Transkript

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2 Vorwort... Einführung Die biologische 'Revolution Biotechnik vs. Gentechnik Die Vorgeschichte zur Gentechnik Die Geschichte der Gentechnik.. Kommerzialisierung der Molekularbiologie Biotechnik Gentechnik Molekularbiologie, eine interdisziplinäre Wissenschaft Prinzipien der Gentechnik Die DNA... Bau der DNA... Denaturierung von DNA... Molekülgröße und Form der DNA Superhelikale DNA... Methoden 1: Elektrophorese... Modifizieren von DNA... Fragmentierung von DNA... Restriktionsendonukleasen... Methoden 2: Physikalische Kartierung... Enzymatische Modifikation von DNA-Molekülen... Verknüpfen von DNA-Fragmenten Pol ymerase-kettenrea ktion (PCR) Nested P CR.....Touch down PCR"... Warmstart-PCR.... Veran kerte-pcr... Inverse-PCR... Reverse-PCR... I m m u no-pc R... Anwendungen... Sequenzieren... Einführen von Mutationen... Verbinden zweier DNA-Fragmente:. Splicing by overlap extension".. Ungerichtete Mutationen durch Polymerase-Kettenreaktion... Amplifikationen analoger DNA- Bereiche... Diagnostik... Methode 4: Sequenzieren von DNA nach Sanger Klonieren in Escherichia coli Prinzip der PCR-Technik... Limitation und Effizienz... Methoden 3: DNA-Synthese.... Modifikationen DNA-Transfersysteme für. COLI Vektoren für die E.-coli-Transformation Plasmidvektoren... 69

3 Phagenvektoren Beispiele für gängige Lambda- Vektoren M 13-Phagen Cosmid-Vektoren Bacterial artificiai chromosomes" (BACs) Bakteriophagen-PI -Vektoren (PACs) Konstruktion von Genbanken Genomische Genbanken cdna-ban ken KI o n i er u n g chemisch sy n t h et i. sierter Gene Identifizierung spezifischer Gene 90 Punktmutagenese mit Hilfe synthetischer Oligonukleotide Methode 5: Zentrifugationsmethoden... Mikrobielle Systeme Genexpression in Prokaryonten Klonieren in Hefe Bakterielle Promotoren... Das Operon... Die,,Shine-Dalgarn o-sequenz". Die Translation... Regulierbare Promotoren... Optimierung der Translations- Effizienz... Sekretions-Systeme.... Fusionssysteme zur effizienten Produktreinigung... Plasmidsta bilisierung... Möglichkeiten, rekombinante Stämme zu stabilisieren... Methoden 6: Elektrophorese von Proteinen Vektoren in Hefe... Selektions-Marker... Integrierende Vektoren (Yip)... Episomale Plasmide (YEp)... Autonom replizierende Plasmide (YRp)... Zentromere Vektoren (YCp)... Artifizielle Chromosomen (YAC). Hefe-Transformation.... Homologe Rekombination... Genersatz (gene replacement).. Expression heterologer Proteine. Proteinmodifikation in Hefe... Andere Hefe-Expressions-Systeme Methoden 7: Protein-Blotting Klonierung in höheren Systemen Genexpression in Zell-Linien aus Säugetieren Expressions-Vektoren für Tier- Zell-Systeme Heterologe Genexpression in Säugerzellen... Transiente Expression... Stabile Expression... Zell-Linien aus Säugetieren... Selektions-Marker... Genamplifikation... Co- und posttranslationale Modif i kationen... Methoden 8: Autoradiographie Transkriptions-Kontrollelemente höherer Eukaryonten... Promotoren.... Enhancer" bzw... Silencer"... Transkriptions-Terminatoren... Spezialelemente... Das SV40-COS-Expressions-System B PV-Ve kto ren... Das Vaccinia-System.... Das Baculo-Virus-System... Baculo-Virus Transfer-Vektoren.. Methoden 9: Der ELISA

4 Transgenesis Methodenspektrum... Gentransfer mittels retroviraler Vektoren... DNA-Mikroinjektionsmethode.. Transfektion embryonaler Stamm- Zellen... Transgene Ratten... Mikroinjektionstechniken bei anderen Tieren... Auswirkungen fremden genetischen Materials auf den Wirts- Organismus... Konstitutive Expression fremder genetischer Information... Regulierte Expression fremder genetischer Information... Zerstörung der Genfunktion... Gezielte Zerstörung von Zellen durch fremde genetische Information Gentherapie Die erste gentherapeutische Studie 202 Die Gentherapie als Spezialform der Arzneimitteltherapie Gentherapeutisch behandelbare Krankheiten Gentherapeutische Konzepte Genersatztherapie Tu m o r-va kzi n i eru n g Sensibilisierung von Zellen für eine Sekundärtherapie Möglichkeiten der Aufnahme von DNA in Zellen... Direkte Aufnahme nackter DNA. Ca-Phosphat-vermittelte-Transfektion... Elektroporation.... Liposomen... Rezeptor-vermittelte Aufnahme von Adenovirus-Polylysin-DNA- Komplexen... Biol isti k... Virus-vermittelter Gentransfer.. Kritische Fragen und zu lösende Probleme Pflanzen-Gentechnik Der Beginn der Pflanzen- Gentechnik... Agroba kterium... Ti- und Ri-Plasmide... Vektoren für die Pflanzenzell- Transformation... Transformation von Pflanzenzellen Monokotyle vs. dikotyle Pflanzen Regulierte Genexpression in Pflanzen... Was wird verändert?... Männliche Sterilität... Verbesserung der Pflanzenqualität Gentechnisch veränderte Organismen und Allergien... Akzeptanzprobleme Zellkultur und Fermentation Biologische Wirkstoff Tryptophan-Produktion durch Produktion rekombinante E.-coli-Zellen Biosynthese von Tryptophan in. 1 Einleitung Biotechnik/Fermentationstechni E. coli k Inaktivierung von Regulations- Kult u rve rfa h ren mechanismen Der Fermentationsprozeß Plasmidsta bilität Chymosin und Käseherstellung Verbesserung der Plasmidstabilität 254 S h i kon i n- Produ ktion durch Pf la n Überproduktion von Tryptophan zenzell kulturen durch rekombinante E.-coli-Zellen 255 Synthese von L-Ascorbinsäure

5 Inhaltsverzeichnis Bioreaktoren Kultivierung höherer Zellen Feste Mikrocarrier Makroporöse Mikrocarrier Ag g regatku I t u ren Zelleinschluß Bioreaktoren für Säugerkulturen. 262 Roller bottles Reaktoren mit mechanischen Rührern Isolierung biologischer Wirkstoffe Extraktion/Fällung Reinigung Primäraufarbeitung Feinreinigung Endreinigung Renaturierung von Proteinen Airlift-Rea ktoren Flüssigbett-Reaktoren Die Ausbildung von. inclusion Hohlfaser-Bioreaktoren bodies Festbett-Reaktoren In-vitro-Neufaltung von Proteinen 265 (Renaturierung) Biotransformationen und Enzymreaktoren Immobilisierung von Enzymen und Zellen Biotransformationen in Enzym reaktoren Oxidoreduktasen Hydrolasen Lyasen lsomerasen Mikroorganismen bei der Auf bereitung von Erzen Methoden 10: Protein-Sequenzieren Monoklonale Antikörper Das Problem Die Herstellung monoklonaler Antikörper Immunisierung Fusion der Milz-Zellen mit Myelom-Zellen Selektion fusionierter.. Hybridom- Zellen" Primäres Screening antikörperproduzierender Hybridom-Zellen Klonierung der vorselektionierten 5.4 Isolierung und Aufschluß von Zellen... Zellen Identifizierung anti körperprodu Zellernte zierender Klone Zellaufschluß Charakterisierung der produzierten 288 Antikörper Rekombinante Antikörper Rekombinante Wirkstoffe 6.1 Die Anforderungen des Euro Charakterisierung der Wirtszelle päischen Arzneibuchs an gentechnisch hergestellte Produkte 317 einschließlich der Herkunft. des Phänotyps und des Genotyps sowie der Zellkulturmedien Definition Dokumentation der Klonierungs Herstellung Strategie für das Gen und Charak Nachweis der Eignung eines Wirtterisierung des rekombinanten Vektor-Systems zur Herstellung Vektors DNA-rekombinanter Produkte.. 318

6 Charakterisierung des Wirt- Ve ktor-systems.... Zellbanksysteme: Validierung und Kontrolle... Validierung des Herstellungs- Prozesses... Extraktion und Reinigung... Charakterisierung des Bulk- Produkts und Gleichförmigkeit der Produktion... Identitätsprüfung... Rein heitsprüf ung... Chemische Reinheit... Von Wirtszellen stammende Proteine... Aus Wirtszelle oder Vektor stammende DNA... Ge ha It und Wirksamkeit.... Struktur Biotechnische und gentechnische Herstellung von Insulin. 326 Insuline aus verschiedenen Tier- Spezies... Umwandlung von Schweine- Insulin in Human-Insulin der Firma Hoechst... Die Alternative: Gentechnisch hergestelltes Insulin.... Insulin-Biosynthese.... Drei Ansätze zur gentechnischen lnsulinherstellung... Expression der beiden lnsulinketten in unterschiedlichen E-coli-Stämmen... Expression von Proinsulin in E. COLI Expression von Mini-Proinsulin in S. cerevisiae... lnsulinvarianten als Alternative herkömmlicher Depotzubereitungen Das erste zugelassene Insulin- Mutein Gentechnisch hergestellte Fibrinolytika und Antikoagulanzien 338 Fibrinolytika Streptokinase Urokinase Der Gewebe-Plasminogen- Aktivator Inhaltsverzeichnis r-pa (Reteplase), ein gentechnisch hergestelltes Derivat des Gewebe- Plasminogen-Aktivators Antikoagulanzien Blutgerinnungsfaktoren Gentechnisch hergestellte Faktor- VIII-Präparate Zusa m menfassu ng/sch I ußbemerkung Gentechnisch hergestellte Faktor- VII-Präparate Gentechnisch hergestellte Erythropoetin-Präparate Rekombinante Hypophysenhormon-Präparate Somatro pi n Präparate mit Follikel-stimulierendem Hormon (FSH) Desoxyribonuklease Pulmozyme@ Gentechnisch hergestellte ß- Glucocerebrosidase zur Behandlung der Gaucher-Krankheit Cerezyme@ Zytokine lnterleukine Proleukin@ Interferone Alp ha-in te rferone Roferon

7 Zusammenfassung/Schluß ein monoklonaler Antibemerkung lntron körper zur Behandlung von Kolon-/ Beta-Interferon zur Behandlung Rektalkarzinomen der Multiplen Sklerose Adjuvante und palliative Therapie- Zusammenfassung/Schluß- Schemata zur Behandlung kolorekbem er ku ng... taler Karzinome Gamma-Interferon Der Antikörper MoAbl7-1A Zusammenfassung/Schluß (abciximab)- ein monobemerkung klonaler Antikörper zur Ver Hämatopoetische Wachstums- meid u ng ischämischer Korn pl i kafaktoren tionen Zusammenfassung/Schluß Biologie der Thrombozyten bemerkung Der GPllb/llla-Rezeptor Zusammenfassung/Schluß Aktuelle medikamentöse Therapie bemerkung zur Verhütung thrombotischer Zusammenfassung/Schluß- Komplikationen der PTCA und ihre bemerkung Grenzen zur Prävention der Thrombosen Monoklonale und rekombi- Zusammen fassu ng/sc h I ußnante Antikörper bemerkung OKT3. ein muriner monoklonaler Antikörper Transplantations-Immunologie und 6.11 Inhibierende Nukleinsäuren Ansatz der immunsuppressiven Interaktion von Nukleinsäuren mit Therapie Proteinen Das HLA-System human leuco Inhibierende Nukleinsäuren cyte antigens") Antisense-Oligonukleotide T-Zellaktivierung und Abstoßung Katalytische RNA Drei Phasen der Abstoßungs Tri pe I h el ix- B i I d u n g reaktion Stabilisierung von Nukleinsäuren Monoklonale Antikörper bei der PNA Organtransplantation Bioverfüg barkei t Zusammenfassung/Schluß- 483 bemerkung Molekulare Diagnostik 7.1 Restri ktionsf ragment-längen polymorphismus Kartierung des menschlichen Genoms In-situ-Hybridisation Somatische Zellhybride Physikalische Kartierung mit Hilfe von Restriktionsenzymen Überlappende Klonierung Zusammenfassung Methoden 11 Pulsfeld-Gel- Elektrophorese Identifizierung von Genen. die Erbkrankheiten verursachen. 501 Experimentelle Strategien zur Identifizierung krankheitsrelevanter Gene

8 Funktionelles Klonieren.... Funktionelles Klonieren mit Hilfe des isolierten Genprodukts... Funktionelles Klonieren auf der Basis eines funktionellen Gentests Positionelles Klonieren... Isolierung des Dystrophin-Gens.. Isolierung des NF1 -Gens... Isolierung des CF-Gens... Positionsunabhängiges Klonieren eines Kandidaten-Gens.... Positionelles Klonieren eines Kandidaten-Gens... Das Rhodopsin-Gen als Kandidaten-Gen für die Retinitis pigmentosa... Verschiedene Fibrillin-Gene als Kandidaten-Gene für verschiedene Formen des Marfan-Syndroms.. Entdeckung eines Kandidaten- Gens für das Waardenburg- Syndrom über eine Homologie zwischen Mensch und Maus.... Methoden 12: Automatisches DNA-Sequenzieren Genetische Erkrankungen Autosomal dominante Krankheiten Autosomal rezessive Krankheiten 521 X-gekoppelte Krankheiten Methoden 13: Sequenzautomaten 525 Molekulare Krebsdiagnostik Zytologische Verfahren Tumormarker" Immunologische Verfahren zur CD-Typisierung In-situ-lm m u nverf a h ren zum Nachweis von Onkogenprodukten Zytogenetische Analysen zum Nachweis von Aneuploidie und Onkogen-Amplifikationen Inhaltsverzeichnis Nukleinsäurediagnostik... DNA-Restri ktionsfragment-längenpolymorphismus (RFLP)... Nachweis von Punktmutationen durch RNase-Spaltung... Nachweis von Punktmutationen durch Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse (SSCP). Nachweis eines Tumor-Risikos durch Verlust einer Heterozygotie Analyse der RNA... Expressionsanalyse durch Dot-Blot- Verfahren... Methoden 14: Durchflußzytometrie Diagnose von Infektionskrankheiten Virale lnfe ktionen... Humanes Papillomavirus (HPV).. Herpes-Viren... Hepatitis-Viren... Humanes lmmundefizienzvirus (H... Humanes T-ly m p hozytotropes Virus (HTLV)... Bakterielle Infektionen... Infektionen durch Mycobakterium Infektionen mit Borrelia burgdorferi... Bakterien des Gastrointestinal traktes... Infektionen des Nervensystems DNA-Charakterisierung in den forensischen Wissenschaften. 549 DNA-Fingerprinting Die Methode Interpretation der Daten Datenstatistik Die Polymerase-Kettenreaktion

9 Molekularbiologische Ansätze zur Wirkstoff-Findung Das H y brid-ve ktorsystem aus Hefe Suche nach DNA-Bindeproteinen 558 Suche nach Inhibitoren für DNAbindende Proteine Suche nach Proteinen, die mit anderen Proteinen wechselwirken. 561 Suche nach Inhibitoren, die mit Protein/Protein-Wechselwirkungen interferieren....., Zusammenfassung Transformation des rekombinanten Phagenvektors in E.-coli-Zellen Klonieren von Fab-Fragmenten in-vitro-mutation durch fehlerhaftes PCR Phagen-Panning": Selektion optimierter Antikörperfragmente 576 Konstruktion und Selektion wirksamer Peptide Konstruktion und Selektion funktioneller Nukleinsäuren Zusammenfassung In-vitro-Evolution: Konstruktion neuer Wirkstoffe nach dem Zufallsprinzip Re kom bi nan te An t i kö r pe rf rag - men te Phagen- Display") PCR-Amplifikation der cdna-bereiche für die variablen Regionen Klonierung der gebildeten Amplimere in einen Phagenvektor Molekularbiologische Kombinatorik Herstellung neuer Peptidantibiotika durch,,domänen-shuffling".... Herstellung neuer Polyketide durch Domänen-shuffling" oder Precursor-Zufütterung Zusammenfassung Sicherheitsaspekte Das Gentechnikgesetz und die Regulierung gentechnischer Arbeiten in Deutschland Verordnungen zum Gentechnikgesetz Gentechnische Arbeiten in gentechnischen Anlagen Genehmigungs- bzw. anmeldep f I ich t i g e Tatbestände Verfahrensablauf Freisetzungen und Inverkehrbringen Überwachungs-, Auskunfts- und Duldungspflichten Haftungsregelungen Sicherheitskonzept für gentechnische Arbeiten in gentechnischen Anlagen... Die Maßnahmen zur Verwirklichung der Schutzziele Beschreibung der Sicher heitsstufen Sicherheitsmaßna hmen Anmelde- und Genehmigungsverfahren von gentechnischen Anlagen und Arbeiten Freisetzung und Inverkehrbringen