Validierung von stabilitätsindizierenden HPLC-Methoden
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- Kora Heintze
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1 SAQ HPLC-Methoden Optimierung, Validierung, Strukturaufklärung 8. Juni 2005, Olten Validierung von stabilitätsindizierenden HPLC-Methoden Joachim Ermer sanofi-aventis Industrial Quality & Compliance Übersicht Validierung als Good Stability Practice Präzision und (Stabilitäts-) Eignung Spezifität Proben Peakreinheit Richtigkeit Wiederfindung von Nebenprodukten Integrationsart, Responsefaktoren Bestimmungsgrenze Anforderungen BG aus Linearität 2
2 ICH Guidelines Q2A und Q2B Analytical procedure Validation Minimum Identi- Impurities Assay Characteristic number fication Quant. Limit Specificity not applicable Linearity Range not applicable Accuracy 9 (e.g. 3x3) Precision Repeatability 6 or 9 (e.g. 3x3) Intermediate Precision/ Reproducibility 2 series Detection Limit (DL) Quantitation Limit (QL) approach dependent approach dependent Leistungsfähigkeit des analytischen Verfahrens Qualität der Analysenergebnisse Nicht nur regulatorische und GMP-Anforderung Good Science Good Compliance Good Business Transfer Stabilität Robustheit OOS & Zuverlässigkeit Anpassungen (SST) Wdh. 4
3 Präzision und Eignung Assay: Erkennung einer Gehaltsabnahme Beispiel: 1% wahre Abnahme in 36 Monaten 101% 100% σ = 0.5% 101% 100% σ = 2.0% 99% 99% Content (%) 98% 97% 96% 98% 97% 96% 95% 95% 94% Storage interval (months) 94% Storage interval (months) 5 Präzision und Eignung Assay: Extrapolation der Verwendungsfrist Beispiel: 3% wahre Abnahme in 36 Monaten σ = 0.5% σ = 1.0% 1 1 Content Content Regression line 95% Confidence interval Data Storage interval Regression line 95% Confidence interval Data Storage interval 6
4 Präzision aus Stabilitätsstudien Langzeitanwendung des analytischen Verfahrens Routinerelevante Variation aller Faktoren Große Datenzahl zuverlässige Abschätzung der Präzision Berechnung aller Präzisionsebenen Indiv. Wiederholpräzision (n 4 pro Lagerzeit, evtl. Pooling) Gesamtwiederholpräzision (n 2 pro Lagerzeit) Intermediate Precision/Vergleichspräzision Kein signifikanter Anstieg: ANOVA Signifikanter Anstieg: Reststandardabweichung der Regression Projekt der FG Analytik der DPhG 9 Firmen, 44 Produkte, 156 Stabilitätsstudien J. Ermer et. al.: J.Pharm.Biomed.Anal., Online Feb Spezifität Kritische Grundlage ( hallmark ) jedes Prüfverfahrens Was ist ausreichend/angemessen? Bezugnahme auf die gesamte Spezifikation (alle Prüfungen) z.b. Assay Titration + chromat. Nebenproduktbestimmung Indirekte Verfahren: Beleg der Richtigkeit Bestätigung der Massenbilanz Gleiches Ergebnis durch unabhängiges Prüfverfahren z.b. Bei LC: Titration, N-Bestimmung, NMR Statistische Signifikanztests nicht empfehlenswert Statistische Signifikanz praktische Relevanz Unterschiedliche Spezifität zu erwarten = systematischer Fehler 8
5 Spezifität: Direkte Verfahren Fehlender bzw. akzeptabler Einfluss von anderen Substanzen Nebenprodukte, Intermediate, Degradationsprodukte, Matrices / Placebo Untersuchung: Übereinstimmende Ergebnisse mit und ohne Chromatographische Auftrennung Peakreinheitsuntersuchungen Peakformanalyse Rechromatographie DAD MS 10 To Stress or not to Stress? Ziel der Validierung: Eignung für die beabsichtigte Anwendung Für Stabilität: relevante Degradationsprodukte Muster aus akzelerierten Lagerbedingungen bevorzugt Stressmuster: (einige) Degradationsprodukte sind evtl. nicht von Bedeutung für angestrebte Lagerbedingungen Wichtig für Degradationswege, Arzneimittelentwicklung Für Validierung: Anforderungen und relevante Bedingungen genau definieren z.b. Nachweis der allg. Fähigkeit zur Auftrennung zusätzlicher Peaks Auswahl von relevanten Stressbedingungen (Lagerung, Verpackung) Beschränkung der Degradation (~ 10%) 11
6 Peakreinheit Untersuchung auf Koelution Nur Fehlen eines Beweises möglich (absence of evidence) Kombination verschiedener Untersuchungen Peakformanalyse Rechromatographie DAD MS Variation der chromatographischen Bedingungen Gradient, ph, Säulen usw. aus Methodenentwicklung, Robustheit 12 Vergleich der Peakformanalyse-Verfahren Erkennen von Koelution, Peaktailing 1.33 (USP) Peakverh. Geringster Trennfaktor Visuell Asymmetriekurve 1. Ableitung 100:10 ~0.7 ~0.5 ~ :1 ~1.3 ~1.1 n.n. (Rauschen) 100:0.5 ~1.5 ~1.3 n.n. (Rauschen) Hoher Nebenproduktgehalt (~ 10%) 1. Ableitung geeignet Geringer Nebenproduktgehalt (< 1%) Asymmetriekurve nur geringer Vorteil gegenüber visuelle Prüfung (nur wenn software-unterstützt) 13
7 Peakreinheit mittels Rechromatographie 200 mv Sampling of a peak fraction from 9.6 to 11.0 minutes in acetonitrile/water/ 0.1% trifluoroacetic acid 10,0 mau 8,0 Rechromatography with 0.2M sodium 6,0 phosphate buffer ph 4.0 / acetonitrile 4,0 UV, 240 nm ,0 Impurity 1.6 % 0,0 min -20 min -2, , , ,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 14 Peakreinheit mittels Diodenarray Detektion 0.5 % Nebenprodukt 10 % Nebenprodukt 15
8 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Peakreinheit mittels LC-MS m/z m/z m/z m/z UV chromatogram 240 nm Mass chromatogram m/z Time (min) 16 Peakreinheituntersuchungen - Grenzen Variation der Chromatographiebedingungen und/oder Rechromatographie empfindlich Abhängig von Substanzeigenschaften (Elutionsverhalten) Peakformuntersuchung und DAD Schwierig für geringe Konzentrationen der koeluierenden Substanz Unterschied der Retentionszeiten erforderlich MS Sehr empfindlich, hohe Selektivität Abhängig von Substanzeigenschaften (Ionisierung, -unterdrückung) 17
9 Wiederfindung bei Nebenprodukten Nur für spezifizierte NP erforderlich Bei gleichzeitiger Aufstockung mehrerer NP Ggf. Berechnung der gespikten Gesamtmenge erforderlich (wenn NP A auch in NP B enthalten ist) Bei größerem Konzentrationsbereich (~) gleiche Verteilung vorteilhaft (Wichtung, Hebeleffekt) Kombination von Richtigkeit, Linearität, BG (falls nicht zu groß, ~10-20xNG) Wenn keine NP-freie Matrix vorhanden ist: Berechnung der Wiederfindung bzgl. Gesamtmenge, da Präzision abhängig von Gesamtkonzentration 18 Wiederfindung aus NP-haltiger Matrix No. Nebenproduktkonzentration Wiederfindung Vorh. Zugeg. Gesamt Gefunden bezügl. bezüglich Gesamt Zugeg. Gesamt Zugeg. 1 0,02 0,01 0,03 0,039 0, ,0 % 190,0 % 2 0,02 0,03 0,05 0,060 0, ,0 % 133,3 % 3 0,02 0,08 0,10 0,090 0,070 90,0 % 87,5 % 4 0,02 0,23 0,25 0,280 0, ,0 % 113,0 % 5 0,02 0,48 0,50 0,475 0,455 95,0 % 94,8 % 6 0,02 0,73 0,75 0,813 0, ,4 % 108,6 % 7 0,02 0,98 1,00 1,010 0, ,0 % 101,0 % 19
10 Lot oder Aufsetzer? Rechromatographie 15,0 13,8 11,3 10,0 mv Fehler: Bzgl. Hauptpeak: ~ 1.5 % Bzgl. NP: % 8,8 Rider: 2.1 % 7,5 6,3 Probe 5,0 3,8 2,5 1,3 Drop: 3.4 % Rechromatographie des Hauptpeaks min -1,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 21,0 22,0 23,0 24,0 25,0 20 Lot oder Aufsetzer? Säulenschaltung 15,0 12,5 mv 0,49 % 99,06 % Schaltung auf 2. Säule 210 nm 10,0 7,5 0,27 % 0,17 % 0,18 % 5,0 0,51 % 2,5 0,27 % Rider 0,03 % 0,13 % -2,0 0,25 % 0,21 % Drop 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0 48,0 min 21
11 UV-Responsefaktoren: Spezifizierte NP Response für bekannte Konzentrationen von WS und NP Verwendung von reinen NP-Standardlösungen Berechnung: Einzelkonzentration (spezifisches Responseverhältnis) oder Aus Linearität (Verhältnis der Steigungen) Bedingungen: Ausreichende Anzahl an Bestimmungen (mind. 5 6) Gleiche(r) Konzentration(sbereich) für Wirkstoff und NP (zur Vermeidung von Wichtungs- und Variabilitätseffekt) Ausreichend große Konzentration (zur Minimierung der Variabilität) 22 Konzentrationsabhängigkeit der Präzision Relative Standard Deviation 16% 14% 12% 10% 8% 6% 4% 2% 0% HORWITZ-Vorhersage für Wiederholpräzision 0.01% 0.10% 1.00% 10.00% % Analyte (spiked) Beispiel: Aufstockung von Glibenclamid auf Tabletten-Placebo % Jew. 5-7 Aufstockungen U. Schepers, J. Ermer, L. Preu, H. Wätzig: Wide concentration range investigation of recovery, precision and error structure in HPLC J. Chromatogr. B 810 (2004)
12 UV-Responsefaktoren: Unbekannte NP Response-Check: Chromatogramme bei versch. λ 0,26 % 0,14 % 0,02 % 2,63 % 2,82 % 0,47 % 0,41 % 220 nm 0,14 % 0,24 % 0,11 % 0,07 % 0,07 % 240 nm Retention time (min) Bei (deutlich) unterschiedlichem Response Identifizierung, Synthese von Referenzsubstanz. Analytische Untersuchung: Massenspezifischer(er) Detektor Brechungsindex (RI), Lichtstreuung (ELSD) Identifizierung und universelle Kalibrierung Stickstoffdetektor (CLND), oder anderer elementspezif. Detektor LC-NMR 25
13 Responsefaktorabschätzung durch RI 35,0 20,0 mv 2.86 % 0,54 % 0.12 % 0.08 % 1.03 % UV 240 nm 20 µg 10,0 0,0 0,17 % 2.45 % 1.16 % 0.73 % 0,81 % RI 300 µg RF 9-10 min -10,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 26 Responsefaktorbestimmung durch RI 50,0 mau 40,0 30,0 2,63 % 0,26 % 0,14 % 0,47 % 0,41 % 0,02 % 220 nm 0,04 % 0,87 % 0,05 % 0,04 % RF Imp = = 14 (Area UV / Area RI) DS (Area UV / Area RI) Imp 20,0 10,0 2,82 % 0,14 % 0,24 % 0,11 % 0,07 % 0,07 % 240 nm 0,05 % 1,01 % 0,05 % 0,05 % 50,0 mv 40,0 30, mv*min -5,0 min 15,0 17,5 20,0 22,5 25,0 27,5 30,0 32,5 35,0 20,0 Rechromatographie der Peaks RP-8 Säule 125x2mm, 50 C 0.2M Na-Phosphat, 0.5 ml/min 10,0 0, mv*min 3.95 mv*min UV 240 nm 0.1 mv*min -10,0 min 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 15,0 RI 27
14 Bestimmungsgrenze: Anforderungen Experimentelle BG = Schnappschuß Hohe Variabilität, abhängig von Actuellen Bedingungen Berechnungsverfahren Essentiell: BG muss für alle künftigen Anwendungen gelten Wie kann das gewährleistet werden? Robuste Bestimmung ( intermediate BG) Definition aus Spezifikationsgrenzen ( allgemeine BG) (Minimalanforderung) Aktuelle Kontrolle im Systemeignungstest (Ph.Eur.) 28 Allgemeine Bestimmungsgrenze Approximation: 50% der Spezifikationsgrenze z.b. 0.05% bei Limit von 0.1% (bei Präzision < ~20% RSD) Entspricht ICH reporting threshold Spezifischer Ansatz: Spezif. Präzision (bei BG) und Anzahl der Bestimmungen In Anlehnung an Positionspapier der DPhG ( s tdegreesof freedom,0. 95onesided) validation QLgeneral = AL n assay Validierung: Bestätigung, dass aktuelle BG kleiner ist mit beliebigem/praktikabelstem Verfahren 29
15 Intermediate Bestimmungsgrenze Wiederholte BG Bestimmungen Falls Quantifizierung < reporting threshold von Interesse ist Einbeziehung aller praktisch relevanten Faktoren Intermediate BG = obere Verteilungsgrenze der indiv. BGs Maximale indiv. BG (evtl. + Sicherheitsbetrag) Aus Mittelwert und Standardabweichung QL interm = QL average s QL Kombinationsansatz Experimentelle BG < definierte BG < 50% Spezifikationsgrenze 30 Abhängigkeit der BG vom Regressionsbereich Calculated QL 1.0% 0.9% 0.8% 0.7% 0.6% 0.5% 0.4% 0.3% 0.2% SD intercept Residual SD 95% Prediction interv. Auf Grund der Varianzeninhomogenität: Größere Variabilität der höheren Konzentrationen dominiert 0.1% 0.0% Concentration range (max/min=0.025%) Wahre BG 31
16 Zusammenfassung Validierungsziel: Leistungsfähigkeit der Routineanwendung Experimentelle Bedingungen sollten (so weit wie möglich) denen der Routineanwendung entsprechen Akzeptanzkriterien zur Bewertung der Eignung Vorsichtiger Umgang mit statistischen Signifikanztests Absolute (Ober)Grenzen bevorzugt Mehr Details: J. Ermer, J.H.McB. Miller (Eds.): Method Validation in Pharmaceutical Analysis. A Guide to Best Practice. Wiley VCH, Weinheim 2005, ISBN Gute Validierung liegt im Eigeninteresse! Risikominimierung 32
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