Referat und bibliographische Beschreibung
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- Annegret Thomas
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1 Referat und bibliographische Beschreibung Die gestörte Funktion der Zelladhäsionsproteine, extrazellulären Matrixproteine, zellulärer Proteinasen, Apoptosegene und anderer Peptidsignale ist wesentlicher Bestandteil der Tumorentwicklung und -metastasierung. Schilddrüsenkarzinome stellen ein besonders geeignetes Modell zur Überprüfung dieser Hypothese dar, da aus einem einzigen Zelltyp, dem epithelialen Thyreozyten, unterschiedliche Tumorarten mit sehr unterschiedlichen klinischen Eigenschaften entstehen können: papillär differenzierte Karzinome zeigen eine vorwiegend lymphogene Metastasierung, follikulär differenzierte Karzinome eine hämatogene Metastasierung, undifferenzierte ein schnelles lokal infiltratives Wachstum verbunden mit systemischer Tumorausbreitung. Die pathophysiologische Basis für die bisher ausgeübte medikamentöse Therapie differenzierter Schilddrüsenkarzinome ist die Vorstellung, das veränderte Signaltransduktionssystem modulieren zu können, indem die Proliferationsstimulation durch TSH ausgeschaltet wird. Dieses Vorgehen wird zwar durch klinische Beobachtungen gestützt, ist aber bislang nicht sicher experimentell belegt. Ziele dieser Arbeit sind Untersuchungen der Rolle von oben genannten Faktoren auf die Tumorentstehung und -ausbreitung. Die Analyse dieser Faktoren läßt darüber hinaus neue Erkenntnisse zur Tumorsensitivität gegenüber Therapiestrategien und die Entwicklung kausal begründbarer präventiver Therapien bei Maladaptationsvorgängen im Verlauf der Tumorgenese der Schilddrüse erhoffen. TSH-R und E-Cad gehen mit zunehmendem Dedifferenzierungsgrad verloren und sind in undifferenzierten Schilddrüsenkarzinomen nicht nachweisbar. CD97 ist nicht in normalen Geweben, variabel in differenzierten und sehr stark in undifferenzierten Schilddrüsenkarzinomen und Lymphknotenmetastasen nachweisbar. Die Expression der Matrixmetalloproteinasen und ihrer Inhibitoren wurde in allen Typen von Schilddrüsentumoren nachgewiesen. Mit zunehmender Malignität der Schilddrüsenkarzinome wurde das Fas-Protein down-reguliert, während das FasL-Protein verstärkt exprimiert wurde. In-vitro haben TSH, Forskolin, PMA und Insulin keinen Einfluß auf die CD97-, MMPssowie TIMPs-, DR4, DR5, TRAIL, TNF-R1, Fas- und FasL-Expression. EGF bewirkt eine Steigerung der CD97- und MMP-9-, FasL- und DcR-1-Expression bei gleichzeitigem Verlust der Expression von E-Cad. All-trans Retinsäure führte zur verminderten CD97-, MMP-9- und TIMP-3- und DcR1- bei gleichzeitig erhöhter E-Cad-Expression. In-vivo kann eine Veränderung der TSH-Plasmakonzentration im physiologischen Bereich ultrastrukturelle Veränderungen der Thyreozyten verursachen. Sensitivierung oder Desensitivierung innerhalb des untersuchten Rattensystems hängt vom jeweiligen Applikationsmodus (kontinuierlich vs pulsatil), von der verwendeten Dosis (niedrigdosiert vs hochdosiert) und von der eingesetzten Präparation (rtsh vs rec htsh) ab. Ein Jodüberschuß führte zur deutlichen Erhöhung der TSH-Plasmaspiegel ohne Veränderung der Plasmaspiegel von T3 und T4. Jodmangel induzierte eine deutliche Verminderung der T3- und der T4-Plasmakonzentrationen, daraus resultierend einen Anstieg der TSH-Plasmaspiegel. Eine Bestrahlung aggraviert den Abfall der Schilddrüsenhormonspiegel und es findet sich ein etwas stärkerer Anstieg der TSH-Plasmaspiegel. Zwei Jahre nach der Bestrahlung bildeten die Jodmangelschilddrüsen in 25% der Fälle, unter jodreicher Ernährung in 50% der Fälle Karzinome aus. Niedrige Strahlendosen induzierten follikuläre, hohe Strahlendosen papilläre Karzinome. Euthyreose bietet den besten Schutz vor den Umweltnoxen und deren Folgeschäden. Hoang-Vu, Cuong: Zellbiologische und tierexperimentelle Untersuchungen zur Pathogenese, Proliferation und Differenzierung von Schilddrüsenkarzinomen. Halle, Univ., Med. Fak., Habil., 148 Seiten, 2000
2 INHALTSVERZEICHNIS 1 ALLGEMEINE EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG Signalübertragung im Thyreozyten Regulation der Zellproliferation und Zelldifferenzierung Störung der Transduktionskaskaden als mögliche Ursache der Tumorentstehung Die Schilddrüsenzelle: Ein Modell zur Untersuchung der Tumorgenese Thyreotropin und Wachstumsfaktoren E-Cadherin CD Metalloproteinasen und ihre Inhibitoren Apoptose-induzierende Gene ZIELE DER UNTERSUCHUNGEN MATERIAL UND METHODEN Zellbiologische Untersuchungen Gewebe und Zellinien Gewebe und Primärkulturen Zellinien Stimulationsversuche RNA-Gewinnung Northern-Blot zum Nachweis von E-Cadherin- und TSH-Rezeptor-mRNA RT-PCR Immunhistochemie Tierexperimentelle Untersuchungen Versuchstiere Technik zur Plazierung eines Dauerkatheters Experimentelles Design TRH-Stimulationsmodell Funktionsstudien Proliferationsstudien mit BrDU Histomorphologie Tg- und T4-Immunogold-Markierung TSH-Stimulationsmodell Tumorinduktionsmodell Alimentärer Jodgehalt Bestrahlung der Schilddrüse Gewinnung der Blut- und Gewebeproben Immunhistochemie Hormonanalytik... 33
3 4 ERGEBNISSE Zellbiologische Untersuchungen E-Cadherin und TSH-Rezeptor Humane Gewebe und Primärkulturen Humane Gewebe Primärkulturen Zellinie FTC CD Humane Gewebe Zellinie FTC Metalloproteinasen und ihre Inhibitoren in der Schilddrüse Humane Gewebe Korrelation der MMP- und TIMP-Expressionen zum ptnm-stadium Zellinie FTC Expression und Regulation von Apoptose-induzierten Genen in der Schilddrüse Humane Gewebe Zellinie 8505C Zusammenfassung der Ergebnisse Tierexperimentelle Untersuchungen TRH-Stimulationsmodell Schilddrüsenhormone Ratten-Thyreotropin (rtsh) rtsh-freisetzung am Ende der Infusion TRH-Konzentrationen am Ende der Infusion rtsh-antwort auf einen TRH-Bolus T4-Suppression PTU-Behandlung Proliferation Histomorphologische Veränderungen Immunogoldmarkierung TSH-Stimulationsmodell rtsh und T4-Verlauf unter Suppression T4-Antwort nach TSH-Gabe in Tieren mit und ohne T3-Suppression Konzentrationen des humanen TSH (htsh) am Ende der Infusion rtsh-c vs. rtsh-p Niedrigdosierung Hochdosierung rec-htsh-c vs. rec-htsh-p Niedrigdosierung Hochdosierung Tiermodell zur Tumorinduktion Jodvarianz Hormonkonzentrationen Gewichtsentwicklung der Tiere Histomorphometrie Tumoridentifikation Jodvarianz und Radiatio... 87
4 Hormonkonzentrationen Gewichtsentwicklung der Tiere Histomorphometrie Tumoridentifikation Zusammenfassung der Ergebnisse DISKUSSION Zellbiologische Untersuchungen Tierexperimentelle Untersuchungen Tiermodell zur Untersuchung der hypothalamo-hypophysär-thyreoidalen Achse Tiermodell zur Untersuchung der Tumorinduktion ZUSAMMENFASSUNG TSH-Rezeptor und E-Cadherin in der Schilddrüse CD97 in der Schilddrüse Metalloproteinasen und ihre Inhibitoren in der Schilddrüse Apoptose-Gene in der Schilddrüse Einfluß von TSH auf Funktion und Morphologie der Schilddrüse in-vivo Einfluß von Jodzufuhr und Radiatio auf die Schilddrüse LITERATUR THESEN DANKSAGUNG
5 VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN Abb. ABC AD AP APO APUD AS as bp BrDU BSA bsd bzw. C Ca Ca 2+ ca. camp CD CEA COS DAG DcR ddrs DMEM DNA DR4 DR5 DZ E-Cad EGF EGR E-pal ER EtBr FA Abbildung Avidin-Biotin Complex Adenom Activator protein apoptosis-inducing protein Amine Precursor Uptake Decarboxylation Aminosäuresequenz Antisense Basenpaar 5-Bromo-2 -Desoxyuridin bovine serum albumin benigne Schilddrüse beziehungsweise Kolloid Karzinom Calciumionen Circa cyclic Adenosine Monophosphate Cluster of differentiation karzinogenes embryonales Antigen CV-1 simian cells transformed with Origindefective mutant of SV40 Diacylglycerol decoy receptor Death-Domain - Rezeptoren Dulbecco modifiziertes Eagles Medium Desoxyribonukleinsäure Death-Domain -Rezeptor Typ 4 Death-Domain -Rezeptor Typ 5 Dermoidzyste E-Cadherin Epidermal Growth Factor early growth response protein palindrome Sequenz endoplasmatisches Reticulum Ethidiumbromid follikulärer Anteil Fas F7 associated surface protein FasL F7 associated surface protein Ligand FCS fötales Kälberserum FGF Fibroblast Growth Factor FI Fibrosierung FK fibröse Kapsel FS fibrotische Septen FTC follikuläres Schilddrüsenkarzinom GAPDH Glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase GS Gefäßsprossung GTC Guanidiniumthiocyanat HA autonomes Adenom Han-SPRD Hannover-Sprague Dawley-Ratte HBSS Hanks Buffer Salt Solution HD Hochdosisbestrahlung (4 Gray und 6 Gray) htsh humanes TSH I Lysosom i.v. intravenös IGF-1 Insulin-like Growth Factor InsCa insuläres Karzinom IP 3 Inositoltriphosphat IT insulärer Typ Jm Jodmangel Jn Jodnormal Ju Jodüberschuß K/Ko Kontrolle KG Körpergewicht KS Kapillarsprossung L-CAM Leberzell- Adhäsionsmoleküle LH luteinisierendes Hormon LSAB Labelled Strept Avidin- Biotin Staining MMP Matrix-Metalloproteinase m-rna messenger- Ribonukleinsäure MTC medulläres Schilddrüsenkarzinom MT-MMP membrane type Matrix- Metalloproteinase MTU Methylthioharnstoff
6 N Nukleus n.s. nicht signifikant NaCl-C kontinuierliche NaCl-Infusion NaCl-P pulsatile NaCl-Infusion ND Niedrigdosisbestrahlung (1Gray und 2 Gray) NFκB nuclear transcription factor-kappa B NIH National Institute of Health NIS Natrium-Jodid-Symporter NK-Zellen natural-killer- Zellen NMU Nitrosomethylharnstoff NSD Nebenschilddrüse nt Normalgewebe o.g. oben genannt PBS Phosphatpuffer PEA polyoma enhancer activator Pi Phosphoinositol-Kalzium- Stoffwechsel PIP 2 Phosphatidylinositoldiphosphat PKA Proteinkinase A PLC Phospholipase C pm Metastasennachweis PMA Phorbol 12-myristate-13- acetat pn Lymphknotenmetastasen pt Tumorgröße PTC papilläres Schilddrüsenkarzinom PTU Propylthiouracil PVC Polyvinylchlorid RA all-trans-retinsäure rec-htsh rekombinantes humanes Thyreotropin Rez. Rezidiv RGD Arg-Gly-Asp-Motif RNA Ribonukleinsäure RT-PCR Reverse transcriptase Polymerase chain reaction rtsh Ratten-Thyreotropin r-tsh-c kontinuierliche Ratten- TSH-Infusion r-tsh-p pulsatile Ratten-TSH-Infusion s Sense S Struma SP Specificity protein ssdna salmon sperm DNA SZ solide Zellnester T3 L-3,5,3 -Trijodthyronin T4 L-3,5,3,5 -Tetrajodthyronin = Thyroxin Tab. Tabelle TBE Tris- Borsäure- EDTA Tg Thyreoglobulin TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinase TM7 sieben-transmembranöse Region TNF/NGF Tumor Necrosis Factor / Nerve Growth Factor TPO thyreoidale Peroxidase TRAIL TNF-related-apoptosis inducing-ligand TRH Thyrotropin releasing hormone TRH-C kontinuierliche TRH- Infusion TRH-P pulsatile TRH- Infusion TSH Thyreoidea stimulating hormone = Thyreotropin TSH-R Thyreoidea stimulating hormone receptor TSI schilddrüsenstimulierende Immunglobuline UTC/ATC undifferenziertes anaplastisches Schilddrüsenkarzinom V Mikrovilli vs. versus (im Vergleich zu) z.b. zum Beispiel
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