bei x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und das Pellet in 1,5 ml PBS-Puffer resuspendiert. Mit diesem dekontaminierten Material wurde die weitere Diagnostik durchgeführt.

61 45 Material und Methoden Präparation von genomischer DNA aus Patientenmaterial Als Kit zur Isolierung der genomischen DNA aus Patientenmaterial wurde der Genomic DNA Purification Kit der Fa. THERMOLABSYSTEMS verwendet. Das vom Hersteller angegebene Protokoll zur Präparation von genomischer DNA wurde in einigen Punkten für eine größere Präparationsausbeute abgeändert. Beschrieben wird hier nur die Endversion des Protokolls, die Inkubationszeiten wurden während der Entwicklung mehrmals verändert und sind im Ergebnisteil beschrieben. Von den Reagenzien aus einem Kit wurden vor jeder Präparation in einem separaten Raum Aliquots in sterile Schraubgefäße abgefüllt, um eine Kontamination der Stammlösungen zu verhindern. Die Lagerung der Stammlösungen erfolgte bei 4 C außerhalb des Raumes, in dem die Proben-DNA isoliert wurde. 500 µl einer mit NaOH-NALC dekontaminierten Probe wurden für 20 Minuten bei x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 100 µl Lysozym-Lösung gelöst und für eine Stunde bei 37 C inkubiert. Anschließend wurden 750 µl vom Lysispuffer und 3 µl Proteinase K-Lösung zugegeben, sorgfältig gevortext und bei 56 C für 30 Minuten im Heizblock inkubiert. Die bis dahin aufbereitete Probe wurde weiter im Partikelprozessor KingFisher ml laut Anleitung des Herstellers bearbeitet. Pro Durchgang konnten mit dem Partikelprozessor maximal 15 Proben untersucht werden. Pro Probe wurden fünf Kavitäten nebeneinander mit unterschiedlichen Reagenzien zur Aufarbeitung befüllt. In Well I wurden maximal 100 µl Probe, 750 µl KF-Lysispuffer und 40 µl KF- Magnetperlen pipettiert. In Well II wurden 1000 µl KF-Waschpuffer vorgelegt. In Well III und IV wurden jeweils 1000 µl 70%iger Ethanol und im letzten Well 100 µl Aqua dest. als Elutionsmedium gegeben. Nach Starten des Programms wurde die Probe in Well I für einige Minuten gerüttelt. Anschließend wurden die Magnetperlen der Probe an einen Metallstab durch Aufbau eines magnetischen Feldes vom Gerät gebunden und in Well II überführt und gewaschen. Der Vorgang wurde bis in Well V weitergeführt, indem die an den Magnetperlen haftende DNA im Aqua dest. gelöst wurde. Zum Abschluss wurden die nun von der DNA befreiten Magnetperlen in Well II abgelegt. Die isolierte DNA konnte mit einer Pipette in ein Mikroschraubgefäß überführt und gelagert werden. Von dieser so isolierten DNA wurden anschließend 10 µl DNA direkt für die PCR-Reaktion eingesetzt. Als Programm für den KingFisher ml-automaten wurde das auf der Software von THERMOLABSYSTEMS vorhandene Programm Genomic DNA ml verwendet.

62 46 Material und Methoden Quantifizierung von DNA Gelelektrophorese mit Hilfe eines Größenstandards Ein Zehntel der Eluate mit der gelösten DNA wurde mit 2 µl Farbmarker versetzt und mit 500 ng, 250 ng und 100 ng des Größenstandards Smart-Ladder (in dieser Arbeit als Größenstandard II bezeichnet) zusammen auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen. Nach der elektrophoretischen Auftrennung bei 70 V für 120 Minuten wurde das Gel im Ethidiumbromidbad gefärbt und unter einer UV-Lampe betrachtet. Die einzelnen Banden des Smart-Ladders sind quantifiziert und leuchten unterschiedlich stark. Sie dienen als Bezugsgröße zur aufgetrennten DNA. Diese Methode diente zur groben Abschätzung der DNA-Menge Quantifizierung von DNA mit Hilfe des Pico-Green Kits Eine weitere, wesentlich genauere Methode um DNA zu quantifizieren, ist die Anwendung des Pico-Green Kits. Mit einer Pico Green Standard-DNA-Lösung wurde eine wie vom Hersteller vorgegeben Verdünnungsreihe mit TE-Puffer hergestellt. Die Konzentration der Proben-DNA wurde zuvor im Gel abgeschätzt, da der Messbereich beim Pico Green von 0,05 ng/ml - 2 µg/ml reicht. Entsprechend wurde die Proben-DNA bei Bedarf mit TE-Puffer verdünnt. Die Standard-DNA und die Proben-DNA wurde nach Vorgaben des Kits in die Kavitäten pipettiert und anschließend mit dem Pico Green Farbstoff Cyanin versetzt. Dieser fluoresziert, wenn er an doppelsträngiger DNA bindet. Als Leerwert dienten TE-Puffer und der Pico Green Farbstoff. Der Ansatz wurde für 30 Sekunden gerüttelt und anschließend für fünf Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Messung erfolgte mit dem Spectra Fluor Plus TM -Plattenphotometer und wurde anschließend mit der Software Tecan Magellan 3 analysiert Bestimmung der Kopienzahl Durch das Ergebnis des Pico Green Tests war die Konzentration der DNA bekannt. Das Mykobakteriengenom umfasst 4,4 Millionen Basenpaare, das Genom der Inhibitionskontrolle 4,5*10 3 Basenpaare. Ein Mol Basenpaare wiegt 666 g. Durch Multiplikation lässt sich das Molgewicht eines Genoms errechnen.

63 47 Material und Methoden Die Anzahl der in der Probe befindlichen Genome ließ sich mit der folgenden Formel rechnerisch ermitteln. n Genom PG * N = m * n bp A bp n Genom = 1 [ ml ] Anzahl der Genome = ng / ml Pico Green Quantifikation PG [ ] N A bp = , 022*10 [ ] [ ] 6, 4*10 [ ] 3, 5*10 [ ] mol Avogardrosche Zahl m = 666 g / mol Molmasse eines n bp n bp = 4 = 4 Basenpaares Anzahl Basenpaare eines Mykobakteriumgenomes Anzahl Basenpaare der Inhibitionskontrolle Berechnung der Sensitivität und Spezifität Die Sensitivität eines Testsystems ist definiert als das Verhältnis der Personen mit positivem Testergebnis zu den tatsächlich Positiven. Sie wurde mit folgender Formel erfasst: Sensitivität[ %] = Anzahl richtig positiver Proben Anzahl richtig positver Proben + Anzahl falsch negativer Proben *100 Die Spezifität eines Testsystems ist definiert als das Verhältnis der Personen mit negativem Testergebnis zu den tatsächlich Negativen. Sie wurde mit folgender Formel erfasst: Spezifität[%] = Anzahl richtig negativer Proben Anzahl richtig negativer Proben + Anzahl falsch positiver Proben * Amplifikation und Schmelzpunktanalyse Zum Nachweis von Mykobakterien mit der neu entwickelten Direkt-PCR wurde mit den folgenden Primersequenzen das 16S rrna-gen von Mykobakterien amplifiziert (vgl. Tab. 3.14). Tab. 3.14: Name amplifiziertes Fragment Verwendete Primer für den Direktnachweis von mykobakterieller DNA Richtung Sequenz Schmelztemperatur LC1 16S rrna-gen forward 5`-GAG TTT GAT CCT GGC TCA GGA-3` 59,8 C LC4 16S rrna-gen reverse 5`-TGC ACA CAG GCC ACA AGG GA-3` 61,4 C

64 48 Material und Methoden Die Detektion erfolgte mit den in Tab dargestellten Sondenpaaren in einer Multiplex-PCR. Tab. 3.15: Verwendete Sondenpaare für den Direktnachweis von mykobakterieller DNA Name Nachweis LCRed Sequenz Schmelztemperatur LC39 Mycobacterium - 5`-GCA ACG CGA AGA ACC TTA CCT GG-3` 65,0 C LC40 Mycobacterium 640 5`-TTT GAC ATG CAC AGG ACG-3` 54,2 C LC61 TBC - 5`-GCG GGC TCA TCC CAC ACC GCT A-3` 69,5 C LC62` TBC 705 5`-AGC GCT TTC CAC CAC AAG AC-3` 58,5 C Der Ansatz des Mastermixes und die Durchführung der PCR-Reaktion werden in Kapitel 3.4 beschrieben. 3.4 Unterscheidung innerhalb des M. tuberculosis-komplexes Verwendete Bakterienstämme des M. tuberculosis-komplexes Die beschriebenen Bakterienstämme stammen von der American Type Culture Collection (ATCC) und sind im Kapitel aufgeführt. Die übrigen Isolate stammen aus klinischem Material der MHH, die im Zeitraum von 2000 bis 2002 isoliert und identifiziert wurden, vom Nationalen Referenzzentrum für Mykobakterien (NRZ) in Borstel und vom Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) in Jena. Die klinischen Isolate der MHH wurden durch Sequenzierung des 16S rrna-gens, durch biochemische Differenzierung mit Hilfe des Nitrat- und Niacin-Tests und durch Analyse der RD1-Region, wie von TALBOT und Mitarbeitern (1997) beschrieben, identifiziert. Isolate, die mit diesen Methoden nicht eindeutig identifiziert werden konnten, wurden für die Bestimmung in das NRZ nach Borstel geschickt Verwendete Bakterienstämme nichttuberkulöser Mykobakterien Die verwendeten Stämme stammen alle von der ATCC bzw. von der Deutschen Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig und sind in Tab alphabetisch aufgeführt. Die daraus isolierte genomische DNA stammt aus der Stammsammlung der AG Bange. Die DNA der einzelnen Spezies wurden durch Sequenzierung der hypervariablen Region A auf dem 16S rrna-gen überprüft.

65 49 Material und Methoden Tab. 3.16: Aufstellung der verwendeten nichttuberkulösen Mykobakterien Spezies Stamm Spezies Stamm M. abscessus ATCC M. malmoense ATCC M. asiaticum ATCC M. margeritense ATCC M. aurum ATCC M. marinum ATCC 927 M. avium ssp. avium ATCC M. mucogenicum ATCC M. celatum ATCC M. neoaurum ATCC M. chelonae ATCC M. nonchromogenicum ATCC M. chubuense ATCC M. phlei ATCC M. conspicuum DSMZ M. scrofulaceum ATCC M. flavescens ATCC M. shimoidei ATCC M. fortuitum DSMZ M. simiae ATCC M. gadium ATCC M. smegmatis ATCC M. gastri DSMZ M. szulgai ATCC M. genavense DSMZ M. terrae ATCC M. gordonae ATCC M. thermoresistible ATCC M. interjectum ATCC M. triviale ATCC M. intracellulare ATCC M. vaccae DSMZ M. kansasii ATCC M. xenopi ATCC M. lentiflavum ATCC Kulturbedingungen Die Stämme des TBC wurden im BACTEC MGIT TM 960 Kulturautomaten der Fa. BECTON DICKINSON angezüchtet. Die Stämme aller NTM wurden in 7H9-Medium bzw. auf 7H10-Platten bei 37 C vermehrt Kulturkonservierung Von allen verwendeten Bakterienstämmen wurden Tiefgefrierstammkulturen angelegt. 1,5 ml jeder Bakterienkultur wurde bei x g 10 Minuten in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, und anschließend wurde das Pellet in 1 ml Medium (7H9 für Mykobakterien, LB-Medium für plasmidtragende E. coli-stämme) zusammen mit 15% Glycerol resuspendiert und bei 70 C gelagert Präparation genomischer DNA Bei dieser Methode handelt es sich um eine sehr schnelle Möglichkeit zur Isolierung von genomischer DNA aus den Bakterienzellen mit Hilfe von Glasperlen µl einer für 15 Minuten bei 80 C inaktivierten Kultur aus dem MGIT-Automaten wurden bei x g für 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand abgegossen.

66 50 Material und Methoden Zu dem Pellet wurden 100 µl TE-Puffer (ph 8.0) und 50 µl einer Suspension von Glasperlen (106 µm im Durchmesser) in TE-Puffer gegeben. Dieses Gemisch wurde dann für 2 Minuten im Mickle-Automaten gerüttelt, um die genomische DNA aus den Zellen zu isolieren. Die Zelltrümmer und Glasperlen wurden für 5 Minuten bei x g abzentrifugiert und 100 µl vom Überstand in ein neues Mikroschraubgefäß abgefüllt. Im Überstand lag die DNA in gelöster Form vor. Die Lagerung erfolgte bei 20 C Amplifikation und Schmelzpunktanalyse Die Sequenzen der Primer, die zur Unterscheidung innerhalb des TBC entwickelt und verwendet wurden, sind in Tab zusammengefasst. Tab. 3.17: Verwendete Primer zur Unterscheidung innerhalb des M. tuberculosis-komplexes Name amplifiziertes Fragment Richtung Sequenz Schmelztemperatur LC66 Promotor narghji forward 5`-AAC CGA CGG TGT GGT TGA C-3 58,8 C LC67 Promotor narghji reverse 5`-ATC TCG ATG GAT GGG CGT C-3` 58,8 C LC73 RD-1-Region forward 5`-CTA GAC GAG GCC GCT CAA G-3` 61,0 C LC74 RD-1-Region forward 5`-AAG ACG TGG CCT TTC TGC TG-3` 59,4 C LC75 RD-1-Region reverse 5`-ACG GGT TAC TGC GAA TAC CG-3` 59,4 C LC83 RD-1-Region reverse 5`-CCC GAA AGG AAC ATT GTC GG-3` 59,4 C LC90 OxyR-Gen forward 5`-CGG GTG CCG CTG ACC GCG-3` 67,4 C LC91 OxyR-Gen reverse 5`-CCA GCC GGC TTC GCG TGG-3` 65,1 C Die in diesem Abschnitt entwickelten Sonden werden im Kapitel 4.2 ausführlich beschrieben. Der Ansatz des Mastermixes und die Durchführung der PCR-Reaktion werden in Kapitel 3.4 beschrieben. 3.5 DNA-Amplifikation und Schmelzpunktanalyse Die Grundlagen der in dieser Arbeit durchgeführten PCR am LightCycler beruhen auf den Arbeiten von ACKERMANN (2001) und LACHNIK (2002). Die Einstellungen für das Programm (PCR und anschließende Schmelzkurvenanalyse) wurden übernommen, ebenso wie die jeweiligen Angaben für Konzentrationen und Mengen der Komponenten für den Mastermix.

67 51 Material und Methoden Alignment von Primern und Sonden Für die Entwicklung neuer Primer und Sonden wurden veröffentlichte Sequenzen ( des Nationalen Zentrums für biotechnologische Information (NCBI) in einem Alignment mit Hilfe der in Kapitel 3.7 beschriebenen Software miteinander verglichen. Auf dieser Grundlage wurden die neuen Primer und Sonden in dieser Arbeit entwickelt Primer Die Synthese der Primer wurde von der Fa. MWG BIOTECH GMBH in Ebersberg durchgeführt. Die Primerlyophilisate wurden auf eine Konzentration von 18 pmol/µl mit sterilem A. dest. verdünnt und in Aliquots von 100 µl bei 20 C gelagert. Bei der Primerentwicklung wurden die in Kapitel beschriebenen Vorgaben berücksichtigt Sonden Die Synthese der Sondenpaare wurde von der Fa. TIB MOLBIOL in Berlin durchgeführt. Bei der Sondenentwicklung wurden die in Kapitel beschriebenen Vorgaben berücksichtigt. Die Lyophilisate wurden auf eine Konzentration von 2 pmol/µl mit sterilem A. dest. eingestellt und in Aliquots mit 100 µl je Sonde bei 20 C gelagert. Ein einmal aufgetautes Sondenpaar wurde zur weiteren Verwendung bei 4 C gelagert Ansetzen von Template und Mastermix Das Ansetzen von Template und Mastermix erfolgte in zwei getrennten Räumen, um Kontaminationen sowohl mit Fremd-DNA als auch mit Produkten aus ehemaligen PCR-Reaktionen zu vermeiden. Zuerst wurde der Mastermix in einem sog. Reinstraum, der frei von jeglicher DNA sein sollte, zusammen pipettiert. Das Gesamtvolumen von jeder Probe für die Amplifikation und anschließende Schmelzpunktanalyse betrug 20 µl pro Kapillare (10 µl Mastermix und 10 µl Template).

68 52 Material und Methoden Die 10 µl Mastermix setzten sich wie folgt zusammen: 1 µl Primer (forward) 18 pmol/µl 1 µl Primer (reverse) 18 pmol/µl 2 µl Enzymmix der Fa. ROCHE (Taq-Polymerase, dntps und Puffer) 1 µl Ankersonde 2 pmol/µl 1 µl Detektionssonde 2 pmol/µl 1,6 µl MgCl 2 * beim Einsatz von speziesspezifischen Sonden 2,0 µl MgCl 2 * beim Einsatz von genusspezifischen Sonden x µl Wasser der Fa. ROCHE zum Auffüllen des Volumens auf 10 µl In einer Multiplex-PCR, in der genus- und speziesspezifische Sonden verwendet wurden, fiel die MgCl 2 -Konzentration zugunsten der speziesspezifischen Sonde aus (* die Konzentration der MgCl 2 -Stammlösung betrug 25 mm.). Nach dem Ansetzen wurde der Mastermix gekühlt bei 4 C und dunkel gelagert. Die Template-DNA wurde im Template-Raum angesetzt, bzw. bei Bedarf verdünnt. Das Befüllen der Reaktionskapillaren mit Mastermix und Template-DNA erfolgte in einem weiteren, vom Reinst- und Template-Raum getrennten Raum. 10 µl der Template-DNA wurden zum vorgelegten Mastermix in die Kapillaren pipettiert. Die Kapillaren wurden mit den dazugehörigen Deckeln verschlossen und anschließend in einer Zentrifuge bei x g für einige Sekunden zentrifugiert, um den Ansatz im unteren Bereich der Kapillare anzusammeln. Die Kapillaren wurden dann in den LightCycler-Rotor eingesetzt und der Lauf gestartet. Wurden an einem Tag die Kapillaren nach einem Lauf geöffnet, so wurde der Reinstraum an diesem Tag nicht mehr betreten LightCycler-Programmierung Als Software diente die Version LC Run Version Das Versuchsprotokoll für alle LightCycler-Reaktionen ist in der folgenden Abbildung dargestellt. Das Programm setzt sich aus vier Teilen zusammen (vgl. Tab. 3.18): 1. Denaturierung (denaturation) 2. Amplifikation (cycling) 3. Schmelzpunktanalyse (melting) 4. Kühlung (cooling)

69 53 Material und Methoden Tab. 3.18: Programm für die Amplifikation und anschließende Sondenhybridisierung am LightCycler Segment Target Hold Slope 2. Target Step Step Acquisition Number Temperature Time Temperature Size delay Mode [ - ] [ C ] [ sec ] [ C/sec ] [ C ] [ C ] [ Cycles ] [ - ] Denaturation, 1 cycle None Cycling, 50 cycles None Single None Melting, 1 cycle None None continuous Cooling, 1 cycle None Zu Beginn erfolgte eine zehnminütige Auftrennung der DNA in Einzelstränge bei einer Temperatur von 95 C (Denaturierung). Die Amplifikation der Template-DNA fand in insgesamt 50 Zyklen statt. Jeder Zyklus startete mit einer Denaturierung für drei Sekunden bei 95 C. Das folgende Annealing fand für die ersten fünf Zyklen (Step delay) bei einer Temperatur von 68 C für zwei Sekunden statt, anschließend wurde die Annealing Temperatur schrittweise um 1 C (Step size) auf 62 C (2. Target temperature) abgesenkt. Dieser Schritt ermöglichte eine spezifischere Produktamplifikation in den ersten fünf Zyklen. Die Elongation erfolgte bei 72 C für vierzig Sekunden. In jedem PCR-Zyklus wurde die Fluoreszenz der Sonden gemessen (Acquisition mode: single), wobei das Fluoreszenzsignal mit den höheren DNA-Konzentrationen anstieg. Die Schmelzpunktanalyse wurde im Anschluss an die PCR durchgeführt. Die DNA wurde bei 95 C für dreißig Sekunden denaturiert, anschließend wurde die Temperatur auf 38 C abgesenkt und für dreißig Sekunden gehalten. Bei der darauffolgenden Temperaturerhöhung auf 80 C (0,2 C/Sekunde) wurde die Fluoreszenz der Sonden kontinuierlich gemessen (Acqusition mode: continuous). Das Abschmelzen der Sonden von der Zielstruktur wurde vom entsprechenden Kanal gemessen. Zur Abkühlung des Gerätes erfolgte eine Temperaturabsenkung auf 40 C für dreißig Sekunden.

70 54 Material und Methoden 3.6 Sequenzierungen Alle Sequenzierungen wurden von der Fa. MWG BIOTECH GMBH in Ebersberg oder von der Routinediagnostik der MHH (Sanger-Technik mit Fluorezein-markierten Farbstoffmediatoren) durchgeführt. 3.7 Unterstützende Software Mit dem Klonierungsprogramm Clone (Version 6, DNA-Star 4.0, Scientific & Educational Software) wurden die Plasmidkonstrukte und Restriktionsspaltungen simuliert. Mit dem Programm Advanced Blast Search der NCBI-Datenbank ließ sich die Spezifität der gewählten Sequenzen überprüfen. Alle aus der NCBI-Datenbank entnommenen Sequenzen wurden mit dem Programm Meg Align (DNA-Star 4.0, DNA-Star Inc.) miteinander verglichen. 3.8 Sonstige Materialien Alle weiteren Geräte, Chemikalien, Enzyme und Gebrauchsmaterialien sind im Anhang aufgeführt.

71 55 Ergebnisse 4 Ergebnisse Die Vorarbeiten dieser Arbeit beruhen auf den Dissertationen von ACKERMANN (2001) und LACHNIK (2002). Im ersten Teil dieser Arbeit sollte das in vitro getestete LightCycler-Format an klinischen Probenmaterialien getestet werden. In einem zweiten Abschnitt wurde darüber hinaus eine neue Methode zur Unterscheidung innerhalb des TBC entwickelt. Als Zielstruktur zum Nachweis von Mykobakterien wurde das 16S rrna-gen verwendet. Auf diesem befinden sich halbkonservierte Bereiche, in denen alle Mykobakterien in ihrer Sequenz identisch sind. Diese sind spezifisch für Mykobakterien. Andere Bakterienspezies haben in diesem Bereich eine andere Sequenz und können so von Mykobakterien unterschieden werden. Der Bereich, der für die Gattung Mycobacterium spezifisch ist, wird im Folgenden als Genusregion bezeichnet und mit der genusspezifischen Sonde detektiert. Weiterhin gibt es hypervariable Bereiche auf dem 16S rrna-gen, in denen sich die einzelnen Spezies der Mykobakterien voneinander in ihrer Sequenz unterscheiden. Diese Regionen sind demnach speziesspezifisch und wurden mit speziesspezifischen Sonden detektiert. Alle in dieser Arbeit gezeigten Versuche wurden, soweit nicht anders beschrieben, mindestens dreimal wiederholt. Sensitivitätsversuche wurden jeweils mit Doppelwerten durchgeführt. Die LightCycler-Abbildungen zeigen immer die repräsentativen Ergebnisse eines Versuchs, dargestellt sind die spezifischen Schmelzpunkttemperaturen der Detektionssonden für die jeweilig eingesetzte Spezies. Dabei werden auf der Abszisse die Schmelzpunkttemperatur in Celsius und auf der Ordinate die im entsprechenden Kanal gemessenen Fluoreszenzwerte angegeben. 4.1 Erstellung einer Inhibitionskontrolle für die Polymerase- Kettenreaktion Für die PCR-Reaktionen, die in diesem Kapitel beschrieben werden, wurden die von LACHNIK und Mitarbeitern (2002) beschriebenen Primer und Sonden verwendet. Mit den Primern LC1 und LC4 wurde ein bp großes Fragment auf dem 16S rrna- Gen von Mykobakterien amplifiziert. Auf dem amplifizierten Genabschnitt befinden sich drei Regionen (I, II und III), die genusspezifisch sind und zwei hypervariable Regionen (A und B), die speziesspezifisch sind. Zum Nachweis des Genus Mycobacterium wurde in dieser Arbeit die genusspezifische Sonde LC39/40

72 56 Ergebnisse verwendet, die an die Genusregion III bindet. Das spezifische Signal für die Anwesenheit von Mykobakterien liegt für diese Sonde bei einer Temperatur von 61,5±1 C. Zur weiteren Speziesidentifizierung wurde im F3-Kanal die TBCspezifische Sonde LC11/12 zur Detektion des TBC verwendet, die in der hypervariablen Region A detektiert (64±1 C). Um bei der Untersuchung klinischer Proben unterscheiden zu können, ob eine Probe negativ für die gesuchte Zielstruktur ist, oder ob eine Amplifikation durch Inhibitoren verhindert wurde, wurde diesen Proben eine Inhibitionskontrolle zugesetzt. Diese ermöglichte die Unterscheidung falsch negativer Proben von richtig negativen Proben (ROSENSTRAUS et al. 1998). In der vorangegangenen Dissertation von LACHNIK (2002) wurde bereits eine Inhibitionskontrolle (pjl6) für die beschriebene PCR mit folgender Schmelzpunktanalyse zum Nachweis von Mykobakterien erstellt. Dabei wurde das 16S rrna-gen von M. tuberculosis in einen Vektor subkloniert und der Bereich, der spezifisch für das Genus Mycobacterium ist, durch gezielte Mutagenese in zwei Basen verändert. Bei der anschließenden Amplifikation und Sondenhybridisierung verschob sich der Schmelzpunkt der genusspezifischen Sonde bei Bindung an der Inhibitionskontrolle aufgrund der zwei Fehlbasen von 61,5 C auf 48 C. Inhibitionskontrolle und Amplifikate der Proben-DNA waren so voneinander zu unterscheiden. Diese interne Kontrolle sollte zu jeder zu untersuchenden Probe als Amplifikationskontrolle hinzugefügt werden und so gleichzeitig als Positivkontrolle der PCR gelten. Für die Genussonde II, die an der Genusregion II bindet, wurde ebenfalls eine solche Inhibitionskontrolle (pjl8) angefertigt Versuche mit der Inhibitionskontrolle pjl6 In einer Multiplex-PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse, in dem die genusspezifische Sonde im F2-Kanal und die TBC-spezifische Sonde im F3-Kanal gleichzeitig detektierten und als Inhibitionskontrolle pjl6 zu den Proben hinzugefügt wurde, zeigten sich folgende Ergebnisse. Als Template war in Probe 1 genomische DNA von M. tuberculosis als Vertreter des TBC, in Probe 2 genomische DNA von M. gordonae als atypisches Mykobakterium und Wasser als Negativkontrolle in den Proben 3 und 4. Als Amplifikationskontrolle wurde die Inhibitionskontrolle pjl6 mit jeweils 500 Kopien zu den in den Reaktionen 1-3 zugesetzt. Die Probe 4 enthielt nur Wasser ohne Zusatz der Inhibitionskontrolle. Die Abb. 4.1 und Abb. 4.2 zeigen die Schmelzpunktanalyse der Proben mit der genusspezifischen Sonde und der TBC-spezifischen Sonde.

73 57 Ergebnisse Abb. 4.1: Genusspezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pjl6 im F2-Kanal eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von M. tuberculosis, M. gordonae und pjl6 als Inhibitionskontrolle Abb. 4.2: TBC-spezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pjl6 im F3-Kanal eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: TBC-spezifische Sonde LC11/12 genomische DNA von M. tuberculosis, M. gordonae und pjl6 als Inhibitionskontrolle Die genusspezifische Sonde detektierte in den Proben 1 und 2 bei 61,5 C Mykobakterien (vgl. Abb. 4.1). Gleichzeitig erschien bei diesen beiden Proben die Inhibitionskontrolle pjl6 bei 48 C als Zeichen für eine erfolgreiche Amplifikation. In Probe 3 (enthielt Wasser und die Inhibitionskontrolle) gab die Sonde ein Signal bei 48 C für die Inhibitionskontrolle als Zeichen einer erfolgreichen Amplifikation, Mykobakterien waren in dieser Probe nicht enthalten. In Probe 4 wurde nur Wasser

74 58 Ergebnisse ohne Inhibitionskontrolle verwendet, es erschien kein Signal für Mykobakterien bzw. für die Inhibitionskontrolle. Die TBC-spezifische Sonde detektierte in den Proben 1, 2 und 3 den TBC bei einer spezifischen Temperatur von 66,5 C (vgl. Abb. 4.2). Lediglich in Probe 4, in der keine Inhibitionskontrolle zugesetzt war, zeigte die Sonde kein Signal für den TBC. Für Probe 2 und 3 lag damit ein falsch positives Ergebnis vor. Der Grund für das falsch positive Ergebnis war die Inhibitionskontrolle pjl6. Lediglich die genusspezifische Region der Inhibitionskontrolle wurde durch gezielte Mutagenese verändert, der Bereich, der spezifisch für den TBC ist (hypervariable Region A), wurde bei der Inhibitionskontrolle nicht verändert. Die TBC-spezifische Sonde konnte damit an der Region A der Inhibitionskontrolle binden und zeigte so ein positives Signal für den TBC bei jeder Probe, der pjl6 zugesetzt war. Der Schmelzpunkt für die Inhibitionskontrolle und den Wildtyp bei der Detektion mit der TBC-spezifischen Sonde war damit nicht zu unterscheiden. Um die bereits für die Genusregion veränderte Inhibitionskontrolle pjl6 auch für eine Multiplex-PCR mit genusspezifischer und TBC-spezifischer Sonde verwenden zu können, musste der Bereich auf dem 16S rrna-gen, der spezifisch für den TBC ist, deletiert werden Klonierungsstrategie Die TBC-spezifische Region der Inhibitionskontrolle sollte zum einen so verändert werden, dass die TBC-spezifische Sonde nicht mehr binden kann. Gleichzeitig sollte aber die Größe des amplifizierten Fragmentes der Inhibitionskontrolle nicht verändert werden, um eine präferentielle Amplifikation kleinerer Fragmente zu vermeiden. Die Sequenzen der 16S rrna-gene verschiedener Mykobakterien und anderer Bakterienspezies wurden in einem Alignment in der hypervariablen Region A miteinander verglichen und es wurden universelle Regionen gesucht, die die TBCspezifische Region flankieren. Diese universellen Regionen sind bei allen Bakterienspezies in ihrer Sequenz identisch. Weiterhin sollte innerhalb von diesen universellen Regionen eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym vorhanden sein, welches an keiner weiteren Stelle innerhalb der Sequenz der Inhibitionskontrolle schneidet. Mit der Hilfe dieses Enzyms könnte die hypervariable Region des 16S rrna-gens von M. tuberculosis aus pjl6 herausgeschnitten werden und durch ein gleich großes Fragment vom 16S rrna- Gen einer anderen Bakterienspezies (ebenfalls mit diesem Enzym geschnitten) ersetzt werden. Der restliche Abschnitt des 16S rrna-gens bliebe auf der

75 59 Ergebnisse Inhibitionskontrolle unverändert. Das Restriktionsenzym EcoNI erfüllte die oben genannten Anforderungen (vgl. Abb. 4.3 und Abb. 4.4). Zum Verständnis ist die Strategie in den folgenden Abbildungen (Abb. 4.3 und Abb. 4.4) noch einmal skizziert: EcoNI EcoNI TBC-Region Genus II Genus III Genus I [bp] LC1 Abb. 4.3: LC4 16S rrna-gen von M. tuberculosis subkloniert in pjl6 Das Enzym EcoNI schneidet innerhalb der universellen Regionen auf dem 16S rrna- Gen, welche die TBC-spezifische Region flankieren. Der übrige Abschnitt mit den genusspezifischen Regionen bleibt unverändert. Im Genusbereich I bindet der genusspezifische Primer, der Genusbereich III ist durch gezielte Mutagenese in zwei Basen verändert. Genus II Genus III Genus I [bp] LC1 Abb. 4.4: LC4 Verändertes 16S rrna-gen von M. tuberculosis im neuen Konstrukt Der mit EcoNI isolierte Bereich mit der TBC-spezifischen Region ist durch ein gleich großes Fragment aus einer anderen Bakterienspezies auf dem 16S rrna-gen ersetzt. Die TBC-spezifische Sonde ist damit nicht mehr in der Lage, an der spezifischen Region zu binden Restriktionsverdau der Inhibitionskontrollen mit EcoNI Die Plasmid-DNA beider Inhibitionskontrollen pjl6 (Mutation in der Genusregion III) und pjl8 (Mutation in der Genusregion II) wurde isoliert und anschließend mit dem Enzym EcoNI verdaut. Die verdaute DNA wurde auf ein Agarosegel aufgetragen und nach Größe der Fragmente aufgetrennt. Die erwarteten Bandengrößen lagen für beide Plasmide bei 319 bp und 4206 bp. Die Inhibitionskontrolle pjl8 in Spur 3 zeigte die erwarteten Bandengrößen von 319 bp und 4206 bp. Die Inhibitionskontrolle pjl6 in Spur 2 zeigte die erwartete Bande bei 319 bp. Anstatt der erwarteten bp großen Bande waren zwei Banden bei ca bp und bp zu sehen (vgl. Abb. 4.5).

76 60 Ergebnisse Spur 1: DNA-Größenstandard I Spur 2: pjl6 nach Verdau mit EcoNI Spur 3: pjl8 nach Verdau mit EcoNI Spur 4: DNA-Größenstandard II Abb. 4.5: Gelansicht: Plasmide pjl6 und pjl8 nach EcoNI-Verdau Um zu überprüfen, ob die zusätzliche EcoNI Schnittstelle im Vektor oder im Insert (enthält das 16S rrna-gen) von pjl6 lag, wurde ein Kontrollverdau mit EcoNI und XhoI vorgenommen. XhoI hat eine Schnittstelle im Bereich des 319 bp großen EcoNI Fragmentes. In diesem Verdau zeigte sich, dass die weitere EcoNI Schnittstelle im Vektor von pjl6 lag (Daten hier nicht gezeigt). Vermutlich ist die zusätzliche Schnittstelle für EcoNI während der PCR durch einen Fehler der Polymerase bei der damaligen Konstrukterstellung in der Arbeit von LACHNIK (2002) entstanden. Damit weiterhin das subklonierte und in der Genusregion III veränderte 16S rrna- Gen aus pjl6 verwendet werden konnte, musste dieses isoliert werden und in den nicht durch weitere EcoNI-Schnittstellen veränderten Vektor von pjl8 eingesetzt werden (beide Inhibitionskontrollen pjl6 und pjl8 besitzen als Vektor den pgem-t der Fa. PROMEGA) Subklonierung des Inserts von pjl6 in den Vektor von pjl8 Mit Hilfe der Enzyme NdeI und NcoI wurde das im Bereich der Genusregion III mutagenisierte 16S rrna-gen aus pjl6 isoliert und in den Vektoranteil von pjl8 subkloniert. Das neue Konstrukt pab1 (vgl. Abb. 4.6) wies keine weitere Schnittstelle im Kontrollverdau mit EcoNI auf, sondern zeigte wie die Inhibitionskontrolle pjl8 für die Genusregion II die erwarteten Bandengrößen bei 319 und bp (Daten nicht gezeigt). Mit diesem neuen Konstrukt pab1 konnte nun die eigentliche Klonierungsstrategie (vgl. Abbildung 4.1.2) fortgesetzt werden.

77 61 Ergebnisse EcoNI NcoI XhoI LC1 EcoNI TBC-Region EcoNI schneidet pab1 an Position 10 und 329 in ein bp und ein 319 bp großes Fragment NcoI schneidet pab1 an Position pab bps LC4 Genusregion III* Genusregion I NdeI schneidet pab1 an Position XhoI schneidet pab1 an Position 81 Ampicillinresistenzgen ori NdeI Abb. 4.6: Vektorkarte von pab1 Das 16S rrna-gen von M. tuberculosis wurde in den Vektor subkloniert. Die genusspezifische Region III wurde durch gezielte Mutagenese in zwei Basen verändert, um bei der Detektion vom Wildtyp unterschieden werden zu können. Das Enzym EcoNI flankierte die TBC-spezifische Region. Mit den beiden Primern LC1 und LC4 wurde das bp große Fragment vom 16S rrna-gen amplifiziert Klonierung der neuen Inhibitionskontrolle Dafür wurde die genomische DNA von Staphylococcus aureus mit Hilfe von Glasperlen mechanisch isoliert. Mittels universeller Primer LC1 und AB1 wurde ein 350 bp großes Fragment auf dem 16S rrna-gen von Staphylococcus aureus mit der konventionellen Block-PCR amplifiziert und anschließend mit EcoNI verdaut. Innerhalb der Primerbindungsregionen von LC1 und AB1 lagen die beiden Schnittstellen des Enzyms. Das Insert vom 16S rrna-gen aus Staphylococcus aureus wurde mit dem Vektor pab1 ligiert. Der hypervariable Bereich mit der TBC-spezifischen Region von M. tuberculosis war auf der neuen Inhibitionskontrolle pab2 nicht mehr vorhanden, die TBC-spezifische Sonde hatte dadurch keine Möglichkeit, an der Inhibitionskontrolle zu binden. Die Überprüfung des neues Konstruktes pab2 erfolgte durch DNA-Sequenzierung. Dabei wurde ein 800 bp großes Fragment von pab2 sequenziert, welches den Bereich des subklonierten Fragments vom 16S rrna-gen aus Staphylococcus aureus einschloss. Die Primerbindungsregion für LC1, in der die Schnittstelle von EcoNI lag, blieb wie durch die Sequenzierung bestätigt, durch die Klonierung unverändert in der Sequenz.

78 62 Ergebnisse EcoNI EcoNI LC1 pab bps LC4 Genusregion III* Genusregion I Ampicillinresistenzgen ori Abb. 4.7: Vektorkarte von pab2 Das 16S rrna-gen von M. tuberculosis wurde in den Vektor subkloniert. Die genusspezifische Region III war durch gezielte Mutagenese in zwei Basen verändert worden, um bei der Detektion vom Wildtyp unterschieden werden zu können. Das subklonierte Fragment vom 16S rrna-gen aus Staphylococcus aureus ersetzte das Fragment mit der TBC-spezifische Region, diese war damit in der neuen Inhibitionskontrolle pab2 nicht mehr vorhanden. Mit den beiden Primern LC1 und LC4 wurde das bp große Fragment vom 16S rrna-gen der Inhibitionskontrolle amplifiziert Vergleich der Inhibitionskontrollen in der PCR-Reaktion Um zu überprüfen, ob sich die neue Inhibitionskontrolle pab2 von der alten Inhibitionskontrolle pjl6 in der Intensität oder im Schmelzpunkt nach der Amplifikation mit anschließender Schmelzpunktanalyse unterscheidet, wurden beide Plasmide in einer Reaktion miteinander verglichen. Dazu wurde die Plasmid-DNA beider Konstrukte isoliert, quantifiziert und die Kopienanzahl bestimmt. Mit jeweils zwei Doppelwerten wurden 50 Kopien pab2 mit 50 Kopien pjl6 verglichen.

79 63 Ergebnisse Abb. 4.8: Vergleich der Inhibitionskontrolle pjl6 mit pab2 in der PCR-Reaktion eingesetzte Sonde: genusspezifische Sonde LC39/40 eingesetzte DNA: Plasmid-DNA der Inhibitionskontrollen pab2 und pjl6 Beide Plasmide, pab2 und pjl6, unterscheiden sich in der LightCycler-Reaktion bei gleicher Anzahl eingesetzter Kopien bei der Detektion mit der genusspezifischen Sonde weder in der Intensität noch in dem Schmelzpunkt (vgl. Abb. 4.8). Der Mittelwert des spezifischen Schmelzpunktes von pab2 bei der Detektion mit der genusspezifischen Sonde LC39/40 in Wasser betrug 48,3 C (n=10) mit einer Standardabweichung von 0,13 C Versuche mit der neuen Inhibitionskontrolle pab2 Verwendete man nun die Inhibitionskontrolle pab2 als Amplifikationskontrolle, bei der die genusspezifische Sonde im F2-Kanal und die TBC-spezifische Sonde im F3- Kanal gleichzeitig detektieren sollen, zeigten sich folgende Ergebnisse. Das Template entsprach dem aus Kapitel 4.1.1, nur wurde statt der Inhibitionskontrolle pjl6 die neue Inhibitionskontrolle pab2 mit 500 Kopien zu den Proben 1-3 zugefügt.

80 64 Ergebnisse Abb. 4.9: Genusspezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pab2 im F2-Kanal eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von M. tuberculosis, M. gordonae und pab2 als Inhibitionskontrolle Die genusspezifische Sonde detektierte im F2-Kanal bei 61,5 C in den Proben 1 und 2 Mykobakterien. Gleichzeitig erschien bei diesen beiden Proben die Inhibitionskontrolle pab2 bei 48 C als Zeichen einer erfolgreichen Amplifikation. In Probe 3 wurde durch die Inhibitionskontrolle eine erfolgreiche Amplifikation angezeigt, Mykobakterien wurden nicht detektiert. Probe 4 enthielt nur Wasser, es gab kein Signal (vgl. Abb. 4.9). Im F3-Kanal wurden die gleichen Proben mit der TBC-spezifischen Sonde auf Mykobakterien des TBC detektiert (vgl. Abb. 4.10). Abb. 4.10: TBC-spezifische Sonde mit der Inhibitionskontrolle pab2 im F3-Kanal eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: TBC-spezifische Sonde LC11/12 genomische DNA von M. tuberculosis, M. gordonae und pab2 als Inhibitionskontrolle

81 65 Ergebnisse Die TBC-spezifische Sonde detektierte im F3-Kanal bei 66 C in der Probe 1 den TBC. Die Proben 2-4 zeigten kein Signal, sie waren negativ für den TBC. Die TBCspezifische Sonde war nicht mehr in der Lage, an der speziesspezifischen Region der Inhibitionskontrolle zu binden und ein falsch positives Signal zu zeigen. Eine erfolgreiche Amplifikation wurde mit der Detektion der Inhibitionskontrolle mit der genusspezifischen Sonde im F2-Kanal gezeigt. Mit der neuen Inhibitionskontrolle pab2 konnte damit im weiteren Verlauf dieser Arbeit eine Multiplex-PCR mit Amplifikationskontrolle durchgeführt werden. 4.2 Untersuchung von kulturellen Patientenproben Der Nachweis von Mykobakterien in der Kultur wird als Goldstandard in der Literatur betrachtet. Die Kultur ist die sensitivste Methode (10 1 bis 10 2 lebende Organismen zum Nachweis sind ausreichend für einen Nachweis), allerdings kann es bis zu acht Wochen dauern, bis ein endgültig negatives Ergebnis vorliegt. Die Verwendung des MGIT-Kulturautomaten zur kulturellen Diagnostik von Mykobakterien erlaubt die Detektion von mykobakteriellem Wachstum zu einem sehr frühen Stadium. Die durchschnittliche Detektionszeit von positiven Kulturen beträgt für NTM sieben Tage und für M. tuberculosis neun bis vierzehn Tage (vgl. Kapitel 2.5.4). Die Verwendung dieser Flüssigkultursysteme hat die Detektionsraten und zeiten von Mykobakterien signifikant verbessert (METCHOCK et al. 1999; LAVERDIERE et al. 2000). Der endgültige Nachweis aus den positiven Kulturen erfolgt anschließend durch Sequenzierung des 16S rrna-gens oder durch die Verwendung spezifischer Gensonden. Im Rahmen dieser Dissertation wurden Kulturen von Patientenmaterialien aus dem MGIT-Automaten mit Hilfe der PCR überprüft. Es sollte getestet werden, ob mit der Amplifikation von Proben-DNA mit anschließender Schmelzpunktanalyse eine schnellere und genauere Diagnostik erfolgen kann als mit Hilfe der ZN-Färbung und anschließender Sequenzierung des 16S rrna-gens, wie sie bisher in der Routinediagnostik der MHH durchgeführt wird. Die Studie wurde in mehrere Abschnitte gegliedert, abhängig vom jeweiligen Stand der Sondenentwicklung. Um neben dem Patientengut einer Universitätsklinik die LightCycler-Technologie auch an Materialien anderer Kliniken zu vergleichen, wurden nach Ende der Pilotstudie MGIT-Kulturen aus dem Klinikum Hannover Nordstadt mit in die weitere Studie aufgenommen. Die Abteilung für Klinische Mikrobiologie und Hygiene hat u.a. eine Lungenklinik in Hannover als Einsender, so dass mit einem hohen Aufkommen an Patientenproben mit Mykobakterien des TBC zu rechnen war.

82 66 Ergebnisse Pilotstudie ( ) Am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der MHH wird der kulturelle Nachweis von Mykobakterien mit Hilfe des MGIT-Kulturautomaten geführt. Alle Kulturen, für die der Kulturautomat ein positives Signal meldet, werden mit Hilfe der ZN-Färbetechnik auf säurefeste Stäbchen untersucht. Lediglich die Proben, die säurefeste Stäbchen enthalten, werden mit Hilfe der Sequenzierung der Region A des mykobakteriellen 16S rrna-gens weiter untersucht. Die übrigen Proben werden als steril oder als kontaminiert befundet. Mit Hilfe der PCR und anschließender Schmelzpunktanalyse sollten alle positiven MGIT-Kulturen untersucht werden, die eines oder mehrere der folgenden Kriterien erfüllten: säurefeste Stäbchen in der Kultur CF-Patient HIV-Infektion, Zustand nach Transplantation Klinischer Verdacht (Anamnese, z.b. Geburt oder Aufenthalt in Endemiegebieten [z.b. Kosovo, Russland, Indien, Asien]) Mit den erweiterten Einschlusskriterien sollte untersucht werden, ob die Nachweisrate der neuen Diagnostikmethode für den Nachweis von Mykobakterien aus MGIT-Kulturen möglicherweise höher ist als die gegenwärtig in unserem Institut praktizierte Kombination aus ZN-Färbung und anschließender Sequenzanalyse des 16S rrna-gens. Alle Proben, die im MGIT-Kulturautomaten ein positives Signal gaben, wurden mit Hilfe der ZN-Färbung auf säurefeste Stäbchen untersucht und der Diagnostik zugeführt. Alle Proben, die säurefeste Stäbchen enthielten, wurden der Speziesidentifizierung durch Sequenzierung der variablen Region A des 16S rrna- Gens zugeführt. Die genomische DNA wurde mechanisch mit Hilfe von Glasperlen isoliert und davon wurden 10 µl direkt in der PCR-Reaktion eingesetzt. Die Amplifikations-und Detektionsmethode wurde wie von LACHNIK und Mitarbeitern (2002) beschrieben durchgeführt. Zunächst wurde jede Probe in einem ersten Lauf mit der genusspezifischen Sonde LC39/40 auf die Anwesenheit von Mykobakterien untersucht. Ergab die genusspezifische Sonde einen spezifischen Schmelzpunkt von 61,5 C für Mykobakterien, wurde in einem zweiten Lauf die TBC-spezifische-Sonde LC11/12 und die M. avium-spezifische Sonde LC25/26 verwendet. Ergab sich ein TBCspezifischer Schmelzpunkt von 64 C, lautete die Diagnose Mykobakterien des TBC wurden kulturell nachgewiesen.

83 67 Ergebnisse Ergab sich ein M. avium-spezifischer Schmelzpunkt von 61 C, lautete die Diagnose M. avium wurde kulturell nachgewiesen. Ergab sich im zweiten Lauf kein spezifischer Schmelzpunkt, so lautete die Diagnose NTM wurden kulturell nachgewiesen, M. avium wurde ausgeschlossen. Bei jeder Probe wurden im ersten Lauf 50 Kopien der Inhibitionskontrolle pjl6 mitgeführt. Im zweiten Lauf zur weiteren Speziesdifferenzierung wurde das Kontrollplasmid nicht mehr mitgeführt, da die Probe bereits im ersten Durchgang auf die Anwesenheit von Inhibitoren untersucht wurde. Proben, die im ersten Lauf inhibiert waren, wurden 1:10 verdünnt und der erste Lauf wurde wiederholt. Wegen der bekannten starken inhibitorischen Wirkung von Blut in der DNA-Amplifikationsreaktion wurden positive Blutkulturen von vorne herein 1:100 verdünnt. Alle Proben, die nach der PCR-Amplifikation und anschließender Schmelzpunktanalyse positiv für Mykobakterien waren, wurden zur Kontrolle der Speziesidentifizierung durch Sequenzierung der hypervariablen Region A des 16S rrna-gens zugeführt. Zwischen dem und wurden 448 Proben kulturell angelegt. 120 Proben erfüllten die oben genannten Einschlusskriterien. 13 Proben enthielten laut Mikroskopie säurefeste Stäbchen, wobei in der anschließenden Sequenzierung lediglich in 12 Proben Mykobakterien gefunden wurden. Von diesen enthielten drei Proben den TBC, während in neun Proben NTM gefunden wurden. Von diesen neun Proben enthielten drei Proben M. avium, vier Proben M. intracellulare und zwei Proben den M. chelonae-abscessus-komplex. 20 der 120 untersuchten Proben enthielten nach der ersten Amplifikation und Schmelzpunktanalyse Mykobakterien. Von diesen enthielten nach dem zweiten Lauf fünf Proben den TBC, drei Proben M. avium, und 12 Proben andere NTM. Die anderen NTM wurden durch die Sequenzanalyse des 16S rrna-gens weiter differenziert und sind in der Tab. 4.1 aufgeführt. Das Ergebnis aus allen 12 Proben, die säurefeste Stäbchen enthielten und bei denen in der anschließenden Sequenzierung Mykobakterien gefunden wurden, wurde mit der neuen Diagnostik mittels PCR und anschließender Schmelzpunktanalyse bestätigt. Zusätzlich wurden acht weitere Proben als positiv detektiert. Die direkte Sequenzierung der Amplifikationsprodukte aus diesen acht Amplifikaten ergab, dass sich in zwei Proben der TBC, in drei Proben M. gastri / kansasii, und in drei weiteren Proben der M. chelonae-abscessus-komplex befand. Sechs dieser acht zusätzlich detektierten Proben stammten von dem Patienten P.W. Von diesem Patienten wurden bereits vor Beginn der Pilotstudie zwischen dem

84 68 Ergebnisse und dem in insgesamt fünf Proben aus dem oberen Respirationstrakt atypische Mykobakterien nachgewiesen. Die anderen beiden Proben stammten aus dem nationalen Ringversuch für Mykobakterien, der während der Pilotstudie am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene durchgeführt wurde. Laut Ringversuchsleiter enthielten beide Proben M. tuberculosis. Daher handelt es sich bei den acht Proben um richtig positive Proben. Eine Kreuzkontamination während der Amplifikationsreaktion war praktisch ausgeschlossen. Von 120 untersuchten Proben waren mit der PCR 27 Proben auch nach einer Wiederholung des ersten Laufs mit einer 1:10 Verdünnung inhibiert. Das entspricht einer Inhibitionsrate von 22,5%. Die Ergebnisse der Pilotstudie sind in der Tab. 4.1 zusammengefasst. Tab. 4.1: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Pilotstudie Routine-Diagnostik PCR-Analyse ZN-Färbung Sequenz 16S rrna-gen Genus Spezies 12 x positiv 20 x positiv 3 x TBC 5 x TBC 3 x M. avium 3 x M. avium 2 x M. chel. / absc. 5 x M. chel. / absc.* 4 x M. intracellulare 4 x M. intracellulare* 3 x M. gastri / kans.* * nach Sequenzierung des 16 rrna-gens vom PCR-Amplifikat Zusammengefasst zeigte die Pilotstudie eine vollständige Übereinstimmung der Ergebnisse mit der neuen Methode mittels PCR und Schmelzkurvenanalyse und der Diagnostik mit Hilfe der ZN-Färbung und Sequenzanalyse. Darüber hinaus beobachteten wir, dass durch den Einsatz der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse zusätzlich positive Proben gefunden wurden, die in der ZN Färbung keine säurefesten Stäbchen aufwiesen. Im Zeitraum vom wurden aus 448 kulturell angelegten Proben mit Hilfe der etablierten Technik (MGIT-Kulturautomat ZN-Färbung Sequenzanalyse) in 12 Proben Mykobakterien identifiziert. Wurden die Einschlusskriterien für die Untersuchung mittels PCR erweitert, konnten in 20 Proben Mykobakterien gefunden werden. Dieses Ergebnis entspricht einer Nachweisrate von 2,68% für den kulturellen Nachweis mit ZN-Färbung und anschließender Sequenzierung, bzw. 4,46% für den kulturellen Nachweis mit Hilfe der PCR und anschließender Schmelzpunktanalyse bei erweiterten Einschlusskriterien. Bezogen auf die absolute Anzahl positiver

85 69 Ergebnisse Proben konnten durch den Einsatz der PCR 60,0% mehr Proben als kulturell positiv identifiziert werden. Eine weitere Aufgliederung der Ergebnisse der PCR-Analyse hinsichtlich der untersuchten Patientenmaterialien ist im Anhang aufgeführt (vgl. Tab. 8.1). Bei den untersuchten Patientengruppen wurden in der Pilotstudie folgende Mykobakterien- Spezies isoliert: Von 10 untersuchten HIV-Patienten wurden 12 Proben untersucht und bei einem M. intracellulare isoliert. Von 9 untersuchten Transplantationspatienten wurden 18 Proben untersucht und aus keiner der untersuchten Proben Mykobakterien isoliert. Von 54 untersuchten CF-Patienten wurden 67 Proben untersucht und bei sieben Patienten Mykobakterien (3 x M. avium, 3 x der M. chelonae-abscessus-komplex, 1 x M. intracellulare, 1 x M. gastri/kansasii) isoliert. Bei einem dieser Patienten wurde eine Doppelinfektion mit M. gastri/kansasii und dem M. chelonae-abscessus- Komplex nachgewiesen. Von den übrigen 18 Patienten ohne bekannte Vorerkrankungen wurden 23 Proben untersucht und bei vier Patienten Mykobakterien (2 x der TBC und 2 x M. intracellulare) isoliert Bestimmung einer neuen Kopienanzahl der Inhibitionskontrolle für die Untersuchung kultureller Patientenisolate Die Inhibitionskontrollen waren mit 50 Kopien des Kontrollplasmids pjl6 pro PCR- Reaktion durchgeführt worden. Die Inhibitionsrate lag damit bei 22,5% und war entsprechend zu hoch. In diesem Versuch sollte getestet werden, welche Anzahl an Kopien des Kontrollplasmids in allen Proben nachzuweisen ist. Dabei wurde bereits die neue Inhibitionskontrolle pab2 verwendet, die im weiteren Verlauf dieser Studie verwendet werden sollte (s. a. Kapitel 4.1). Sechs kulturell negative MGIT-Proben wurden gewaschen, mit Glasperlen behandelt und anschließend mit unterschiedlichen Mengen an Kontrollplasmid versetzt. Die folgende Schmelzpunktanalyse wurde mit der genusspezifischen Sonde LC39/40 zum Nachweis der Inhibitionskontrolle pab2 durchgeführt. Das Ergebnis ist in Tab. 4.2 dargestellt. Ein Signal bei der spezifischen Temperatur von 48 C für die Inhibitionskontrolle wurde als positiv gewertet, sobald es über die Nulllinie hinausging.

86 70 Ergebnisse Tab. 4.2: Nachweisgrenze der Inhibitionskontrolle in kulturellen Patientenisolaten Kopien pab2 Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe Lediglich 500 Kopien der Inhibitionskontrolle ließen sich in allen sechs Proben nachweisen. Daher sollte im Hauptteil dieser Studie die Anzahl der Kopien des Kontrollplasmids auf 500 pro Reaktionsansatz erhöht werden. Da sich, laut Aussage der Fa. BECTON DICKINSON, bei einem positiven Signal mindestens 10 5 bis 10 6 KBE pro Milliliter in einem MGIT-Kulturröhrchen und damit pro PCR-Reaktion zwischen 10 3 und 10 4 Genomkopien in der Reaktionskapillare befinden, wurde der Einsatz von 500 Kopien Kontrollplasmid pro Reaktion für den weiteren Verlauf dieser Untersuchung von kulturellen Proben aus dem MGIT-Automaten als unbedenklich erachtet Spezifische Detektion des M. chelonae-abscessus-komplexes In der Vergangenheit hatte sich gezeigt, dass am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der MHH neben dem TBC hauptsächlich M. avium und der M. chelonae-abscessus-komplex aus Patientenproben nachgewiesen wurden (BANGE et al. 1999; BANGE u. BÖTTGER 2002). Deshalb wurde der Einsatz einer weiteren Sonde, die spezifisch für den M. chelonaeabscessus-komplex detektiert, geplant. Zur Erstellung der Sonde wurde ein Alignment der Sequenzen des 16S rrna-gens von allen klinisch bedeutsamen Mykobakterien hergestellt (vgl. Kapitel 8.1). Im Bereich der hypervariablen Region A unterscheiden sich die meisten der Mykobakterienspezies voneinander. Zum Nachweis von M. chelonae und M. abscessus, die sich in der Sequenz des 16S rrna-gens nicht voneinander unterscheiden lassen, wurde mit der Hilfe des Sequenzvergleiches eine Sonde entwickelt. Als Ankersonde wurde eine Sonde ausgewählt, die zu allen getesteten Mykobakterien eine vollständige Homologie hatte. LC68: 5`-GGC CGC GGG CCC ATC CCA CAC-3` (21 bp) Ankersonde - genusspezifisch (Fluoreszein markiert)

87 71 Ergebnisse Die Sequenz der Detektionssonde war spezifisch für M. chelonae und M. abscessus und sollte sich damit deutlich in ihrem Schmelzpunkt von den anderen Mykobakterien unterscheiden. LC86: 5`-CAA AAG CTT TGC ACC ACT CAC-3` (21 bp) Detektionssonde speziesspezifisch (LCRed 705 markiert) Die Spezifität der neuen Sonde wurde anhand der genomischen DNA von 36 verschiedenen Mykobakterien-Spezies überprüft. Gezeigt werden hier nur Daten aus einem Lauf. Als Vertreter der sequenzgleichen Mitglieder des TBC wurde die genomische DNA von M. tuberculosis verwendet. Mit den Primern LC1 und LC4 wurde das bp Fragment auf dem 16S rrna-gen der Mykobakterien amplifiziert und mit der neuen M. chelonae / abscessus-sonde detektiert. Abb. 4.11: Spezifität der M. chelonae/abscessus-sonde LC86 eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: M. chelonae/abscessus-sonde LC68/86 genomische DNA von M. abscessus, M. chelonae und 29 weiteren Mykobakterien Die Detektionssonde LC86 schmolz für die beiden sequenzgleichen Spezies M. chelonae und M. abscessus bei einer Temperatur von 66,5 C ab. Die anderen Mykobakterien zeigten bedingt durch Fehlbasen mit der Detektionssonde ein Signal bei einer niedrigeren Temperatur (<56 C) bzw. bei zu vielen Fehlbasen mit der Sequenz der Detektionssonde gar kein Signal (vgl. Abb. 4.11). Sequenzgleiche Stämme zeigten einen gemeinsamen Schmelzpunkt.

88 72 Ergebnisse Der Mittelwert für den spezifischen Schmelzpunkt von M. chelonae und M. abscessus lag für die Sonde LC86/68 bei 65,8 C, die berechnete Standardabweichung betrug 0,34 C (n=10) Hauptstudie I ( ) Da sich in der Pilotstudie gezeigt hatte, dass die PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse die Nachweisrate der klassischen Methodik um 60,0% verbesserte, wurde für die Hauptstudie ein neues Eingangskriterium festgelegt. Es wurden alle MGIT-Proben, die im Kulturautomaten ein positives Signal gaben, mit der neuen Methode untersucht. An der Methodik wurde folgendes verändert: Die Fertigstellung der Inhibitionskontrolle pab2 erlaubte nun den Einsatz der genusspezifischen Sonde und der TBC-spezifischen Sonde in einem Lauf (vgl. Kapitel 4.1). Um die Unterscheidung zwischen dem TBC und NTM zu beschleunigen, sollten deshalb in der Hauptstudie beide Sonden im ersten Durchgang verwendet werden. Im zweiten Durchgang wurde die M. avium-sonde und die M. chelonae / abscessus- Sonde zum weiteren Nachweis von NTM verwendet. Ein zweiter Durchgang wurde immer dann durchgeführt, wenn der erste positiv für Mykobakterien, aber negativ für den TBC ausgefallen war. Die Kopienanzahl der Inhibitionskontrolle pab2 wurde von 50 auf 500 Kopien erhöht (vgl. Tab. 4.2). Die DNA-Amplifikate sämtlicher PCR-Reaktionen, in denen Mykobakterien nachgewiesen werden konnten, wurden aus den Reaktionskapillaren isoliert und anschließend sequenziert. Wurden innerhalb von acht Wochen von einem Patienten in mehreren Proben, sofern diese nicht aus unterschiedlichen Materialien waren (z.b. Sputum, Trachealsekret, Urin, usw.), Mykobakterien in der LightCycler-Reaktion nachgewiesen, so wurde das Amplifikat nur einmal sequenziert, sofern keine Unstimmigkeiten mit der vorherigen Diagnose vorlagen. Zwischen dem und wurden 1526 Proben kulturell angelegt. Von diesen erfüllten 530 Kulturen das Eingangskriterium. 77 Proben enthielten säurefeste Stäbchen, wobei in der Sequenzierung in allen Proben Mykobakterien gefunden wurden. Von diesen enthielten 37 Proben den TBC, während in 40 Proben NTM gefunden wurden. Von diesen 40 Proben enthielten 17 Proben M. avium, drei Proben M. intracellulare, 10 Proben den M. chelonaeabscessus-komplex, vier Proben M. malmoense und sechs Proben M. gordonae. 101 Proben enthielten als Ergebnis der PCR Mykobakterien. 53 Proben enthielten den TBC, 48 Proben hatten NTM. Von diesen 48 Proben wurde ein zweiter Lauf

89 73 Ergebnisse durchgeführt, wobei in 19 Proben M. avium und in 15 Proben den M. chelonaeabscessus-komplex nachgewiesen wurde. Demnach konnte nach zwei Durchgängen in 87 von 101 Proben mit Hilfe der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse eine eindeutige Speziesdiagnose gestellt werden (86,1%). Bei den noch ausbleibenden 14 Proben wurde mit der Sequenzierung des 16S rrna-gens eine weitere Differenzierung durchgeführt (vgl. Tab. 4.3). Das Ergebnis aus allen 77 Proben, die säurefeste Stäbchen enthielten und bei denen in der anschließenden Sequenzierung Mykobakterien gefunden wurden, wurde mit der PCR bestätigt. Zusätzlich wurden jedoch mit Hilfe der Amplifikation und anschließender Schmelzpunktanalyse 24 weitere Proben als positiv detektiert. Neun dieser 24 Proben waren im ZN-Präparat negativ für Mykobakterien. Diese wurden im Rahmen der Routinediagnostik wieder zurück in den MGIT-Kulturautomaten zurückgestellt und weiter inkubiert. Alle neun Proben wurden während dieser zweiten Inkubation erneut positiv vom Automaten gemeldet und bei der anschließenden ZN-Färbung zeigten alle Proben säurefeste Stäbchen. Im Durchschnitt wurden die Proben in diesen Fällen 7,8 Tage später als mit der LightCycler-Technologie nachgewiesen. Die übrigen 15 Proben waren in der ZN-Färbung negativ für säurefeste Stäbchen und kontaminiert mit anderen Bakterien. Zehn Proben stammten von Patienten, bei denen entweder in einer Parallelprobe oder mit der konventionellen PCR Mykobakterien nachgewiesen werden konnten. Fünf Proben stammten von CF- Patienten, diese wurden ein weiteres Mal mit Oxalsäure dekontaminiert und erneut im MGIT-Automaten inkubiert. Davon wurden drei Proben später positiv für säurefeste Stäbchen und es wurden in der Sequenzierung Mykobakterien nachgewiesen. Durchschnittlich dauerte die Diagnose mit einer erneuten Dekontamination mit Oxalsäure 7,8 Tage länger. Zwei Proben blieben nach der Oxalsäuredekontamination steril, allerdings konnte bei beiden Patienten in Parallelproben Mykobakterien nachgewiesen werden. Die zusätzlich mit der PCR detektierten Proben waren damit auch mit der herkömmlichen Diagnostik erfasst worden, bzw. erfolgte der Nachweis aus Parallelproben. Nachteilig blieb die zeitliche Verzögerung bis zur endgültigen Diagnose. Die direkte Sequenzierung der 24 zusätzlich detektierten Amplifikationsprodukten ergab, dass sich in 16 Proben der TBC, in einer Probe M. avium und sieben weiteren Proben der M. chelonae-abscessus-komplex befanden. In keinem Fall wurde ein Problem bei der Amplifikation der Inhibitionskontrolle beobachtet.

90 74 Ergebnisse Die Ergebnisse der Hauptstudie I sind in Tab. 4.3 zusammengefasst. Tab. 4.3: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Hauptstudie I Routine-Diagnostik PCR-Analyse ZN-Färbung Sequenz 16S rrna-gen Genus Spezies 77 x positiv 101 x positiv 37 x TBC 53 x TBC 17 x M. avium 19 x M. avium 10 x M. chel. / absc. 15 x M. chel. / absc. 3 x M. intracellulare 3 x M. intracellulare* 6 x M. gordonae 6 x M. gordonae* 4 x M. malmoense 4 x M. malmoense* 1 x M. genavense* * nach Sequenzierung des 16 rrna-gens vom PCR-Amplifikat Zusammengefasst wurde im Zeitraum vom aus 1526 kulturell angelegten Proben mit Hilfe der etablierten Technik (MGIT-Kulturautomat ZN- Färbung Sequenzanalyse) in 77 Proben Mykobakterien isoliert. Untersuchte man mit Hilfe der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse alle Proben, die im MGIT-Automaten ein positives Signal gaben, so wurden in 101 Proben Mykobakterien gefunden. Dieses Ergebnis entspricht einer Nachweisrate von 5,04% für den kulturellen Nachweis mit der ZN-Färbung und anschließender Sequenzierung, bzw. 6,61% für den kulturellen Nachweis mit Hilfe der PCR bei erweiterten Einschlusskriterien. Bezogen auf die absolute Anzahl positiver Proben konnten durch den Einsatz der neuen Methode 31,2% mehr Proben als kulturell positiv identifiziert werden. Eine weitere Aufschlüsselung der Ergebnisse der PCR-Analyse bezüglich der untersuchten Patientenmaterialien ist im Anhang in Tab. 8.2 aufgeführt. Bei den untersuchten Patientengruppen wurden in der Hauptstudie I folgende Mykobakterien- Spezies isoliert: Von 19 untersuchten HIV-Patienten wurden 69 Proben untersucht und bei fünf Patienten Mykobakterien (2 x TBC und 3 x M. avium) isoliert. Von 45 untersuchten Transplantationspatienten wurden 104 Proben untersucht und bei drei Patienten Mykobakterien (1 x M. chelonae-abscessus-komplex und 2 x M. gordonae) isoliert. Von 130 untersuchten CF-Patienten wurden 229 Proben untersucht und bei 13 Patienten Mykobakterien (8 x der M. chelonae-abscessus-komplex, 4 x M. avium, 2 x M. intracellulare und 1 x der TBC) isoliert. Bei einem Patienten wurde eine Doppelinfektion mit dem M. chelonae-abscessus-komplex und M. intracellulare nachgewiesen.

91 75 Ergebnisse Von den übrigen 64 Patienten wurden 128 Proben untersucht und bei 11 Patienten Mykobakterien (6 x der TBC und jeweils 1 x M. avium, M. malmoense, M. genavense, M. gordonae und M. intracellulare) isoliert Hauptstudie II ( ) Die höhere Nachweisrate von Mykobakterien aus Kulturisolaten mittels PCR und anschließender Schmelzpunktanalyse im Vergleich zur herkömmlichen Diagnostik wurde in der Hauptstudie bestätigt. Jedoch wurde bei 530 Proben eine LightCycler- Diagnostik durchgeführt, in 482 Fällen mit einem Lauf, in 48 Fällen mit zwei Läufen. Bei einem Preis von ca. 4,- pro Lauf (reine Materialkosten) beliefen sich die Kosten dabei auf insgesamt 2.312,-. Wir stellten uns daraufhin die Frage, ob es eine Möglichkeit gibt, die neue Diagnostikmethode auf einen Teil der im MGIT- Kulturautomat positiv gemeldeten Proben zu beschränken. Ein Möglichkeit wäre, nur die Proben zu untersuchen, die säurefeste Stäbchen in der ZN-Färbung aufweisen. Dadurch wäre die Anzahl der mit der PCR untersuchten Proben von 530 auf 77 reduziert worden, wobei gleichzeitig die Kosten von 2.312,- um 86 % auf 335,- gesenkt worden wären. Allerdings hatte sowohl die Pilotstudie als auch die Hauptstudie eindeutig gezeigt, dass dadurch die Nachweisrate bezogen auf die untersuchten Proben des kulturellen Nachweises deutlich gesenkt wurde. Bezogen auf die untersuchten Patienten konnte die Nachweisrate durch den erheblichen Aufwand allerdings nicht gesteigert werden. Aus diesem Grunde entschlossen wir uns, vorwiegend aus ökonomischen Überlegungen, in einem dritten Teil dieser Untersuchung (Hauptstudie II) lediglich die Kulturen zu untersuchen, in denen säurefeste Stäbchen nachgewiesen werden konnten. Hinsichtlich der Durchführung der Untersuchung gab es keine Veränderung gegenüber der ersten Hauptstudie. Zu diesem Zeitpunkt hatten wir allerdings eine Methode entwickelt, die M. tuberculosis von den anderen Mitgliedern des TBC unterscheidet (vgl. Kapitel 4.4). Daher wurden mit der M. tuberculosis-sonde alle TBC-positiven Isolate in einem zweiten Durchgang untersucht. Bei einem negativen Ergebnis mit dieser Sonde wurde eine weitere Diagnostik auf das Vorliegen von M. bovis und M. bovis BCG mit den entsprechenden Sonden durchgeführt. Zwischen dem und wurden insgesamt Proben kulturell angelegt. Von diesen erfüllten 54 Kulturen das Eingangskriterium. 54 Proben enthielten laut ZN-Färbung säurefeste Stäbchen, wobei in der anschließenden Sequenzierung in 50 Proben Mykobakterien gefunden wurden. Die

92 76 Ergebnisse fehlenden vier Proben blieben in der Sequenzierung negativ für Mykobakterien. Von den 50 Proben enthielten 14 Proben den TBC, während in 36 Proben NTM gefunden wurden. Von diesen 36 Proben enthielten 12 Proben M. avium, fünf Proben M. intracellulare, 12 Proben den M. chelonae-abscessus-komplex, vier Proben M. xenopi, eine Probe M. malmoense, eine Probe M. szulgai und eine Probe M. gastri / kansasii. 50 Proben enthielten nach der Amplifikation mit dem LightCycler Mykobakterien. 14 Proben enthielten den TBC und wurden in einem weiteren Lauf mit der M. tuberculosis-sonde weiter differenziert. 13 dieser Proben konnten als M. tuberculosis identifiziert werden. Die verbleibende Probe konnte mit den Sonden zur Unterscheidung im TBC nicht weiter differenziert werden. Zur Bestimmung wurde diese Probe ins NRZ nach Borstel geschickt und als M. africanum identifiziert. 36 Proben enthielten NTM. Von diesen 36 Proben wurde ein zweiter Lauf durchgeführt, wobei in 12 Proben M. avium und in 12 Proben der M. chelonae-abscessus-komplex nachgewiesen wurde. Demnach konnte nach zwei Läufen in 37 von 50 Proben mit Hilfe der neuen Diagnostikmethode eine eindeutige Speziesdiagnose gestellt werden (74%). Zusätzlich gelang die eindeutige Identifizierung von M. tuberculosis aus dem TBC. Bei den noch ausbleibenden 12 Proben erfolgte mit Hilfe der Sequenzierung des 16S rrna-gens eine weitere Differenzierung (vgl. Tab. 4.4). Das Ergebnis aus allen 50 Proben, die säurefeste Stäbchen enthielten und bei denen in der anschließenden Sequenzierung Mykobakterien gefunden wurden, wurde mit der PCR bestätigt. In keinem Fall wurde ein Problem bei der Amplifikation der Inhibitionskontrolle beobachtet. Die Ergebnisse der Hauptstudie II sind in der Tab. 4.4 zusammengefasst. Tab. 4.4: Vergleich der Ergebnisse der Routinediagnostik und PCR in der Hauptstudie II Routine-Diagnostik PCR-Analyse ZN-Färbung Sequenz 16S rrna-gen Genus Spezies 54 x positiv 50 x positiv 14 x TBC 14 x TBC davon 13 x M. tuberculosis und 1 x M. africanum** 12 x M. avium 12 x M. avium 12 x M. chel. / absc. 12 x M. chel. / absc. 5 x M. intracellulare 5 x M. intracellulare* 4 x M. xenopi 4 x M. xenopi* 1 x M. malmoense 1 x M. malmoense* 1 x M. gastri / kans. 1 x M. gastri / kans.* 1 x M. szulgai 1 x M. szulgai * 4 x negativ * nach Sequenzierung des 16 rrna-gens vom PCR-Amplifikat ** Analyse im NRZ, positiv mit der TBC-spezifischen Sonde

93 77 Ergebnisse Zusammengefasst wurde in dem Zeitraum aus kulturell angelegten Proben mit Hilfe der etablierten Technik in 50 Proben Mykobakterien isoliert und mit der PCR und anschließenden Schmelzpunktanalyse ebenfalls. Zeitdauer, Arbeitsaufwand und damit verbundenen Personalkosten bis zur Diagnose konnten damit durch den Einsatz der PCR mit Schmelzpunktanalyse gegenüber der bisherigen Diagnostik deutlich gesenkt werden. Eine weitere Aufschlüsselung der Ergebnisse der PCR-Analyse bezüglich der untersuchten Patientenmaterialien ist im Anhang in Tab. 8.3 aufgeführt. Bei den untersuchten Patientengruppen wurden in der Hauptstudie folgende Mykobakterien- Spezies isoliert: Von vier untersuchten HIV-Patienten wurden fünf Proben untersucht und bei vier Patienten Mykobakterien (jeweils 1 x TBC, M. avium, M. gastri/kansasii und M. gordonae) isoliert. Von zwei untersuchten Transplantationspatienten wurden zwei Proben untersucht und bei beiden Mykobakterien (1 x M. chelonae-abscessus-komplex und 1 x M. xenopi) isoliert. Von 16 untersuchten CF-Patienten wurden 19 Proben untersucht und bei 14 Patienten Mykobakterien (7 x der M. chelonae-abscessus-komplex, 5 x M. avium, 2 x M. intracellulare) isoliert. Von den übrigen 20 untersuchten Patienten wurden 28 Proben untersucht und bei 18 Patienten Mykobakterien (6 x der TBC, 4 x M. avium, 1 x M. chelonae-abscessus- Komplex, 3 x M. intracellulare, 2 x M. xenopi und jeweils 1 x M. szulgai und M. malmoense) isoliert. Insgesamt wurden in allen drei Studien Kulturen von insgesamt 704 Patientenproben untersucht. Davon waren 566 respiratorische und 138 nichtrespiratorische Materialien. Mykobakterien wurden in 137 respiratorischen Materialien (24,2%) und in 34 nichtrespiratorischen Materialien (24,6%) nachgewiesen. Von den 18 Patienten, bei denen der TBC isoliert wurde, hatten drei eine HIV- Infektion und ein Patient litt an CF. Vier der 18 Patienten stammten aus Deutschland, von denen zwei eine HIV-Infektion hatten. Vier weitere Patienten stammten aus dem mittleren Osten (Türkei, Iran), zwei aus Asien (Thailand, Vietnam), zwei aus Osteuropa (Polen) und einer aus Afrika (Nigeria). Fünf der TBC positiven Proben stammten von Patienten aus dem nationalen Ringversuch für Mykobakterien und konnten nicht weiter identifiziert werden. Von den 21 Patienten, bei denen M. avium nachgewiesen wurde, waren vier mit dem HI-Virus infiziert und 12 an CF erkrankt. Bei fünf weiteren Patienten war keine Vorerkrankung bekannt.

94 78 Ergebnisse Von den 20 Patienten, bei denen der M. chelonae-abscessus-komplex nachgewiesen wurde, waren 17 an CF erkrankt und bei zwei Patienten war eine Lungentransplantation durchgeführt worden. Von den 12 Patienten, bei denen M. intracellulare nachgewiesen wurde, war einer HIV positiv und fünf Patienten an CF erkrankt. Bei sechs weiteren Patienten war keine Vorerkrankung bekannt. Die damit am häufigsten isolierte Spezies bei HIV-Patienten waren in dieser Studie M. avium gefolgt von dem TBC. Die am häufigsten isolierten Spezies bei CF-Patienten waren der M. chelonaeabscessus-komplex gefolgt von M. avium Untersuchung von Proben aus dem Klinikum Hannover Nordstadt Um neben dem Patientengut einer Universitätsklinik (MHH) auch die Einsatzfähigkeit der PCR und Schmelzpunktanalyse bei Proben aus anderen Krankenhäusern zu beurteilen, wurde parallel zu den beiden Hauptstudien eine Untersuchung von Proben aus dem Institut für klinische Mikrobiologie und Hygiene des Klinikum Hannover Nordstadt (Nordstadtkrankenhaus) durchgeführt. Die Studie wurde parallel zu den beiden Hauptstudien der MHH in zwei Abschnitte eingeteilt. Untersucht wurden alle MGIT-Kulturen, die ein positives Signal im Kulturautomaten gaben. Die Durchführung der Untersuchung entsprach den oben genannten Bedingungen während der ersten Hauptstudie der MHH. Die Proben wurden in der Routinediagnostik des Nordstadtkrankenhauses ebenfalls mit NALC-NaOH dekontaminiert und anschließend im MGIT-Kulturautomaten bebrütet. Von den positiv gemeldeten Kulturen wurde eine ZN-Färbung angefertigt und eine Blutplatte angelegt, die nach 24 Stunden abgelesen wurde. Weiterhin wurden zwei Festmedien (Löwenstein-Jensen und Stonebrink) mit dem Material aus dem positiven MGIT-Röhrchen beimpft. Waren die ZN-Färbung und Blutplatte mit anderen Bakterien kontaminiert und konnten mikroskopisch keine säurefesten Stäbchen festgestellt werden, wurde die Probe als mit Begleitflora kontaminiert befundet. Eine neue Einsendung von Material wurde erbeten. Zeigten sich in der ZN- Färbung säurefeste Stäbchen, so wurde die Probe mit dem AccuProbe Mycobacterium tuberculosis Komplex Kulturbestätigungstest bei Verdacht auf den TBC (säurefeste Stäbchen, Cordlagerung im Ausstrich), bzw. bei Verdacht auf atypische Mykobakterien (säurefeste Stäbchen, aber keine Cordlagerung im Ausstrich) mit dem AccuProbe Mycobacterium avium Kulturbestätigungstest der Fa. GEN-PROBE untersucht. Proben, die positiv für den TBC waren, wurden weiter mit der

95 79 Ergebnisse Nitrat/Niacin-Testung differenziert, um M. tuberculosis von den anderen Mitgliedern des TBC zu unterscheiden. Blieb die Sonde negativ für den TBC wurde diese Probe noch einmal mit der M. avium-sonde untersucht. War dieses Ergebnis ebenfalls negativ, wurde die Probe zu weiteren Differenzierung ins NRZ nach Borstel geschickt. Ebenso wurde mit allen Proben verfahren, die mit der M. avium-sonde untersucht wurden und mit dieser Gensonde negativ blieben Abschnitt I ( ) Es wurden alle MGIT-Kulturen untersucht, die ein positives Signal im Kulturautomaten gaben. Die Durchführung der Untersuchung entsprach den oben genannten Bedingungen während der ersten Hauptstudie der MHH. 69 Kulturen erfüllten das Eingangskriterium. 25 Proben enthielten nach der ZN- Färbung säurefeste Stäbchen. Von diesen 25 Proben wurden 25 mit der PCR positiv für Mykobakterien. Von diesen 25 Proben enthielten 17 Proben den TBC, zwei Proben M. avium und zwei Proben den M. chelonae-abscessus-komplex. Bei vier Proben handelte es sich um andere NTM. Die anschließende Sequenzierung der LightCycler-Amplifikate ergab in drei Proben M. gastri / kansasii und in einer Probe M. gordonae. Von den 44 ZN-negativen Proben enthielten nach der ersten PCR- Reaktion vier Proben Mykobakterien. In drei Proben konnte der TBC nachgewiesen werden, während in einer Probe aus dem Amplifikat M. gastri / kansasii nachgewiesen wurde. Demnach konnte nach zwei Durchgängen in 24 von 29 Proben mit der PCR und anschließenden Schmelzpunktanalyse eine eindeutige Speziesdiagnose gestellt werden (82,7%). Bei den noch ausbleibenden fünf Proben konnte mit der Sequenzierung des 16S rrna-gens in vier Proben M. gastri / kansasii und in einer Probe M. gordonae nachgewiesen werden. In keinem Fall wurde ein Problem bei der Amplifikation der Inhibitionskontrolle beobachtet. Die Ergebnisse des Abschnitt I sind in der Tab. 4.5 zusammengefasst. Tab. 4.5: Ergebnisse des Abschnitts I der Studie Nordstadtkrankenhaus Routine-Diagnostik PCR-Analyse ZN-Färbung Sequenz 16S rrna-gen Genus Spezies 25 x positiv 29 x positiv 17 x TBC 20 x TBC 2 x M. avium 2 x M. avium 2 x M. chel. / absc.** 2 x M. chel. / absc. 1 x M. gordonae** 1 x M. gordonae* 3 x M. gastri / kans.** 4 x M. gastri / kans.* * nach Sequenzierung des 16 rrna-gens vom PCR-Amplifikat ** Analyse im NRZ

96 80 Ergebnisse Zusammengefasst wurden in dem Zeitraum mit Hilfe der etablierten Technik (ZN-Färbung AccuProbe Test) in 25 Proben Mykobakterien isoliert und mit der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse ebenfalls. Mit zwei unterschiedlichen PCR-Reaktionen konnte in 24 von 29 Proben eine eindeutige Speziesdiagnose gestellt werden Abschnitt II ( ) Es wurden alle MGIT-Kulturen untersucht, die ein positives Signal im Kulturautomaten gaben. Die Durchführung der Untersuchung entsprach den oben genannten Bedingungen während der zweiten Hauptstudie der MHH. 86 Kulturen erfüllten das Eingangskriterium. 39 Proben enthielten nach der ZN- Färbung säurefeste Stäbchen. Von diesen 39 Proben wurden 37 in der PCR positiv für Mykobakterien, zwei blieben negativ. Von diesen 37 Proben enthielten 27 Proben M. tuberculosis, eine Probe M. avium, drei Proben M. intracellulare, eine Probe M. malmoense, drei Proben M. xenopi und zwei Proben M. gordonae. Von den 47 ZN-negativen Proben enthielten nach der ersten PCR-Reaktion zwei Proben Mykobakterien. Eine Probe enthielt M. tuberculosis, während es sich bei der anderen Probe um ein NTM handelte. Die anschließende Sequenzierung des 16S rrna-gens ergab M. xenopi. Demnach konnte nach zwei Durchgängen in 29 von 39 Proben mit der PCR mit anschließenden Schmelzpunktanalyse eine eindeutige Speziesdiagnose gestellt werden (74,4%). Bei den noch ausbleibenden 10 Proben konnte mit der Sequenzierung des 16S rrna-gens in drei Proben M. intracellulare, in vier Proben M. xenopi, in zwei Proben M. gordonae und in einer Probe M. malmoense nachgewiesen werden. Das Ergebnis aus allen Proben, die säurefeste Stäbchen enthielten, wurde mit der PCR in 37 Proben bestätigt. Zwei Proben blieben negativ in der PCR-Reaktion. Die Diagnostik des Nordstadtkrankenhauses bestätigte diese beiden Fälle mit einem negativen Ergebnis in der Kultur und mit dem AccuProbe Test. Mit der Amplifikation und Schmelzpunktanalyse wurden jedoch zusätzlich zwei weitere Proben als positiv detektiert. In keinem Fall wurde ein Problem bei der Amplifikation der Inhibitionskontrolle beobachtet. Die Ergebnisse des Abschnitt II sind in der Tab. 4.6 zusammengefasst.

97 81 Ergebnisse Tab. 4.6: Ergebnisse des Abschnitts II der Studie Nordstadtkrankenhaus Routine-Diagnostik PCR-Analyse ZN-Färbung Sequenz 16S rrna-gen Genus Spezies 39 x positiv 39 x positiv 27 x TBC 28 x TBC davon 28 x M. tuberculosis 1 x M. avium 1 x M. avium 3 x M. intracellulare** 3 x M. intracellulare* 3 x M. xenopi** 4 x M. xenopi* 1 x M. malmoense** 1 x M. malmoense* 2 x M. gordonae** 2 x M. gordonae* 2 x negativ * nach Sequenzierung des 16 rrna-gens vom LightCycler-Amplifikat ** Analyse im NRZ Zusammengefasst wurden in dem Zeitraum mit Hilfe der etablierten Technik (ZN-Färbung AccuProbe Test) in 37 Proben Mykobakterien isoliert und mit der PCR und anschließenden Schmelzpunktanalyse bei erweiterten Einschlusskriterien in 39 Proben. Mit dem neuen Nachweisformat konnte in 29 von 39 Proben eine eindeutige Speziesdiagnose gestellt werden. 4.3 Direktnachweis von mykobakterieller DNA aus Patientenproben Von den wenigen schnellwachsenden Mykobakterien abgesehen, benötigt der Nachweis von Mykobakterien in den kommerziell erhältlichen Kulturautomaten mindestens neun bis vierzehn Tage. Aus diesem Grund war es wünschenswert, die diagnostische Lücke mit dem Nachweis aus dem Direktmaterial zu schließen (BÖTTGER 1991). An der MHH wird bei ausgesuchten Fällen der Nachweis von Mykobakterien aus Patientenmaterial in einem Direktnachweis mit Hilfe einer konventionellen PCR mit anschließender Sondenhybridisierung durchgeführt (vgl. Kapitel 2.6). Diese bisher verwendete Methode ist arbeitsintensiv und zeitaufwendig. Die Isolierung der DNA bis hin zum Nachweis der Mykobakterien mittels PCR und anschließender Sondenhybridisierung dauert 16 Stunden, insgesamt zwei Tage. Ein Nachweis von mykobakterieller DNA aus Direktmaterial mit dem neuen PCR- Format mit anschließender Schmelzpunktanalyse würde die Zeit des Nachweises erheblich verkürzen. Versuche, die mit der bereits etablierten DNA- Präparationsmethode isolierte DNA aus Patientenmaterialien nach der Amplifikation und Schmelzpunktanalyse mit Hilfe des LightCyclers nachzuweisen, schlugen fehl, da die Proben alle inhibiert waren. Es musste nach einer neuen Methode für die

98 82 Ergebnisse Präparation von Mykobakterien-DNA aus Patientenmaterialien gesucht werden, die eine möglichst hohe Sensitivität hat, aber gleichzeitig zeitsparend und kostengünstig ist. In diesem Kapitel wurden alle PCR-Reaktionen und die Schmelzpunktanalyse mit der genusspezifischen Sonde LC39/40 im F2-Kanal und mit der TBC-spezifischen Sonde 61/62 im F3-Kanal untersucht. Amplifiziert wurde das bp Fragment des 16S rrna-gens von Mykobakterien mit den Primern LC1 und LC4. Als Inhibitionskontrolle wurde pab2 in den jeweils angegebenen Kopienzahlen verwendet. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden bei den im Folgenden gezeigten Abbildungen nur die Ergebnisse der genusspezifischen Sonde im F2- Kanal gezeigt Präparation von Mykobakterien-DNA aus Patientenmaterial Einer der Kernpunkte hinsichtlich der Anwendung einer entsprechenden Technik ist die effiziente Extraktion von amplifizierbarer, genomischer DNA aus Mykobakterien in Abwesenheit von Inhibitoren. Dazu muss die rigide, lipopolysaccharidreiche Zellwand der Mykobakterien zerstört werden und gleichzeitig muss das Material von Inhibitoren befreit werden, die die anschließende Amplifikation hemmen. Im Verlauf dieser Arbeit wurden verschiedene kommerziell erhältliche Kits zur DNA- Präparation aus Patientenmaterial auf ihre Sensitivität, den Aufreinigungsgrad, Zeitdauer und Kosten getestet. Alle Protokolle zeigten Vor- und Nachteile. Die einzelnen Ergebnisse sollen hier nicht weiter aufgeführt werden. Säulensysteme, die die DNA an einer Silicagel-Membran binden und Proteine, andere Kontaminaten und Inhibitoren separieren, zeigten einen hohen Aufreinigungsgrad der Proben, d. h. Inhibitoren der Probe wurden bis auf einen geringen Anteil aus der Probe entfernt. Allerdings wurden hinsichtlich der Sensitivität bei der Präparation etwas schlechtere Werte erreicht, als bei Systemen, die die DNA durch Alkoholpräzipitation isolieren. Diese zeigten bessere Sensitivitäten, allerdings wurden mit dieser Methode nicht genügend Inhibitoren aus dem Patientenmaterial entfernt. Ein von der Fa. THERMOLABSYSTEMS entwickelter Kit zur Präparation genomischer DNA aus Patientenmaterialien (Genomic DNA Purification Kit) wurde schließlich für die Isolierung der DNA aus Patientenmaterial für den Nachweis mittels PCR und Schmelzpunktanalyse in dieser Arbeit ausgewählt. Die Proben werden mit einem speziellen Puffer, der chaotrope Salze enthält, lysiert und anschließend wird die DNA an die Oberfläche paramagnetischer Silicagelpartikel gebunden. Ungebundene Substanzen der Probe, wie Proteine und andere

99 83 Ergebnisse Inhibitoren, werden durch Waschschritte eliminiert. Die gereinigte DNA wird anschließend eluiert. Der Kit ist außerdem für die Anwendung am KingFisher ml Automaten der Fa. THERMOLABSYSTEMS entwickelt worden, einem automatisierten magnetischen Partikelprozessor. Im Weiteren wird die Verwendung des Genomic DNA Purification Kit in Zusammenarbeit mit dem KingFisher ml-automaten als KingFisher (KF)- System bezeichnet Titerbestimmung einer Bakterienkultur Für die Evaluierung der Versuchsparameter mit dem KF-Systems wurde eine Bakterienkultur von M. bovis BCG in 7H9-Medium bis zu einer OD 600 von 0,5 bebrütet und anschliessend wurde der Titer durch Ausstreichen von 10ner- Verdünnungsreihen auf 7H10-Platten bestimmt (vgl. Kapitel 3.3.1). Zuvor wurde die Bakterienkultur im Ultraschallbad behandelt, um eine Vereinzelung der Bakterien zu erreichen. Die ausgestrichenen Platten wurden bei 37 C bebrütet und anschließend wurden die gewachsenen Kolonien gezählt und der Titer rechnerisch ermittelt. Der errechnete Titer bildete die Grundlage zur Bestimmung der Bakterienanzahl bei den weiteren Versuchen. Als Stamm wurde eine Kultur von M. bovis BCG ausgewählt, da diese Spezies vom Aufbau der Zellwand M. tuberculosis sehr ähnlich ist, im Gegensatz aber ein attenuierter Organismus ist und unter geringeren Sicherheitsbedingungen bearbeitet werden konnte Überprüfung der Kreuzkontamination im King-Fisher-Automaten Bei der Untersuchung von mehreren Patientenproben gleichzeitig besteht die Gefahr der Übertragung von Material von Probe zu Probe, der sog. Kreuzkontamination. Zur Überprüfung der Kreuzkontamination innerhalb eines Durchgangs wurden die Positionen im KF-Automat abwechselnd mit einer hochpositiven Probe (5 x 10 5 Bakterien M. bovis BCG in TE-Puffer) an Position 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 und 15 und mit TE-Puffer als Negativkontrolle an Position 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 14 beladen. Das Programm wurde gestartet und die Präparation, wie vom Hersteller angegeben, durchgeführt. Jeweils 10 µl des Eluats wurden für die PCR eingesetzt, als Inhibitionskontrolle wurden 50 Kopien pab2 zu jeder Kapillare hinzugefügt.

100 84 Ergebnisse Abb. 4.12: Überprüfung der Positivkontrollen hinsichtlich der Kreuzkontamination eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von M. bovis BCG nach der Präparation mit dem KF-System In Abb sind die Eluate aller Positivkontrollen (schwarz unterlegt) nach der Detektion mit der genusspezifischen Sonde LC39/40 im F2-Kanal dargestellt. Die genusspezifische Sonde detektierte bei allen Positivkontrollen Mykobakterien bei 62 C. Die zugesetzte Inhibitionskontrolle ist bei keiner Probe zu sehen, da sie mit 50 Kopien im Verhältnis zu eingesetzten Bakterien vom Mykobakterien-Signal überlagert wurde. Um zu überprüfen, ob bei den mit den Negativkontrollen belegten Plätzen Kreuzkontaminationen auftraten, wurden in der Abb nur die mit Puffer belegten Plätze (schwarz unterlegt) nach der Detektion mit der genusspezifischen Sonde gezeigt. Abb. 4.13: Überprüfung der Negativkontrollen hinsichtlich der Kreuzkontamination eingesetzte Sonde: genusspezifische Sonde LC39/40 eingesetzte DNA: Plasmid-DNA der Inhibitionskontrolle pab2 mit 50 Kopien

101 85 Ergebnisse Bei allen Negativkontrollen zeigte sich lediglich für die Inhibitionskontrolle pab2 bei 48 C ein Schmelzpunkt für eine erfolgreiche Amplifikation. Mykobakterien wurden in keiner der Negativkontrollen detektiert. Um außerdem eine Kreuzkontamination zwischen zwei nacheinanderfolgenden Präparationen mit dem KF-System zu überprüfen, wurde gleich nach der ersten Präparation eine weitere mit dem Automaten durchgeführt. Dabei wurden die Plätze, die im ersten Durchgang mit den Positivkontrollen belegt waren, mit Negativkontrollen (TE-Puffer) belegt und umgekehrt. Die Durchführung erfolgte wie oben beschrieben. Auch bei diesem Versuch zeigten sich keine Anzeichen von einer Kreuzkontamination (Daten hier nicht gezeigt). Eine Übertragung von Mykobakterien während der Präparation von einer Position zur anderen durch das Gerät konnte damit, wie von der Fa. THERMOLABSYSTEMS versichert, ausgeschlossen werden. Ein Versuch der Fa. THERMOLABSYSTEMS hinsichtlich der Kreuzkontamination im KF- Automaten ist im Anhang in Kapitel 8.3 abgebildet Verbesserung der Sensitivität bei der Präparation von Mykobakterien-DNA aus Patientenmaterial Die Versuche zur Sensitivität wurden immer mit Doppelwerten durchgeführt und mindestens dreimal wiederholt. Dafür wurden Patientenmaterialien (Sputen) aus der mikrobiologischen Routinediagnostik der MHH verwendet, die negativ für Mykobakterien waren. Musste ein Sputum für einen Versuch mehrmals aufgeteilt werden, so wurden mehrere dekontaminierte Sputen miteinander gemischt, um gleiche Bedingungen für jede Probe zu simulieren. Diesen Proben wurde eine bestimmte Anzahl an Bakterien M. bovis BCG zugefügt. Bei allen Präparationen wurde als Negativkontrolle für die Präparation das gleiche Sputum wie für die mit Mykobakterien versetzten Proben verwendet. Pro maximal 15 präparierte Proben wurde eine Negativkontrolle eingesetzt. Für die PCR-Reaktion wurden jeweils 10 µl der präparierten DNA eingesetzt, das entspricht einem Zehntel des Elutionsvolumens. Wurden für die Präparation 500 Bakterien pro ml Sputum eingesetzt, so wurde in den dargestellten Abbildungen von einer 100%igen Ausbeute bei der Präparation ausgegangen. Bei eingesetzten 10 µl für die PCR-Reaktion entsprachen damit 500 Bakterien pro Milliliter Sputum 50 Bakterien pro PCR-Reaktion.

102 86 Ergebnisse Es wurde immer eine Positivkontrolle (genomische DNA von M. tuberculosis) und eine Negativkontrolle (H 2 O) mitgeführt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden die Schmelzpunkte der Positiv- und Negativkontrollen in den folgenden Abbildungen weggelassen. Die Abbildungen zeigen jeweils ein repräsentatives Ergebnis der durchgeführten Wiederholungen. Die Wiederholungen der gezeigten Versuche sind im Anhang in Tab. 8.4, Tab. 8.5 und Tab. 8.6 aufgeführt Verwendung von Lysozym zur Lyse der Zellwand Die Lyse der Zellwand wurde durch den im Kit vorhandenen Lysispuffer erreicht. Durch Präinkubation mit dem Enzym Lysozym kann die Lyse verstärkt werden, insbesondere bei Bakterien mit mehrschichtigen, rigiden Zellwänden. In Vorversuchen wurde bereits die Verwendung von Lysozym zur Lyse der Zellwand bei Mykobakterien getestet. Es zeigten sich deutliche Verbesserungen der Präparationsausbeute bei Verwendung des Enzyms. Dabei wurde eine Lysozym- Lösung mit einer Konzentration von 100 mg/ml eingesetzt. In dieser Arbeit soll nun die Auswirkung verschiedener Einwirkungszeiten der Lysozym-Lösung auf die Probe getestet werden. Für Mykobakterien negative Sputen wurden mit NaOH-NALC dekontaminiert und es wurde jeweils 1 ml jeder Probe in ein Mikroschraubgefäß abgefüllt. Die dekontaminierten Proben wurden mit bestimmten Mengen an M. bovis BCG (500 Bakterien, 250 Bakterien und 100 Bakterien M. bovis BCG pro Milliliter Sputum) versehen. Anschließend wurde jede Probe bei x g für 20 Minuten zentrifugiert, das Pellet in 100 µl Lysozym-Lösung gelöst und bei 37 C inkubiert. Dabei wurde die Einwirkdauer von einer Stunde, zwei und drei Stunden miteinander verglichen. Die Präparation mit magnetischen Silicapartikeln wurde nach Protokoll des Herstellers weitergeführt. Die eluierte DNA wurde amplifiziert und nach der Schmelzpunktanalyse überprüft. Die Abb. 4.14, Abb und Abb zeigen die Auswirkung von ein, zwei und drei Stunden Inkubationszeit mit Lysozym-Lösung auf die Probe bei 500, 250 und 100 eingesetzten Bakterien pro Milliliter Sputum (50, 25 und 10 Bakterien pro PCR- Reaktion).

103 87 Ergebnisse Abb. 4.14: Verschiedene Inkubationszeiten mit Lysozym bei 50 Bakterien BCG eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von 50 Bakterien M. bovis BCG pro PCR- Reaktion nach Präparation mit magnetischen Silicapartikeln Abb. 4.15: Verschiedene Inkubationszeiten mit Lysozym bei 25 Bakterien BCG eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von 25 Bakterien M. bovis BCG pro PCR- Reaktion nach Präparation mit magnetischen Silicapartikeln

104 88 Ergebnisse Abb. 4.16: Verschiedene Inkubationszeiten mit Lysozym bei 10 Bakterien BCG eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von 10 Bakterien M. bovis BCG pro PCR- Reaktion nach Präparation mit magnetischen Silicapartikeln Eine längere Inkubation mit Lysozym (zwei bzw. drei Stunden) auf das Probenmaterial wirkte sich vor allem im unteren Sensitivitätsbereich positiv auf die Präparationsausbeute aus. Hier konnten mit längerer Inkubation (drei Stunden) bessere Ergebnisse erzielt werden. Die Höhe der Präparationsausbeute bei längerer Inkubationszeit war jedoch im Verhältnis zur Präparationsdauer nicht gravierend. Die erreichte Sensitivität von 250 Bakterien pro Milliliter Sputum wurde im Hinblick auf die Präparationsdauer als ausreichend angesehen. Für die weiteren Versuche wurde zunächst eine Präinkubation von zwei Stunden mit Lysozym auf das Probenmaterial ausgewählt Anwendung von Proteinase K Die Zugabe von einer Protease ermöglicht den Verdau zellulärer Proteinkomponenten und somit eine verbesserte Isolierung der DNA. Zudem gelingt mit Hilfe der Proteinase K die Zerstörung einiger Inhibitoren. Für die Verwendung bei SDS-haltigen Puffern wird Proteinase K empfohlen, diese hat ihr Wirkungsoptimum bei einer Temperatur von C. In diesem Versuch sollte geklärt werden, ob die Zugabe von Proteinase K zu einem verbesserten Ergebnis bei der Präparation führt. Dafür wurden Sputen wie oben beschrieben dekontaminiert und mit einer bestimmten Anzahl Bakterien versehen. Jeder Ansatz wurde abzentrifugiert, das Pellet in 100 µl Lysozym-Lösung gelöst und bei 37 C für zwei Stunden inkubiert.

105 89 Ergebnisse Um die Wirkungsintensität der Proteinase K zu verbessern, wurden 750 µl der Lysispuffer schon vor dem Start der Präparation im Automaten zur Probe gegeben und zusammen mit 3 µl Proteinase K-Lösung (20 mg/ml) bei 56 C inkubiert. Als Zeitdauer wurden dreißig Minuten gewählt, als Bezug dienten dabei Empfehlungen verschiedener Anleitungen zur Isolierung genomischer DNA. Ebenso wurde mit den Vergleichsansätzen verfahren, nur wurde hier keine Proteinase K-Lösung zugefügt. Verglichen wurde in den Abb. 4.17, Abb und Abb die Ausbeute bei Zugabe von 500, 250, 100 und 30 Bakterien pro Milliliter Sputum mit und ohne Zusatz von Proteinase K-Lösung (50, 25 und 10 Bakterien pro PCR-Reaktion). Es wurden jeweils 10 µl der eluierten DNA zum Nachweis für die PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse eingesetzt. Abb. 4.17: Auswirkung beim Einsatz von Proteinase K bei 50 Bakterien BCG eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von 50 Bakterien M. bovis BCG pro PCR- Reaktion nach Präparation mit magnetischen Silicapartikeln

106 90 Ergebnisse Abb. 4.18: Auswirkung beim Einsatz von Proteinase K bei 25 Bakterien BCG eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von 25 Bakterien M. bovis BCG pro PCR- Reaktion nach Präparation mit magnetischen Silicapartikeln Abb. 4.19: Auswirkung beim Einsatz von Proteinase K bei 10 Bakterien BCG eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von 10 Bakterien M. bovis BCG pro PCR- Reaktion nach Präparation mit magnetischen Silicapartikeln Durch Zugabe von Proteinase K konnten die Präparationsausbeuten bei den eingesetzten Bakterienmengen pro Milliliter Sputum deutlich erhöht werden. Proteinase K erhöhte reproduzierbar die Sensitivität auf 100 Bakterien pro Milliliter Sputum. Ohne den Zusatz von Proteinase K lag die Sensitivität weiterhin bei 250 Bakterien pro Milliliter, unterhalb von 100 Bakterien pro Milliliter Sputum gelang auch mit Zusatz von Proteinase K keine reproduzierbare Darstellung.

107 91 Ergebnisse Reduktion der Inkubationszeit bei paralleler Verwendung von Lysozym und Proteinase K In diesem Versuch sollte überprüft werden, ob die verbesserte Sensitivität durch Zugabe von Proteinase K-Lösung eine reduzierte Inkubationszeit mit Lysozym- Lösung erlaubt, um das Verfahren für die Anwendung in der Routinediagnostik in möglichst kurzer Zeit durchführbar zu machen. Dafür wurden wiederum verschiedene Mengen an Bakterien (500, 250 und 100 Bakterien M. bovis BCG) pro Milliliter dekontaminiertem Sputum mit Lysozym-Lösung für ein bzw. zwei Stunden bei 37 C inkubiert und anschließend mit Proteinase K-Lösung für dreißig Minuten bei 56 C versetzt. Die isolierte DNA wurde amplifiziert. Die Ergebnisse sind in den Abb. 4.20, Abb und Abb dargestellt. Abb. 4.20: Kombinierte Anwendung von Lysozym und Proteinase K bei 50 Bakterien BCG eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von 50 Bakterien M. bovis BCG pro PCR- Reaktion nach Präparation mit magnetischen Silicapartikeln

108 92 Ergebnisse Abb. 4.21: Kombinierte Anwendung von Lysozym und Proteinase K bei 25 Bakterien BCG eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von 25 Bakterien M. bovis BCG pro PCR- Reaktion nach Präparation mit magnetischen Silicapartikeln Abb. 4.22: Kombinierte Anwendung von Lysozym und Proteinase K bei 10 Bakterien BCG eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/40 genomische DNA von 10 Bakterien M. bovis BCG pro PCR- Reaktion nach Präparation mit magnetischen Silicapartikeln Eine längere Inkubationszeit von zwei Stunden mit Lysozym-Lösung brachte keine wesentliche Verbesserung der Sensitivität bei gleichzeitiger Anwendung von Proteinase K-Lösung gegenüber einer Stunde. Es gelang für beide Inkubationszeiten (ein und zwei Stunden) der reproduzierbare Nachweis von 100 Bakterien pro Milliliter Sputum, bei gleichzeitiger Verwendung von Proteinase K-Lösung. Aus Gründen der Praktikabilität entschieden wir uns für eine Stunde Lysozyminkubation, da die Präparationsmethode für die Anwendung in der Routinediagnostik möglichst

109 93 Ergebnisse zeitsparend gestaltet werden sollte und damit eine schnelle Diagnose möglich sein sollte Anwendung der Inhibitionskontrolle beim Direktnachweis In der Arbeit von LACHNIK und Mitarbeitern (2002) wurde der Einsatz von 50 Kopien der Inhibitionskontrolle in Gegenwart von 100 ng Fremd-DNA als akzeptabel erachtet. In diesem in vitro getestetem Amplifikationssystem waren damit noch 10 Genome von Mykobakterien detektierbar. Da Inhibitionskontrolle und Probe beide Träger der zu detektierenden Zielstruktur sind, stehen sie in Konkurrenz zueinander. Das Ziel war es in diesem Abschnitt der Arbeit, eine Anzahl an eingesetzten Kopien der Inhibitionskontrolle für jede Probe festzulegen, mit der die Sensitivität der nachzuweisenden Proben-DNA möglichst wenig vermindert würde, aber gleichzeitig die Signalstärke des Kontrollplasmids in den Proben bei einer Intensität zu halten, bei der nicht zu viele Proben als inhibiert gewertet werden müssen. Die Anwendung von 50 Kopien der Inhibitionskontrolle pab2 pro Probe erwies sich in durchgeführten Versuchen mit klinischen Materialien als zu wenig. Das Signal war entweder nur schwach oder gar nicht zu sehen (Daten nicht gezeigt). Um zu testen, welche Sensitivitäten bei Verwendung von 200 Kopien Kontrollplasmid erreicht werden können, wurden dekontaminierte Sputen, die sicher negativ für Mykobakterien waren, mit Hilfe des KF-Systems präpariert. 10 µl der eluierten DNA jeder Probe wurden in der darauffolgenden Amplifikation und Schmelzpunktanalyse mit 200 Kopien pab2 und verschiedenen Genomkopien von M. bovis BCG versetzt. Der Einsatz von Genomkopien wurde in diesem Abschnitt der Arbeit verwendet, um eine möglichst genaue Bestimmung der eingesetzten Mykobakterien-DNA zu ermöglichen und Verluste, die während der Präparation von Bakterien aus Direktmaterial auftreten, auszuschließen. Es wurde die Sensitivität von 1000, 300, 100 und 30 Genomen von M. bovis BCG bei gleichzeitig 200 eingesetzten Kopien pab2 getestet.

110 94 Ergebnisse Abb. 4.23: Sensitivität der Proben-DNA beim Einsatz von 200 Kopien pab2 eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/ , 300, 100 und 30 Kopien genomische DNA von M. bovis BCG und jeweils 200 Kopien pab2 als Inhibitionskontrolle Bei dem Einsatz von 200 Kopien pab2 war in allen Proben ein deutliches Signal der Inhibitionskontrolle bei 48 C zu sehen. Es konnten bis zu 100 Kopien Mykobakterien reproduzierbar detektiert werden, 30 Kopien waren nicht reproduzierbar bei 200 Kopien eingesetzter Inhibitionskontrolle detektierbar. Um zu vergleichen, wie sich der Einsatz von 100 Kopien pab2 auf die Sensitivität der zu detektierenden Mykobakterien auswirken, wurde der gleiche Versuch, wie in Abb beschrieben, mit 100 Kopien pab2 durchgeführt. Abb. 4.24: Sensitivität der Proben-DNA beim Einsatz von 100 Kopien pab2 eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: genusspezifische Sonde LC39/ , 300, 100 und 30 Kopien genomische DNA von M. bovis BCG und jeweils 100 Kopien pab2 als Inhibitionskontrolle

111 95 Ergebnisse Der Einsatz von 100 Kopien pab2 brachte keine deutliche Verbesserung der Signalstärke bei Mykobakterien. 30 Kopien M. bovis BCG waren nicht reproduzierbar nachweisbar. Das Detektionssignal der Inhibitionskontrolle war in allen Proben deutlich schwächer als bei 200 eingesetzten Kopien. Da eine Verringerung der Kontrollplasmidmenge keinen deutlichen Erfolg bei der Detektion der Mykobakterien brachte, wurde auf eine Verringerung der Plasmidmenge verzichtet Anwendung des Direktnachweisformats Der in diesem Abschnitt der Arbeit entwickelte Direktnachweis für Mykobakterien- DNA aus Patientenmaterial mit Hilfe der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse sollte nun an einigen klinischen Proben hinsichtlich Sensitivität und Spezifität getestet werden. Dafür wurden im ersten Abschnitt Proben von einem Patienten verwendet, der klinisch an einer Larynx-Tuberkulose erkrankt und mehrere Wochen in der MHH in Behandlung war. Die Proben stammten aus Oktober Im zweiten Abschnitt wurden Proben von CF-Patienten aufgearbeitet und untersucht, die im Zeitraum der Jahre in der Routinediagnostik der MHH auf Mykobakterien untersucht und aufbewahrt wurden. Bei beiden Studien handelte es sich um eine retrospektive Analyse Interpretation der Ergebnisse der Schmelzpunktanalyse Als positives Signal wurde jeder Peak, der über die Nulllinie hinausging und bei der entsprechenden spezifischen Temperatur lag, gewertet. Als positiv für Mykobakterien wurden alle Proben bewertet, die ein Signal mit der genusspezifischen Sonde bei der spezifischen Temperatur von 61,5 C zeigten, unabhängig vom Ergebnis der Inhibitionskontrolle. Proben, die kein Signal für Mykobakterien zeigten, allerdings ein positives Signal bei der spezifischen Temperatur für die Inhibitionskontrolle (48 C), wurden als negativ beurteilt. Alle Proben, die weder für die Zielstruktur noch für die Inhibitionskontrolle ein positives Signal zeigten, wurden als inhibiert beurteilt. Von allen Proben, die positiv für Mykobakterien waren, wurde anschließend im F3- Kanal das Ergebnis der TBC-spezifischen Sonde beurteilt. Auch hier wurde jedes positive Signal bei der entsprechenden spezifischen Temperatur von 67 C als positiv für den TBC gewertet.

112 96 Ergebnisse Ein negatives Ergebnis für den TBC lag vor, wenn kein Signal bei der entsprechenden Temperatur zu erkennen war. In diesem Fall lagen in der Probe NTM vor und sie wurde entsprechend beurteilt. Tab. 4.7: Interpretation der Ergebnisse der Schmelzpunktanalyse aus Direktmaterial Genus III 61,5 C Inhibitionskontrolle 48 C TBC 67 C Beurteilung (Diagnose) + + / - + TBC + + / - - NTM negativ inhibiert Anwendung an Proben mit tuberkulösen Mykobakterien Für diesen Abschnitt der Studie wurde respiratorisches Material (Sputum) über einen Zeitraum von zwei Monaten von einem Patienten gesammelt, der aufgrund einer Larynx-Tuberkulose in der MHH in Behandlung war. Das Material wurde zunächst bei -20 C ohne weitere Bearbeitung gelagert. Anschließend wurde jede Probe aufgetaut und mit NaOH-NALC dekontaminiert. Von jeder dieser dekontaminierten Proben wurde ein Direktausstrich angefertigt, mit Auramin gefärbt und mikroskopisch auf säurefeste Stäbchen untersucht. Gleichzeitig wurde ein MGIT-Kulturröhrchen sowie ein Löwenstein-Jensen-Nährboden mit dem Material beimpft und inkubiert. 500 µl jeder Probe wurden für den Direktnachweis abgefüllt, die Lagerung erfolgte bei 20 C. Als Negativkontrollen für die Präparation wurden dekontaminierte Proben von Patienten aus dem gleichen Zeitraum verwendet, die sich in der Routinediagnostik als negativ für Mykobakterien herausgestellt hatten (sowohl in der Kultur als auch im Direktpräparat). Diese Proben wurden mit dem KF-System nach dem in Kapitel modifizierten Protokoll aufgearbeitet und mit dem Direktnachweisformat untersucht. Die Belegung der Plätze im Automaten erfolgte abwechselnd mit einer positiven und einer negativen Probe, um eventuelle Kreuzkontaminationen während der Präparation festzustellen. Als Positivkontrollen für die Präparation wurden die Proben des Patienten angesehen, da dieser im Rahmen der Untersuchungen der Routinediagnostik in regelmäßigen Abständen kulturell und mikroskopisch als positiv für den TBC getestet wurde. 10 µl der eluierten DNA wurden für die anschließende PCR-Reaktion verwendet. Als Positivkontrolle wurde genomische DNA von M. tuberculosis und als Negativkontrolle

113 97 Ergebnisse Wasser pro Lauf verwendet. In jeder Probe wurden 200 Kopien pab2 als Inhibitionskontrolle für die Amplifikation mitgeführt. Amplifiziert wurde das 16S rrna-gen mit den Primern LC1 und LC4. Detektiert wurde mit der genusspezifischen Sonde LC39/40 im F2-Kanal auf Mykobakterien und mit der TBC-spezifischen Sonde LC61/62 im F3-Kanal auf das Vorliegen des TBC. 16 Proben des Patienten zeigten im Direktausstrich säurefeste Stäbchen und wurden in der Kultur positiv für Mykobakterien. Von den 16 positiven Proben war eine Probe, von den Negativkontrollen war ebenfalls eine Probe in der Amplifikation inhibiert. Diese Proben wurden bei der Auswertung (vgl. Abb. 4.25) nicht berücksichtigt. Die Inhibitionsrate lag bei 32 untersuchten Proben bei 6,25%. Alle 15 im Direktausstrich und in der Kultur positiven Proben wurden in der durchgeführten Amplifikation mit anschließender Schmelzpunktanalyse sowohl mit der genusspezifischen Sonde als auch mit der TBC-spezifischen Sonde positiv. Von den 15 negativen Proben wurden 15 als negativ für Mykobakterien detektiert. PCR positiv PCR negativ Kultur positiv 15 (A) 0 (C) Sensitivität A/(A+C) Kultur negativ 0 (B) 15 (D) Spezifität D/(D+B) Abb. 4.25: Sensitivität und Spezifität für die Untersuchung tuberkulöser Proben Die Sensitivität für den Direktnachweis für Mykobakterien lag in diesem Fall bei 100%, die Spezifität des Tests ebenfalls bei 100%. Alle Proben enthielten im Direktausstrich säurefeste Stäbchen Anwendung an Proben mit nichttuberkulösen Mykobakterien Für die Untersuchung im zweiten Abschnitt waren respiratorische Proben (Sputum, Bronchoalveolarlavage, Bronchialsekret, Trachealsekret) von CF-Patienten der MHH über zwei Jahre ( ) gesammelt worden. Diese waren bereits mit NaOH- NALC dekontaminiert worden und wurden bei -20 C gelagert. Die Proben, die sich in der Routinediagnostik als positiv für Mykobakterien bestätigt hatten (in der Kultur

114 98 Ergebnisse und/oder im Direktausstrich), wurden mit dem KF-System aufgearbeitet und mit dem Direktnachweisformat untersucht. Es handelte sich bei den positiven Proben ausnahmslos um atypische Mykobakterien, diagnostiziert durch Sequenzierung des 16S rrna-gens. Als Negativkontrollen bei der Präparation wurden Proben von CF-Patienten aus dem gleichen Zeitraum ausgewählt, die sicher negativ für Mykobakterien waren (im Direktausstrich und in der Kultur). Die Durchführung der Präparation sowie der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse erfolgte wie in Kapitel beschrieben. Insgesamt wurden 74 für Mykobakterien kulturell positive Proben und 74 negative Proben präpariert und anschließend in der PCR amplifiziert. Von den positiven Proben blieben sechs Proben, bei den negativen Proben drei inhibiert. Diese wurden in der folgenden Auswertung nicht berücksichtigt. Die Inhibitionsrate lag damit bei 6,1%. Von den 68 kulturell positiven Proben wurden 39 Proben positiv für Mykobakterien. Die TBC-spezifische Sonde zeigte für keine der Proben ein Signal, es handelte sich um NTM. 29 Proben blieben nach der Amplifikation und Schmelzpunktanalyse negativ für Mykobakterien. Von den 71 negativen Kulturen blieben 71 nach der PCR negativ für Mykobakterien. PCR positiv PCR negativ Kultur positiv Kultur negativ Abb. 4.26: Sensitivität und Spezifität für alle untersuchten Proben Die Sensitivität für den Direktnachweis von Mykobakterien lag im Vergleich zu den positiven Kulturen bei 66,7%, die Spezifität des Tests bei 100%. Daraufhin wurden von den 68 kulturell positiven Proben nur die betrachtet, die gleichzeitig im Direktpräparat säurefeste Stäbchen zeigten. 18 Proben waren im Direktausstrich positiv für säurefeste Stäbchen. Diese wurden nach der Präparation mit 18 für Mykobakterien negativen Proben untersucht. Von den positiven Proben war keine Probe inhibiert, bei den negativen Proben blieben zwei Proben inhibiert. Die Inhibitionsrate lag bei 5,5%.

115 99 Ergebnisse PCR positiv PCR negativ Kultur positiv Kultur negativ Abb. 4.27: Sensitivität und Spezifität für alle untersuchten Proben, die säurefeste Stäbchen im Direktausstrich zeigen Von den 18 positiven Proben wurden 16 nach der PCR positiv für atypische Mykobakterien, zwei blieben negativ. Von den 16 negativen Proben blieben 16 nach der PCR negativ für Mykobakterien. In diesem Fall ergab sich eine Sensitivität von 88,9%, die Spezifität des Tests lag bei 100%. 4.4 Unterscheidung innerhalb des M. tuberculosis-komplexes Die zum TBC gehörenden Spezies M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. bovis, M. bovis caprae und M. bovis BCG sind in der Sequenz des 16S rrna-gens identisch und somit nicht durch Sequenzierung voneinander zu unterscheiden. Die Unterscheidung der einzelnen Spezies des TBC erfolgt meistens durch phänotypische Charakterisierung, wie Koloniemorphologie, Wachstumsgeschwindigkeit und mit Hilfe biochemischer Tests. Aufgrund der langsamen Wachstumsgeschwindigkeit und der engen genetischen Verwandtschaft ist die Speziesidentifizierung schwierig und zeitaufwendig. Mit Hilfe der PCR und anschließender Schmelzpunktanalyse wurde in dieser Arbeit versucht, eine Methode zu finden, um die drei klinisch bedeutsamsten Spezies des TBC (M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG) zu identifizieren. Dafür wurde eine Reihe von neuen Sondenpaaren für den Nachweis entwickelt und getestet. Es sollen hier nur die endgültigen Versionen aufgeführt werden. Die errechneten spezifischen Schmelzpunkte und Standardabweichungen für die neu entwickelten Sonden beziehen sich auf die jeweilig angewendete Präparationsmethode und das damit verbundene Elutionsmedium. Proben, die mit einer anderen Methode aufgearbeitet wurden, können in ihrem Schmelzpunkt geringgradig abweichen.

116 100 Ergebnisse Identifizierung von M. tuberculosis Eine weit verbreitete Methode, M. tuberculosis von den anderen Mitgliedern des TBC zu unterscheiden, ist die Bestimmung der Nitratreduktase-Aktivität. M. tuberculosis ist in der Lage, Nitrat in kurzer Zeit zu Nitrit zu reduzieren. Die anderen Spezies des TBC besitzen nur eine schwache Aktivität oder sind dazu nicht in der Lage (METCHOCK et al. 1999). Die Messung dieser Nitritakkumulation ermöglicht damit die Differenzierung von M. tuberculosis von den anderen Spezies des TBC. Der molekulare Mechanismus für diese Reaktion war bisher nicht bekannt. Eine bekannte Nitratreduktase ist die respiratorische Nitratreduktase, die durch das Gen narghji codiert wird. Alle Spezies des TBC sind im Besitz dieser Nitratreduktase. Um die Gründe der unterschiedlichen Aktivität bei den einzelnen Spezies des TBC zu untersuchen, wurde der Promotorbereich von narghji bei M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG in unserem Labor durch eine Sequenzanalyse näher betrachtet. Dabei zeigte sich in der Promotorregion von narghji bei M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG ein Basenunterschied an Position M. tuberculosis trägt an dieser Stelle ein Thymin (T), während die bovinen Mykobakterien an dieser Stelle ein Cytosin (C) in ihrer Sequenz aufweisen. Ziel war es, diesen Unterschied als molekularen Marker zur Diagnostik von M. tuberculosis zu nutzen. Abb. 4.28: Sequenzvergleich vom Promotorbereich narghji von tuberkulösen und bovinen Mykobakterien (Ausschnitt) In der Sequenzanalyse der Promotorregion narghji zeigt sich bei M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG ein T/C-Polymorphismus. Jede Homologie in der Basenabfolge ist durch einen Punkt gekennzeichnet. Auf der Grundlage von Abb wurde zur Unterscheidung von M. tuberculosis von den anderen Mitgliedern des TBC eine Sonde entwickelt, die diesen Unterschied detektiert Entwicklung einer Sonde zur Detektion des T/C-Polymorphismus Als Template wurde für alle Versuche in diesem Kapitel, soweit keine anderen Angaben gemacht, die genomische DNA von M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. bovis, M. bovis BCG, sowie von M. canetti und M. bovis caprae

117 101 Ergebnisse mechanisch mit Glasperlen aus einer MGIT-Kultur isoliert und direkt für die PCR- Reaktion verwendet. Als Negativkontrolle wurde Wasser benutzt. Mit den beiden Primerpaaren LC66 und LC67 wurde ein 154 bp großes Fragment im Promotorbereich von narghji amplifiziert, welches den T/C-Polymorphismus an Position -215 enthielt. Als Ankersonde wurde eine Sonde entwickelt, die zu den in Abb gezeigten Mitgliedern des TBC eine hundertprozentige Homologie hat. LC63: 5`-GTC GCC ACG CGT CCA GAA AAC C-3` (22 bp) Ankersonde, Fluoreszein-markiert Zur Detektion des T/C-Polymorphismus wurde eine Sonde entworfen, die den Basenaustausch durch unterschiedliche Schmelzpunkte detektieren sollte. LC65: 5`-CGT AAT CGC TAC GGG CAT-3` (18 bp) Detektionssonde, LCRed 640 markiert An der entsprechenden Stelle trug die Detektionssonde LC65 ein Adenin (A) und hatte damit an der Position des T/C-Polymorphismus für M. tuberculosis (A-T) eine hundertprozentige Übereinstimmung, während sie für die restlichen Mitglieder des TBC eine Fehlbase zur Sequenz hatte (A-C). Abb. 4.29: Promotorsonde LC65 zur Identifizierung von M. tuberculosis eingesetzte Sonde: Promotorsonde LC63/65 eingesetzte DNA: genomische DNA von M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. bovis, M. bovis caprae, M. bovis BCG

118 102 Ergebnisse Bei der anschließenden Schmelzkurvenanalyse schmolz die Sonde LC65 für M. africanum, M. microti, M. canetti, M. bovis, M. bovis caprae, M. bovis BCG bei einer Temperatur von 58 C von der Zielstruktur ab, während der Schmelzpunkt für M. tuberculosis bei einer vollständigen Übereinstimmung zur Sondensequenz bei einer Temperatur von 63 C lag (vgl. Abb. 4.29). Der Mittelwert für den spezifischen Schmelzpunkt von M. tuberculosis lag für die Sonde LC63/65 bei 62,3 C, die berechnete Standardabweichung betrug 0,29 C (n=10). Um zu testen, ob ein Basenaustausch in der Detektionssonde zu einem noch größeren Abstand zwischen den Schmelzpunkten von M. tuberculosis und den anderen Spezies des TBC führen würde, wurde eine weitere Sonde entwickelt, die eine Fehlbase zur Sequenz von M. tuberculosis hatte und zu den anderen Mitgliedern eine hundertprozentige Homologie. LC64: 5`-CGT GAT CGC TAC GGG CAT` (18 bp) Detektionssonde, LCRed 640 markiert An der Stelle des Basenaustausches trug LC64 ein Guanin (G) und hatte damit an der Position des Basenunterschieds für M. tuberculosis eine Fehlbase (G-T), während für die Sequenz der bovinen Mykobakterien eine hundertprozentige Homologie vorlag (G-C). Die 2+4 Regel ließ aufgrund der G-C-Bindung bei einer hundertprozentigen Homologie einen größeren Temperaturunterschied gegenüber der Sonde LC65 erwarten. Abb. 4.30: Promotorsonde LC64 zur Identifizierung von M. tuberculosis eingesetzte Sonde: eingesetzte DNA: Promotorsonde LC63/64 genomische DNA von M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. bovis, M. bovis caprae, M. bovis BCG

119 103 Ergebnisse Bei der anschließenden Schmelzpunktanalyse schmolz die Sonde LC64 für M. africanum, M. microti, M. canetti, M. bovis, M. bovis caprae und M. bovis BCG bei einer Temperatur von 63 C ab. Dies wies auf eine hundertprozentige Übereinstimmung zur Sondensequenz bei diesen Spezies hin. Der Schmelzpunkt für M. tuberculosis lag bei 56,5 C, was auf die Fehlbase mit der Sonde hinwies und somit zu einem niedrigeren Schmelzpunkt führte. Der Abstand von M. tuberculosis zu den übrigen Spezies des TBC betrug 6 C (vgl. Abb. 4.30) und war damit gegenüber der Sonde LC65 deutlich vergrößert. Die Base Thymin an der Position -215 im narghji-promotorereich schien demnach ein eindeutiger, spezifischer Nachweis für M. tuberculosis zu sein. Der Mittelwert für den spezifischen Schmelzpunkt von M. tuberculosis lag für die Sonde LC63/64 bei 56,8 C, die berechnete Standardabweichung betrug 0,24 C (n=10). Um eine deutliche Identifizierung von M. tuberculosis zu ermöglichen, wurde die Sonde LC64 für die weitere Diagnostik verwendet und wird im weiteren Verlauf dieser Arbeit als M. tuberculosis-sonde bezeichnet Spezifität der neuen M. tuberculosis-sonde LC64 Um die Spezifität der neuen M. tuberculosis-sonde hinsichtlich anderer Mykobakterien zu überprüfen, wurde die genomische DNA von NTM mit dieser Sonde getestet. Insgesamt wurde die genomische DNA von 35 NTM überprüft, gezeigt werden hier nur die Daten aus einer Reaktion (Abb. 4.31). Abb. 4.31: Spezifität der M. tuberculosis-sonde LC64 mit nichttuberkulösen Mykobakterien eingesetzte Sonde: M. tuberculosis-sonde LC63/64 eingesetzte DNA: genomische DNA von M. tuberculosis und 30 NTM

120 104 Ergebnisse Lediglich die DNA von M. tuberculosis wurde mit den Primern LC66 und LC67 amplifiziert und bei der entsprechenden Temperatur detektiert. Alle NTM wurden nicht amplifiziert und detektiert. Die verwendete genomische DNA war zuvor mit der genusspezifischen Sonde LC39/40 auf Mykobakterien überprüft worden und zeigte bei allen Spezies ein spezifisches Signal für Mykobakterien (Daten hier nicht gezeigt). Die Sonde LC64 war damit spezifisch für die Identifizierung von M. tuberculosis Identifizierung von bovinen Mykobakterien Bovine Mykobakterien unterscheiden sich durch einen A/G-Polymorphismus in einem 410 bp großen Fragment des oxyr-pseudogens von den anderen TBC-Mitgliedern (SREEVATSAN et al. 1996). Eine automatisierte Sequenzanalyse von mehr als 100 TBC-Isolaten ergab, dass die bovinen Mykobakterien an der Position 285 ein Adenin besitzen, während die anderen Spezies an dieser Stelle ein Guanin in der Sequenzabfolge zeigen. Bovine Mykobakterien waren damit von den anderen Spezies des TBC zu unterscheiden. Auf der Grundlage von Abb wurde eine Sonde zur Detektion des A/G- Polymorphismus entwickelt. Für die Ankersonde wurde wieder eine Sequenz gewählt, die sowohl zu den bovinen als auch zu den anderen Spezies des TBC eine hundertprozentige Homologie hatte. C C C G G G C G G T G T G G C T G G C C A A C C G Consensus Tb Bovis BCG Abb. 4.32: Sequenzvergleich vom oxyr-gen von tuberkulösen und bovinen Mykobakterien (Ausschnitt) In der Sequenzanalyse des oxyr-gens zeigt sich bei M. tuberculosis, M bovis und M. bovis BCG ein A/G-Polymorphismus. Jede Identität in der Basenabfolge ist durch einen Punkt gekennzeichnet. LC92: 5`-GCC GGT CAC GCA CTG CAC GAC G-3` (22 bp) Ankersonde, Fluoreszein-markiert Die Detektionssonde trug an der entsprechenden Stelle ein Cytosin und hatte somit zu der Sequenz der bovinen Mykobakterien an Position 285 eine Fehlbase (A-C), während die anderen Spezies des TBC eine hundertprozentige Homologie zur

121 105 Ergebnisse Sondensequenz (G-C) hatten. Um den Polymorphismus zu detektieren, wurde das Cytosin in der Sondensequenz dem Adenin (vollständige Übereinstimmung zur Sequenz boviner Mykobakterien) vorgezogen, da die 2+4-Regel eine größere Diskrepanz in den Schmelzpunkten erwarten ließ (vgl. Kapitel 4.4.1). Infolgedessen sollte eine deutlichere Unterscheidung der bovinen Mykobakterien von den anderen TBC-Mitgliedern ermöglicht werden. LC94: 5`-GGC CAG CCA CAC CGC-3` (15 bp) Detektionssonde, LCRed 705 markiert Amplifiziert wurde mit Hilfe der Primer LC90 und LC91 ein 200 bp großes Fragment, das den Sequenzunterschied enthielt. Abb. 4.33: Bovine Sonde LC94 zur Identifizierung von bovinen Mykobakterien eingesetzte Sonde: Bovine-Sonde LC92/94 eingesetzte DNA: genomische DNA von M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. bovis, M. bovis caprae, M. bovis BCG Der Schmelzpunkt der Sonde LC94 lag für die bovinen Mykobakterien (M. bovis, M. bovis caprae und M. bovis BCG) bei einer Temperatur von 58,5 C und für die anderen TBC-Spezies bei einer Temperatur von 68 C. Damit waren die bovinen Mykobakterien mit einer Temperaturdifferenz von fast 10 C von den anderen TBC- Mitgliedern deutlich zu unterscheiden (vgl. Abb. 4.33). Der Mittelwert für den spezifischen Schmelzpunkt von bovinen Mykobakterien lag für die Sonde LC92/94 bei 59,2 C, die berechnete Standardabweichung betrug 0,24 C (n=10).

122 106 Ergebnisse Identifizierung von M. bovis BCG Um die für die Humanmedizin wichtige Spezies M. bovis BCG noch weiter von den bovinen Mykobakterien zu differenzieren, wurde eine Sonde zu Identifizierung von M. bovis BCG entwickelt. Grundlage zur Entwicklung dieser Sonde waren die Beschreibungen von TALBOT und Mitarbeitern (1997b). Eine Region, bezeichnet als region of differences 1 (RD1), wurde auf der genomischen DNA aller virulenten Stämme von M. tuberculosis, M. africanum, M. microti und M. bovis gefunden. Bei M. bovis BCG ist dieser bp große Bereich deletiert. Durch die Verwendung von drei verschiedenen Primern, die an unterschiedlichen Bereichen an und um die RD1- Region binden, wurden unterschiedliche Fragmente bei M. bovis BCG und den anderen TBC-Spezies amplifiziert. Die Sichtbarmachung erfolgte anschließend im Agarosegel. Der Nachweis mittels Amplifikation und sich anschließender Schmelzpunktanalyse, wie er bisher in dieser Arbeit durchgeführt wurde, erfordert die Hybridisierung der DNA-Amplifikate. Ein Nachweis der verschiedenen Amplifikate mit Hilfe von Hybridisierungssonden wurde von TALBOT und Mitarbeitern (1997b) nicht geführt. Bisher wurden ausschließlich Punktmutationen mit Fluoreszenz-markierten DNA- Sonden durch Hybridisierung mit Amplifikationsprodukten nachgewiesen. In diesem Fall musste die Detektionssonde zwischen völlig unterschiedlichen Amplifikaten, die durch das Vorhandensein bzw. das Fehlen der RD1-Region entstehen, unterscheiden. Das Problem wurde durch eine Sonde mit möglichst hoher Homologie zu den unterschiedlichen Amplifikaten gelöst (vgl. Abb. 4.34). In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Sonden entwickelt, die jeweils den 5` bzw. 3` Übergang der RD1-Region zur Identifizierung von M. bovis BCG aus dem TBC abgreifen Entwicklung einer Sonde zur Identifizierung von M. bovis BCG am 3` Übergang der RD1-Region Zur einfacheren Erklärung des Prinzips ist eine Skizze eingefügt (vgl. Abb. 4.34).

123 107 Ergebnisse RD bp I LC73 LC74 ATTCATcGgcTTC CACCCAGCCGCCCGGATCCAGC CCGTAAG GTGGGTCGGCGG Sonde LC79 LC75 RD bp II LC73 TGGTCGACGATTGGCAcat CCGTAAG Sonde CACCCAGCCGCCCGGATCCAGCA GTGGGTCGGCGG LC79 LC75 Abb. 4.34: Darstellung der RD1-Region am 3` Übergang mit der BCG-Sonde LC79 Die bp große RD1-Region (region of differences 1) ist bei M. bovis BCG deletiert (II), zu sehen an der gestrichelten Linie. Bei M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis und M. microti dagegen ist dieser Bereich vorhanden (I). Die PCR-Primer sind als Pfeile dargestellt und zeigen in die Richtung der Amplifikation. Die Sequenz der Detektionssonde ist mit der Zielsequenz des TBC, ausgenommen M. bovis BCG (I) und mit der Zielsequenz von M. bovis BCG (II) verglichen. Fehlbasen zwischen Detektionssonde und Zielsequenz sind als kleine Buchstaben dargestellt. Mit Hilfe von drei verschiedenen Primern wurden unterschiedliche Fragmente amplifiziert, je nachdem, welche Spezies vorlag. Bei M. tuberculosis, M. africanum, M. microti und M. bovis (I) konnten alle drei Primer an der entsprechenden Zielsequenz binden. Mit den Primern LC74 und LC75 wurde ein 300 bp großes Fragment amplifiziert. Das zweite Fragment der Primer LC73 und LC75 wurde aufgrund der Länge (ca bp) nicht amplifiziert (präferentielle Amplifikation kleiner Fragmente). Bei M. bovis BCG (II) konnten nur die beiden Primer LC73 und LC75 binden, es wurde ein 320 bp großes Fragment amplifiziert. Der Primer LC74 war nicht in der Lage, eine Bindung zur Zielsequenz einzugehen, da diese in den Bereich der Deletion fiel. Zur Detektion der unterschiedlichen Fragmente wurde eine Sonde konstruiert, welche zu keiner der Sequenzen von M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. bovis und M. bovis BCG eine vollständige Homologie hatte, es lagen jeweils drei Fehlbasen mit der Zielsequenz vor. Somit gab es Bereiche der Detektionssonde, die spezifisch für M. tuberculosis, M. africanum, M. microti und M. bovis waren, und Bereiche, die spezifisch für die Sequenz von M. bovis BCG waren. Der Schmelzpunkt für M. bovis BCG sollte nach Berechnungen der 2+4-Regel zwischen 50 und 55 C liegen, während der Schmelzpunkt für die übrigen Mitglieder des TBC zwischen 60 und 65 C liegen sollte.

124 108 Ergebnisse LC79: 5`-GGC GGC TGG GTG GAA TGC-3` (18 bp) Detektionssonde, LCRed 640 markiert Als Ankersonde wurde eine Sonde verwendet, deren Sequenz komplett homolog zur Sequenz der Mitglieder des TBC war. LC78: 5`-GCT ATG CCA GAC AGA TGC TGG ATC-3` (24 bp) Ankersonde, Fluoreszein-markiert Abb. 4.35: BCG-Sonde LC79 zur Identifizierung von M. bovis BCG eingesetzte Sonde: BCG-Sonde LC78/79 eingesetzte DNA: genomische DNA von M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. bovis, M. bovis caprae, M. bovis BCG M. bovis BCG zeigte mit der Sonde LC78/79 einen spezifischen Schmelzpunkt bei 49,5 C. Alle anderen Spezies des TBC wurden amplifiziert und schmolzen bei einer Temperatur von 63 C von der Zielstruktur ab (vgl. Abb. 4.35). Der Mittelwert für den spezifischen Schmelzpunkt von M. bovis BCG lag für die Sonde LC78/79 bei 49,6 C, die berechnete Standardabweichung betrug 0,16 C (n=10) Entwicklung einer Sonde zur Identifizierung von M. bovis BCG am 5` Übergang der RD1-Region Detektiert sollte hier der 5`Übergang der RD1-Region werden. Zur besseren Erklärung ist auch hier wieder eine Skizze eingefügt (vgl. Abb. 4.36). Gezeigt werden in diesem Fall die Sequenzen von M. tuberculosis (I) und M. bovis BCG (II). Für die

125 109 Ergebnisse anderen Spezies des TBC lagen keine Informationen über die Sequenz am 5` Übergang in der Datenbank vor. Das Amplifikationsprinzip entspricht der am 3` Übergang beschriebenen Weise. RD bp I LC73 GTCGACGATTGGCACAT gatcg CGACGATTGGCACAT CACC Sonde LC85 LC83 LC75 RD bp II LC73 TGGTCGACGATTGGCACAT CGACGATTGGCACAT Sonde CACCCAGCCGCCCGGATCCAGCA CACC LC85 LC75 Abb. 4.36: Darstellung der RD1-Region am 5` Übergang mit der BCG-Sonde LC85 Die bp große RD1-Region (region of differences 1) ist in M. bovis BCG deletiert (II), bei M. tuberculosis dagegen ist dieser Bereich vorhanden (I). Die PCR-Primer sind als Pfeile dargestellt und zeigen in die Richtung der Amplifikation. Die Sequenz der Detektionssonde ist mit der Zielsequenz von M. tuberculosis (I) und der Zielsequenz von M. bovis BCG (II) verglichen. Fehlübereinstimmungen zwischen Detektionssonde und Zielsequenz sind als kleine Buchstaben dargestellt. Als Ankersonde wurde eine Sonde konstruiert, die sowohl zur Sequenz von M. tuberculosis als auch zur Sequenz von M. bovis BCG eine vollständige Homologie zeigte. LC84: 5`-GCG GAT TTG ACG TCG TGC TTC TG-3` (23 bp) Ankersonde, Fluoreszein-markiert Zur Detektion der unterschiedlichen Fragmente wurde eine Sonde entwickelt, die zu der Sequenz des 320 bp großen amplifizierten Fragments von M. bovis BCG eine vollständige Homologie hatte (I). Das amplifizierte Fragment von M. tuberculosis wurde ebenfalls mit dieser Sonde detektiert, zur Sequenz lagen jedoch zwei Fehlbasen vor (dargestellt als kleine Buchstaben). Damit sollte sich der Schmelzpunkt für M. bovis BCG bei Vorliegen einer vollständigen Übereinstimmung vom Schmelzpunkt der anderen Spezies des TBC deutlich unterscheiden. LC85: 5`-CGA CGA TTG GCA CAT CAC C-3` (19 bp) Detektionssonde, LCRed640 markiert

126 110 Ergebnisse Abb. 4.37: BCG-Sonde LC85 zur Identifizierung von M. bovis BCG eingesetzte Sonde: BCG- Sonde LC84/85 eingesetzte DNA: genomische DNA von M. tuberculosis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. bovis, M. bovis caprae, M. bovis BCG Der Schmelzpunkt für M. bovis BCG lag mit einer hundertprozentigen Homologie zur Sonde LC84/85 bei 59,5 C. Die anderen Spezies des TBC hatten durch die beiden Fehlsequenzen zur Sonde einen verringerten Schmelzpunkt bei 56 C, ausgenommen M. microti. Für die genomische DNA von M. microti ergab sich kein Signal. Der Mittelwert für den spezifischen Schmelzpunkt von M. bovis BCG lag für die Sonde LC84/85 bei 59,5 C, die berechnete Standardabweichung betrug 0,03 C (n=10). Um zu überprüfen, ob die DNA von M. microti nicht mit den Primern amplifiziert oder von der Sonde nicht detektiert wurde, wurde die DNA nach der Amplifikation aus den Reaktionskapillaren isoliert und auf ein Agarosegel aufgetragen, aufgetrennt und anschließend unter der UV-Lampe betrachtet. Zum Vergleich wurden die amplifizierten Fragmente aus der Promotorregion zur Detektion von M. tuberculosis mit aufgetragen, die alle ein Signal bei der Schmelzpunktanalyse gezeigt hatten. Die erwartete Bande aus der Amplifikation des Promotorbereichs lag bei 154 bp, die aus der Amplifikation des RD1-Bereichs bei 320 bp.

127 111 Ergebnisse bp 154 bp Spur 1: Größenstandard I Spur 2: Amplifikate von M. tuberculosis Spur 3: Amplifikate von M. africanum Spur 4: Amplifikate von M. microti Spur 5: Amplifikate von M. canetti Spur 6: Amplifikate von M. bovis Spur 7: Amplifikate von M. bovis caprae Spur 8: Amplifikate von M. bovis BCG Pasteur Spur 9: Amplifikate von M. bovis BCG Tice Spur 10: H 2 O als Negativkontrolle Abb. 4.38: Gelansicht: Amplifikate der Spezies des M. tuberculosis-komplexes vom Promotorund RD1-Fragment Alle Spezies des TBC zeigten die erwartete Bande bei 154 bp (Promotorbereich). Die Bande aus der RD1-Region-Amplifikation (320 bp) zeigte sich bei allen Spezies, außer bei M. microti in Spur 4 (vgl. Abb. 4.38). Die genomische DNA von M. microti wurde demnach mit den verwendeten Primern LC73, LC75 und LC83 nicht amplifiziert. Die Gründe sind nicht bekannt, da es keine Daten in der Sequenzdatenbank für diesen Bereich gab. Aufgrund der Versuche mit der Sonde LC78/79, die den 3` Übergang detektierte, konnte man aber darauf schließen, dass das Problem im Primerbindungsbereich von LC83 liegen musste, da das Fragment von M. microti am 3` Übergang mit der Primerkombination LC73, LC74 und LC75 amplifiziert und detektiert wurde. Vermutlich lag bei M. microti im Bereich des mittleren Primers LC83 eine Veränderung in der Sequenz vor, so dass LC83 nicht binden konnte. Für die weitere Untersuchung von Patientenmaterialien wurde die Sonde LC78/79 ausgewählt, die den 3` Übergang der RD1-Region detektiert, da alle Spezies des TBC mit dieser Methode amplifiziert und detektiert werden konnten Anwendung an Kulturisolaten aus Patientenproben Die ausgewählten neuen Sonden LC63/64, LC92/94 und LC78/79 zur Identifizierung von M. tuberculosis, bovinen Mykobakterien und M. bovis BCG sollten nun an klinischen Proben, die positiv für den TBC waren, und einigen weiteren ATCC- Stämmen des TBC zur Überprüfung der Spezifität untersucht werden. Wie in der nachstehenden Tab. 4.8 gezeigt, wurde dafür die genomische DNA von 63 Stämmen und Isolaten mit den Sonden auf die Anwesenheit von M. tuberculosis, bovinen Mykobakterien und M. bovis BCG untersucht.

128 112 Ergebnisse Ein Überblick des Diagnosewegs ist in der nachstehenden Abb aufgeführt: LightCycler narghji-215 "T" an Position -215 ID=M.tuberculosis "C" an Position -215 andere Spezies des TBC LightCycler oxyr, RD1 oxyr: "G" RD1 positiv M. africanum, M. microti, M. canetti oxyr: "A" RD1 positiv ID = M. bovis oxyr: "A" RD1 negativ ID = BCG weitere Differenzierung erforderlich Abb. 4.39: Übersicht der Differenzierung des M. tuberculosis-komplexes Von den untersuchten Stämmen waren acht ATCC-Stämme. Die übrigen 55 Isolate stammten von Patientenproben, die kulturell im MGIT-Automaten angezüchtet wurden, davon waren 39 Isolate von Patienten der MHH, die im Zeitraum von 2000 bis 2002 im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene untersucht wurden. Sieben Isolate wurden aus dem Nationalen Referenzzentrum für Mykobakterien (NRZ) bezogen und neun Isolate vom Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin (BgVV) in Jena. Die Identifizierung der MHH-Isolate erfolgte über partielle Sequenzierung des 16S rrna-gens, Niacin/Nitrat-Testung und Analyse der RD1-Region mittels konventioneller PCR, wie von TALBOT und Mitarbeitern (1997b) beschrieben. Isolate, die mittels dieser Methoden nicht eindeutig identifiziert werden konnten, wurden ins NRZ geschickt und dort untersucht. Alle untersuchten Proben wurden im MGIT-Kulturautomaten angezüchtet und anschließend wurde die genomische DNA mechanisch mit Glasperlen isoliert. 10 µl dieser DNA wurden direkt für die PCR verwendet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tab. 4.8 aufgeführt.

129 113 Ergebnisse Tab. 4.8: Spezies Unterscheidung des M. tuberculosis-komplexes an klinischen Patientenmaterialien Stamm M. tuberculosis H37RV ATCC Erdmann ATCC Klinische Isolate (n=31) Schmelzpunkt ( C) der Hybridisierungssonden spezifisch für M. tuberculosis bovine Mykobakterien M. bovis BCG LC64 LC94 LC79 (narghji) (oxyr) (RD1) (SD=0.36) (SD=0.15) (SD=0,47) M. africanum Klinische Isolate (n=3) 63.4 (SD=0.21) 68.0 (SD=0.28) 62.4 (SD=0.49) M. microti Klinische Isolate (n=2) 63.2 (SD=0.28) 68.2 (SD=0.07) 61.7 (SD=0.07) M. canetti Klinische Isolate (n=2) 63.2 (SD=0.25) 68.0 (SD=0.1) 62.1 (SD=0.2) M. bovis ATCC Klinische Isolate (n=12) (SD=0.30) (SD=0.13) (SD=0.26) M. bovis caprae Klinische Isolate (n=1) M. bovis BCG Pasteur ATCC Copenhagen ATCC Moreau ATCC Tice ATCC Connaught ATCC Klinische Isolate (n=31) (SD=0.26) (SD=0.09) (SD=0.14) Für die ATCC-Stämme sind die einzelnen Schmelzpunkte gezeigt. Für die untersuchten klinischen Isolate sind die Mittelwerte und Standardabweichungen (SD) berechnet. Mit dieser Methode konnten damit M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG spezifisch und schnell aus Kulturmaterial identifiziert werden. Die weiteren Spezies des TBC müssen von Speziallaboratorien differenziert werden. Insgesamt gab es im Verlauf dieser Arbeit zwei TBC-positive Isolate aus dem MGIT- Automaten, die mit den drei ausgewählten Sonden nicht als M. tuberculosis, M. bovis oder M. bovis BCG identifiziert werden konnten. Diese werden in der folgenden Tabelle noch einmal gesondert aufgeführt. Als Vergleichswerte wurden die Schmelzpunkte der genomischen DNA von M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti und M. canetti angegeben. Tab. 4.9: Schmelzpunkt-Profil der Mykobakterien des M. tuberculosis-komplexes Spezies Stamm Schmelzpunkt ( C) der Hybridisierungssonden spezifisch für M. tuberculosis LC64 (narghji) bovine Mykobakterien LC94 (oxyr) M. bovis BCG LC79 (RD1) M. tuberculosis ATCC (SD=0.36) M. bovis ATCC (SD=0.13) 62,5 M. bovis BCG ATCC ,4 (SD=0.14) M. africanum klinisches Isolat M. microti klinisches Isolat M. canetti klinisches Isolat Probe klinisches Isolat Probe klinisches Isolat

130 114 Ergebnisse Beide Proben zeigten Schmelzpunkte, die für M. africanum, M. microti und M. canetti spezifisch sind. Das Vorliegen von M. tuberculosis, M. bovis oder M. bovis BCG konnte mit dem angewendeten System ausgeschlossen werden. Eine weitere Untersuchung und Identifizierung dieser beiden Proben im NRZ in Borstel ergab in beiden Fällen M. africanum.

131 115 Diskussion 5 Diskussion Die Einführung der PCR in die mikrobiologische Diagnostik hat die Möglichkeit einer sehr schnellen und sensitiven Diagnostik geschaffen (WHITE et al. 1992; DIDOMENICO et al. 1996). Einen allgemein anerkannten, molekularbiologischen Goldstandard zum Nachweis von Mykobakterien gibt es bisher nicht. Die PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse stellt zur Zeit die schnellste Methode dar, Mykobakterien-DNA zu amplifizieren und spezifisch zu detektieren. Ziel war es im ersten Teil der Arbeit, das beschriebene System an kulturellen Isolaten von Patienten zu testen. Für die Anwendung der PCR in der klinischen Diagnostik ist eine Inhibitionskontrolle unerlässlich (ROSENSTRAUS et al. 1998). PCR-Inhibitoren, die in klinischen Materialien häufig vorkommen, verringern die Effizienz der Amplifikationsreaktion und damit die Menge des PCR-Produktes oder sie hemmen die Amplifikation vollständig. Durch die Verwendung einer Inhibitionskontrolle in jeder Probe wird überprüft, ob eine Amplifikation stattgefunden hat. Ein negatives Ergebnis der Probe, verursacht durch Inhibitoren, ist somit von einem richtig negativen Ergebnis zu unterscheiden. Die Inhibitionskontrolle muss immer eindeutig von der Probe zu unterscheiden sein. Eine Möglichkeit besteht darin, die Zielstruktur der Probe und der Inhibitionskontrolle durch die gleiche Sonde zu detektieren. Dafür muss die Zielsequenz der Inhibitionskontrolle so verändert werden, dass der Schmelzpunkt bei Bindung an der Kontrolle deutlich vom Wildtyp zu unterscheiden ist. Eine weitere Möglichkeit wäre die Verwendung einer eigenen Zielstruktur für die Inhibitionskontrolle. Es müsste allerdings ein weiteres Sondenpaar zu Detektion der Kontrolle verwendet werden, was die Kosten des Verfahrens erhöhen würde. Außerdem wäre bei diesem Verfahren die Messung mit genusspezifischer und speziesspezifischer Sonde zur Detektion von Mykobakterien und des TBC in einem Lauf nicht möglich, da nur zwei Kanäle zur Messung zur Verfügung stehen. Aus diesen Gründen wurde die erste Möglichkeit für die interne Kontrolle gewählt. Eine Verwendung der in LACHNIK (2002) beschriebenen Inhibitionskontrolle pjl6 zur Unterscheidung von tuberkulösen und NTM in einer Multiplex-PCR war nicht möglich. Da für dieses Kontrollplasmid nur der Bindungsbereich für die genusspezifische Region verändert worden war, konnte bei gleichzeitiger Verwendung der TBC-spezifischen Sonde diese an der TBC-spezifischen Region des Kontrollplasmids binden. Die Folge war ein positives Signal für Mykobakterien des TBC in allen Proben, denen die Inhibitionskontrolle zugesetzt war.

132 116 Diskussion Um aber die Diagnostik, insbesondere den Nachweis vom TBC, zu beschleunigen, sollte eine Messung mit beiden Sonden in einem Lauf möglich sein. Aus diesem Grund wurde die bereits erstellte Inhibitionskontrolle auch in der TBC-spezifischen Region verändert. Dabei wurde berücksichtigt, dass Inhibitionskontrolle und Probe bei der Amplifikation miteinander in Konkurrenz stehen. Eine hohe Anzahl an Kontrollplasmiden könnte, bei nur geringer Menge an Zielstruktur der Probe, ein falsch negatives Ergebnis für die entsprechende Probe liefern. Um eine präferentielle Amplifikation kleinerer Fragmente zu verhindern, wurde die TBC-spezifische Region nicht einfach deletiert, sondern durch ein gleich großes Fragment aus Staphylococcus aureus ersetzt. In einer vorangegangenen Studie von ROSENSTRAUS und Mitarbeitern (1998) wurde eine Anzahl von 20 Kopien pro Reaktionsansatz für die CORBAS AMPLICOR Testsysteme der Fa. ROCHE eingesetzt. Die Inhibitionsraten lagen dabei zwischen 5 und 9%. In der Studie von LACHNIK und Mitarbeitern (2002) wurde die Verwendung von 50 Kopien Inhibitionskontrolle pro Reaktionsansatz in einem PCR-Format getestet. Dabei konnten 10 Genome M. tuberculosis bei gleichzeitiger Verwendung von 200 ng Hintergrund-DNA in dem in vitro System detektiert werden. In dieser Arbeit erfolgte die Untersuchung der kulturellen Isolate aus Patientenproben zunächst mit 50 Kopien Inhibitionskontrolle pro Reaktionsansatz. Die angewendete Kopienanzahl erwies sich in dem Fall als nicht praktikabel. Zu viele der Proben blieben in der Pilotstudie mit der vorgegebenen Anzahl an Kopien inhibiert (22,5%). Bei der Untersuchung von Proben aus dem MGIT-Kulturautomaten, in denen laut Angaben der Fa. BECTON DICKINSON 10 5 bis 10 6 KBE pro Milliliter in einem positiv gemeldeten Probenröhrchen vorhanden sind, wurden schließlich 500 Kopien Kontrollplasmid mitgeführt. Ein Sensitivitätsverlust unter die Detektionsgrenze bei 500 eingesetzten Kopien Kontrollplasmid war aufgrund der Bakteriendichte in einem MGIT-Kulturröhrchen nicht zu erwarten. Zudem war durch die angewandte Präparationsmethode (mechanischer Aufschluss mit Glasperlen), der großen Anzahl von CF-Patienten, die einen hohen Anteil an Begleitflora in den Proben besitzen, mit einer hohen Rate an Inhibitoren zu rechnen. Durch eine Wiederholung der inhibierten Proben mit einer 1:10 Verdünnung konnte die Anzahl der inhibierten Proben vollständig reduziert werden. Im zweiten und dritten Abschnitt dieser Arbeit wurde sowohl die Differenzierung von kulturell positiven Proben aus Patientenmaterial, als auch der Direktnachweis von Mykobakterien-DNA aus Patientenmaterial mit Hilfe der Amplifikation und anschließender Schmelzpunktanalyse beschrieben. Die Kultur gilt nach wie vor als

133 117 Diskussion Goldstandard beim Nachweis von Mykobakterien (TAYLOR et al. 2001). Es sind 10 1 bis 10 2 lebende Organismen pro Milliliter nötig, um ein positives Ergebnis zu erzielen. Damit ist die Kultur eine der sensitivsten Methoden. Sie hat aber den Nachteil, dass es, bedingt durch das langsame Wachstum der Mykobakterien, ein zeitaufwendiges Verfahren ist. Um Mykobakterien aus der Kultur zu differenzieren, müssen weitere Methoden angewendet werden. Eine weit verbreitete Methode ist die Sequenzierung (SOINI u. MUSSER 2001). In dieser Arbeit sollte die Sequenzierung von Patientenisolaten aus dem MGIT- Kulturautomaten, die von der Routinediagnostik der MHH durchgeführt wird, mit der Differenzierung mit Hilfe der Amplifikation und anschließenden Schmelzpunktanalyse am LightCycler aus MGIT-Kulturmaterial verglichen, und gegebenenfalls ersetzt werden. Bei dem bisher verwendeten Nachweis werden alle Proben, die ein positives Signal im Kulturautomaten geben, mit der ZN-Färbung mikroskopisch auf säurefeste Stäbchen untersucht. Bei einem positiven Ergebnis wird das Material durch Sequenzierung des 16S rrna-gens identifiziert. Dieser Vorgang ist teuer und zeitaufwendig. Zudem ist die Sensitivität der mikroskopischen Untersuchung des Materials auf säurefeste Stäbchen sehr von der Fähigkeit und Erfahrung des Untersuchers abhängig (METCHOCK et al. 1999). Probenmaterial, das durch Begleitflora überwuchert ist, ist vom Betrachter schwer bis gar nicht auf die Anwesenheit von säurefesten Stäbchen zu beurteilen. Mykobakterienspezies, die eine identische Sequenz auf dem 16S rrna-gen besitzen, v.a. die des TBC, können mit der Sequenzierung nicht identifiziert werden, sondern benötigen weitere Schritte der Untersuchung. In der Pilot-Studie war geplant, alle ZN-positiven Proben aus dem MGIT-Automaten mit der genusspezifischen Sonde zu untersuchen. Dabei wurde eine Inhibitionskontrolle mitgeführt. Im zweiten Lauf sollten alle Proben, die ein positives Signal für Mykobakterien gezeigt haben, weiter mit der TBC-spezifischen Sonde auf die Anwesenheit des TBC bzw. in einem weiteren Kanal parallel mit der M. avium- Sonde auf die Anwesenheit von M. avium untersucht werden. Mit diesem System sollte ein Großteil aller klinischen Isolate, die in der MHH untersucht werden, identifiziert werden. Dieser Abschnitt zeigte eine vollständige Übereinstimmung mit der herkömmlichen Diagnostikmethode durch die Sequenzierung. Durch eine Erweiterung der Einschlusskriterien für den Nachweis mit der neuen Methode konnten in weiteren Proben Mykobakterien detektiert werden, die mit der ZN-Färbung nicht erfasst wurden. Aus diesem Grund wurden in der Hauptstudie alle Proben mit der PCR untersucht, die ein positives Signal aus dem Kulturautomaten gaben. Damit sollte überprüft

134 118 Diskussion werden, ob eine signifikante Anzahl an Proben aus dem Kulturautomaten mit der herkömmlichen Methode als falsch negativ beurteilt wird. Durch die Fertigstellung der neuen Inhibitionskontrolle war nun eine parallele Detektion von Mykobakterien und von Mykobakterien des TBC möglich. Damit war eine Unterscheidung zwischen tuberkulösen und NTM innerhalb einer Stunde aus kulturellen Patientenisolaten möglich. Um einen noch größeren Anteil an Spezies mit der Amplifikation mit anschließender Schmelzpunktanalyse zu erfassen, wurde eine Sonde zum Nachweis der sequenzgleichen Spezies M. chelonae und M. abscessus entwickelt. Neben Mykobakterien des TBC und M. avium ist der M. chelonae-abscessus-komplex derjenige, der am häufigsten bei den eingesendeten Materialien an der MHH vorkommt. Mit dem Einsatz von vier unterschiedlichen Sonden in zwei verschiedenen Läufen konnten bei 86% (Hauptstudie I) bzw. 74% (Hauptstudie II) der untersuchten Proben mit der neuen Methode eine eindeutige Speziesdiagnose gestellt werden. Die Ergebnisse stimmten in allen Fällen mit denen der Sequenzierung überein. Bei erweiterten Einschlusskriterien (CF-Patienten, HIV-Infektionen, Zustand nach Transplantation, Geburt oder Aufenthalt in Endemiegebieten) war es mit Hilfe der PCR und Schmelzpunktanalyse möglich, aus weiteren, in der ZN-Färbung negativ beurteilten Proben, Mykobakterien nachzuweisen. Die Diagnose Mykobakterien des TBC, NTM oder negativ für Mykobakterien konnte innerhalb von einer Stunde sicher und schnell aus Kulturisolaten von Patienten gestellt werden, was insbesondere für das weitere Verfahren in der Klinik von großer Bedeutung ist. In einem zweiten Lauf konnte eine weitere Unterscheidung bei der Diagnose NTM gestellt werden. Durch den Einsatz der neuen Diagnostikmethode könnte durchschnittlich auf 80% der Sequenzierungen verzichtet werden. Die Zeit des Nachweises kann durch den Einsatz der PCR und Schmelzpunktanalyse erheblich verkürzt werden. Alle in der Sequenzierung gestellten Diagnosen bei ZN-positiven Proben konnten mit der am LightCycler durchgeführten Diagnostik bestätigt werden. Die Untersuchung aller Kulturen aus Patientenmaterial mit dem angewandten PCR- Format, die im MGIT-Automaten ein positives Signal gaben, erwies sich als nicht rentabel. Zwar konnten durch die Erweiterung der oben genannten Einschlusskriterien in weiteren Proben Mykobakterien nachgewiesen werden, die Anzahl der Patienten, die zusätzlich detektiert wurden, konnte allerdings nicht gesteigert werden. Da in der klinischen Mykobakteriendiagnostik von jedem Patienten mehrere Proben untersucht werden, konnte die Diagnose aus einer

135 119 Diskussion Parallelprobe gestellt werden. Der Zeitraum bis zur endgültigen Diagnose war jedoch teilweise deutlich gegenüber dem Nachweis mit der PCR und anschließender Schmelzpunktanalyse verlängert. Die Detektionszeit konnte mit dem neuen Nachweisformat in allen zusätzlich detektierten Fällen deutlich verkürzt werden. Zu viele Proben, die im MGIT-Kulturautomaten inkubiert und später vom Gerät positiv gemeldet wurden enthielten keine Mykobakterien, sondern waren mit anderen Bakterien kontaminiert. Aus diesem Grund wird der LightCycler die bisher durchgeführte Screening-Methode, die ZN-Färbung aller positiv gemeldeten Kulturen aus dem MGIT-Automaten, nicht ersetzen. Ein möglicher Grund für die hohe Anzahl an vom MGIT-Automaten falsch positiv gemeldeten Proben ist das Patientengut der MHH. Eine große Anzahl an Proben zur Untersuchung auf Mykobakterien sind Proben von CF-Patienten, die häufig Infektionen mit NTM besitzen. Bei etwa 80% dieser CF-Patienten ist der Respirationstrakt mit Pseudomonas aeruginosa besiedelt (BANGE et al. 1999; BANGE u. BÖTTGER 2002). Dieser Keim führt zu einer schnellen Überwucherung der Kultur. Für die ZN-positiven Kulturen stellt die Amplifikation mit anschließender Schmelzpunktanalyse eine sehr gute Alternative zur arbeits- und kostenintensiven Sequenzierung dar, in diesem Fall wird die PCR und Schmelzpunktanalyse die bisher durchgeführte Sequenzierung ersetzen. Weiterhin bietet es sich an, bei Bestehen eines klinischen Verdachts auf das Vorliegen einer Infektion mit Mykobakterien bei einzelnen Fällen auch Proben aus dem MGIT-Automaten mit dem real-time PCR-Format zu untersuchen, die in der ZN- Färbung keinen Hinweis auf säurefeste Stäbchen gezeigt haben. Mit diesem Format war es möglich, aus diesen Proben Mykobakterien zu einem früheren Zeitpunkt nachzuweisen als mit der Methode der ZN-Färbung mit anschließender Mikroskopie. Das langsame Wachstum von Mykobakterien, v.a. der Spezies des TBC, verzögert die klinische Diagnose und Behandlung und trägt damit zur Verbreitung der Erkrankung bei. Aus diesem Grund wurde im dritten Abschnitt dieser Arbeit versucht, eine Methode zu entwickeln, Mykobakterien-DNA mit dem neuen PCR-Format direkt in respiratorischen Patientenmaterialien nachzuweisen. Die Hauptprobleme bei der Isolation von Mykobakterien-DNA aus Patientenmaterial sind die Lyse der starren, lipopolysaccharidreichen Zellwand und gleichzeitig eine konsequente Separation der Inhibitoren zu erreichen, die die anschließende PCR hemmen können (KIRSCHNER et al. 1996).

136 120 Diskussion Bei den meisten kommerziell erhältlichen PCR-Assays liegen die erreichten Sensitivitäten zwischen 70-90%. Unterschieden wird dabei zwischen den Sensitivitäten bei Proben, die im Direktpräparat positiv für säurefeste Stäbchen sind und denen, die negativ sind. Bei den Proben, die positiv im Direktausstrich sind, werden Sensitivitäten zwischen 90-95% erreicht, während bei den für säurefeste Stäbchen negativen Proben nur Sensitivitäten zwischen 50-60% erreicht werden (METCHOCK et al. 1999). Von der American Food and Drug Administration wurden zwei Testsysteme, der M. tuberculosis Direct Test der Fa. GEN-PROBE und der Amplicor M. tuberculosis Test der Fa. ROCHE für den Nachweis von Mykobakterien aus Direktmaterial empfohlen. Aufgrund der schlechteren Sensitivitäten bei negativen Direktpräparaten (40-73%) (STAUFFER et al. 1995; TEVERE et al. 1996; BERGMANN et al. 2000) soll der Amplicor M. tuberculosis Direct Test nur bei Proben angewendet werden, die positiv für säurefeste Stäbchen sind. Die Spezifität liegt dagegen bei nahezu allen kommerziellen Kits zwischen %. In dieser Arbeit wurde ein Kit der Fa. THERMOLABSYSTEMS zur Isolation von DNA aus Patientenmaterial verwendet, welcher die DNA an der Oberfläche paramagnetischer Silicapartikel bindet und von den übrigen Stoffen der Probe durch verschiedene Waschschritte separiert. Dieses Verfahren erlaubt die Anwendung im KingFisher ml- Gerät, welches die Automatisierung von aufwendigen, manuellen Arbeitsschritten und ein gleichmäßiges Aufreinigen und Isolieren aller Proben ermöglicht. Um die Effizienz dieses Kits zu erhöhen, wurde das Protokoll in einigen Punkten verändert, um eine Lyse der Mykobakterienzellwand zu erreichen. Dafür wurden Sputen mit einer bestimmten Menge an M. bovis BCG versetzt, um zu überprüfen, wie sich die Anwendung bestimmter Enzyme auf die Präparationsausbeute auswirkt. Sowohl durch die zusätzliche Anwendung von Lysozym als auch durch Proteinase K konnten die Präparationsausbeuten erhöht werden. Bei der abschließenden Untersuchung der Sensitivität und Spezifität mit den etablierten und optimierten Versuchsparametern an respiratorischen Patientenproben zeigte sich eine 100%ige Spezifität sowohl für den Vergleich mit der Kultur als auch mit den Direktausstrichen. Die Inhibitionsraten zwischen 5,5 und 6,52% waren im Vergleich zu den meisten kommerziell erhältlichen Kits mit Inhibitionsraten von 5-9% vergleichbar niedrig. Beim Nachweis von Mykobakterien-DNA ist zu bedenken, dass durch die Dekontamination des Originalmaterials mit NaOH-NALC bis zu 90% aller Mykobakterien vernichtet werden können und so ein falsch negatives Ergebnis in der Kultur erzielt werden kann (METCHOCK et al. 1999). Aus diesem Grund ist darüber nachzudenken, ob die Kultur immer als Goldstandard betrachtet werden sollte. Ein

137 121 Diskussion Verzicht auf die Dekontamination von Sputen ist allerdings nicht möglich, da die Methode nicht nur eine Anreicherung der Mykobakterien durch Zentrifugation erreicht, sondern einen Großteil der schnell wachsenden Begleitflora abtötet und gleichzeitig einen hohen Anteil an Inhibitoren aus der Probe eliminiert. Zudem wird durch die gleichzeitige Zugabe von Acetyl-Cystein eine Verflüssigung des zähen, respiratorischen Materials erreicht (KAUFMANN 1994). Die Untersuchung der Proben (Sputen) eines an M. tuberculosis infizierten Patienten zeigte eine Sensitivität von 100% für alle kulturell positiven Proben, die gleichzeitig säurefeste Stäbchen im Direktausstrich enthielten. Bei der Untersuchung von respiratorischen Proben (Sputum, Bronchoalveolarlavage, Bronchialsekret) von CF-Patienten aus den Jahren 2001 und 2002 zeigten sich schlechtere Sensitivitäten, 66,7% für alle untersuchten kulturell positiven Proben und 88,9% für kulturell positive Proben, die auch im Direktpräparat säurefeste Stäbchen gezeigt hatten. Ein möglicher Grund für die schlechteren erreichten Sensitivitäten ist der lange Zeitraum, in dem die Proben bei 20 C gelagert wurden. Dies kann eventuell zu Veränderungen der Probe (Degradierung der DNA) geführt haben. Zu kritisieren ist die geringe Anzahl an untersuchten Proben in Bezug auf die errechneten Sensitivitäten und Spezifitäten. Mit einem größeren Spektrum an Probenmaterial könnten genauere Aussagen hinsichtlich der beiden Parameter gemacht werden. Um die neu entwickelte Präparationsmethode mit der anschließenden Amplifikation und Schmelzpunktanalyse hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und Inhibitionsrate genau beurteilen zu können, muss eine prospektive Studie mit einer wesentlich höheren Anzahl an Proben durchgeführt werden. Dabei sollten zur Überprüfung der DNA-Extraktion neben den Negativkontrollen Positivkontrollen während der Präparationskontrolle mitgeführt werden. Diese sollten einen bestimmten, bekannten Erregergehalt aufweisen, um selbstdefinierte Sensitivitätskontrollen zu ermöglichen. Im vierten Abschnitt der Arbeit wurde die Unterscheidung der Spezies des TBC mit Hilfe der Amplifikation und Schmelzpunktanalyse beschrieben. Die Unterscheidung von Mykobakterien des TBC von NTM ist durch die Detektion verschiedener Regionen auf dem 16S rrna-gen mit der in LACHNIK und Mitarbeitern (2002) beschriebenen Methode möglich. Da alle Mitglieder des TBC eine identische Sequenz auf dem 16S rrna-gen besitzen, ist eine Unterscheidung innerhalb des TBC mit dieser Methode jedoch nicht möglich (PARSONS et al. 2002). Die routinemäßige Differenzierung innerhalb des TBC erfolgt in den meisten Fällen durch phänotypische Charakteristika und biochemische Tests. Diese Tests benötigen

138 122 Diskussion eine ausreichende Menge an Bakterien (Kultur), sind zeitaufwendig und erlauben nicht in allen Fällen eine eindeutige Speziesdiagnose (NIEMANN et al. 2000b). Aus diesem Grund sind in der letzten Zeit eine Vielzahl an molekularbiologischen Differenzierungsmethoden entwickelt worden. Keine dieser molekularbiologischen Techniken kann jedoch alle Spezies des TBC differenzieren und keiner der angewendeten molekularen Marker kann allein angewendet werden (NIEMANN et al. 2000a). Als Methode der Wahl für epidemiologische Studien wird nach einer Studie von KREMER und Mitarbeitern (1999) die Stammidentifizierung mittels RFLP oder mixedlinker-pcr der Insertionssequenz IS6110 angesehen. In der Routinediagnostik der meisten klinischen Institutionen erfolgt lediglich die Unterscheidung von M. tuberculosis und M. bovis. Dies geschieht zumeist durch die phänotypische Bestimmung der Nitratreduktase-Aktivität. M. tuberculosis hat im Vergleich zu den anderen Spezies des TBC die Eigenschaft, in kurzer Zeit große Mengen Nitrit aus Nitrat zu akkumulieren. M. bovis und M. bovis BCG zeigen nur eine schwache Aktivität (METCHOCK et al. 1999). Auch die selten auftretenden Spezies des TBC M. africanum, M. microti, M. canetti und M. bovis caprae zeigen ebenfalls nur eine schwache bzw. gar keine Nitritakkumulation im Vergleich zu M. tuberculosis. Der molekulare Mechanismus dieser Reaktion war bisher nicht bekannt. In anderen Bakterienspezies wurden verschiedene Nitratreduktasen identifiziert. Das Gen narghji codiert für eine der mindestens drei verschiedenen Nitratreduktasen (FRITZ et al. 2002). Auffallend war bei Untersuchungen in unserem Labor, dass die Nitritakkumulation zwischen den Spezies M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG variiert, obwohl alle das Gen narghji besitzen. Aus diesem Grund wurde die Promotorregion von narghji bei den drei Spezies mit Hilfe einer Sequenzanalyse verglichen. An der Position -215 vor Translationsstart von narg zeigte sich ein T/C- Polymorphismus. M. tuberculosis wies ein Thymin in der Sequenz auf, während M. bovis und M. bovis BCG ein Cytosin an der entsprechenden Position zeigten. Anhand zahlreicher klinischer Isolate wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass dieser T/C- Polymorphismus im Bereich des narg-promotors eindeutig zwischen M. tuberculosis und allen anderen Spezies des TBC unterscheidet. Ein Thymin an Position -215 im narghji Promotorbereich stellt die eindeutige Diagnose M. tuberculosis. Es sind keine weiteren Untersuchungen wie phänotypische Charakterisierung der Nitratreduktaseaktivität oder weitere molekulare Untersuchungen nötig. Damit ist ein schneller und spezifischer molekularer Nachweis mit Hilfe der Amplifikation und Schmelzpunktanalyse von M. tuberculosis möglich. Stämme, die

139 123 Diskussion unterschiedliche Variabilität im Phänotyp zeigen, wie z.b. M. africanum (NIEMANN et al. 2002), können mit dieser Methode sicher von M. tuberculosis abgegrenzt werden. Im Verlauf dieser Arbeit gab es zwei Patientenproben, die positiv für den TBC waren und phänotypisch mittels Nitratdeduktasetest als M. tuberculosis eingestuft wurden. Die Analyse dieser Proben mit den Sonden zur Unterscheidung des TBC konnte die Diagnose eindeutig widerlegen. Weder die M. tuberculosis-sonde noch die beiden Sonden zum Nachweis für M. bovis und M. bovis BCG zeigten spezifische Signale. Das Schmelzpunktprofil sprach für das Vorliegen von M. africanum, M. microti oder M. canetti. Bei der einen Probe handelte es sich um einen Patienten aus Ghambia, bei dem in der MHH eine Tuberkulose des Auges festgestellt wurde (GROSSE et al. 2002). Eine Überprüfung des Stammes im NRZ für Mykobakterien in Borstel ergab die Diagnose M. africanum. In dem anderen Fall handelte es sich um eine Probe aus dem Ringversuch für Mykobakterien, der zweimal jährlich zur Qualitätskontrolle in Deutschland durchgeführt wird. Die Probe wurde vom Ringversuchsleiter als M. africanum bestätigt. Hauptkriterium für die Identifizierung von M. bovis durch die herkömmliche Methode ist die PZA Resistenz. Allerdings haben sich in der vergangenen Zeit Stämme gezeigt, die dieses Merkmal nicht aufweisen und somit falsch eingestuft werden können (COLLINS u. YATES 1984; WAYNE et al. 1991). In einer Studie von SREEVATSAN und Mitarbeitern (1996) wurde ein molekularer Nachweis für bovine Mykobakterien entwickelt. Dieser basiert auf der Detektion eines einzelnen Basenaustausches im oxyr-pseudogen von Mykobakterien des TBC. Auf dieser Grundlage wurde eine Sonde zum Nachweis von bovinen Mykobakterien mit Hilfe der PCR mit anschließender Schmelzpunktanalyse in dieser Arbeit entwickelt. Sie ermöglichte damit die Identifizierung boviner Mykobakterien des TBC. Um die für die Humanmedizin wichtige Spezies M. bovis BCG innerhalb der Gruppe der bovinen Mykobakterien zu differenzieren, wurde eine Detektionssonde entwickelt, die M. bovis BCG von den anderen Mitgliedern des TBC unterscheidet. Das verwendete Amplifikationsprinzip beruht auf den Beschreibungen von TALBOT und Mitarbeitern (1997b). Für die anschließende Detektion wurde eine Sonde entwickelt, die zu keiner der amplifizierten Fragmente eine vollständige Homologie hatte, aber beide Amplifikate von M. bovis BCG und den anderen Spezies des TBC durch bestimmte Bereiche die zu den Amplifikaten homolog waren unterscheiden kann. Durch Kombination der Sonde zum Nachweis von bovinen Mykobakterien und der BCG-Sonde in einem Lauf können die beiden Spezies M. bovis und M. bovis BCG voneinander unterschieden werden.

140 124 Diskussion Mit dem entwickelten Differenzierungssystem zur Unterscheidung innerhalb des TBC konnten nach der Diagnose Mykobakterien des TBC mit Hilfe der drei verwendeten Sonden ein eindeutiges Schmelzpunktprofil für die am häufigsten auftretenden Spezies des TBC erstellt werden. Da etwa 95% der TBC-positiven Isolate in Deutschland als M. tuberculosis identifiziert werden (HAHN 1999), könnten diagnostische Labore, die vorwiegend humanes Probenmaterial erhalten, mit der Sonde zur Identifikation von M. tuberculosis nahezu alle Proben durch die alleinige Anwendung der M. tuberculosis-sonde eindeutig identifizieren. Gleichzeitig besteht die Möglichkeit, die M. tuberculosis-sonde mit der Sonde zum Nachweis von M. bovis BCG in einer Multiplex-PCR zu kombinieren und so die beiden in der Humanmedizin in Deutschland am häufigsten auftretenden Spezies schnell und eindeutig zu identifizieren. Für den Nachweis von M. bovis in der Veterinärmedizin kann die Sonde zum Nachweis boviner Mykobakterien in Kombination mit der BCG-Sonde verwendet werden. Lediglich die mit diesen drei Sonden nicht zu differenzierenden Spezies M. africanum, M. microti und M. canetti müssen durch weiterführende Untersuchungen identifiziert werden. Diese sind jedoch geographische Varianten und sind nur selten in klinischen Materialien zu finden. Auf Sensitivitätsversuche mit den neu entwickelten Sonden wurde in dieser Arbeit verzichtet, da sie lediglich zum Nachweis aus Kulturmaterialien angewendet wurden. In diesem Fall konnte davon ausgegangen werden, dass ein hoher Anteil an Ziel- DNA vorhanden war, es sollte lediglich ein qualitativer Nachweis erfolgen. Die errechneten spezifischen Schmelzpunkte und Standardabweichungen verwendeten Sonden beziehen sich auf die jeweilig angewendete Präparationsmethode und dem damit verbundenen Elutionsmedium. Proben, die mit einer anderen Methode aufgearbeitet wurden, können in ihrem Schmelzpunkt abweichen. Grund dafür ist die Salzkonzentration im verwendeten Medium, in dem die DNA gelöst ist. Unterschiedliche Salzkonzentrationen können den Schmelzpunkt nach oben und unten verschieben (NAKANO et al. 1999; LACHNIK 2002). Daher ist es sinnvoll, bei der Untersuchung klinischer Proben die Positivkontrollen nach dem gleichen Verfahren aufzuarbeiten, bzw. für die DNA das gleiche Elutionsmedium zu verwenden, um identische Schmelzpunkte und somit vergleichbare Werte für die einzelnen Spezies zu erhalten.

141 125 Diskussion Ausblick Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden zur Isolation von Mykobakterien-DNA aus Patientenmaterial und der anschließende Nachweis mittels Amplifikation und anschließender Schmelzpunktanalyse sollen in einer prospektiven Studie an Patientenproben, die in der Routinediagnostik am Institut für Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der MHH anfallen, getestet werden. Dabei soll die Sensitivität, Spezifität und die Inhibitionsrate mit den Ergebnissen aus dem Direktausstrich, der Kultur und der bisher durchgeführten konventionellen PCR verglichen werden. Weiterhin bietet sich die Etablierung einer Multiplex-PCR zum spezifischen Nachweis von M. tuberculosis und den anderen tuberkulösen und NTM sowohl aus Kulturisolaten als auch aus dem Direktmaterial an. Durch Amplifikation des Promotorfragments zum spezifischen Nachweis von M. tuberculosis und der gleichzeitigen Amplifikation des 16S rrna-gens zum Nachweis der übrigen tuberkulösen und NTM in einer Multiplex-PCR wäre eine noch schnellere Unterscheidung möglich. Diese Multiplex-PCR im engeren Sinn birgt jedoch viele Schwierigkeiten, aufgrund von vermehrten Interaktionen zwischen den verschiedenen Primern und Sonden und der Tatsache, dass die beiden Amplifikate miteinander konkurrieren und eventuell nicht gleichmäßig amplifiziert werden. Dies ist insbesondere bei Proben, die nur geringe Mengen an Zielsequenz und Inhibitoren enthalten, also beim Direktnachweis aus Patientenmaterial, ein Problem. Zu überlegen wäre dazu, ob man das bp Fragment vom 16S rrna-gen amplifiziert, auf dem die gleichzeitige Detektion von Mykobakterien und dem TBC möglich ist, oder eine Amplifikation eines kleineren Fragmentes vom 16S rrna-gen ermöglicht, die nur die genusspezifische Region III beinhaltet. Die Amplifikation des kleineren Fragmentes hätte den Vorteil, für beide Zielstrukturen, Promotorfragment und 16S rrna-gen, etwa gleich grosse Amplifikate zu erhalten. Die Inhibitionskontrolle pab2 aus dieser Arbeit könnte für jede dieser Multiplex-PCR weiterhin verwendet werden. Dieses System würde sich sowohl für den Nachweis aus Direktmaterial als auch für den Nachweis aus der Kultur eignen.

142 126 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung / Summary Antje Bohrßen Diagnostik von Mykobakterien mittels Polymerase-Kettenreaktion: Nachweis aus Patientenmaterial und Erweiterung der Speziesdiagnostik Eine effektive Bekämpfung der Tuberkulose erfordert eine schnelle Detektion und Identifikation des Erregers. Aufgrund des langsamen Wachstums von Mykobakterien kann die Isolation und Identifizierung aus der Kultur, die als Goldstandard betrachtet wird, mehrere Wochen dauern. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) im real-time Modus ermöglicht in der klinischen Diagnostik eine Amplifikation und anschließende Sondenhybridisierung von DNA in einer Stunde. Mit dem in dieser Arbeit etablierten LightCycler-Test kann der spezifische Nachweis von Mykobakterien und gleichzeitig die Unterscheidung von tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien auf der Grundlage des 16S rrna-gens innerhalb einer Stunde aus positiven Kulturisolaten von respiratorischen und nichtrespiratorischen Patientenmaterialien gestellt werden. Zur Zeit gibt es kein schnelleres Nachweisverfahren für Mykobakterien. Durch eine optimierte Inhibitionskontrolle lassen sich negative Proben von aufgrund von Inhibitoren nicht amplifizierten Proben unterscheiden. Durch den Einsatz von zwei weiteren Sonden zur Differenzierung von nichttuberkulösen Mykobakterien konnten die am Institut für Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) neben dem M. tuberculosis-komplex (TBC) am häufigsten isolierten Spezies, M. avium und der M. chelonae-abscessus-komplex, in einer zweiten Reaktion identifiziert werden. Damit kann in etwa 80% der Fälle auf die bisher durchgeführte zeitaufwendige und kostenintensive Sequenzierung von positiven Kulturisolaten verzichtet werden und diese durch die neue beschriebene Methode ersetzt werden. Die bei HIV-Patienten in der Studie der MHH am häufigsten isolierte Spezies war M. avium, bei den mit Cystischer Fibrose (CF) erkrankten Patienten der M. chelonae-abscessus-komplex. Um eine Diagnose und Unterscheidung von tuberkulösen und nichttuberkulösen Mykobakterien direkt aus respiratorischem Patientenmaterial zu ermöglichen, wurde eine Präparationsmethode getestet, die die Detektion von Mykobakterien-DNA mit dem beschriebenen PCR-Format ermöglicht. Der Nachweis von 100 Mykobakterien pro Milliliter Sputum war mit der anschließenden Amplifikation und Detektion möglich.

143 127 Zusammenfassung Bei der Überprüfung des Direktnachweises auf die Spezifität und Sensitivität anhand von respiratorischen Patientenproben wurde eine Spezifität von 100% erreicht. Die Sensitivität betrug 66,7%, unabhängig davon, ob im Direktausstrich säurefeste Stäbchen zu sehen waren. Bei Proben die im Direktausstrich positiv waren, konnte die Sensitivität auf 88,9% und 100% gesteigert werden. Das bedeutet, dass insbesondere Proben, die im Direktausstrich säurefeste Stäbchen zeigen, für den Nachweis aus Direktmaterial geeignet sind. Da allerdings nur eine geringe Anzahl an Proben getestet wurde, muss eine endgültige Aussage hinsichtlich Spezifität und Sensitivität anhand einer prospektiven Studie gemacht werden. Schließlich konnte in dieser Arbeit die weit verbreitete phänotypische Unterscheidung zwischen M. tuberculosis und den anderen Mitgliedern des TBC mit Hilfe der Nitratreduktaseaktivität durch einen neuen molekularen Test ersetzt werden. Der T/C-Polymorphismus im Promotorbereich von narghji war spezifisch für M. tuberculosis. Damit ist ein spezifischer molekularer Nachweis für M. tuberculosis möglich. In der humanen Mykobakteriendiagnostik sind weit über 90% der TBC- Isolate M. tuberculosis, die nun eindeutig ohne weitere Phänotypisierung identifiziert werden können. Für die weitere Differenzierung innerhalb des TBC wurde außerdem der Nachweis von M. bovis und M. bovis BCG mit zwei weiteren Sonden geführt. Basierend auf diesen eigenen Ergebnissen war es möglich, M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG eindeutig aus kulturellen Isolaten zu identifizieren.

144 128 Zusammenfassung 6 Summary Antje Bohrßen Diagnosis of mycobacteria using polymerase chain reaction: detection from clinical specimens and improved species-diagnosis An effective treatment of tuberculosis requires a rapid detection and identification of the causative agent. Because of the slow growth rate of mycobacteria culture-based isolation and identification can take several weeks. The use of real-time PCR in clinical diagnostic procedures allows an amplification followed by hybridisation within one hour. In the present study using LightCycler technology, identification and differentiation of tuberculous and non-tuberculous mycobacteria from clinical specimens grown in culture was achieved by targeting the 16S rrna-gene. At present, it is the fastes available method for identification of mycobacteria. An improved inhibition control allowed the distinction between negative and because of inhibitors not amplified samples. By using two further hybridization probes the most frequently isolated species besides the M. tuberculosis-complex (TBC), M. avium and M. chelonae-abscessuscomplex were identified in a second reaction. Therefore the time-consuming and expensive sequencing could be avoided in approximately 80% of culture positive specimens. M. avium appeared to be the most prevalent species in specimens from HIV-positive patients. M. chelonae-abscessus-complex was most frequently detected in specimens from patients suffering from cystic fibrosis Furthermore we evaluated differentiation of tuberculous and non-tuberculous mycobacteria in clinical respiratory specimens without antecedent culture. The lower limit of detection was 100 mycobacteria/ml sputum. Specificity was 100% for all tests. Sensitivity was 66.7% for specimens regardless of smear result. A sensitivity of 88.9% and 100% respectively, was achieved for smear positive samples. These results suggest, that only smear positive specimens should be subjected to molecular analysis using PCR. Finally a method was developed to replace phenotypic differentiation of the TBC with a molecular technique. A single nucleotide polymorphism in narghji was specific for M. tuberculosis. In medical microbiology more than 90% of TBC isolates from human specimens are typically M. tuberculosis, which can now be diagnosed without further phenotyping. For further differentiations within the TBC we included the analysis of

145 129 Zusammenfassung M. bovis and M. bovis BCG. Based on these results, a rapid and unambiguous diagnosis of M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG from culture positive specimens was possible.

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162 146 Anhang 8 Anhang 8.1 Sequenzvergleiche Abb. 8.1: Alignment des 16S rrna-gens von 31 Mykobakterien Sequenzanalyse der hypervariablen Region A auf dem 16S rrna-gen von 31 Mykobakterienspezies. M. abscessus und M. chelonae sind identisch in der Sequenz. Jede Homologie ist durch einen Punkt dargestellt, fehlende Basen durch einen Querstrich. Ankersonde (LC68) und Detektionssonde (LC86) sind an der entsprechenden Bindungsregion eingezeichnet.

163 147 Anhang Abb. 8.2: Alignment (Promotorregion narghji) von M. tuberculosis, M. bovis und BCG Sequenzanalyse der Promotorregion narghji von M. tuberculosis, M. bovis und M. bovis BCG. An Position -215 vor Start des narg tritt ein T/C-Polymorphismus auf, der spezifisch für die Unterscheidung von M. tuberculosis zu den anderen Spezies des TBC ist. Sequenzgleiche Basen sind durch einen Punkt dargestellt. Der Pfeil beschreibt den Übergang der Promotorregion zum Gen.

164 148 Anhang 8.2 Weitere Differenzierung der kulturellen Patientenisolate Die in diesem Abschnitt aufgefürten Tabellen zeigen die isolierten Mykobakterien- Spezies aus den jeweilig mit der PCR und Schmelzpunktanalyse untersuchten respiratorischen und nichtrespiratorischen Materialien aus der Pilotstudie (vgl. Tab. 8.1), der Hauptstudie I (vgl. Tab. 8.2) und der Hauptstudie II (vgl. Tab. 8.3). Tab. 8.1: Isolierte Mykobakterien-Spezies mit Hilfe der PCR in der Pilotstudie Probenmaterial Anzahl der Proben TBC M. avium weitere NTM respiratorisch Sputum Bronchialsekret 15 Bronchoalveolarlavage 14 3 nichtrespiratorisch Blut 6 1 Magensaft 4 1 Knochenmarkbioptat 2 Liquor 1 Mittelstrahlurin 1 Stuhl 1 Perikardpunktat 1 Tab. 8.2: Isolierte Mykobakterien-Spezies mit Hilfe der PCR in der Hauptstudie I Probenmaterialien Anzahl der Proben TBC M. avium M. chel./absc. weitere NTM respiratorisch Sputum Bronchialsekret Bronchoalveolarlavage Trachealsekret 4 nichtrespiratorisch Lymphknotenbioptat 3 2 Stuhl Blut 26 3 Abstrich 3 1 Gewebe 6 2 Knochenmarkbioptat 2 1 Liquor 4 1 Magensaft 9 1 Mittelstrahlurin 20 3 Organ Sektion 1 Punktat 5 Wundabstrich 1 Biopsie 3

165 149 Anhang Tab. 8.3: Isolierte Mykobakterien-Spezies mit Hilfe der PCR in der Hauptstudie II Probenmaterialien Anzahl der Proben TBC M. avium M. chel./absc. weitere NTM respiratorisch Sputum Bronchialsekret Bronchoalveolarlavage 2 2 nichtrespiratorisch Lymphknotenbioptat Stuhl Blut Versuch zur Kreuzkontamination im KingFisher ml Partikelprozessor Abb. 8.3: Versuch der Fa. THERMOLABSYSTEMS zur Kreuzkontamination Laut Aussage der Fa. THERMOLABSYSTEMS kommt es bei der Präparation mit dem KingFisher ml Gerät zu keiner Kreuzkontamination zwischen den Proben. Im gezeigten Versuch wurde abwechselnd aus 10 6 HeLa-Zellen (Position 1,3,5,7,9,11) und Wasser (Position 2,4,6,8,10,12) im KingFisher ml mrna aufbereitet. Das Material wurde anschließend in einer RT-PCR amplifiziert und auf ein Agarosegel aufgetragen. Alle Proben die Zellen enthalten, zeigen eine Bande bei 300 bp, bei den als Negativkontrollen verwendeten Wasserproben sind diese nicht vorhanden. 8.4 Wiederholungsversuche zur Präparation von Mykobakterien- DNA direkt aus Patientenmaterial In den folgenden Tabellen sind die Ergebnisse der Wiederholungsversuche aus dem Kapitel aufgeführt. Dabei wurde eine semiquantitative Auswertung der jeweilig gemessenen Signalhöhe durchgeführt. Angegeben sind jeweils die Doppelwerte (I und II) einer Wiederholung für die verwendete Menge (Anzahl) an Bakterien M. bovis M. bovis BCG pro Milliliter Sputum.