Charakterisierung von Getreide aus ökologischem und konventionellem Anbau - Anwendung von Protein-Profiling- Techniques und Inhaltsstoffanalysen

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1 Chrkterisierung von Getreide us ökologischem und konventionellem Anbu - Anwendung von Protein-Profiling- Techniques und Inhltsstoffnlysen Chrcteristion of cerel grin from orgnic nd conventionl frming ppliction of protein profiling techniques nd nlysis of individul compounds FKZ: 02OE069 Projektnehmer: Mx Rubner-Institut, Bundesforschungsinstitut für Ernährung und Lebensmittel Institut für Sicherheit und Qulität bei Getreide Schützenberg 12, Detmold Tel.: Fx: E-Mil: poststelle@mri.bund.de Internet: Autoren: Lngenkämper, G; Zörb, C.; Betsche, T. Gefördert vom Bundesministerium für Ernährung, Lndwirtschft und Verbrucherschutz im Rhmen des Bundesprogrmms Ökologischer Lndbu (BÖL) Dieses Dokument ist über unter der BÖL-Bericht-ID verfügbr.

2 Abschlussbericht Chrkterisierung von Getreide us ökologischem und konventionellem Anbu - Anwendung von Protein-Profiling-Techniques und Inhltsstoffnlysen Projektnummer: 02OE069 Forschungsprojekt im Bundesprogrmm Ökologischer Lndbu Lufzeit und Berichtszeitrum: bis Berbeiter: Dr. G. Lngenkämper (Projektleitung) PD. Dr. C. Zörb Dr. T. Betsche Bundesforschungsnstlt für Ernährung und Lebensmittel Institut für Biochemie von Getreide und Krtoffeln Schützenberg Detmold Zusmmenrbeit mit nderen Stellen: Forschungsinstitut für biologischen Lndbu, Frick (Schweiz) und Forschungsnstlt Agroscope Reckenholz-Tänikon, Zürich (Schweiz) Universität Bielefeld, Abteilung Proteom- und Metbolomforschung m Lehrstuhl für Genetik Universität Köln, Zentrum für Molekulre Medizin Köln, Zentrle Bionlytik 1

3 INHALTSVERZEICHNIS 1 Ziele und Aufgbenstellung des Projekts Wissenschftlicher und technischer Stnd, n den ngeknüpft wurde Plnung und Abluf des Projekts 7 2 Mteril und Methoden Weizennbu Probenverrbeitung und lgerung Anlytik von Inhltsstoffen Zweidimensionle Gel-Elektrophorese und Mssenspektrometrie von Proteinen 11 3 Ergebnisse Protein-Profiling Protein-Auftrennung (2D Gel-Elektrophorese) Proteinidentifizierung Profiling mit speziellen Proteingruppen Anlyse von einzelnen Inhltsstoffen Tusendkornmsse Protein- und Stärkegehlte Minerlstoffe Bllststoffe, Fruktne, Gesmt-Oxlsäure, lösliche Oxlsäure und Phytinsäure Antioxidtive Prmeter Lipide Metboliten-Profile Vorussichtlicher Nutzen und Verwertbrkeit der Ergebnisse, bisherige und geplnte Aktivitäten zur Verbreitung der Ergebnisse 29 4 Zusmmenfssung 31 5 Gegenüberstellung der ursprünglich geplnten zu den ttsächlich erreichten Zielen; Hinweise uf weiterführende Frgestellungen 33 6 Literturverzeichnis 35 7 Übersicht über lle im Berichtszeitrum vom Projektnehmer relisierten Veröffentlichungen zum Projekt 39 2

4 1 Ziele und Aufgbenstellung des Projekts Anhnd definierten Probenmterils us prllelem ökologischem und konventionellem Anbu wurde mit Hilfe von Protein-Profiling eine vergleichende Chrkterisierung des Proteoms von Weizen durchgeführt. Ds Ergebnis des Vorhbens ist ein Profil von verschieden strk uftretenden Proteinen in ökologisch und konventionell ngebutem Weizen. In weitergehenden Studien knn uf dieser Grundlge ufgeklärt werden, ob die differentiell uftretenden Proteine direkt oder indirekt z. B. über Stoffwechselktivität in der Pflnze die ernährungsphysiologische Qulität (Gesundheitswert) von Lebensmitteln beeinflussen. Zusätzlich knn ein solches Profil ls Grundlge für einen Herkunftsnchweis dienen und somit im Sinne des Verbrucherschutzes von großem Wert sein. Inhltsstoffnlysen, die sowohl mit Profiling-Methoden ls uch mit klssischen Methoden durchgeführt werden, dienen der Chrkterisierung des Weizens hinsichtlich der ernährungsphysiologischen Qulität. Gesmtziel des Forschungsvorhbens ist lso eine umfssende biochemische Chrkterisierung von Weizen bei kontrollierten ökologischen und konventionellen Anbuformen. Im Rhmen der Beknntmchung Nr. 04/03/51 (April 2003) über die Durchführung von Forschungs- und Entwicklungsprojekten im Bereich des Bundesprogrmms Ökologischer Lndbu wr ds generelle Ziel, die Qulität (Eignungswert, Genusswert, Gesundheitswert) ökologisch erzeugter Lebensmittel, uch im Vergleich zu konventionell erzeugten Lebensmitteln, zu erfssen und nlytisch zu prüfen. Die hier vorgestellten Ergebnisse des Forschungsprojekts 02OE069 hben Bezug zu folgenden, konkreten Themensetzungen des Bundesprogrmms Ökologischer Lndbu: - Vergleichende Bewertung von pflnzlichen Rohstoffen und drus hergestellten Lebensmitteln us konventionellem und ökologischem Anbu (Getreide, Krtoffeln, Ölsten, Obst, Gemüse); - Gehlte und funktionelle Eigenschften sekundärer Pflnzenstoffe von pflnzlichen Lebensmitteln us dem ökologischen und konventionellen Anbu (Gemüse, Obst, Getreide); - Entwicklung und Weiterentwicklung gnzheitlicher Untersuchungsmethoden; - Entwicklung von Methoden zur Identifizierung von ökologisch erzeugten Produkten uf der Endverbrucherstufe. 3

5 1.1 Wissenschftlicher und technischer Stnd, n den ngeknüpft wurde Positive Auswirkungen des ökologischen Lndbus uf Agro-Ökosysteme, besonders die Biodiversität und die Bodenfruchtbrkeit, sind durch wissenschftliche Dten gut belegt (Mäder et l., 2002). Zudem gehen viele Verbrucher dvon us, dss ökologische Lebensmittel sicherer und gesünder seien ls konventionelle (Bourn und Prescott, 2002, Kuhnert et l., 2003). Diese Verbruchermeinung ist ein Grund für den wchsenden Erfolg von Produkten us dem ökologischen Lndbu. Ein wissenschftlicher Nchweis, dss ökologische Lebensmittel eine ernährungsphysiologisch bessere Qulität hben, ist llerdings schwierig zu erbringen. Eine umfngreiche Literturstudie us dem Jhr 2003 stellt fest, dss zwr häufig Unterschiede hinsichtlich verschiedener Inhltsstoffe uftreten, wegen widersprüchlicher Ergebnisse jedoch keine eindeutigen Folgerungen bgeleitet werden können (Tuscher et l., 2003). Eine der möglichen Urschen für die Widersprüche in den Ergebnissen wurde im Probenmteril gesehen, ds vielfältigen Einflüssen usgesetzt wr, die nicht im Zusmmenhng mit ökologischem oder konventionellem Lndbu stehen (Hrker, 2004). Um diese Einflüsse und Unwägbrkeiten zu vermeiden, wurde für die hier vorgestellte Arbeit uf Probenmteril us dem DOK-Feldversuch zurückgegriffen. Der DOK-Feldversuch umfsst verschiedene ökologische und konventionelle Anbusysteme und wird seit 1978 kontinuierlich in der Nähe von Bsel durchgeführt (Mäder et l., 2006). Der Anbu identischer Sorten und gleicher Fruchtfolgen bei gleichen klimtischen Bedingungen und homogenem Bodentyp gewährleisten weitestgehend gleiche Bedingungen bei den ökologischen und konventionellen Anbusystemen. Lediglich Form und Menge der Düngung und die Pflnzenschutzmßnhmen sind spezifisch unterschiedlich für die jeweiligen Anbusysteme (Mäder et l., 2002, Mäder et l., 2006). Weizen des DOK-Feldversuchs eignet sich dher hervorrgend, um belstbre Vergleichsstudien zur Qulität von Weizen verschiedener lndwirtschftlicher Systeme durchzuführen. Dieses Forschungsprojekt nutzt grundsätzlich ndere Methoden, ls die mit denen der Weizen des DOK-Feldversuchs zuvor untersucht wurde. Dher ergeben die erzielten Ergebnisse in Verbindung mit den Ergebnissen nderer Forschungsrbeiten zur Qulität des DOK-Weizens (Mäder et l., 2007, Meier-Ploeger et l., 2003) ein viel umfssenderes, komplementäres Gesmtbild. Vom Stndpunkt der Pflnzenphysiologie gesehen, ergibt sich die generelle Frge nch der Whrscheinlichkeit, dss sich Weizen us ökologischer und konventioneller Produktion 4

6 unterscheidet. Pflnzenbiologische und mikrobiologische Forschungsrbeiten hben zweifelsfrei gezeigt, dss einige Umweltfktoren, die u.. lndbubhängig sind, Auswirkungen uf den pflnzlichen Stoffwechsel hben (Bry et l., 2000, Hmmond-Kosck und Jones, 2000). Dzu gehören sind z. B. Art der Nährstoff-/Minerlstoffversorgung, Bestndsdichte, Bodenmikroorgnismen, Pflnzenpthogene und Bodenqulität (Abb. 1). Licht Tempertur Wind CO 2 Photoperiode Luftfeuchtigkeit Herbivore Signlerkennung Signltrnsduktion Pthogene O 2 Prsiten Mikoorgnismen Bodenqulität Toxische Minerlien Wssersttus Mine rlische Nährstoffe Veränderter Stoffwechsel Auswirkungen uf: -Proteinmuster - Inhltsstoffe - Morphologie - Gesundheitswert? Abbildung 1: Pflnzen regieren uf Umweltsignle uf zellulärer Ebene und ls gesmter Orgnismus Erkennung und Trnsduktion der Signle resultieren in der Regel in veränderter Genexpression uf zellulärer Ebene. Die veränderte Genexpression knn Auswirkungen uf die Protein- und Inhltsstoffzusmmensetzung, die Morphologie und gegebenenflls uch den Gesundheitswert der gesmten Pflnze hben. Prmeter, die sich zwischen ökologischem und konventionellem Anbu potentiell unterscheiden sind fett gedruckt. Verändert nch: Buchnn et l. (2000). 5

7 Der DOK-Feldversuch ht übererzeugende Dten geliefert, die belegen, dss sowohl Pflnzenernährung ls uch Bodenqulität in den verschiednen Anbuvrinten verschieden sind (Mäder et l., 2002). Grundsätzlich ist dher dvon uszugehen, dss sich ökologisch und konventionell ngebute Pflnzen in Teilen ihres Stoffwechsels unterscheiden. Diese Unterschiede sind vermutlich in den vegettiven Orgnen m deutlichsten usgeprägt (Krtoffeln, Krotten, Blttgemüse), können sich ber uch uf die genertiven Orgne, lso die Körner bei Getreide, uswirken. Zur Erfssung der Unterschiede zwischen ökologisch und konventionell ngebuten Pflnzen ist die nlytische Bestimmung einzelner Inhltsstoffe ein Anstzpunkt, der ber us konzeptionellen Gründen nur ein sehr geringes Spektrum der möglichen Änderungen erfssen knn. Eine Reihe von methodischen Konzepten, die es erluben den pflnzlichen Stoffwechsel umfssender zu nlysieren, werden mit dem Begriff Profiling-Techniques bezeichnet. Diese Techniken werden seit einigen Jhren eingesetzt, um z. B. die Effekte und Wirkungen von Vriblen wie Stress, Hormonen oder Arzneimitteln uf Orgnismen ufzuklären. Grundsätzlich ermöglichen die Profiling-Techniken die Erfssung der gesmten Bndbreite des Stoffwechsels uf den Ebenen der mrna (Trnscripte), der Proteine (Lottspeich, 1999) und uch der Stoffwechselmetbolite (Fiehn et l., 2000). Der betrchteten Stoffklsse entsprechend werden die Methoden mit den Begriffen Trnscriptomics, Proteomics und Metbolomics umschrieben. Ds Proteom des Weizenkorns wurde in den letzten Jhren für verschiedene wissenschftliche Frgestellungen mit Protein-Profiling untersucht, z. B. zur Identifizierung von Proteinen ls genetische Mrker für die Züchtung (Cornish et l., 2001), zur Chrkterisierung der Proteinzusmmensetzung in unreifem und reifem Endosperm (Skyls et l., 2000, Vensel et l., 2005), zur Aufklärung der biologischen Funktion einzelner Proteine wie Thioredoxin (Wong et l., 2004) und zur Untersuchung der Auswirkung von Hitzestress uf die Proteinexpression (Mjoul et l., 2003). Die Anwendung der Profiling-Techniken zur vergleichenden Chrkterisierung von Pflnzen wurde erst vor kurzem in zwei Publiktionen beschrieben. Lehesrnt et l. (2007) verwendeten Proteomics, um Krtoffeln us ökologischem und konventionellem Anbu zu vergleichen. Lu et l. (2005) verwendeten Weizen- DNA-Chips zur Chrkterisierung des Trnscriptoms von Weizen us intensiver und extensiver Lndwirtschft. Protein-Profiling zur Chrkterisierung von Weizen us ökologischem und konventionellem Anbu wurde unseres Wissens bisher nicht durchgeführt. 6

8 1.2 Plnung und Abluf des Projekts Ds Projekt ht zum Ziel, mögliche Unterschiede zwischen ökologischem und konventionellem Weizen mit Hilfe von Protein-Profiling und Inhltsstoffnlysen zu erkennen und zu spezifizieren. Die Plnung der Arbeitsziele des Projekts wr usgerichtet uf diese zwei methodischen Ansätze, Protein-Profiling und Inhltsstoffnlysen. Im Lbor wurde zunächst die Extrktion von Gesmtprotein us Weizen und die nschließende zweidimensionle (2D) Gel-Elektrophorese der Weizenproteine etbliert. Die 2D Gele wurden durch Bilduswertung densitometrisch nlysiert. Ds Ergebnis dieser Anlysen ist ein Protein-Profil der im Weizen exprimierten Proteine. Als nächster Schritt folgte die Identifizierung individueller Proteine us den 2D Gelen über Mssenspektrometrie und Dtenbnksuche (Peptide Mss Fingerprinting). Prllel wurden zur Grundchrkterisierung des Weizens durch klssische Anlytik die Gehlte n folgenden Inhltsstoffen bestimmt: Minerlstoffe, Gesmtstickstoff und Stärke. Als ernährungsphysiologisch relevnte Prmeter wurden die Gehlte von Phytinsäure, Bllststoffen, Oxlsäure, phenolische Substnzen und Glutthion ermittelt. Die Antioxidtive Kpzität sowie die Aktivitäten der Enzyme Peroxidse und Glutthionreduktse wurden bestimmt. Während der Projektlufzeit konnte eine Zusmmenrbeit mit der Abteilung Proteom- und Metbolomforschung m Lehrstuhl für Genetik der Universität Bielefeld ngestoßen und erfolgreich etbliert werden. Im Rhmen dieser Zusmmenrbeit wurde ein Metboliten- Profiling von Weizenschroten durchgeführt. Um ussgekräftige und belstbre Ergebnisse zu erhlten, wurden in diesem Projekt die große Mehrzhl der Prmeter n Weizen us zwei Erntejhren, 2003 und 2005, untersucht. Die wünschenswerte Erfssung von noch mehr Ernten wr im Rhmen des Projekts nicht möglich. Der Weizen stmmte us dem schweizerischen DOK-Feldversuch, in dem unter kontrollierten Bedingungen verschiedene ökologische und konventionelle Anbuvrinten ngelegt sind. 7

9 2 Mteril und Methoden 2.1 Weizennbu Körner des Winterweizens (Triticum estivum L. cv. Titlis) der Ernten 2003 und 2005 wurden vom DOK-Feldversuch bezogen. Der DOK-Feldversuch wird seit 1978 in der Nähe von Bsel vom Forschungsinstitut für biologischen Lndbu, Frick (Schweiz) und der Forschungsnstlt Agroscope Reckenholz-Tänikon, Zürich (Schweiz), durchgeführt. Für eine detillierte Beschreibung des Feldversuchs wird uf die Arbeiten von Mäder et l. (2002, 2006) verwiesen. In der hier vorgestellten Arbeit wurde Weizen von zwei ökologischen Anbusystemen, die ls bio-orgnisch (Org) und bio-dynmisch (Dyn) bezeichnet wurden, verwendet. Konventioneller Weizen des DOK-Feldversuchs wurde in integrierten Anbusystemen produziert, in denen entweder nur minerlischer Dünger (M) oder minerlischer und orgnischer Dünger (OM) einsetzt wurden. Die Menge n orgnischem Dünger betrug bei den zwei ökologischen Anbusystemen 1,4 Düngergroßvieheinheiten pro Hektr, und in den konventionellen Systemen entsprch die Düngemenge der schweizerischen Stndrdempfehlung für Pflnzenbu. Für jede der beschriebenen vier Anbusysteme wurde eine weitere Düngestufe mit der Hälfte der oben beschriebenen Düngemenge ngelegt. Der Weizen mit geringerer Düngestufe wurde im Rhmen dieser Arbeiten nur uf eine reltiv geringe Anzhl von Prmetern nlysiert. Bezogen uf Stickstoff, Phosphor und Klium wren die Düngemengen zwischen 34 und 51 % niedriger in den ökologischen Anbusystemen (Mäder et l., 2002). Weizen, der während des Anbus nicht gedüngt worden wr, wurde ebenflls in die Untersuchung einbezogen ( Null ). Dieser Weizen erhielt Nährstoffe durch zwei Klee-Grs- Kulturen in einer siebenjährigen Fruchtfolge und Stickstoff-Einträge durch die Atmosphäre. Sämtliche Vrinten wurden in rndomisierten Przellen in vierfcher Wiederholung ngebut (Abb. 2). Abbildung 2: DOK-Lngzeitversuch in Therwil bei Bsel, Schweiz (Fotogrphie: FiBL, Schweiz) 8

10 Fruchtfolgen, Sorten und Bodenberbeitung wren in llen Anbusystemen identisch. Ernte und Reinigung des Weizens erfolgte durch FiBL/ART. 2.2 Probenverrbeitung und lgerung Die Weizenkörner (c. 100 g) wurden mit einer Zentrifuglmühle us Titn (F. Retsch) zu Schrot vermhlen. Der Siebeinstz htte eine Porengröße von 0,5 mm. Sämtliche nlytischen Arbeiten wurden mit diesem Mteril durchgeführt. Für die Bestimmung der Elementkonzentrtionen wurde ein Aliquot des Weizenschrots bei 4 C gelgert. Für lle weiteren Untersuchungen wurde ein zweites Aliquot bei -80 C gelgert. Rückstellproben (gnze Weizenkörner) wurden bei c. 17 C dunkel gelgert. Die Tusendkornmsse (TKM) wurde durch Wiegen dreier Aliquote à 100 Körner ermittelt. 2.3 Anlytik von Inhltsstoffen Elementbestimmungen Der Probenufschluss und die Elementbestimmung wurde durchgeführt wie von Lngenkämper et l. (2006) beschrieben. Die Elementbestimmung von Cd, Pb und Ni erfolgte mittels flmmenloser Atombsorptions-Spektroskopie und Zeemnn-Untergrundkorrektur, die der Elemente Fe, Mg und Zn durch Flmmen-AAS. Proteingehlt In den Weizenproben der Ernte 2003 wurde Stickstoff (N) nch den Methode von Kjeldhl (EN ISO 3188, 1994) und in Proben der Ernte 2005 nch der Methode von Dums (ICC STANDARD No.167, 2000) bestimmt. Die ermittelten Stickstoffgehlte wurden mit dem Fktor 5,7 in Proteingehlte umgerechnet. Oxlsäure Die Gehlte n Gesmt-Oxlsäure und nd löslicher Oxlsäure wurden enzymtisch ermittelt wie von Fretzdorff (2005) beschrieben. Phytinsäure Phytinsäuregehlte wurden mit der Eisenbindemethode nch Wheeler und Ferrel (1971) bestimmt. 9

11 Stärke Stärkegehlte wurde durch enzymtischen Abbu (AOAC Methode ) unter Einstz des kommerzieller Kits K-TSTA (Megzyme, Irlnd) bestimmt (McClery et l., 1997). Fruktn Fruktngehlte wurden nch der AOAC Methode bestimmt wie von Fretzdorff und Welge (2003) beschrieben. Lösliche und unlösliche Bllststoffe Die Gehlte n löslichen und unlöslichen Bllststoffen wurden mit einer enzymtisch-grvimetrischen Methode (Anonym, 1997, Lee et l., 1992) bestimmt. Glutthion Glutthionreduktse-Aktivität und Glutthiongehlte wurden bestimmt wie zuvor beschrieben (Lngenkämper et l., 2006). Peroxidse Peroxidse-Aktivität wurde bestimmt wie von Fretzdorff (1980) beschrieben. Antioxidtive Kpzität Antioxidtive Kpzität wurde mit dem Rdiklfänger DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrlhydrozyl) bestimmt (Lngenkämper et l., 2006b). Phenol Lösliches Phenol und Gesmt-Phenol wurde mit dem Folin-Cioclteu Regenz bestimmt (Lngenkämper et l., 2006b). Metboliten-Profile Metboliten-Profile wurden in methnolischen Extrkten von Weizenproben mit Hilfe von Gschromtogrphie-Mssenspektrometrie (GC-MS) ufgenommen (Zörb et l., 2006). 10

12 Lipide Lipide wurden bestimmt wie von Helmerich und Köhler (2002) beschrieben: Lipidextrkte wurden mittels Dünnschichtchromtogrphie (DC) ufgetrennt. Die DC-Ergebnisse wurden mit Hilfe eines Lborscnners digitlisiert und densitometrisch usgewertet. Sttistische Auswertung Die sttistische Auswertung der Ergebnisse wurde mit dem Test nch Tukey mit Hilfe des SAS Progrmms (SAS Institute Inc., USA) durchgeführt. Signifiknz wurde uf dem 5 % Niveu getestet. Für jedes der verschiedenen Anbusysteme wurden Proben von mindestens drei unbhängigen Versuchsprzellen untersucht. Gezeigt werden Mittelwerte und Stndrdfehler des Mittelwertes (SE). 2.4 Zweidimensionle Gel-Elektrophorese und Mssenspektrometrie von Proteinen Die Erstellung von Protein-Profilen mit zweidimensionler Gel-Elektrophorese (2D GE) und Imgenlyse sowie Mssenspektrometrie wr ein Huptziel dieses Forschungsprojekts. Dher werden diese Methoden im Folgenden usführlich beschrieben. Proteinextrktion Geschroteter Weizen (siehe Kpitel 2.2) wurde unter Kühlung mit flüssigem Stickstoff mit Mörser und Pistill nochmls zerkleinert. Aus 200 mg Weizenschrot wurden Proteine nch einer geringfügig veränderten Methode von Görg et l. (2000) und Zörb et l. (2004) extrhiert. Ds Prinzip der Extrktion ist ein Fällen der Proteine us dem trockenen Weizenschrot mit Hilfe von Aceton, Trichloressigsäure (TCA) und Dithiothreit (DTT) und nschließendem Lösen der Proteine in hochkonzentriertem Hrnstoff und Detergens. Ein 2D Clen- Up Kit (GE Helthcre, USA) wurde zur weiteren Reinigung der Proteinextrkte eingesetzt. Diese Arbeitsschritte entfernen u.. Stärke, Lipide, orgnische Säuren, phenolische Verbindungen, Pigmente, Terpene und Ionen, die sich störend uf die 2D GE uswirken können. Die Proteinbestimmung in den Extrkten erfolgte mit dem 2D Qunt Protein Determintion Kit (GE-Helthcre, USA). 11

13 2D Gel-Elektrophorese: Isoelektrische Fokussierung (IEF) und Ntriumdodecylsulft Polycrylmid Gel-Elektrophorese (SDS PAGE) 2D GE wurde leicht modifiziert nch etblierten Protokollen durchgeführt (Westermeier und Nven, 2002). IEF erfolgte mit 500 µg Protein in immobilisierten ph Grdienten (IPG) Gelstreifen (18 cm) mit einem lineren Grdienten von ph 3 10 in einer Multiphor II Elektrophoresepprtur (GE-Helthcre, USA). Im Anschluss n die IEF wurde die SDS PAGE (12,5 % Acrylmid) der im IPG Gelstreifen fokussierten Proteine durchgeführt. Nch Inkubtion in einem Fixierungsbd wurde mit dem Frbstoff Coomssie-Blu uf Protein gefärbt. Zur Digitlisierung der 2D Gele wurden diese mit einem über Grustufen geeichten Durchlicht-Lborscnner gescnnt. Um die Lesbrkeit des Textes zu verbessern, wird in den folgenden Abschnitten der Begriff Protein verwendet, wenn ein Spot in einem 2D Gel gemeint ist. Es wird dvon usgegngen, dss jeder Spot in einem 2D Gel ein individuelles Polypeptid drstellt, ds mit oder ohne posttrnscriptionle Modifiktion vorliegen knn. Imgenlyse und sttistische Auswertung Für die beiden Erntejhre 2003 und 2005 wurden jeweils mindestens drei Feldwiederholungen von den ökologischen und konventionellen Anbuvrinten untersucht. Von jeder Vrinte wurden drei technische 2D Gel-Replikte erstellt. Die Auswertung der 2D Gele erfolgte über eine Spezilsoftwre (Delt2D, Decodon, Deutschlnd), mit der die jeweiligen technischen Replikte einer Vrinte zu virtuellen 2D Mittelwertgelen verrbeitet wurden. Auf Bsis dieser 2D Mittelwertgele wurde dnn ein Vergleich des reltiven Gehlts jedes einzelnen Proteins durchgeführt. Über die Einführung sttistischer Kriterien und Filter wurden nur solche Proteine usgewertet, die reproduzierbr in verschiedenen Gelen detektierbr wren. Ein weiterer Filter wurde so gesetzt, dss Proteingehlte us konventioneller und ökologischer Anbuform nur dnn ls verändert kzeptiert wurden, wenn durch ds Auswertungssystem ein mindestens zweifcher Unterschied der reltiven Gehlte festgestellt wurde. Proteinidentifizierung Die Identifiktion von Proteinen us 2D Gelen durch tryptischen Verdu und Mtrixunterstützter Lserdesorptions/Ionistions-Flugzeit-Mssenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) wurde im Zentrum für Molekulre Medizin Köln (ZMMK), Zentrle Bionlytik, der Universität Köln ls Auftrgsrbeit durchgeführt. Mit den experimentell erhltenen Peptidmssen- 12

14 spektren wurden Dtenbnken mit Sequenzdten von grünen Pflnzen (z. B. Reis, Weizen und Arbidopsis thlin) mit Hilfe des Progrmms MASCOT 1.9 durchsucht, um die Proteine zu identifizieren. 13

15 3 Ergebnisse Grundsätzlich sind in llen Abbildungen und Tbellen Dten für Weizen von der höheren Düngestufe (siehe Kpitel 2.1) gezeigt. Wenn Dten für Weizen von den geringeren Düngestufen ermittelt wurden, ist dies in den Abbildungen ngegeben. 3.1 Protein-Profiling Protein-Auftrennung (2D Gel-Elektrophorese) Die Arbeiten zum Protein-Profiling mit den Weizenproben des DOK-Versuchs innerhlb dieses Projekts sind bgeschlossen. Die Ergebnisse sind in einem Mnuskript, ds zur Publiktion vorbereitet wird, zusmmengestellt (Zörb et l., in Vorbereitung). In diesem Kpitel des Abschlussberichts werden die Ergebnisse zum Protein-Profiling in zusmmenfssender Form präsentiert. Zunächst wurde die Proteinufrbeitung us trockenem Weizenschrot mittels Aceton /DTT- Fällung und nschließender Lyse der Proteine in hochkonzentriertem Hrnstoff und Detergens im Lbor etbliert (siehe Kpitel 2.4). Diese Proteinufrbeitung gründet uf der Methode von Zörb et l. (2004). Dmit ist die vollständige Extrktion löslicher und uch teilweise membrnständiger Proteine möglich; eine Diskriminierung von spezifischen Proteingruppen wird weitestgehend vermieden. Die Proteinextrkte wurden einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen, in der eine Auftrennung der Proteine nch Ldungseigenschften erfolgt. Im Anschluss wurden die Proteine in SDS-PAGE Gelen nch Molekülgröße getrennt, dnn ngefärbt und die Ergebnisse (Gele) schließlich digitlisiert (siehe Kpitel 2.4). Abb. 3 zeigt ein Beispiel einer Gegenüberstellung von zwei Coomssie gefärbten 2D Gelen us ökologischem und konventionellem Anbu. Insgesmt wurden im Protein-Profiling us Weizenkörnern etw 1000 Proteine detektiert. Die reltiven Gehlte dieser 1000 Proteine wurden im sttistisch bgesicherten Vergleich von ökologischen und konventionellen Weizenkornproben ermittelt. Dzu wurden lle 1000 Proteine von jeweils über vierundzwnzig 2D Gelen us den Erntejhren 2003 und 2005 miteinnder verglichen. Zur Anlyse wurden so gennnte `Filter verwendet, die solche Proteine diskriminieren, die nicht sttistisch signifiknt in den Anbuvrinten uftrten oder 14

16 ndere usfiltert, die nicht uf llen Wiederholungen in genügend hoher Präzision wieder zu finden wren. Schließlich wurde ein weiterer Filter ngewendet, der eine differenzielle Expression eines Proteins nur dnn nerkennt, wenn ds System mindestens einen Fktor zwei zwischen den Proteingehlten in ökologischen und konventionellen Proben feststellt. Mw [ kd ] Orgnisch ph 3 Minerlisch ph ph 3 ph 10 ph 10 78,0 66,3 42,7 30,0 Abbildung 3: Protein-Profiling: Beispiel einer zweidimensionlen Auftrennung von Weizenkornproteinen durch kombinierte isoelektrische Fokussierung und SDS-Polycrylmid-Gel- Elektrophorese Aufgetrennt wurden 400 µg Gesmtprotein us Weizenschrot der Ernte 2005 des DOK-Versuchs; Molekulrgewicht (kd), vertikl. ph-wert, horizontl. Gezeigt sind zwei Einzelgele von Weizen us bio-orgnischem und konventionellem (minerlische Düngung) Anbu. Von 1000 Proteinen konnten 25 Proteine identifiziert werden, die nch Anwendung der oben gennnten strengen Qulitätskriterien in beiden Jhren unterschiedliche Gehlte in ökologischem und konventionellem Weizen ufwiesen. Nch Einbezug von strkem sisonlem Einfluss ls `Knock-out-Kriterium beim Vergleich beider Erntejhre erfüllten noch 16 Proteine die strengen Kriterien. Diese 16 Proteine bilden eine Signtur, nhnd derer die DOK-Weizenmuster us ökologischem und konventionellem Anbu unterschieden werden können. Unter diesen 16 Proteinen sind Speicherproteine, Enzyme des Kohlenhydrtstoffwechsels, eine Peroxidse und einige Proteine mit unbeknnter Funktion (Detils zur Proteinidentifizierung in Kpitel 3.1.2). In einem nächsten Schritt, der über den Rhmen dieses Projekt hinusgeht, soll untersucht werden, ob diese Signtur gleichflls bei ökologischen und konventionellen Weizenproben gilt, die von verschiedenen Stndorten und von verschiedenen Sorten stmmen. 15

17 Vor dem Hintergrund des komplexen Gesmtstoffwechsels von Pflnzen ergeben die reltiv wenigen mit verschiedenen Gehlten uftretenden Proteine, so weit identifiziert, keinen Hinweis uf Änderungen von Stoffwechselktivitäten oder uf signifiknte Reduzierung von Speicherproteinen, die für die menschliche Ernährung kritisch wären. Dher wird uf Grund der Ergebnisse des Protein-Profiling gefolgert, dss ökologischer und konventioneller DOK- Weizen hinsichtlich der untersuchen Prmeter ernährungsphysiologisch gleich wertvoll ist Proteinidentifizierung Die Identifizierung der Proteine in den 2D Gelen wurde per MALDI-TOF-MS durchgeführt (Abb. 4 und siehe Kpitel 2.4). Insgesmt wurden von 370 Proteinen mssenspektrometrische Dtensätze mit hoher Qulität erhlten. A B Abbildung 4: Zweidimensionle Gel-Elektrophorese und mssenspektrometrische Anlyse der Proteine us Weizenschrot us dem DOK-Versuch A, B: Gesmtprotein (400 µg) us Weizenschrot wurden ufgetrennt und mit Coomssie-Blu visulisiert. Anschließend wurden Proteine us dem 2D Gel extrhiert und einer MALDI-TOF-MS Anlyse unterzogen. B: Im 2D Gel sind Proteine mrkiert, von denen exkte MALDI-TOF-MS Mssenspektren erzeugt wurden. Grünfrbene Kreise mrkieren Proteine, die in Dtenbnken identifiziert werden konnten; orngefrbene Kreise zeigen Proteine, die nicht in Dtenbnken beschrieben sind. 16

18 Ein Abgleich der mssenspektrometrischen Dten mit solchen, die durch Genom- und EST- Sequenzierungsprojekte verschiedener Pflnzen (z. B. Reis, Weizen und Arbidopsis thlin) verfügbr sind, ergb, dss 132 Proteine (36 %) identifiziert werden konnten (siehe grünfrbene Kreise in Abb. 4B, individuelle Proteinidentität nicht gezeigt). Die Identität von 238 Proteinen (64 %) konnte bisher nicht ufgeklärt werden (siehe orngefrbene Kreise in Abb. 4B). Durch nhltende Vervollständigung der genomischen Dtenbnken ist dvon uszugehen, dss bld der größere Teil uch dieser Proteine identifiziert werden knn. Weitere c. 150 Spots in den Gelen konnten wegen nicht usreichender Proteinmenge oder nderer Störungen nicht per MALDI-TOF-MS nlysiert werden Profiling mit speziellen Proteingruppen Zusätzlich zur Gesmtproteinextrktion wurde eine Methodik ngewendet, die es erlubt Proteinfrktionen us Weizen uf 2D Gelen ufzutrennen. Bsis dieser Methode ist die Frktionierung der Weizenproteine nch Osborne in Albumine plus Globuline, Glidine und Glutenine, die ursprünglich für Flüssigchromtogrphie weiterentwickelt wurde (Wieser et l., 1998). Im Hinblick uf 2D GE besteht die Schwierigkeit in der Inkomptibilität der gewonnenen Proteinfrktionen, uf Grund hoher Slz- und hoher Alkoholkonzentrtion, mit der isoelektrischen Fokussierung. Durch Ausfällen der Proteine mit Aceton und DTT konnten die Störsubstnzen entfernt werden. Mit Hilfe dieses Schritts wurde die Methodik soweit ngepsst, dss trotzdem eine sehr gute Trennqulität erreicht wurde. Weil diese Methode wesentlich ufwändiger ist ls die Gesmtproteinextrktion, konnte schließlich ein Vergleich der verschiedenen Anbuvrinten über einzelne Proteinfrktionen im Rhmen dieses Projekts nicht relisiert werden. 17

19 3.2 Anlyse von einzelnen Inhltsstoffen Inhltsstoffnlysen, die mit klssischen Methoden gezielt einzelne Substnzen nchweisen, dienen der weiteren Chrkterisierung der Untersuchungsmuster. Diese Anlysen sind zudem geeignet, um eventuelle Unterscheidungsmerkmle der verschiedenen Anbuformen zu identifizieren. In den verschiedenen Anbuformen des DOK-Weizens wurden die Konzentrtionen der Minerlstoffe Mg, Fe, Ni, Zn, Cd, und Pb, Gesmtprotein, Stärke, Bllststoffe, Fruktne, Phytinsäure, Phospht, Oxlt, Oxlt Oxidse, Glutthion und Glutthionreduktse, ntioxidtive Kpzität, Ascorbinsäure, Peroxidse, α-amylse, verschiedene Lipide und ds Tusendkorngewicht bestimmt. Die Inhltsstoffnlysen sind wegen der Fülle der Ergebnisse nicht vollständig im Einzelnen ufgeführt. Eine Auswhl wird gezeigt. Die Ergebnisse sind in den in Kpitel 7 gennnten Publiktionen bereits im Detil veröffentlicht bzw. liegen ls Mnuskripte zur Veröffentlichung vor Tusendkornmsse Die Tusendkornmssen (TKM) wren in den beiden Erntejhren 2003 und 2005 in den verschiedenen ökologischen oder konventionellen Anbuformen gleich (Tb. 1); lediglich die TKM der nicht gedüngten Vrinte wr in beiden Jhren signifiknt geringer (Tb. 1). Tbelle 1: Weizen-Tusendkornmssen in den Anbusystemen des DOK-Versuches für die Erntejhre 2003 und 2005 Mittelwerte von jeweils 4 Feldwiederholungen und Stndrdfehler des Mittelwerts (SE) sind ngegeben. Signifiknz Tests (p = 0.05) wurden nch dem Tukey-Test-Algorithmus des Student-Verfhrens für ds jeweilige Erntejhr berechnet. Unterschiedliche Buchstben bezeichnen signifiknte Unterschiede der Mittelwerte. (Dyn, biologisch-dynmisch; Org, bio-orgnisch; OM, orgnisch-minerlisch; M, minerlische Düngung; Null, keine Düngung). Anbusysteme TKM (g) Ernte 2003 TKM (g) Ernte 2005 Dyn 45.3 ± ± 0.33 Org 45.2 ± ± 0.46 OM 45.1 ± ± 0.65 M 43.8 ± ± 0.60 Null 39.9 ± 0.39 b 35.2 ± 1.38 b 18

20 Dieses Ergebnis stimmt überein mit den Resultten, die für DOK-Weizen us den Fruchtfolgen von 1978 bis 1998 erhlten wurden (Mäder et l., 2007). Bei den konventionellen Anbuvrinten wurden über mehrere Fruchtfolgen zwischen 11 und 24 % höhere Weizenkornerträge bestimmt (Mäder et l., 2007). Drus wird gefolgert, dss die Anzhl der Hlme und/oder die Anzhl Körner pro Ähre in den ökologischen Anbuvrinten verringert wren Protein- und Stärkegehlte Der Proteingehlt vriierte in den Weizen der Ernten 2003 und 2005 zwischen den verschiedenen Anbuformen (Tb. 2). Der Proteingehlt stieg mit dem wchsenden Stickstoffngebot über die Düngung: in den konventionellen Vrinten OM und M wurden die signifiknt höchsten Proteingehlte gefunden (Tb. 2). Tbelle 2: Proteingehlte in Weizenkörnern des DOK-Versuchs der Ernte 2003 und 2005 Mittelwerte von jeweils 4 Feldwiederholungen und Stndrdfehler des Mittelwerts (SE) sind ngegeben. Signifiknz Tests (p = 0.05) wurden nch dem Tukey-Test-Algorithmus des Student-Verfhrens für ds jeweilige Erntejhr ermittelt. Unterschiedliche Buchstben bezeichnen signifiknte Unterschiede der Mittelwerte. (Dyn, Biodynmisch; Org, Bioorgnisch; OM, Konventionell; M, Minerlische Düngung; Null, keine Düngung). Anbusysteme Proteingehlt (g/100 g) Ernte 2003 Proteingehlt (g/100 g) Ernte 2005 Dyn 13.2 ± 0.5 cb 12.7 ± 0.1 b Org 13.5 ± 0.4 b 12.7 ± 0.3 b OM 14.8 ± ± 0.6 M 15.6 ± ± 0.5 Null 12.2 ± 0.2 c 13.1 ± 0.2 b Ähnliche Ergebnisse hben Mäder et l. (2007) für den DOK-Weizen der Anbuperioden 1978 bis 1998 berichtet. D. h. der DOK-Weizen, der in diesem Projekt verwendet wurde, verhält sich diesbezüglich so wie nch dem Stnd des Wissens zu erwrten; ds Anbusystem zeigt keine Abweichung von der Norm. Der Trend zu geringeren Proteingehlten wird beim Vergleich von ökologischem und konventionellem Weizen in der Litertur häufiger beschrieben (Bolling et l., 1986, Eltun, 1996, Steineck und Liebhrd, 1984). In 2003 htte der Weizen ohne Düngung den signifiknt geringsten Proteingehlt, während in 2005 kein Unterschied zu den beiden orgnischen Anbuformen festzustellen wr (Tb. 2). 19

21 Eine Erklärung für dieses Ergebnis ist, dss die ntürliche hohe Bodenfruchtbrkeit im DOK- Feldversuch zu reltiv hohen Proteinwerten im Weizen führt. Die Stärkegehlte wren in llen drei Jhren zwischen den verschiedenen Anbuvrinten nicht signifiknt unterschiedlich, mit Ausnhme der Vrinte M, die im Jhr 2003 signifiknt weniger Stärke ufwies ls lle nderen Vrinten (Tb. 3). Über beide Erntejhre gesehen erwiesen sich die Stärkegehlte ls nicht geeignet, um in ökologische oder konventionelle Weizen zu differenzieren. Eine usführliche Vorstellung der Ergebnisse mit Diskussion zu Stärke, resistenter Stärke und Protein findet sich im Mnuskript Bruder et l. (siehe Kpitel 7). Tbelle 3: Stärkegehlte in Weizenkörnern des DOK Versuchs der Ernte 2003 und 2005 Mittelwerte von jeweils 4 Feldwiederholungen und Stndrdfehler des Mittelwerts (SE) sind ngegeben. Signifiknz Tests (p = 0.05) wurden nch dem Tukey-Test-Algorithmus des Student-Verfhrens für ds jeweilige Erntejhr ermittelt. Unterschiedliche Buchstben bezeichnen signifiknte Unterschiede der Mittelwerte. (Dyn, Biodynmisch; Org, Bioorgnisch; OM, Konventionell; M, Minerlische Düngung; Null, keine Düngung). Anbusysteme Stärkegehlt (g/100 g) Ernte 2003 Stärkegehlt (g/100 g) Ernte 2005 Dyn 56.6 ± ± 0.4 Org 56.9 ± ± 1.1 OM 57.2 ± ± 0.7 M 52.4 ± 0.5 b 60.7 ± 0.2 Null 55.2 ± ± Minerlstoffe Die Konzentrtionen der ernährungsphysiologisch relevnten Metlle lgen in für Getreide üblichen und publizierten Bereichen. Die von uns ermittelten Konzentrtionen für Mg und Zn (Lngenkämper et l., 2006) stimmen gut mit Mittelwerten überein, die von Mäder et l. (2007) für diese Elemente im DOK-Weizen über drei Fruchtfolgen veröffentlicht wurden. Für Mg (Abb. 5A) und Zn (Abb. 5D) wurden zwischen den Anbuformen im Jhr 2003 keine signifiknten Unterschiede festgestellt. Für Fe (Abb. 5B) wurde in der Null-Vrinte eine signifiknt niedrigere Konzentrtion festgestellt ls in den gedüngten Vrinten. Es ist hervorzuheben, dss jedoch kein Unterschied für Fe zwischen ökologischer oder konventioneller Anbuform bestnd (Abb. 5B). Die Konzentrtionen des unerwünschten Metlls Ni 20

22 vriierten mit µg/kg FM reltiv strk in Abhängigkeit von der Anbuform. Ni- Konzentrtionen wren signifiknt niedriger in Org und Dyn gegenüber M und Null, ber nicht niedriger gegenüber OM. Die unterschiedlichen Ni-Konzentrtionen könnten mit erhöhten orgnischen Anteilen im Boden und dmit einer stärkeren Bindung von Ni im Boden bei Org, Dyn und OM zusmmen hängen mg / kg mg / kg Mgnesium A Eisen b b b Org Dyn OM M Null ökologisch konventionell B µg / kg mg / kg Nickel C b b b Zink D Org Dyn OM M Null ökologisch konventionell µg / kg µg / kg Cdmium E bc cd d cd Blei F Org Dyn OM M Null ökologisch konventionell Abbildung 5: Gehlte n den Minerlstoffen Mgnesium (A), Eisen (B), Nickel (C) und Zink (D) sowie den unerwünschten Minerlstoffen Cdmium (E) und Blei (F) in Weizen des DOK- Versuchs des Erntejhrs 2003 Mittelwerte von mindestens drei unbhängigen Versuchsprzellen mit Stndrdfehlern sind drgestellt. Sttistische Signifiknzen wurden mit dem Tukey-Test (p = 0.05) ermittelt. Abweichende Kleinbuchstben zeigen signifiknte Unterschiede der Mittelwerte n. (Org, bio-orgnisch, Dyn, biodynmisch, M, minerlisch gedüngt, OM, minerlisch und orgnisch gedüngt, Null, keine Düngung). [Verändert us Lngenkämper et l. (2006)]. In Abb. 5E und F sind Konzentrtionen von Cd und Pb gezeigt. Für Pb zeigen sich keine signifiknten Unterschiede zwischen den Anbuformen, während für Cd die Anbuformen M und Null leicht höhere Konzentrtionen ufweisen ls OM, Org und Dyn. Eine mögliche Erklärung könnte der mit ph 6,1 6,2 leicht niedrigere Boden ph-wert der letztgennnten Vrinten sein, gegenüber einem Boden ph-wert von 6,5 6,9 für Org und Dyn (Mäder et l., 2002). Der ph-wert des Bodens spielt für die Cd-Aufnhme (im Gegenstz zum Pb) in die Pflnze die größte Rolle, gefolgt von der Pflnzenrt und weiteren Bodenprmetern, wie z. B. dem Gehlt n orgnischer Substnz (Christensen, 1984). Mit durchschnittlich µg Cd/kg FM und µg Pb/kg FM liegen die gefundenen Konzentrtionen im 21

23 gleichen, niedrigen Bereich wie in den Weizenproben der Besonderen Ernte und Qulitätsermittlung und schöpfen die EU-Höchstwerte von jeweils 200 µg/kg FM für Cd und Pb bei weitem nicht us. Im Vergleich der Erntejhre zeigten die Konzentrtionen ller Minerlstoffe in den DOK- Weizenproben der Ernte 2005 sehr geringfügige Unterschiede zur Ernte 2003 (Dten nicht gezeigt). Es ist festzuhlten, dss die Minerlstoffkonzentrtionen in llen Anbuformen in den für Weizen üblichen Bereichen lgen. Für die Elemente Ni und tendenziell uch Cd wurden in den ökologischen und konventionellen Anbuvrinten, die orgnisch gedüngt worden wren, geringere Konzentrtionen ermittelt. Ws die Suche nch Kriterien für einen Herkunftsnchweis nbetrifft, wren die Minerlstoffe lso für Differenzierung von ökologischem und konventionellem Weizen us dem DOK-Versuch nicht geeignet Bllststoffe, Fruktne, Gesmt-Oxlsäure, lösliche Oxlsäure und Phytinsäure Bllststoffe und Fruktne gehören zu den erwünschten Inhltsstoffen, die in der menschlichen Verduung nicht verwertet werden können (Asp, 2004). Epidemiologische Studien deuten drufhin, dss Bllststoffe gesundheitsförderlich sind, insbesondere im Hinblick uf Fettleibigkeit, Dibetes, koronre Herzkrnkheiten und einige Krebsrten (Miller Jones, 2004). Die Gehlte n löslichen Bllststoffen wren in Dyn (hohes Düngeniveu) m höchsten und in OM (hohes Düngeniveu) m geringsten (Abb. 6A). Wren diese beiden Extremwerte signifiknt unterschiedlich, so zeigten die löslichen Bllststoffe zwischen nderen Anbuvrinten wesentlich geringere und nicht signifiknte Unterschiede (Abb. 6A). Insgesmt noch geringere Abweichungen ergb die Anlyse der Gehlte der unlöslichen Bllststoffe (Abb. 6B) und Fruktne (Abb. 6C). Die oben beschriebenen Dten wurden mit den Weizenproben der Ernte 2003 ermittelt. In den Weizenproben der Ernte 2005 wren nur in der Anbuvrinte ohne Düngung (Null) signifiknte höhere Bllststoffgehlte festzustellen (Dten nicht gezeigt), d. h. die Effekte der Anbuweise uf die Bllststoffe wren deutlich vom Erntejhr überlgert. 22

24 g / 100 g bc b bc Lösliche Bllststoffe b bc c b A mg / 100 g b b b Gesmt-Oxlsäure b b b b D g / 100 g Unlösliche Bllststoffe b b b b b b b B mg / 100 g Lösliche Oxlsäure E ,0 Fruktn b b b b b b b C b b Phytinsäure b b b b b F g / 100 g 0,8 0,6 0,4 mg / g ,2 2 0 Org Dyn OM Org Dyn OM M Null 0 Org Dyn OM Org Dyn OM M Null Dünger niedr. Niveu Dünger hohes Niveu kein Dünger Dünger niedr. Niveu Dünger hohes Niveu kein Dünger Abbildung 6: Gehlte n Bllststoffen [löslich (A) und unlöslich (B)]; Fruktnen (C), Oxlsäuren [Gesmt-Oxlsäure (D) und löslich (E)] und Phytinsäure (F) in Weizen des DOK Versuchs des Erntejhres 2003 Mittelwerte von mindestens drei unbhängigen Versuchsprzellen mit Stndrdfehlern sind drgestellt. Sttistische Signifiknzen wurden mit dem Tukey-Test (p = 0.05) ermittelt. Abweichende Kleinbuchstben zeigen signifiknte Unterschiede n. (Org, bio-orgnisch, Dyn, bio-dynmisch, M, minerlisch gedüngt, OM, minerlisch und orgnisch gedüngt, Null, keine Düngung). [Verändert us Lngenkämper et l. (2006b)]. Oxlsäure wird in der menschlichen und tierischen Ernährung ls `unerwünschter Inhltsstoff ngesehen, der in vielen Pflnzen einschließlich Weizenkörnern uftritt (Fretzdorff und Betsche, 1998). Oxlsäure wird in Verbindung gebrcht mit Irrittion der Drmmucos durch Oxltkristlle, Reduktion der Bioverfügbrkeit von Mg, C und Fe und Steigerung des Nierenstein-Risikos bei genetisch prädisponierten Menschen (Dunwell et l., 2000, Frnceschi und Libert, 1987). 23

25 Alle Anbuvrinten, bei denen gedüngt wurde, zeigten gleiche Gehlte n Gesmt- bzw. löslicher Oxlsäure (Abb. 6D und E). Lediglich bei der Vrinte ohne Düngung wurden signifiknt erhöhte Gesmt-Oxlsäuregehlte gefunden (Abb. 6D). Phytinsäure wurde lnge Zeit einzig ls ein Antinährstoff ngesehen, d sie die Bioverfügbrkeit von Minerlien verringert (Lopez et l., 2002). In jüngerer Zeit werden ber uch positive Eigenschften diskutiert: Phytinsäure soll wegen seiner eisencheltierenden Wirkung ls Antioxidns fungieren (Minihne und Rimbch, 2002) und ddurch sowie durch Inhibition der Tumorzellprolifertion nticnzerogen wirken (Shmsuddin, 2002). In den Weizenproben des DOK-Versuchs wren die Phytinsäuregehlte in der Ernte 2003 insgesmt wenig vribel (Abb. 6F). In der Ernte 2005 wurde dieses Ergebnis bestätigt: die Phytinsäuregehlte wren nur im Weizen ohne Düngung (Null) signifiknt erhöht (Dten nicht gezeigt). Ds Fzit dieser Untersuchung erwünschter und unerwünschter Stoffe ist, dss hinsichtlich Bllststoff-, Fruktn-, Oxlsäure- und Phytinsäuregehlte kein eindeutiger Trend zu höheren oder niedrigeren Gehlten in den ökologischen oder konventionellen Anbuformen festgestellt wurde. Für eine nlytische Differenzierung von Weizen der verschiedenen Anbuformen des DOK-Versuchs wren diese Prmeter lso nicht geeignet Antioxidtive Prmeter Antioxidntien hben eine große Bedeutung für die Funktionsfähigkeit von Pflnzen, weil sie toxische Suerstoff-Rdikle entgiften (Blokhin et l., 2003). Antioxidntien in Lebensmitteln werden in der menschlichen Ernährung ebenflls positiv bewertet, insbesondere im Hinblick uf Herz-Kreisluferkrnkungen, bestimmte Krebsrten und degenertive Krnkheiten (Stnner et l., 2004). Um die ntioxidtive Kpzität der Weizenkörner us den verschiedenen Anbuvrinten einzuschätzen, wurden unterschiedliche Tests und Anlysen durchgeführt. Die ntioxidtive Kpzität, gemessen über die Entfernung freier Rdikle (siehe Kpitel 2.3), wr in ökologischen und konventionellen Anbuvrinten gleich (Abb. 7A). Ebenso wurden für die Gehlte n Gesmt- und löslichen Phenolen (Substnzen die ntioxidtiv wirken) keine signifiknten Unterschiede zwischen den Anbuvrinten mit Düngung gefunden (Abb. 7B und C). 24

26 16 14 Antioxidtive Kpzität A 12 TE / g Gesmt-Phenol B mg / g mg / g b b b Org Dyn OM Lösliche Phenole b b b b Org Dyn OM M Null C Abbildung 7: Antioxidtive Kpzität (A), sowie Gehlte von Gesmt-Phenol (B) und löslichen Phenolen (C) in Weizen des DOK- Versuchs des Erntejhres 2003 Mittelwerte von mindestens drei unbhängigen Versuchsprzellen mit Stndrdfehlern sind drgestellt. Sttistische Signifiknzen wurden mit dem Tukey-Test (p = 0.05) ermittelt. Abweichende Kleinbuchstben zeigen signifiknte Unterschiede n. (Org, bioorgnisch, Dyn, bio-dynmisch, M, minerlisch gedüngt, OM, minerlisch und orgnisch gedüngt, Null, keine Düngung). [Verändert us Lngenkämper et l. (2006b)]. Dünger niedr. Niveu Dünger hohes Niveu kein Dünger Ascorbinsäure und reduziertes Glutthion (GSH), ein cysteinhltiges Tripeptid (N-N-γ- Glutmyl-Cysteinyl-Glycin), sind die wichtigsten ntioxidtiven Substnzen pflnzlicher Zellen (Noctor und Foyer, 1998). Ascorbinsäure kommt in Weizenkörnern llerdings nur in Spuren vor (Souci et l., 2000), ws unsere Untersuchungen der DOK-Weizenproben bestätigten (Dten nicht gezeigt). Ws Glutthion nbetrifft, wurde in Weizenkörnern ller Anbuvrinten eine um den Fktor vier höhere Konzentrtion von reduziertem gegenüber oxidiertem Glutthion bestimmt (Abb. 8A und B). Ein großer Pool n reduziertem Glutthion deutet n, dss in pflnzlichen Geweben wenig oxidtiver Stress vorliegt (Alscher, 1989). In den ökologisch ngebuten Vrinten Org und Dyn wurden im Vergleich zu den konventionellen Vrinten OM und M keine signifiknt unterschiedlichen Glutthiongehlte gefunden. Auch die leicht erhöhten 25

27 Mittelwerte von GSH und GSSG in den Körnern der Null-Vrinte sind sttistisch nicht signifiknt unterschiedlich von denen der Weizenkörner der Anbuformen Org, Dyn, OM und M. Die Aktivität von Glutthionreduktse wr in llen Vrinten gleich (Abb. 8C). Die Peroxidse-Aktivität wr in Weizen der Vrinte M m höchsten und in der Null-Vrinte signifiknt m niedrigsten. In den Anbuformen Org und Dyn lgen die Aktivitäten zwischen denen der M- und der Null-Vrinte (Abb. 8D), wobei OM einen höheren Wert ufwies ls Org und Dyn. 250 GSH A 200 GSH [µg/g ] GSSG B GSSG [ µg/g] µmol GSSG * min -1 * g Glutthionreduktse-Aktivität C µmol H 2 O 2 * min -1 * mg bc bc Peroxidse b d D 0.0 Org Dyn OM M Null ökologisch konventionell onell 0.0 Org Dyn OM M Null ökologisch konventionell Abbildung 8: Antioxidtive Substrte und Enzyme: Glutthion in reduzierter Form, GSH (A); in oxidierter Form, GSSG (B) und Glutthionreduktse-Aktivität (C) sowie Peroxidse-Aktivität (D) in Weizen des DOK-Versuchs des Erntejhres 2003 Mittelwerte von mindestens drei unbhängigen Versuchsprzellen mit Stndrdfehlern sind drgestellt. Sttistische Signifiknzen wurden mit dem Tukey-Test (p = 0.05) ermittelt. Abweichende Kleinbuchstben zeigen signifiknte Unterschiede n. (Org, bio-orgnisch, Dyn, bio-dynmisch, M, minerlisch gedüngt, OM, minerlisch und orgnisch gedüngt, Null, keine Düngung). [Verändert us Lngenkämper et l. (2006)]. 26

28 Zusmmenfssend ist festzuhlten, dss die Antioxidtive Kpzität, die Phenol- und Glutthiongehlte, sowie die Aktivitäten der Glutthionreduktse und Peroxidse in den ökologischen und konventionellen Anbuvrinten nur geringfügig und meistens sttistisch nicht signifiknt verschieden wren. Ws die Suche nch Kriterien für einen Herkunftsnchweis nbetrifft, wren diese Prmeter lso für Differenzierung von ökologischem und konventionellem Weizen us dem DOK-Versuch nicht geeignet Lipide Im DOK-Weizen (Erntejhr 2003) wurden reltive Lipidgehlte mit Hilfe von Dünnschichtchromtogrphie bestimmt (siehe Kpitel 2.3). Die freien Fettsäuren bildeten die größte Gruppe der nchgewiesenen Lipide (Tb. 4). Tbelle 4: Zusmmenstellung der Lipide in Weizen des DOK-Versuchs (in reltiven Einheiten) des Erntejhres 2003 Mittelwerte von jeweils 4 Feldwiederholungen sind ngegeben. Signifiknz Tests (p = 0.05) wurden nch dem Tukey-Test-Algorithmus des Student-Verfhrens berechnet. Unterschiedliche Buchstben bezeichnen signifiknte Unterschiede der Mittelwerte. Dyn, biologischdynmisch; Org, bio-orgnisch; OM, orgnisch-minerlisch; M, minerlische Düngung. Anbussysteme Dyn Org OM M Art der Lipide Lipidgehlte (reltive Einheiten) Freie Fettsäuren Tricylglyceride 180 b 218 b 199 b 230 1,2-Dicylglyceride ,3-Dicylglyceride 316 b b 458 b Cholesterin Cerebroside Phosphtidylethnolmin b 36 b 56 Gnglioside Archidolylphosphtidylcholin Lysophosphtidylinosit Phosphtid Säure

29 Die Lipidgehlte wren insgesmt wenig unterschiedlich in Weizen der verschiedenen Anbuvrinten. Sttistisch signifiknte Unterschiede wurden nur bei Tricylglyceriden, 1,3- Dicylglyceriden und Phosphtidylethnolmin festgestellt (Tb. 4). Diese Unterschiede ergben jedoch keinen eindeutigen Trend zu höheren oder niedrigeren Gehlten in den ökologischen oder konventionellen Anbuformen. 3.3 Metboliten-Profile Während der Projektlufzeit konnte eine Zusmmenrbeit mit der Abteilung Proteom- und Metbolomforschung m Lehrstuhl für Genetik der Universität Bielefeld etbliert werden. Im Rhmen dieser Zusmmenrbeit wurde Metboliten-Profiling von Weizenschroten us dem DOK-Versuch des Erntejhres 2003 durchgeführt. In Abb. 9 ist exemplrisch ein Profil der mit Gschromtogrphie-Mssenspektrometrie (GC-MS) erfssten Inhltsstoffe gezeigt. Orgnisch Fumrt Citrt Mlt Glukose Ribitol (IS) Scchrose Rffinose 10 Vlin Gesmt Ionenstrom (x10 6 ) Konventionell Zeit (min) Abbildung 9: Gschromtogrphische und mssenspektrometrische Anlyse methnollöslicher Inhltsstoffe von Weizen des DOK-Versuchs (2003) Oberes Chromtogrmm: bio-orgnisch gedüngt (Orgnisch); unteres Chromtogrmm: Orgnisch und minerlisch gedüngt (konventionell). Eine Auswhl identifizierter Substnzen ist gezeigt. Ribitol (IS), interner Stndrd. [Abbildung verändert nch Zörb et l. (2006)]. 28

30 Von insgesmt etw 250 detektierbren Substnzen wurden 52 unterschiedliche Metbolite für die verschiedenen Anbuformen des DOK-Versuchs bestimmt und miteinnder verglichen. Unter diesen Metboliten befinden sich Aminosäuren, Alkohole, Zuckerlkohole, Zuckerphosphte und Nukleotide. Lediglich bei den cht Inhltsstoffen α-alnin, β-alnin, Vlin, myo-inosit, Glycert, Hydroxyglutrt, Hrnstoff und Pntothensäure wurden sttistisch signifiknte Konzentrtionsunterschiede zwischen den Weizen der verschiedenen Anbuformen festgestellt. Die Konzentrtionsunterschiede dieser cht Inhltsstoffe zwischen den verschiedenen Anbuformen betrugen bis zu 50%. Eine Huptkomponentennlyse der Ergebnisse ht ber gezeigt, dss die Unterschiede in den Metbolitkonzentrtionen llein nicht zur Differenzierung zwischen ökologischem und konventionellem Weizen genutzt werden konnten. Eine Möglichkeit die Ergebnisse des Metboliten-Profiling in Kombintion mit Ergebnissen nderer nlytischer Techniken für einen Herkunftsnchweis zu nutzen, wird in Kpitel 5 erläutert. Die Ergebnisse des Metboliten-Profiling wurden im Detil veröffentlicht (Zörb et l., 2006). 3.4 Vorussichtlicher Nutzen und Verwertbrkeit der Ergebnisse, bisherige und geplnte Aktivitäten zur Verbreitung der Ergebnisse Vorussichtlicher Nutzen und Verwertbrkeit der Ergebnisse Die Projektergebnisse wurden und werden durch wissenschftliche Veröffentlichungen und durch Präsenttionen uf wissenschftlichen Tgungen einem breitem Publikum vorgestellt (s. u.). Die Ergebnisse des Protein-Profiling hben gezeigt, dss die Anbuvrinten des DOK- Weizens unterschieden werden können. Zur Etblierung eines generellen Herkunftsnchweises von ökologisch und konventionell erzeugtem Weizen sind weitergehende Forschungsrbeiten notwendig. Diese werden in Kpitel 5 erläutert. 29