Konfokale Mikroskopie

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1 Universität Regensburg Wintersemester 23/4 Seminarvortrag zum Thema: Konfokale Mikroskopie von Christoph Kamseder

2 Inhalt Das konfokale Mikroskop. Historisches Aufbau eines optischen Standard Mikroskops Aufbau eines konfokalen Mikroskops ( CSOM ) Auflösung dieses Mikroskops Beschreibung der einzelnen Bauteile Verschiedene Ausführungen von konfokalen Mikroskopen Anwendungsgebiete Vergleich mit anderen Rastermikroskopen Literaturverzeichnis Abbildungverzeichnis

3 . Historisches Zu Beginn meines Referates möchte ich kurz die Entwicklung des konfokalen Mikroskops darstellen. Im Jahr 1951 benutzten Young und Roberts ein optisches Standard - Mikroskop mit Punktbeleuchtung. Etwa sechs Jahre später baute Minsky zum erstenmal ein vom Prinzip her konfokales Mikroskop. Dieses Mikroskop war aber wenig praxistauglich, da es noch Probleme mit der Beleuchtung hatte. Erst im Jahr 1969 konnten dann Davidovids und Egger ein arbeitsfähiges konfokales Mikroskop bauen. Hierzu verwendeten sie einen Laser, der immer größere Verbreitung fand. Im gleichen Jahr gelang es Petran und Hadravsky ein konfokales Mikroskop mit Nipkow - Disk zu konstruieren. Ungefähr zehn Jahre später entwickelte Brakenhoff das konfokale Laser Mikroskop, das heute wohl am meisten verwendet wird. In den achtziger Jahren beschäftigten sich Wilson und Sheppard noch mit der Entwicklung konfokaler Mikroskope. Außerdem verbesserten Xiao, Corle und Kino Ende der Achtziger noch die Entwicklung von Petran und Hadravsky. 3

4 1. Aufbau eines optische Standard - Mikroskops Dieser Abschnitt soll den schematischen Aufbau eines optischen Standard - Mikroskops zeigen, um von diesem Aufbau dann überzugehen zum Prinzip eines konfokalen Mikroskops. Außerdem werden noch einige Formeln eingeführt, die dann später wieder verwendet werden. Abb. 1: Schematischer Aufbau Eine wichtige Formel in diesem Zusammenhang ist die Vergrößerung des Mikroskops: M = M M r T E Wichtiger aber sind noch die folgenden beiden Formeln für die numerische Apertur und die Auflösung: N. A. = nsinθ 51λ, d( 3dB) = N. A. Desweiteren soll noch unterschieden werden, ob die Beleuchtung der Probe mit inkohärentem oder kohärentem Licht erfolgt. Für eine Beleuchtung der Probe mit inkohärentem Licht ergeben sich für das Rayleigh - Kriterium folgende Gleichungen: Θ min, = 122λ D, d = 61λ min NA 4

5 Für das Sparrow - Kriterium erhält man bei inkohärenter Beleuchtung leicht verschiedene Zusammenhänge: Θ min, = 95λ D, d = 51λ min NA Im Fall von kohärenter Beleuchtung bleibt das Rayleigh - Kriterium unverändert nur das Sparrow - Kriterium andert seinen Vorfaktor., d = 51λ min NA Einen weiteren Punkt, auf den ich an dieser Stelle noch eingehen will, sind die verschiedenen Beleuchtungstechniken, da diese teilweise auch beim konfokalen Mikroskop Anwendung finden. Die wichtigsten davon sollen in einer kurzen Auflistung erwähnt werden: - Hellfeld - Aufnahme - Dunkelfeld - Aufnahme - Fluoreszenz - Aufnahme - Polarisations - Aufnahme - Phasen - Kontrast - Aufnahme Im Anschluß an diese kurze Erinnerung an das Standard - Mikroskop werden nun Aufbau und Funktion des konfokalen Mikroskops dargestellt. 5

6 2. Aufbau eines konfokalen Mikroskops ( CSOM ) Der Aufbau eines konfokalen Mikroskops wird in der nachfolgenden Skizze schematisch gezeigt. Abb. 2: Konfokales Prinzip Das wichtigste Merkmal an dieser Anordnung ist der konfokale Aufbau der Linsen und Blenden. Wie oben zu sehen, sind die Kondensor - Linse und das Objektiv so angeordnet, daß sie einen gemeinsamen Brennpunkt haben. In diesem Brennpunkt ist die Probe, die dort senkrecht zur optischen Achse gerastert wird. Die beiden Blenden komplettieren das konfokale System, indem sie jeweils im anderen Brennpunkt der Linsen befestigt sind. Hieraus sind schon die wichtigsten Bestandteile eines solchen Mikroskops ersichtlich. Diese sind zum einen die Möglichkeit der Punktbeleuchtung und -detektion, was durch ein konfokales Linsensystem erreicht wird, zum anderen ein geeignetes Rasterverfahren und eine dazugehörige elektronische Auswertung. Der erste wichtige Bestandteil daraus, nämlich die Beleuchtung, soll nun genauer betrachtet werden. Hierzu soll folgende Skizze herangezogen werden, um den Vorteil der Beleuchtung beim konfokalen Mikroskop im Gegensatz zu standardmäßiger Beleuchtung zu zeigen. Abb. 3: Beleuchtung 6

7 In dieser Grafik ist der Vorteil der Punktrasterung erkennbar. Es ist möglich genau festgelegte Ebenen in der Probe zu untersuchen, die bei normaler Beleuchtung nur schlecht oder gar nicht auflösbar wären. Man erreicht also mit dem konfokalen System eine um vieles verbesserte Auflösung entlang der optischen Achse, d.h. Tiefenschärfe, als mit einem Standard - Mikroskop möglich wäre. Außerdem verschwinden defokusierte Bilder um vieles schneller als beim normalen Mikroskop, wie an einer zweiten späteren Grafik zur Herleitung der Auflösungen zu erkennen ist. Ein weiterer Vorteil ist die verbesserte laterale Auflösung, wie auch am obigen Bild ersichtlich ist, da diese hauptsächlich durch die axiale Ausdehnung des Fokuspunkts bestimmt ist. Im weiteren Verlauf werden dann sowohl für die Tiefenschärfe als auch für die laterale Auflösung Formeln hergeleitet. Zunächst soll aber noch die Wichtigkeit der numerischen Apertur erwähnt werden. Es ist von entscheidender Bedeutung für die Tiefenschärfe, daß der Fokuspunkt entlang der optischen Achse eine möglichst geringe Ausdehnung hat. Dazu ist es notwendig, daß die Linsen eine möglichst große numerische Apertur aufweisen, damit die Strahlen möglichst steil auf die Probe einfallen. Dies soll folgende Grafik nochmal verdeutlichen. Abb. 4: Numerische Apertur Hier ist die Ausdehnung der Intensität entlang der z Achse zu sehen in Abhängigkeit von der numerischen Apertur. Man erkennt für eine hohe numerische Apertur einen schmalen Intensitätsverlauf. Daraus ergibt sich eine hohe Tiefenschärfe. 7

8 3. Auflösung dieses Mikroskops Nun sollen die Gleichungen für Tiefenschärfe und laterale Auflösung kurz und in stichpunktartiger Form hergeleitet werden. Um das weiter Verfahren klar darzustellen, folgt an dieser Stelle die bereits oben erwähnte Grafik. Abb. 5: Schema zur Berechnung der Auflösung Bei der Herleitung der Formel für die Tiefenschärfe soll zunächst von einem ebenen Spiegel, also einem ebenen Reflektor, als Probe ausgegangen werden, und dann eine ähnliche Rechnung für einen Punkt - Reflektor durchgeführt werden. Dazu wird die Amplitude des einfallenden Strahls mit Φ und eine Linsenfunktion P( Θ ) benutzt. Da nun der Strahl diese Linse zweimal durchläuft, erhält man für den reflektierten Strahl folgende Amplitude: Φ R = P 2 ( Θ) Φ Daraus ergibt sich am Detektor folgendes Signal: Θ V( ) = Φ P 2 ( Θ)sinΘ dθ Um jetzt die Tiefenschärfe zu berechnen, wird die Probe um den Weg z aus der Brennebene des Objektivs verschoben und das gemessene Signal zu dem ursprünglichen in Beziehung gesetzt. Bei der Verschiebung der Probe um z erleidet der Lichtstrahl eine Phasenverschiebung um 2knz cosθ. 8

9 Daraus ergibt sich für das normierte elektrische Feld unter Berücksichtigung der Vergrößerungsformel des optischen Systems: V ( z) = Θ P 2 ( Θ) e 2iknz cos Θ sin Θ cosθdθ Θ 2 P ( Θ)sin Θ cosθdθ Um diese komplizierten Integrale leichter berechnen zu können, wird eine paraxiale Näherung gemacht: P 2 ( Θ) = 1 cosθ = 1 Unter dieser Annahme und nach Auslassung einiger Rechenschritte ergibt sich für die Intensität dann folgender Zusammenhang: 2 sin knz( 1 cos Θ ) 2 I() z = V() z = 1 knz( 1 cos Θ ) z 2 Für die axiale Auflösung, der Tiefenschärfe, ergibt sich damit folgender Wert als Breite der Intensitätskurve bei halber Höhe zum Maximum (3dB): 45, λ d ( 3dB) = z n( 1 cos Θ ) 9, nλ ( NA) 2 Dieser Wert, der unter paraxialer Näherung und damit für kleine Winkel Θ entstanden ist, stimmt sehr gut mit dem Wert überein, der aus einer analytischen Rechnung hervorginge. Nun wird der ebene Reflektor durch einen Punkt - Reflektor ersetzt und eine analoge Rechnung angestellt. Nachdem die Probe um z aus der Brennebene des Objektivs verschoben ist, ergibt sich für die Amplitude des Strahls in Abhängigkeit von z und Θ folgender Zusammenhang, wobei sich der Punkt Reflektor auf der optischen Achse befindet: Φ(, z, Θ) = Θ P( Θ) e iknz cos Θ sin ΘdΘ Θ P( Θ)sin ΘdΘ Hierbei wurde bereits eine Phasenverschiebung berücksichtigt, die durch den Punkt - Reflektor auf der optischen Achse verursacht wird und in der e-funktion enthalten ist. Eine weitere Phasenverschiebung von exp( iknz cosθ) tritt auf für Strahlen, die unter dem Winkel Θ reflektiert werden. 9

10 Damit ergibt sich, nachdem man das Feld am Detektor analog zu vorher aus der Integration über alle Winkel berechnet hat, für die Intensität: knz 4 sin ( cos ) 2 I() z = V() z 2 1 Θ 1 = knz ( cos ) z Θ Für die axiale Auflösung, der Tiefenschärfe, ergibt sich damit folgender Wert als Breite der Intensitätskurve bei halber Höhe zum Maximum (3dB): 62, λ d ( 3dB) = z n( 1 cos Θ ) Im Anschluß daran soll nun die verbesserte laterale Auflösung berechnet werden. Dazu benötigt man eine Gleichung für Linsen. Diese Gleichung enthält als entscheidenden Bestandteil eine Bessel - Funktion ersten Grades. Diese Formel lautet: 2J ( krsin Θ) 1 hr () = kr sinθ Der Graph dieser Funktion stellt eine Airy - Funktion dar, wie im folgenden Bild für Amplitude und Intensität gezeigt. Abb. 6: Airy - Funktion Wird nun ein Lichtstrahl auf die Probe geschickt und von dieser reflektiert, so erhält man als Probenantwort: U( x, y) = h ( x, y) r( x, y) 1 Dabei stellt r(x,y) die Funktion der Probe dar, d.h. sie charakterisiert deren Reflexionsverhalten, und h () r die oben erwähnte Linsengleichung für das Objektiv. 1 Am Detektor ist dann die Wirkung der zweiten Linse auf diese Probenantwort zu messen. Die Amplitude an der Blende vor dem Detektor stellt sich folgendermaßen dar: Φ( x, y ) = h ( x, y ) h ( x, y) r( x, y) 2 1 1

11 Die Koordinaten x und y sind bestimmt durch die Vergrößerung des optischen Systems. Bei der Blende nehmen sie die Werte x und y an. Für die Intensität ergibt sich damit dieser Ausdruck: I = h 2 2 * r Damit erhält man für die laterale Auflösung einen besseren Wert als den oben beschriebenen für ein Standard - Mikroskop: 37, λ 37, λ d ( 3dB) = = z nsin Θ NA Dies wird nochmals mit folgendem Graphen deutlich. Abb. 7:Auflösungen im Vergleich Wird nun die laterale Auflösung gegen die Tiefenschärfe aufgetragen, ergibt sich der nachfolgende Graph, in dem die Vorteile des konfokalen gegenüber dem Standard - Mikroskop nochmals dargestellt sind. Dieser Graph zeigt das Auflösungsverhalten in Abhängigkeit von der numerischen Apertur. Optimal wäre eine kreisförmige Kurve. Das konfokale Mikroskop unterdrückt die Ausbuchtungen beim normalen Mikroskop schon ziemlich gut, sie sind aber immer noch leicht vorhanden, wie aber kaum zu sehen ist. 11

12 Diese Graph zeigt die laterale Auflösung aufgetragen gegen die Tiefenschärfe in Abhängigkeit von der numerischen Apertur. Abb. 8: Auflösung 3D Abschließend zu diesem sehr theoretischen Teil sollen noch stichpunktartig die Vorteile des konfokalen Mikroskops gegenüber dem Standard - Mikroskop dargestellt werden: - größere Schärfe - Verschwinden defokusierter Bilder - kein Schneiden dünner Schichten nötig - verbesserte Auflösung - Vielzahl von Anwendungsgebieten - verbesserter Kontrast Im Experiment wird dies folgendermaßen deutlich ( links Standard Mikroskop, rechts konfokales Mikroskop ). Abb. 9: Experimentelle Unterschiede 12

13 4. Beschreibung der einzelnen Bauteile Nun gehe ich auf die technische Realisierung solcher konfokaler Mikroskope ein, wobei zunächst speziell auf die verwendeten Lichtquellen, die optischen Bauteile, das Rasterverfahren und das Detektionsverfahren eingegangen wird. Bei den verwendeten Lichtquellen findet man Quecksilberdampflampen, Xenonlampen und Bogenlampen für inkohärente Beleuchtung und verschiedene Laser für kohärente Beleuchtung. In der anschließenden Übersicht sind die Merkmale der obigen Lampen aufgelistet, auf den Laser wird an anderer Stelle eingegangen. Vorteile: - keine unerwünschten Interferenzen - breitbandig - kompakt und effizient - einfache Fokuseinstellung Nachteil: - chromatische Abberation - Intensität gering Zu den optischen Bauteilen ist zu sagen, daß die Qualität der Linsen von entscheidender Bedeutung ist, v.a. im Hinblick darauf daß sphärische und chromatische Abberation sehr schnell zu einem großen Problem werden. Für Blenden und Strahlteiler gelten weniger hohe Qualitätsansprüche. Bei den Blenden gilt grob, daß eine große Blende mehr Intensität zuläßt aber weniger Genauigkeit liefert und eine kleine Blende die Intensität verringert dafür höhere Genauigkeit liefert. Aber der Einfluß des Rauschens nimmt bei kleinen Blenden stark zu. Zu den Rasterverfahren muß erwähnt werden, daß sich verschiedene Techniken als praktisch erwiesen haben, wie z.b. Proben -, Strahl - und Objektivrasterung. Hierzu noch eine kurze Übersicht: - Probenrasterung - mechanisch - piezoelektrisch - Strahlrasterung - Verschiebung der Blende - Drehung von Spiegeln - Rastern einer Glasfaser - Objektivrasterung - Rasterung mit Nipkow - Disk beim RSOM An das Rasterverfahren und den Probenhalter werden hohe Ansprüche an ihre Genauigkeit gerichtet. Außerdem müssen sie vibrationsarm sein und der EDV ihre jeweilige Position rückmelden können. Dies geschieht z.b. über Interferometer, Doppler - Geschwindigkeits - Messung oder Lichtschranken. Es werden auch verschiedene Techniken zur Detektion des Lichtes verwendet, die aber teilweise von der Art des verwendeten konfokalen Mikroskops abhängen. In der folgenden Auflistung ist darauf bereits eingegangen. Die ersten beiden Punkte stellen den Standard dar. Verwendete Detektionsverfahren: - Photomultiplier - Photodiode - CCD - Kamera ( bei Spalt - Mikroskopen und RSOM ) - Augen ( bei Spalt - Mikroskopen und RSOM ) 13

14 5. Verschiedene Ausführungen konfokaler Mikroskope Nun will ich auf die verschiedenen technischen Ausführungen konfokaler Mikroskope eingehen. Diese sollen in nachfolgender Auflistung kurz aufgezählt werden und dann der Reihe nach erklärt werden. - CSLM ( konfokales Laser - Mikroskop ) - RSOM ( konfokales Mikroskop mit Nipkow - Disk ) - Spalt - Mikroskop - CSTM ( konfokales Transmissionsmikroskop ) - 2-Photonen Anregung Das konfokale Laser Mikroskop (CSLM) Beim kofokalen Laser Mikroskop wird an Stelle einer Lampe ein Laser als Lichtquelle verwendet. Der Laser bringt einige Vorteile aber auch Nachteile mit, die hier kurz aufgelistet werden sollen. Vorteile eines Lasers: - Kohärenz - Strahlbündelung - monochromatisch - u. U. abstimmbar - hohe Intensitäten möglich - punktstabil Mögliche Nachteile: - Kohärenz - Modenstruktur, TEM erwünscht Die hauptsächlich verwendeten Laser sind der HeNe-Laser, weil er kostengünstig und modenstabil ist und mehrere Wellenlängen bietet, sowie der Diodenlaser, wobei Rückreflexionen zu vermeiden sind. Der Argon-Laser wird vorwiegend zu Fluoreszenzversuchen verwendet. Der schematische Aufbau eines Laser Mikroskops hat folgende Gestalt. Abb.1: CSLM 14

15 Eine technisch ausgefeiltere Version sieht folgendermaßen aus: Abb.11: CSLM detailliert Das konfokale Mikroskop mit Nipkow - Disk Das Prinzip liegt darin, zeitgleich viele Löcher in der Nipkow Disk anstatt nur eines einzigen in der Lochblende zu beleuchten und die Disk dabei rotieren zu lassen. Der Vorteil besteht in der höheren Lichteffizienz und der höheren Rastergeschwindigkeit. Außerdem ist eine Betrachtung der Probe direkt ohne Meßelektronik und in Echtzeit möglich. Der schematische Aufbau eines solchen Mikroskops sieht wie folgt aus. Abb.12: RSOM 15

16 Das konfokale Spalt - Mikroskop Hier besteht das Prinzip darin, die Lochblende durch eine Spaltblende zu ersetzen. Das hat eine höhere Lichteffizienz und damit höhere Intensität zur Folge. Außerdem werden andere Beobachtungsmöglichkeiten realisierbar, wie z.b. eine Kamera, und nur eine Rasterrichtung ist nötig. Nachteile sind bei dieser Ausführung, daß der Hintergrund bei Defokusierung stark zunimmt und das Mikroskop sich wie ein Standard - Mikroskop entlang des Spalts verhält. Eine Ausführung soll hier dargestellt werden, wobei der Spalt durch eine Zylinderlinse ersetzt ist und das Licht über eine Glasfaser eingekoppelt wird ( was die Verwendung mehrerer Laser zeitgleich möglich macht ). Abb.13: Spalt - Mikroskop Das konfokale Transmissionsmikroskop (CSTM) Der Unterschied zum normalen konfokalen Mikroskop liegt lediglich darin, daß dieses Mikroskop die Strahlen detektiert, die durch die Probe gehen, anstatt der reflektierten Stahlen. Man unterscheidet zwischen zwei Formen, nämlich ob das Licht die Probe einmal oder zweimal durchläuft. Abb.14: CSTM 16

17 Kommerzielle Ausführungen arbeiten sowohl in Transmission wie auch in Reflexion. Mit ihnen ist es möglich zu unterscheiden welches Licht von der Probe reflektiert wurde und welches durchging. Außerdem können Ober- und Unterseite der Probe unabhängig voneinander betrachtet werden. Man kann die Probe also von beiden Seiten ansehen. Abb.15: Kommerzielle Ausführung Die 2-Photonen Anregung Auf die 2-Photonen Anregung soll hier nur oberflächlich eingegangen werden. Das Prinzip besteht darin ein Molekül nicht mit seiner charakteristischen Wellenlänge anzuregen sondern mit zwei Photonen von je genau der halben Wellenlänge. Dann wird die Fluoreszenz des Moleküls, daß in seiner charakteristischen Wellenlänge die vorher zugeführte Energie wieder abstrahlt, beobachtet. Es ist so auch möglich z.b. Partikel in der Zelle zu verfolgen. 17

18 6. Anwendungsgebiete Nun will ich noch auf die wichtigsten Anwendungsgebiete der konfokalen Mikroskopie eingehen, wobei ein besonderes Augenmerk auf die Untersuchung von Halbleitern (Halbleiter - Metrologie) und die Biologie gelegt wird. Andere wichtige Anwendungsbereiche sind die Materialwissenschaften generell und die Geologie. Die Anwendungsgebiete in der Halbleiter - Metrologie sind: - Critical Dimension Messung, d.h.: Vermessen der kleinsten Bauteile auf integrierten Schaltungen erreichbare Präzission: bei,5µm - Strukturen müssen,16µm - Fehler im Halbleiter erkennbar sein - Dickenmessung von Schichten möglich - Overlay Measurement, d.h.: Vermessung der Lage verschiedener Schichten zueinander auf einer integrierten Schaltung Die wichtigsten Anwendungsgebiete in der Biologie: - Untersuchung von lebendigem Gewebe möglich - Einblick ins Gewebe durch geeignete Einstellung des Fokuspunkts möglich; dadurch wird ein Tiefeneinblick ins Gewebe durch eine Verschiebung der Probe möglich - Fluoreszenz - Messungen: dadurch wird eine Verfolgung von Partikeln in der Zelle möglich - Phasenuntersuchungen - Ophthalmologie 18

19 7. Vergleich mit anderen Rastermikroskopen Zum Abschluß stelle ich nun noch einen Vergleich mit anderen Rastermikroskopen dar. Stellvertretend nehme ich dafür das REM und das RTM. Hierzu werden kurz die Vorteile und Nachteile dieser Mikroskope gegenüber dem konfokalen Mikroskop aufgelistet. Die Vorteile beim REM sind: - für kleine Strukturen besser - 3-dimensionale Bilder - hoher Fokusbereich durch kurze Wellenlänge der Elektronen Die Nachteile gegenüber dem konfokalen Mikroskop: - keine Tiefeninformation, deswegen wird Schneiden dünner Schichten nötig - Vakuum nötig, deswegen können lebende Objekte nur sehr schwer untersucht werden - hohe Energie des Elektronenstrahls kann die Probe zerstören - hoher Aufwand unter anderem auch bei den Kosten Die Vorteile des RTM sind: - Untersuchung atomarer Größenordnungen möglich - keine Probleme mit Wellenlängen, da der Tunnelstrom gemessen wird - Untersuchung von Oberflächenprofilen und -potentialen Die Nachteile gegenüber dem konfokalen Mikroskop: - nur Oberflächenmessung möglich, keine Gewinnung von Tiefeninformationen möglich - Probe muß leitend sein - Spitze ( Cantilever ) verschleißanfällig, da er in kleinem Abstand über der Probe sitzt 19

20 Abschließend noch ein Bild wie ein solches konfokales Mikroskop aussieht: Abb. 16: Konfokales Mikroskop 2

21 8. Quellen Lipson, Tannhauser; Optik; Springer Verlag Berlin Heidelberg, 1997; [1] Corle, Kino; Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems; ACADEMIC PRESS, 1996; [2] Sheppard, Shotton; Confocal Scanning Laser Microscopy; BIOS Scientific Publishers, 1997; [3] Internet: [4] 9. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Schematischer Aufbau [2] Abbildung 2: Konfokales Prinzip [1] Abbildung 3: Beleuchtung [3] Abbildung 4: Numerische Apertur [3] Abbildung 5: Schema zur Berechnung der Auflösung [2] Abbildung 6: Airy - Funktion [2] Abbildung 7: Auflösung im Vergleich [3] Abbildung 8: Auflösung 3D [3] Abbildung 9: Experimentelle Unterschiede [2] Abbildung 1: CSLM [2] Abbildung 11: CSLM detailliert [2] Abbildung 12: RSOM [2] Abbildung 13: Spalt - Mikroskop [2] Abbildung 14: CSTM [2] Abbildung 15: Kommerzielle Ausführung [2] Abbildung 16: Konfokales Mikroskop [4] 21