Simplexa C. difficile Direct

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1 Simplexa C. difficile Direct REF MOL2950 Rev. A (Deutsch) Ein Real-Time-PCR-Assay zum qualitativen Nachweis von C.-difficile-DNA in vitro In-vitro-Diagnostikum ANWENDUNGSBEREICH Der Simplexa C. difficile Direct-Assay von Focus Diagnostics ist für die Anwendung auf dem Integrated Cycler-Gerät zum Nachweis des Toxin-B-Gens (tcdb) von Clostridium difficile in flüssigen oder ungeformten Stuhlproben von Patienten mit einer vermuteten C. difficile Infektion (CDI) bestimmt. Der Test dient als Hilfsmittel bei der Diagnose von Erkrankungen im Zusammenhang mit CDI. Der Assay ist nur zur Verwendung durch Fachkräfte bestimmt und unterliegt der Verschreibungspflicht. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG Clostridium difficile ist ein grampositives, anaerobes, sporenbildendes Stäbchenbakterium, das Erkrankungen verursacht, die mit erheblicher Morbidität und Mortalität einhergehen. Toxinbildende Stämme von C. difficile produzieren Virulenzfaktoren, Toxin A (Enterotoxin) und Toxin B (Zytotoxin), die Darmschädigung, starke Bauchschmerzen und Entzündungen verursachen. 1,2,3,4,5 Abgesehen von sehr wenigen Ausnahmen produzieren toxinbildende C.-difficile-Stämme immer beide Toxine. 6,7 Studien zufolge ist der Erreger verantwortlich für bis zu einem Drittel aller Antibiotika-assoziierten Durchfälle, für 50 bis 75% aller Antibiotikaassoziierten Kolitiden und für 90 bis 100% aller Fälle von pseudomembranöser Kolitis. 8,9,10,11,12 Die Krankheitsbilder reichen von leichter, wässriger, nichtblutiger Diarrhö bis hin zu lebensbedrohlichen pseudomembranösen Kolitiden, toxischem Megakolon und Sepsis. 5,12 C. difficile wird entweder fäkal-oral oder über kontaminierte Oberflächen von Mensch zu Mensch übertragen. Wenn C. difficile in das Umfeld von z.b. Kliniken oder Pflegeheimen gelangt, bildet das Bakterium hochresistente Sporen, die äußerst langlebig und resistent gegen viele Desinfektionsmittel sind. CDI tritt in allen Altersgruppen auf. Besonders gefährdet sind jedoch länger hospitalisierte und immunsupprimierte Patienten und ältere Heimbewohner unter antibiotischer Behandlung. Durch die Behandlung mit Antibiotika wird die normale Darmflora zerstört, so dass sich C. difficile rasch vermehren und Infektionen verursachen kann. Zu den üblichen Verfahren zum Nachweis von C. difficile zählen der Nachweis von spezifischer Zytotoxizität in Zellkultur, der Toxinnachweis in Zellkultur und Enzymimmunoassays (EIA) für Toxin A und B. Als Goldstandard gelten der Zytotoxin-Assay und der Toxinnachweis. 13,14 Wegen ihrer ungenügenden Sensitivität (65 bis 90%), der langen Durchlaufzeit (24 bis 48 Stunden) und der Notwendigkeit von Fachkenntnissen in Zellkultur und in der Interpretation der Testergebnisse halten viele Experten diese Tests jedoch für ungeeignet für die Verwendung als diagnostische Routinetests. 15,16 EIA wurden daher zum am häufigsten verwendeten Testverfahren in klinischen Labors, da sie einen schnelle Durchlaufzeit und eine hohe Spezifität haben. Die Sensitivität von EIA beträgt teilweise jedoch nur 49%. 14,17 Aufgrund dieser geringen Sensitivität gilt dieses Verfahren nicht mehr als angemessen, wenn es als alleiniger Test zum Ausschluss von CDI herangezogen wird. 18,19 In den letzten Jahren hat sich die Anwendung von Real-Time-PCR-Assays für die Diagnostik von Infektionen mit toxinbildenden C.difficile-Stämmen als vorteilhaft im Hinblick auf Sensitivität, Spezifität und Durchlaufzeit erwiesen. 20,21,22 So können Patienten schneller behandelt und Infektionen besser kontrolliert werden. 23 GRUNDLAGEN DES VERFAHRENS Beim Simplexa C. difficile Direct-Assaysystem handelt es sich um ein Real-Time-PCR-System zur direkten Amplifikation und Detektion der DNA von toxinbildenden C.- -difficile-stämmen aus unbehandelten flüssigen und ungeformten Stuhlproben ohne vorherige Nukleinsäureextraktion. Das System besteht aus dem Simplexa C. difficile Direct-Assay, dem Integrated Cycler (mit der Integrated Cycler Studio-Software), der Direktamplifikationsplatte und dazu benötigtem Zubehör. Im Simplexa C. difficile Direct-Assay werden bifunktionelle fluoreszenzmarkierte Primersonden zusammen mit entsprechenden Rückwärts-Primern verwendet, um die DNA von C. difficile sowie von internen Kontrollen zu amplifizieren. Das Target der PCR ist eine Sequenz in einer hoch konservierten Region des Toxin-B-Gens von C. difficile, (tcdb). Zur Überprüfung einer Fehlfunktion und/oder Hemmung der PCR wird eine interne DNA-Kontrolle mitgeführt.

2 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 2 MITGELIEFERTES MATERIAL Der Diagnostics Simplexa C. difficile Direct-Assay von Focus Diagnostics enthält ausreichend Reagenzien für 24 Bestimmungen. Nach Erhalt bei -10 C bis -30 ºC aufbewahren (keine Gefriergeräte mit Abtauautomatik verwenden). Jedes Röhrchen enthält genügend Material für eine einzelne Reaktion. Innerhalb von 30 Minuten nach dem Auftauen verwenden. Bezeichnung der Komponente Simplexa C. difficile Direct Reaction Mix REF Beschreibung des Kits EG-SYMBOL AUF ETIKETT Kurzbezeichnung Deckelfarbe Anzahl Fläschchen Reaktionen pro Fläschchen/ Kit Volumen pro Fläschchen MOL2951 REAG A RM Braun 24 1/24 50 µl Kit-Komponente Beschreibung der Komponente Inhalt DNA-Polymerase, Puffer, dntps, DNA-Matrize (interne Kontrolle) farbstoffmarkierte, fluoreszierende Sondenprimer für den spezifischen Nachweis von toxinbildenden C.-difficile-Stämmen und für die interne Kontrolle. Simplexa Group A Strep Direct Reaction Mix (RM) (Reaktionsgemisch) Target Toxinbildende C.-difficile Stämme Sonden Fluorophor (Farbstoff) Anregung (nm) Emission (nm) Zielgen FAM tcdb Interne Kontroll-DNA Q n. z. Simplexa C. difficile Direct Kit Barcode-Karte Test-spezifische Parameter SEPARAT GELIEFERTES MATERIAL 1. Kit mit Direktamplifikationsplatte (Direct Amplification Disc) (REF MOL1455) a) Direktamplifikationsplatten zur Verwendung auf dem Integrated Cycler 2. Simplexa C. difficile Sample Prep-Kit (REF MOL5290) a) Sample Prep-Puffer REF MOL5291 Nur zum Einmalgebrauch. b) Sample Prep Swabs (Abstrichtupfer) zum Probentransfer REF Nur zum Einmalgebrauch. Hinweis: Sample Prep Buffer (MOL5291) als Leerwertkontrolle (NTC, No Template Control) verwenden. Ein zusätzliches Fläschchen zur Verwendung als NTC wird im Sample Prep-Kit mitgeliefert. Hinweis: Bei jedem Kontrolllauf, in dem eine Positivkontrolle getestet wird, wird ein weiteres Fläschchen mit Sample Prep- Puffer für die Verwendung als NTC verfügbar. ERFORDERLICHES, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL 1. Integrated Cycler mit Integrated Cycler Studio-Software, Version 6.0 oder höher 2. Simplexa C. difficile Positive Control Pack (REF MOL2960) 3. Pipette mit fest eingestelltem Volumen von 50 µl (ergonomischer Hochleistungspipettor Signature mit Fixvolumen von VWR, Modell VWR FE50 oder gleichwertige Pipette) 4. Sterile, nukleasefreie Einmalpipettenspitzen mit Filter 5. Gefrierschrank, -10 C bis -30 C (mit manueller Abtaufunktion), für die Lagerung der Kit-Komponenten 6. Kühlschrank mit 2 C bis 8 C (für Proben) 7. Einweg-Schutzhandschuhe (ungepudert) EMPFOHLENES MATERIAL 1. Replacement Foil Wedges (REF MOL1550) HANDHABUNG UND HALTBARKEIT VON REAGENZIEN 1. Reagenzien bei -10 bis -30 aufbewahren (keine Gefriergeräte mit Abtauautomatik verwenden).

3 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 3 2. Reagenzien vor Gebrauch bei Raumtemperatur auftauen lassen (Temperaturbereich ca. 18 C bis 25 C). 3. Kits und Reagenzien nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden. 4. Nach der Entnahme des Reaktionsgemischs aus der Gefrierlagerung den Test innerhalb von 30 Minuten starten. 5. Das Reaktionsgemisch nicht vortexen. 6. Das Reaktionsgemisch nicht wieder einfrieren. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN 1. Beim Umgang mit den Kit-Reagenzien und Geräten persönliche Schutzausrüstung wie (jedoch nicht beschränkt auf) Handschuhe und Laborkittel tragen. Hände nach der Durchführung des Tests gründlich waschen. 2. Nicht mit dem Mund pipettieren. 3. In Bereichen, in denen Kit-Reagenzien und/oder Humanproben gehandhabt werden, darf nicht geraucht, getrunken und gegessen werden. 4. In diesen Bereichen sollten auch keine Kontaktlinsen eingesetzt/herausgenommen und kein Make-up aufgetragen werden. 5. Sämtliche Proben und Discs sind als potenziell infektiös zu betrachten und dementsprechend zu handhaben. 6. Die Kontamination von Reagenzien bzw. Patientenproben kann zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. Befolgen Sie eine gute Laborpraxis und überprüfen Sie den Arbeitsablauf. 5,6 7. Nur das in diesem Beipackzettel beschriebene Protokoll verwenden. Bei Nichteinhaltung des Protokolls oder der angegebenen Zeiten sowie Temperaturen kann es zu fehlerhaften Testergebnissen kommen. 8. Der Testansatz sollte bei Raumtemperatur (Temperaturbereich ca. 18 C bis 25 C) erfolgen. 9. Zum Überführen von Proben und Reaktionsgemisch kalibrierte Fixvolumenpipetten oder gleichwertige Artikel verwenden. 10. Die Unterseite der Folie, die in Kontakt mit den Kavitäten und der Plattenoberfläche kommt, möglichst nicht berühren. 11. Um potenzielle Fehlergebnisse zu verhindern, ist darauf zu achten, die Proben und Reagenzien in die jeweils korrekten Kavitäten zu pipettieren. 12. Den Pipettiervorgang und das Anbringen von Abdeckklebefolie in einer Reihe von Probe- und Reaktionskavitäten zu Ende führen, bevor die Folie der nächsten Reihe(n) von Proben- und Reaktionskavitäten geöffnet wird. 13. Den Lauf innerhalb von 30 Minuten nach der Entnahme des Fläschchens mit dem Reaktionsgemisch aus der Gefrierlagerung starten. 14. Nicht versuchen, die Abdeckklebefolie von bereits benutzten Keilen zu entfernen, oder die Proben- und Reaktionsöffnungen, die bereits bei vorangegangenen Durchgängen verwendet wurden, noch einmal zu verwenden. 15. Die Discs können mehrfach verwendet werden, bis alle 8 Keile benutzt worden sind. Gebrauchte Discs ohne Abnehmen der Abdeckklebefolie als biologisch gefährlichen Abfall entsorgen. 16. Nach jedem Gebrauch sind die DAD-Discs flach und mit der nummerierten Folienseite nach oben zu lagern. 17. Das Reaktionsgemisch enthält >1 % Glycerin. Nach Einatmen oder Berührung sollten Erste-Hilfe-Maßnahmen eingeleitet werden. 18. Das Kit bei offensichtlich angebrochener oder beschädigter Verpackung bzw. angebrochenem oder beschädigtem Inhalt nicht verwenden und Focus Diagnostics kontaktieren. Kontaktadressen befinden sich auf der letzten Seite dieses Dokuments. 19. Die Spektralmatrix muss auf jedem Integrated Cycler installiert werden und darf nur dann geändert werden, wenn von Focus Diagnostics ein aktualisierter QR-Code für das Instrument bereitgestellt wird. Jeder Integrated Cycler hat eine eigene spezifische Spektralmatrix. Die Spektralmatrix für jedes Integrated Cycler-Gerät befindet sich auf der vorderen Umschlagseite des Integrated Cycler-Hardware-Handbuchs. Kann das Matrixetikett nicht gescannt oder gefunden werden, kontaktieren Sie bitte Focus Diagnostics. Kontaktadressen befinden sich auf der letzten Seite dieses Dokuments. 20. Das Nichtinstallieren bzw. die Änderung der Spektralmatrix kann zu falschen Ergebnissen führen. GEBRAUCHSANWEISUNG A. PROBENGEWINNUNG Zur Gewinnung der Stuhlproben sind die üblichen Verfahren und Vorsichtsmaßnahmen anzuwenden. Stuhlproben sollten während des Transports zum Labor bei 2 C bis 25 C aufbewahrt werden. Proben können bis zu 2 Tage vor dem Test bei 2 C bis 8 C gelagert werden. B. EINSTELLUNG DES GERÄTS FÜR DIE REAL-TIME-PCR Einzelheiten darüber, wie die Integrated Cycler Studio Software zu konfigurieren ist, um eine Assaydefinition hinzuzufügen, einen Lauf einzustellen und die Läufe auf dem Integrated Cycler zu analysieren, sind der Bedienungsanleitung des Integrated Cycler zu entnehmen. C. LADEN DER DIREKTAMPLIFIKATIONSPLATTE UND AMPLIFIZIERUNG MITTELS ECHTZEIT-PCR HINWEIS: Vor der PCR-Amplifikation ist keine Probenextraktion erforderlich. 1. Die zu testenden Proben auswählen. 2. Tupfer in die gut durchmischte Stuhlprobe eintauchen, bis ¾ der Spitze eingetaucht ist.

4 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 4 3. Überschüssigen Stuhl durch Auspressen des Tupfers an der Innenseite des Probenbehälters entfernen. 4. Tupfer in das Röhrchen mit dem Sample Prep-Puffer tauchen, bis sich der größte Teil der Probe vom Tupfer gelöst hat. 5. Tupfer entsorgen. 6. Röhrchen mit Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur (ca. 18 C bis 25 C) auftauen. Für jede zu testende Probe oder Kontrolle ein Röhrchen mit Reaktionsgemisch auftauen. 7. Den Barcode auf dem Fläschchen mit dem Reaktionsgemisch des Simplexa C. difficile Direct oder auf der Barcode- Karte einscannen. 8. Den Platten-Barcode auf der Direktamplifikationsplatte (DAD) einscannen. 9. Jede Probenkennung einscannen oder eingeben. 10. Die Abdeckklebefolie jeweils nur von einem Keil abziehen, um die Probenkavitäten (SAMPLE) und Reaktionskavitäten (R) zu öffnen, dabei jedoch die Abdeckklebefolie nicht vollständig entfernen (Abbildung 1 und 2). Die Unterseite der Folie, die in Kontakt mit den Kavitäten und der Plattenoberfläche kommt, möglichst nicht berühren. 11. Stellen Sie sicher, dass das Reaktionsgemisch vollständig aufgetaut ist. Die Röhrchen falls notwendig kurz zentrifugieren. (Das Reaktionsgemisch nicht vortexen.) 12. Mit der Festvolumenpipette 50 µl des Reaktionsgemischs in die Reaktionskavität (R) überführen. 13. Mit der Festvolumenpipette 50 µl der Probe bzw. Kontrolle in die Probenkavität (SAMPLE) überführen. 14. Den Keil mit der abgezogenen Klebefolie abdecken und diese zur Versiegelung der Kavitäten an den Rändern der Platte fest andrücken. Wenn die ursprüngliche Folie zerrissen ist, dürfen die Kavitäten nicht befüllt werden. Stattdessen einen anderen Keil verwenden. 15. Den Laschenteil der Abdeckfolie vorsichtig an der Perforierung abtrennen. 16. Für die nächste(n) Probe(n) Schritt 6 bis 15 wiederholen. 17. Die versiegelte Direktamplifikationsplatte (DAD) in den Integrated Cycler einsetzen und den Lauf starten. Abbildung 1 Platte mit abgezogener Folie von der Proben [Sample]- und der Reaktionskavität [R] in Keil 3 Abbildung 2 Probenkavität [Sample] und Reaktionskavität [R] HINWEISE (nur zur Information - keine Maßnahmen/Umsetzung erforderlich): 1. Der Barcode-Scanner erzeugt einen Signalton, wenn Informationen aus dem Barcode erfolgreich in die Software gescannt worden sind. 2. Kits von Focus Diagnostics können Versionsnummern für Assaydefinitionen enthalten. Falls eine Versionsnummer vorhanden ist, wird sie an die Assay Definition angehängt, z. B. als Probe IVD Assay.2. Wenn mehrere Versionen vorhanden sind, verwendet die Software automatisch die mit der eingescannten Chargennummer verknüpfte Assaydefinition. QUALITÄTSKONTROLLE Als externe Kontrolle für die Qualitätskontrolle, zur Einarbeitung oder für Leistungstests kann das Simplexa C. difficile Positive Control Pack (MOL2960) verwendet werden. Jedes Labor sollte, ausgehend von den vor Ort geltenden Gesetzen, Bestimmungen und der üblichen guten Laborpraxis eigene Qualitätskontrollbereiche wie auch die Häufigkeit der Qualitätskontrollen ermitteln. Anweisungen zur Testung der Positivkontrolle sind der Packungsbeilage des Simplexa C. difficile Positive Control Pack (PI.MOL2960) zu entnehmen.

5 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 5 Art der Kontrolle Erwartete Kontrollergebnisse C. difficile Interne DNA-Kontrolle (DNA Internal Control, DNA IC) Simplexa C. difficile Positive Control 1 Detektiert Nicht zutreffend Leerwertkontrolle (NTC) Nicht detektiert Gültig Typische Ct-Werte für die Positivkontrolle liegen in einem Bereich von 28 bis 34. Eine Detektion der Simplexa DNA Internal Control (DNA IC) ist bei Detektion von toxinbildenden C.-difficile Stämmen für ein gültiges Ergebnis nicht erforderlich. ERGEBNISSE Nach Beendigung des Laufs werden die Ergebnisse von der Software automatisch berechnet und angezeigt. 1. Für jede eingegebene Zugangs-ID (Proben-ID) zeigt die Software ein Ergebnis ( Detected [Detektiert], Not Detected [Nicht detektiert] oder Invalid (Ungültig) für C. difficile an. a. Detected deutet darauf hin, dass DNA von toxinbildenden C.-difficile-Stämmen in der Patientenprobe vorhanden ist. b. Not Detected deutet darauf hin, dass keine DNA von toxinbildenden C.-difficile-Stämmen in der Patientenprobe vorhanden ist. c. Invalid deutet darauf hin, dass die Bestimmung der Anwesenheit bzw. Abwesenheit von DNA von toxinbildenden C.-difficile-Stämmen in der Patientenprobe nicht möglich ist. Dieses Ergebnis kann folgende Ursachen haben: 1) Fehler der internen Kontrolle (DNA IC) oder 2) unzureichende Probenmenge. Die Probe muss erneut getestet werden. Siehe Abschnitt Ungültige Ergebnisse weiter unten. d. Das Ergebnis EC500 deutet auf einen Datenqualitätsfehler hin. Die Software konnte für diese(n) Analyt(en) keine gültige Amplifikation erkennen. Die Probe sollte erneut getestet werden. 2. Den Bericht ggf. ausdrucken. a. Die Ergebnisse ggf. exportieren. UNGÜLTIGE ERGEBNISSE Bei einem als Invalid (ungültig) ausgewiesenen Ergebnis oder einem Fehlercode sollte die Probe erneut aufbereitet werden. Hierzu sollte ein neuer Sample Prep Swab (Tupfer) sowie frischer Sample Prep-Puffer verwendet werden. Folgen Sie dazu bitte den Anweisungen in den Schritten 2 15 im Abschnitt C der Gebrauchsanleitung. Falls der Fehler weiterhin besteht, wenden Sie sich an den technischen Kundendienst von Focus Diagnostics. EINSCHRÄNKUNGEN 1. In-vitro-Diagnostikum 2. Verschreibungspflichtig. 3. Abgesehen von sehr wenigen Ausnahmen produzieren toxinbildende Stämme von C. difficile immer Toxin A und Toxin B. Dieser Assay weist nur das Toxin B-Gen tcdb nach. 4. Die Ergebnisse aus diesem Test müssen im Zusammenhang mit der klinischen Anamnese, den epidemiologischen Daten und anderen Labordaten, die dem Arzt vorliegen, bewertet werden. 5. Der Nachweis bakterieller Nukleinsäuren ist abhängig vom ordnungsgemäßen Vorgehen bei der Entnahme, dem Transport und der Handhabung, Aufbewahrung und Vorbereitung der Proben. Nichtbeachtung der ordnungsgemäßen Vorgehensweise bei einem dieser Schritte kann zu fehlerhaften Ergebnissen führen. 6. Die Prävalenz der Bakterieninfektion kann den prognostischen Wert des Assays beeinflussen. 7. Negative Ergebnisse schließen eine Infektion mit C. difficile nicht aus und dürfen nicht als alleinige Grundlage für die Behandlung oder andere Entscheidungen bezüglich der Versorgung des Patienten herangezogen werden. 8. Falls die Bakterien Genmutationen, Insertionen, Deletionen oder Rearrangements aufweisen oder wenn die Testung im Frühstadium der Erkrankung erfolgt, kann es zu falsch negativen Ergebnissen kommen. 9. Wie bei anderen Testverfahren kann es auch hier zu falsch positiven Ergebnissen kommen. Eine Wiederholung des Tests oder die Durchführung des Tests mit einem anderen Gerät könnte in manchen Fällen indiziert sein. 10. Bei dem Assay handelt es sich um ein qualitatives Testverfahren; es erlaubt keine Aussage über die Gesamtmenge der detektierten Erreger. 11. Die Leistungsfähigkeit dieses Assays wurde nicht für Patienten ohne Symptome einer Infektion mit C. difficile ermittelt. 12. Die Leistungsfähigkeit dieses Assays zur Überwachung einer Therapie bei Infektion mit C. difficile wurde nicht ermittelt. 13. Dieser Assay kann keine Erkrankung ausschließen, die durch andere bakterielle oder virale Erreger verursacht wird. 14. Die Informationen auf dem Fläschchen mit dem Reaktionsgemisch des Simplexa C. difficile Direct-Assays können nur mit einem Barcode-Scanner in die Integrated Cycler Studio-Software übertragen werden. Bei einer Funktionsstörung des Scanners oder wenn die Informationen aus einem anderen Grund nicht übertragbar sind, wenden Sie sich an den technischen Kundendienst von Focus Diagnostics.

6 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 6 SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN METHODENVERGLEICH 2351 Proben von Patienten mit Anzeichen und Symptomen einer Infektion mit C. difficile wurden prospektiv gesammelt. Diese prospektiven Proben wurden vom 3. Dezember 2015 bis zum 10. Juni 2016 an fünf (5) geografisch unterschiedlichen Orten entnommen dieser Proben konnten mit dem Simplexa C. difficile Direct-Assay getestet werden; 10 davon waren jedoch in alternativen molekularen Testverfahren ungültig. Daher konnten insgesamt 2326 Proben mit Simplexa C. difficile Direct und alternativen molekularen Verfahren getestet werden. Die Proben wurden an den Entnahmeorten mit dem Simplexa C. difficile Direct-Assay getestet. Für jede Probe in der Studie wurde außerdem ein Test mit dem am Entnahmeort üblichen molekularen Testverfahren durchgeführt. Der Anteil der ungültigen Ergebnisse in der klinische Prospektivstudie mit Simplexa C. difficile Direct betrug 0,75% oder 25 von 3327 Proben. Die Ergebnisse von drei verschiedenen Nukleinsäureamplifikationstests (NAAT) wurden für einen Vergleich mit dem Simplexa C. difficile Direct-Assay gesammelt. Es wurden 2326 Ergebnisse mit den NAAT-Vergleichsassays erfasst (829 Proben mit NAAT1, 776 Proben mit NAAT2 und 721 Proben mit NAAT3). Zusätzlich zum Simplexa C. difficile Direct-Assay wurden die Proben durch direkten oder kombinierten (direkten plus angereicherten) Toxinnachweis in Zellkultur getestet. NAAT1 Simplexa Detektiert Nicht detektiert Gesamt Detektiert Nicht detektiert Gesamt Positive Übereinstimmung 93,4% (114/122) 95 % KI: 87,6% bis 96,6% Negative Übereinstimmung 96,6% (683/707) 95 % KI: 95,0% bis 97,7% Positiver prädiktiver Wert (PPV) 82,6% (114/138) 95 % KI: 75,4% bis 88,0% Negativer prädiktiver Wert (NPV) 98,8% (683/691) 95 % KI: 97,7% bis 99,4% NAAT2 Simplexa Detektiert Nicht detektiert Gesamt Detektiert Nicht detektiert Gesamt Positive Übereinstimmung 93,9% (138/147) 95 % KI: 88,8% bis 96,7% Negative Übereinstimmung 94,0% (591/629) 95 % KI: 91,8% bis 95,6% Positiver prädiktiver Wert (PPV) 78,4% (138/176) 95 % KI: 71,8% bis 83,8% Negativer prädiktiver Wert (NPV) 98,5% (591/600) 95 % KI: 97,2% bis 99,2% NAAT 3 Simplexa Detektiert Nicht detektiert Gesamt Detektiert Nicht detektiert Gesamt

7 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 7 NAAT 3 Simplexa Detektiert Nicht detektiert Gesamt Positive Übereinstimmung 84,8% (112/132) 95 % KI: 77,8% bis 90,0% Negative Übereinstimmung 99,2% (584/589) 95 % KI: 98,0% bis 99,6% Positiver prädiktiver Wert (PPV) 95,7% (112/117) 95 % KI: 90,4% bis 98,2% Negativer prädiktiver Wert (NPV) 96,7% (584/604) 95 % KI: 94,9% bis 97,8% Zusammenfassung der Ergebnisse des Vergleichs von Simplexa und alternativen molekularen Verfahren Gesamt (alternative molekulare Verfahren) Simplexa Detektiert Nicht detektiert Gesamt Detektiert a 431 Nicht detektiert 37 b Gesamt Positive Übereinstimmung 90,8% (364/401) 95 % KI: 87,5% bis 93,2% Negative Übereinstimmung 96,5% (1858/1925) 95 % KI: 95,6% bis 97,3% Positiver prädiktiver Wert (PPV) 84,4% (364/431) 95 % KI: 80,7% bis 87,7% Negativer prädiktiver Wert (NPV) 98,0% (1858/1895) 95 % KI: 97,3% bis 98,6% Zusätzlich zum Simplexa C. difficile Direct-Assay wurden die Proben durch direkten und kombinierten (direkten plus angereicherten) Toxinnachweis in Zellkultur als Referenzstandard getestet. Die Diskrepanzauflösung für die Ergebnisse aller alternativen molekularen Methoden unter Verwendung des Toxinnachweises in Zellkultur als Resolver ergab eine positive Übereinstimmung von 394/406 (97,0%), eine negative Übereinstimmung von 1883/1920 (98,1%), einen positiven prädiktiven Wert von 394/431 (91,4%) und einen negativen prädiktiven Wert von 1908/1920 (99,4%). REPRODUZIERBARKEIT Die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse des Simplexa C. difficile Direct wurde in drei Prüfzentren an jeweils mindestens fünf nicht aufeinander folgenden Tagen untersucht. Insgesamt wurden sieben Probenpanels getestet, um die Reproduzierbarkeit des Assays zu beurteilen. Jedes Probenpanel enthielt eine Positivkontrolle (PC), eine Negativkontrolle (TE-Puffer-Stuhlmatrix ohne Analyt) und vier künstliche Proben, die durch Beimpfen einer negativen Stuhl/TE-Matrix mit dem Erreger hergestellt wurden. Die vier hergestellten Proben bestanden aus einer schwach positiven und einer mäßig positiven Probe für C. difficile sowie einer schwach positiven und einer mäßig positiven Probe für C. difficile. Jede dieser Proben wurde durch Beimpfen von negativer Stuhl/TE-Matrix mit einer bestimmten Konzentration des jeweiligen Stammes hergestellt. Die Ergebnisse aller Prüfzentren sind in den folgenden Tabellen zusammengefasst.

8 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 8 Analyt Probe ATCC LP ATCC MP Prüfzentrum 1 Übereinstim Prüfzentrum 2 Übereinstim Prüfzentrum 3 Übereinstim Gesamtübe reinstimmu ng in % mit mung in % mung in % mung in % Durchs Gesamt Durchs Gesamt Durchs Gesamt den mit den mit den mit den chn. Ct % VK chn. Ct % VK chn. Ct % VK erwarteten erwarteten erwarteten erwarteten Ergebnisse Ergebnissen Ergebnissen Ergebnissen n Negativ 1 Positivkontrolle NAP1A - LP NAP1A - MP Gesamtüberein stimmung 38,0 1,5 37,3 1,7 n. z. n. z. 31,7 1,7 39,6 2,6 36,4 1,3 38,1 1,4 37,1 1,3 n. z. n. z. 31,4 1,6 39,1 2,0 36,3 1,0 96,7% (29/30) 37,5 1,4 37,0 1,5 n. z. n. z. 30,9 1,4 39,4 1,9 36,6 1,4 100% (180/180) 100% (180/180) 100% (180/180) (90/90) (90/90) (90/90) (90/90) 98,9% (89/90) (90/90) 100% (540/540) 95 % KI 95,9% bis 95,9% bis 95,9% bis 95,9% bis 94,0% bis 99,8% 95,9% bis 99,3% bis 100% 1 Die erwarteten Ergebnisse von Proben, die negativ für C. difficile waren, lauten "Negativ". ANALYSEEMPFINDLICHKEIT / NACHWEISGRENZE Die Nachweisgrenze (Limit of Detection, LoD) von Simplexa C. difficile Direct wurde anhand eines Panels künstlicher Proben bestimmt, die durch Beimpfen einer negativen Stuhl/TE-Puffer-Matrix mit 2 C.-difficile-Stämmen aus einer Keimbank hergestellt wurden. Von diesen Stämmen wurden serielle Verdünnungen hergestellt. Es wurden insgesamt 32 Parallelproben getestet. Die LoD des Stammes war die niedrigste Konzentration von C. difficile, bei der mindestens 95 % der Parallelproben als C. difficilepositiv nachgewiesen wurden. Die folgende Tabelle zeigt den Wert der Nachweisgrenze (LoD) als KBE/ml für zwei C.-difficile-Stämme. C.-difficile-Stamm LoD-Konzentration (KBE/ml) ATCC ,95 NAP1A 0,43 Analytische Reaktivität Die analytische Reaktivität des Simplexa C. difficiledirect-assays wurde für 32 C.-difficile-Stämme untersucht, die nicht bei der Bestimmung der Nachweisgrenze (Limit of Detection, LoD) des Assays verwendet worden waren. Die Proben für die Ermittlung der analytischen Reaktivität wurden durch Beimpfen von negativer Stuhl/TE-Matrix mit einem der 32 neu angezogenen und neu austitrierten Stämme bei 2 bis 4-facher LoD hergestellt. Jede Probe wurde im Dreifachansatz getestet. Die Matrix wurde zunächst mit dem jeweiligen Stamm in einer Konzentration beimpft, die der 2 bis 4-fachen LoD entsprach. Wenn mindestens eine der drei Parallelproben C. difficile-negativ war, wurde eine höhere Konzentration getestet, bis alle drei Parallelproben nachgewiesen worden waren. Alle 32 Stämme testeten positiv auf C. difficile bei bzw. unter 512 KBE/ml.

9 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 9 Stamm interferierenden Substanz (KBE/ml) Clostridium difficile ATCC Clostridium difficile ATCC Clostridium difficile ATCC Clostridium difficile ATCC Clostridium difficile ATCC Clostridium difficile ATCC Clostridium difficile ATCC Clostridium difficile ATCC Clostridium difficile ATCC Clostridium difficile ATCC Clostridium difficile BAA Clostridium difficile BAA Clostridium difficile BAA Clostridium difficile BAA Clostridium difficile BAA Clostridium difficile BAA Clostridium difficile BAA Clostridium difficile BAA Clostridium difficile BAA Clostridium difficile CCUG Clostridium difficile IS81 4 Clostridium difficile R Clostridium difficile R Clostridium difficile R Clostridium difficile R Clostridium difficile R Clostridium difficile R Clostridium difficile R Clostridium difficile R Clostridium difficile R Clostridium difficile R Clostridium difficile R Kreuzreaktivität (Analytische Spezifität) Die Kreuzreaktivität des Simplexa TM C. difficile Direct-Assays wurde mit 127 potenziell kreuzreagierenden Erregern ermittelt. Die Proben wurden in einer internen Prüfstelle vorbereitet. Die Proben mit den Kreuzreaktanden wurden durch Beimpfung negativer Stuhl/TE-Matrix mit je einem der 127 Erreger in klinisch relevanten Konzentrationen hergestellt. Klinisch relevante Konzentrationen werden als 10 6 KBE/ml für Bakterien und Pilze und 10 5 TCID 50/ml (PFU/ml) für Viren definiert. Wenn die TCID 50/ml (PFU/ml) oder KBE/ml nicht verfügbar waren, wurden klinisch relevante Konzentrationen unter Verwendung branchenüblicher Einheiten hergestellt. Nach der Probenvorbereitung wurden alle Proben bis zum Test bei bzw. bei niedriger als - 70 C aufbewahrt. Jede Probe für den Test der Kreuzreaktivität wurde mindestens im Dreifachansatz getestet. Wenn mindestens

10 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 10 eine der drei Parallelproben Reaktivität zeigte, wurden fünf weitere Parallelproben desselben Kreuzreaktanden getestet. Proben zur Ermittlung des Baseline-Werts wurden für jedes Gerät im Fünffachansatz mit vier Baseline-Referenzen, die auf Batch-Tests der Erreger basierten, getestet. Erreger Getestete Konzentration Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl Abiotrophia defectiva 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Acinetobacter baumannii 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Acinetobacter lwoffi 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Adenovirus 1 1,00 x 10 5 TCID 50/ml 0,0% (0/3) Aeromonas hydrophila 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Alcaligenes faecalis Unterart: Faecalis 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Anaerococcus tetradius 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Bacillus cereus ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Bacillus cereus ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Bacteroides caccae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Bacteroides fragilis 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Bacteroides merdae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Bacteroides stercoris 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Bifidobacterium adolescentis 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Bifidobacterium longum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Campylobacter coli 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Campylobacter jejuni 1 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Candida albicans 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Candida catenulate 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Cedecea davisae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Chlamydia trachomatis 1,00 x 10 6 IFU/ml 0,0% (0/3) Citrobacter amalonaticus 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Citrobacter freundii 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Citrobacter koseri 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Citrobacter sedlakii 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium beijerinckii 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium bifermentans 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium bolteae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium butyricum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium chauvoei 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium difficile ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium difficile ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium fallax 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium haemolyticum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium histolyticum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium innocuum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium methylpentosum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium nexile 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium novyi 1,00 x 10 6 KBE/ml 12,5% (1/8) Clostridium paraputrificum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium perfringens 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3)

11 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 11 Erreger Getestete Konzentration Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl Clostridium ramosum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium scindens 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium sepiticum 1,00 x 10 6 Zellen/ml 0,0% (0/3) Clostridium sordellii 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium sphenoides 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium spiroforme 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium sporogenes 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium symbiosum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium tertium 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Clostridium tetani 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Collinsella aerofaciens 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Corynebacterium genitalium 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Coxsackie virus A10 1,00 x 10 5 TCID 50/ml 0,0% (0/3) Cytomegalovirus AD-169 1,00 x 10 5 TCID 50/ml 0,0% (0/3) Echovirus 11 1,00 x 10 5 TCID 50/ml 0,0% (0/3) Edwardsiella tarda 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Eggerthella lenta 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterobacter aerogenes 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterobacter cloacae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterococcus casseliflavus 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterococcus cecorum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterococcus dispar 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterococcus faecalis vanb 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterococcus faecium vana 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterococcus gallinarum vanc 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterococcus hirae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterococcus raffinosus 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Enterovirus 71 1,00 x 10 6 TCID 50/ml 0,0% (0/3) Escherichia coli ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Escherichia coli ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Escherichia coli ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Escherichia coli O157:H7 (ATCC ) 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Escherichia fergusonii 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Escherichia hermannii 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Flavonifractor plautii (Clostridium orbiscindens) 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Fusobacterium varium 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Gardnerella vaginalis 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Gemella morbillorum 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Hafnia alvei 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Helicobacter fennelliae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Helicobacter pylori 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Klebsiella oxytoca 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Klebsiella pneumoniae Unterart: Pneumoniae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Lactobacillus acidophilus 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3)

12 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 12 Erreger Getestete Konzentration Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl Lactobacillus reuteri 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Lactococcus lactis 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Leminorella grimontii 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Listeria grayi 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Listeria innocua 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Listeria monocytogenes 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Norovirus G2 1,00 x 10 5 Kopien/ml 0,0% (0/3) Peptoniphilus asaccharolyticus 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Peptostreptococcus anaerobius 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Plesiomonas shigelloides 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Porphyromonas asaccharolytica 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Prevotella melaninogenica 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Proteus mirabilis 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Proteus penneri 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Providencia alcalifaciens 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Providencia rettgeri 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Providencia stuartii 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Pseudomonas aeruginosa 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Pseudomonas putida 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Rotavirus (Stamm Wa) 1,00 x 10 5 TCID 50/ml 0,0% (0/3) Salmonella enterica Unterart: Arizonae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Salmonella enterica Unterart: Enterica Serovar Choleraesuis Salmonella enterica Unterart Enterica Serovar Typhimurium 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Serratia liquefaciens 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Serratia marcescens Unterart: marcescens 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Shigella boydii 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Shigella dysenteriae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Shigella sonnei 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Staphylococcus aureus 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Staphylococcus epidermidis 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Stenotrophomonas maltophilia 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Streptococcus agalactiae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Streptococcus dysgalactiae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Streptococcus intermedius 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Streptococcus uberis 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Trabulsiella guamensis 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Veillonella parvula 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Vibrio cholerae 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Vibrio parahaemolyticus 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Leukozyten (human) 1,00 x 10 6 LEU/ml 0,0% (0/3) Yersinia bercovieri 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3) Yersinia rohdei 1,00 x 10 6 KBE/ml 0,0% (0/3)

13 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 13 Erreger Getestete Konzentration Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl 1 Campylobacter jejuni wurde während der Validierung getestet. Es ist jedoch nicht bekannt, ob die Unterart jejuni getestet wurde. Es wurde eine in silico NCBI BLAST-Analyse für C. jejuni, Unterart jejuni durchgeführt. Basierend auf der in silico-analyse wurde keine Kreuzreaktivität mit dem Simplexa C. difficile Direct-Kit festgestellt. Hinweis: Clostridium botulinum, Desulfovibrio piger und Ruminococcus bromii standen zum Testen nicht zur Verfügung. Für alle drei Mikroorganismen wurde eine in silico NCBI BLAST-Analyse durchgeführt. Basierend auf der in silico-analyse zeigten Clostridium botulinum, Desulfovibrio piger und Ruminococcus bromii keine Kreuzreaktivität mit dem Simplexa C. difficile Direct-Kit. INTERFERENZEN Insgesamt wurden 33 (endogene & exogene) Substanzen auf eine potenzielle Interferenz mit dem Simplexa TM C. difficile Direct- Assay mit zwei C.-difficile-Stämmen (ATCC und NAP1A) getestet. Die folgende Tabelle fasst die qualitativen Ergebnisse für C. difficile mit allen 33 potenziell interferierenden Substanzen zusammen. Interferierende Substanz Wirkstoff Konzentration der interferierenden Substanz Qualitative Ergebnisse für C. difficile % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl ATCC NAP1A Afrin Oxymetazolinhydrochlorid 0,05% 10 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Antazidum/Carminativum (generisch) Aluminumhydroxid/Magnesiumhydroxid 0,1 mg/ml (3/3) (3/3) Anusol Plus (Pramoxin HCl) Pramoxinhydrochlorid 1% und Zinksulfatmonohydrat 0,5% 10 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Bariumsulfat Bariumsulfat (98% für Suspension) 5 mg/ml (3/3) (3/3) Benzalkonium (Feuchttücher) Blut Benzalkoniumchlorid, Äthanol 10 % (v/v) (3/3) (3/3) Glucose, Hormone, Enzyme, Ionen, Eisen etc. 5 % (v/v) (3/3) (3/3) Colace 1 Docusat-Natrium USP 100 mg 2,5 % (Gew./Vol.) 62,5% (5/8) 87,5% (7/8) Dramamine Dimenhydrinat 10 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Dulcolax 2 Bisacodyl USP 5 mg 10 % (Gew./Vol.) für ATCC & 0,3125 % (Gew./Vol.) für NAP1A (3/3) (3/3) Gynol II, Nonoxynol 9 Nonoxynol 9 (4,0%) 10 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Hydrocortison-Salbe Hydrocortison 2 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3)

14 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 14 Interferierende Substanz Wirkstoff Konzentration der interferierenden Substanz Qualitative Ergebnisse für C. difficile % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl ATCC NAP1A Imodium Loperamidhydrochlorid 0,005 mg/ml (3/3) (3/3) KY Jelly Gleitmittel Glycerin 2 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Mesalazin Mesalazin-Zäpfchen (4 g/60 ml) 10 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Metronidazol Metronidazol 14 mg/ml (3/3) (3/3) Magnesiamilch Magnesiumhydroxid 0,2 mg/ml (3/3) 62,5% (5/8) Mineralöl Mineralöl 2 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Monistat 7 Miconazolnitrat 2% (100 mg) 10 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Mucin Immunoglobuline, Lysozym, Polymere etc. 3 mg/ml (3/3) (3/3) Naproxen 3 Naproxen-Natrium 7 mg/ml (3/3) (3/3) Nystatin Nystatin USP Einheiten/ml (3/3) (3/3) Palmitinsäure Palmitinsäure 2 mg/ml (3/3) (3/3) Pepto Bismol Wismuthsubsalicylat 0,175 mg/ml (3/3) (3/3) Preparation H Hämorrhoidalsalbe Phenylephrin 2 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Sennoside Sennoside 0,1 mg/ml (3/3) (3/3) Sonnenschutzmittel LSF 30 Sonnenschutzmittel LSF 50 Avobenzon 3%, Homosalat 8%, Octisalat 5%, Octocrylen 4% und Oxybenzon 4% Avobenzon 3%, Homosalat 13%, Octisalat 5%, Octocrylen 7% und Oxybenzon 4% 1 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) 1 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Stearinsäure Stearinsäure 4 mg/ml (3/3) (3/3) Tums Calciumcarbonat 0,1 mg/ml (3/3) (3/3) Vagisil Benzocain USP (20% - Lokalanästhetikum), Resorcinol (3% - Lokalanästhetikum) 10 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Vancomycin Vancomycin 1,4 mg/ml (3/3) (3/3)

15 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 15 Interferierende Substanz Wirkstoff Konzentration der interferierenden Substanz Qualitative Ergebnisse für C. difficile % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl ATCC NAP1A Vaseline Weißes Petrolatum USP (100%) 10 % (Gew./Vol.) (3/3) (3/3) Hamamelis Hamamelis Flüssigkeit von einem Feuchttuch (3/3) (3/3) 1 Die Substanz "Colace" wurde auch in zwei höheren Konzentrationen (10% (Gew./Vol.) & 5% (Gew./Vol.)) getestet. Diese ergaben "ungültige" Ergebnisse aufgrund potenzieller Interferenzeffekte. Beim nachfolgenden Test einer Konzentration von 2,5% (Gew./Vol.) wurde die Mehrzahl der Parallelproben als C. difficile nachgewiesen. 2 Die Substanz "Dulcolax" wurde mit dem C. difficile-stamm NAP1A in fünf verschiedenen Konzentrationen (10% (Gew./Vol.), 5% (Gew./Vol.), 2,5% (Gew./Vol.), 0,625% (Gew./Vol.) und 0,3125% (Gew./Vol.)) getestet. Bei einer Konzentration von 0,3125% (Gew./Vol.) wurden die Proben des C. difficile-stammes NAP1A erfolgreich nachgewiesen. 3 Die Substanz "Naproxen" wurde ebenfalls in einer höheren Konzentration (14 mg/ml) getestet, was dazu führte, dass die Mehrheit der Parallelproben aufgrund potenzieller Interferenzeffekte "negativ" auf C. difficile testeten. Beim anschließenden Test einer Konzentration von 7 mg/ml wurden alle getesteten Parallelproben als C. difficile nachgewiesen. HEMMUNG DURCH ANDERE MIKROORGANISMEN Der Simplexa C. difficile Direct-Assay wurde auf seine Fähigkeit untersucht, C. difficile in Gegenwart potenziell inhibitorischer Organismen nachzuweisen. Es wurden 130 Mikroorganismen auf eine potenzielle Interferenz mit zwei C.-difficile-Stämmen (NAP1A & ATCC 43255) bei einer niedrigen/mittleren Konzentration von C. difficile in der Probe (~2-4 mal LoD) untersucht. Insgesamt wurden 127 Mikroorganismen in dieser Studie getestet, und bei drei Erregern wurde zur Bestimmung der mikrobiellen Interferenz eine in silico NCBI BLAST-Analyse durchgeführt. Die Proben mit den potenziell inhibitorischen Organismen wurden durch Beimpfung negativer Stuhl/TE-Matrix mit je einem der 127 Erreger in klinisch relevanten Konzentrationen hergestellt. Wenn die TCID 50/ml (PFU/ml) oder KBE/ml nicht verfügbar waren, wurden klinisch relevante Konzentrationen unter Verwendung branchenüblicher Einheiten hergestellt. Jede Probe für den Test der mikrobiellen Hemmung wurde mindestens im Dreifachansatz getestet. Wenn mindestens eine der drei Parallelproben eine Hemmung zeigte, wurden fünf weitere Parallelproben desselben Hemmstoffs getestet. Alle Parallelproben der Baseline-Proben sowie der Proben mit den potenziell inhibitorischen Mikroorganismen testeten positiv auf C. difficile. Mit keinem der 127 Mikroorganismen wurde eine mikrobielle Hemmung festgestellt. Nachfolgend sind die Ergebnisse der Tests dargestellt. Erreger Getestete Konzentration C.-difficile-Stamm: ATCC Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl C.-difficile-Stamm: NAP1A Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl Baseline nicht zutreffend (5/5) (5/5) Abiotrophia defectiva 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) 75,0% (6/8) Acinetobacter baumannii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Acinetobacter lwoffi 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Adenovirus 1 1,00 X 10 5 TCID50/ml (3/3) (3/3) Aeromonas hydrophila 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Alcaligenes faecalis Unterart: Faecalis 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3)

16 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 16 Erreger Getestete Konzentration C.-difficile-Stamm: ATCC Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl C.-difficile-Stamm: NAP1A Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl Anaerococcus tetradius 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Bacillus cereus ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Bacillus cereus ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Bacteroides caccae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Bacteroides fragilis 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Bacteroides merdae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Bacteroides stercoris 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Bifidobacterium adolescentis 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Bifidobacterium longum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Campylobacter coli 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Campylobacter jejuni 1 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Candida albicans 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Candida catenulate 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Cedecea davisae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Chlamydia trachomatis 1,00 x 10 6 IFU/ml (3/3) (3/3) Citrobacter amalonaticus 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Citrobacter freundii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Citrobacter koseri 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Citrobacter sedlakii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium beijerinckii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium bifermentans 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium bolteae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium butyricum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium chauvoei 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium difficile ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium difficile ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium fallax 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium haemolyticum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium histolyticum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium innocuum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium methylpentosum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium nexile 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium novyi 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium paraputrificum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium perfringens 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium ramosum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium scindens 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium sepiticum 1,00 x 10 6 Zellen/ml (3/3) 87,5% (7/8) Clostridium sordellii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) 87,5% (7/8) Clostridium sphenoides 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium spiroforme 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium sporogenes 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3)

17 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 17 Erreger Getestete Konzentration C.-difficile-Stamm: ATCC Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl C.-difficile-Stamm: NAP1A Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl Clostridium symbiosum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium tertium 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Clostridium tetani 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Collinsella aerofaciens 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Corynebacterium genitalium 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Coxsackie virus A10 1,00 X 10 5 TCID50/ml (3/3) (3/3) Cytomegalovirus 1,00 X 10 5 TCID50/ml (3/3) (3/3) Echovirus 11 1,00 X 10 5 TCID50/ml (3/3) (3/3) Edwardsiella tarda 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Eggerthella lenta 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterobacter aerogenes Z052 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterobacter cloacae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterococcus casseliflavus 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterococcus cecorum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterococcus dispar 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterococcus faecalis 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterococcus faecium 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterococcus gallinarum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterococcus hirae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterococcus raffinosus 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Enterovirus 71 1,00 X 10 6 TCID50/ml (3/3) (3/3) Escherichia coli ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Escherichia coli ATCC O16:K1L:NM 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Escherichia coli ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Escherichia coli O157H7 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Escherichia fergusonii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Escherichia hermannii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Flavonifractor plautii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Fusobacterium varium 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Gardnerella vaginalis 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Gemella morbillorum 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Hafnia alvei 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Helicobacter fennelliae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Helicobacter pylori 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Klebsiella oxytoca 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Klebsiella pneumoniae Unterart: Pneumoniae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Lactobacillus acidophilus 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Lactobacillus reuteri 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Lactococcus lactis 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Leminorella grimontii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Listeria grayi 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Listeria innocua 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3)

18 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 18 Erreger Getestete Konzentration C.-difficile-Stamm: ATCC Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl C.-difficile-Stamm: NAP1A Qualitative Ergebnisse für C. difficile: % Detektion (Anzahl detektiert/anzahl Listeria monocytogenes 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Norovirus G2 1,00 x 10 6 Kopien/ml (3/3) (3/3) Peptoniphilus asaccharolyticus 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Peptostreptococcus anaerobius 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Plesiomonas shigelloides 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Porphyromonas asaccharolytica 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Prevotella melaninogenica 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Proteus mirabilis Z050 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Proteus penneri 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Providencia alcalifaciens 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Providencia rettgeri 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Providencia stuartii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Pseudomonas aeruginosa 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Pseudomonas putida 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Rotavirus (Stamm Wa) 1,00 X 10 6 TCID50/ml (3/3) (3/3) Salmonella enterica Unterart: Arizonae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Salmonella enterica Unterart: Enterica 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Salmonella enterica Unterart: Enterica Serovar Typhim 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Serratia liquefaciens 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Serratia marcescens Unterart: marcescens 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Shigella boydii 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Shigella dysenteriae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Shigella sonnei 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Staphylococcus aureus (MRSA), ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Staphylococcus epidermidis (MRSE), ATCC ,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Stenotrophomonas maltophilia 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Streptococcus agalactiae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Streptococcus dysgalactiae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Streptococcus intermedius 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Streptococcus uberis 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Trabulsiella guamensis 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Veillonella parvula 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Vibrio cholerae 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Vibrio parahaemolyticus 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Leukozyten (human) 1,00 x 10 6 LEU/ml (3/3) (3/3) Yersinia bercovieri 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) Yersinia rohdei 1,00 x 10 6 KBE/ml (3/3) (3/3) 1 Campylobacter jejuni wurde während der Validierung getestet. Es ist jedoch nicht bekannt, ob die Unterart jejuni getestet wurde. Es wurde eine in silico NCBI BLAST-Analyse für C. jejuni, Unterart jejuni durchgeführt. Basierend auf der in silico- Analyse wurde keine Kreuzreaktivität mit dem Simplexa C. difficile Direct-Kit festgestellt. Hinweis: Clostridium botulinum, Desulfovibrio piger und Ruminococcus bromii standen zum Testen nicht zur Verfügung. Für

19 Simplexa C. difficile Direct Kit Seite 19 C.-difficile-Stamm: C.-difficile-Stamm: ATCC NAP1A Qualitative Qualitative Getestete Ergebnisse für C. Ergebnisse für C. Erreger Konzentration difficile: % Detektion difficile: % Detektion (Anzahl (Anzahl detektiert/anzahl detektiert/anzahl alle drei Mikroorganismen wurde eine in silico NCBI BLAST-Analyse durchgeführt. Basierend auf der in silico-analyse zeigten Clostridium botulinum, Desulfovibrio piger und Ruminococcus bromii keine Kreuzreaktivität mit dem Simplexa C. difficile Direct-Kit. KONTAMINATION DURCH VERSCHLEPPUNG Die Amplifizierung von Verschleppungen in Simplexa -Assays, einschließlich des Simplexa C. difficile Direct-Assay-Kits, wurde mit dem Virusassay Simplexa Flu A/B & RSV Direct REF MOL2650 (K120413) untersucht und ist auf der FDA-Website zu finden. Die Untersuchung lässt sich auf den Simplexa C. difficile Direct-Assay anwenden, da sie nicht analytspezifisch ist. Im Simplexa Flu A/B & RSV Direct REF MOL2650 (K120413) zielte die Untersuchung von Amplifikationen von Verschleppungen darauf ab, Kontaminationen in negativen Proben festzustellen, die sich in unmittelbarer Nachbarschaft von stark positiven Proben befanden. Die Untersuchung war so ausgelegt, dass auf jeder Platte abwechselnd stark positive und negative Proben platziert wurden. Es gab keinerlei Hinweise auf Kontaminationen durch Verschleppung. LITERATUR 1. Van Den Berg B. J. et. Al., Prospective Multicenter Evaluation of a New Immunoassay and Real-Time PCR for Rapid Diagnosis of Clostridium difficile-associated Diarrhea in Hospitalized Patients. J. Clin. Microbiol. 43: Akerlund T. et.al., Correlation of Disease Severity with Fecal Toxin Levels in Patients with Clostridium difficile Associated Diarrhea and Distribution of PCR Ribotypes and Toxin Yields in Vitro of Corresponding Isolates. J. Clin. Microbiol.44: Limbago B. M. et.al., Clostridium difficile Strains from Community-Associated Infections. J. Clin. Microbiol. 47: Bartlett JG, Gerding DN Clinical recognition and diagnosis of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46(Suppl 1):S12 S / McCollum DL, Rodriguez JM Detection, treatment, and prevention of Clostridium difficile infection. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 10: Lyerly D. M. et. Al., Characterization of a toxin A-negative, toxin B-positive strain of Clostridium difficile. Infection and Immunity. 60: Cohen S. H. et.al., Isolation of a Toxin B-Deficient Mutant Strain of Clostridium difficile in a Case of Recurrent C.difficile-Associated Diarrhea. Clinical Infectious Diseases 26: Cohen, S. H et.al., Clinical Practice Guidelines for Clostridium difficile Infection in Adults:2010 Update by the Society of Heathcare Epidemiology of America (SHEA) and the Infectious Diseases Society of America (IDSA) Infect Control and Hosp Epidemiol 2010; 31(5): Bartlett JG Historical perspective on studies of Clostridium difficile and C. difficile infection. Clin Infect Dis; 46: S4 S Bartlett JG Clostridium difficile: history of its role as an enteric pathogen and the current state of knowledge about the organism. Clin Infect Dis;18(Suppl. 4):S265e Bartlett, J.G Clinical practice. Antibiotic-associated diarrhea. N Engl J Med.;346: Owens RC Clostridium difficile-associated disease: changing epidemiology and implications for management. Drugs.;67: Alacala L. et.al., Comparison of Three Commercial Methods for Rapid Detection of Clostridium difficile Toxins A and B from Fecal Specimens. J. Clin. Microbiol. 468: Carroll, K. C Tests for the diagnosis of Clostridium difficile infection: the next generation. Anaerobe 17: Planche T, Wilcox M Reference assays for Clostridium difficile infection: one or two gold standards? J. Clin. Pathol. 64: Burnham, C.-A. D., & Carroll, K. C. (2013). Diagnosis of Clostridium difficile Infection: an Ongoing Conundrum for Clinicians and for Clinical Laboratories. Clinical Microbiology Reviews, 26(3),

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