Life Science Konferenz 05. Mai 2010 in Jena. Chancen und Möglichkeiten - Real-time PCR

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1 Life Science Konferenz 05. Mai 2010 in Jena Chancen und Möglichkeiten - Real-time PCR

2 Die 3 Phasen der PCR 1. Denaturierung DNA-Doppelstrang wird in Einzelstränge aufgeschmolzen Für 30 sec auf 95 C erhitzen Genomische oder komplexe DNA wird vorab für 5-10 min denaturiert Denaturierung

3 Die 3 Phasen der PCR 2. Annealing Anlagerung der Primer an die Template DNA für sec auf C abkühlen Annealing Temperatur (T A ) kann anhand der Primer-Schmelztemperatur (T M ) abgeschätzt werden Annealing

4 Die 3 Phasen der PCR 3. Extension Polymerase-vermittelte DNA-Synthese ausgehend vom Primer 3 -Ende (5 3 -Synthese) Extension

5 PCR-Reaktion Zyklus 1 Zyklus 2 Zyklus 3 Zyklus 4 Zyklus n Denaturierung Annealing Extension 2 Kopien 4 Kopien 8 Kopien 16 Kopien 2 n Kopien Die Menge an Produkt verdoppelt sich mit jedem Zyklus N = Zahl der amplifizierten Moleküle N = N 0 * 2 n N 0 = Zahl der Startmoleküle n = Zahl der Zyklen

6 Kinetik der PCR-Reaktion Idealer Verlauf Verlauf mit Sättigung Idealfall Sättigung 14,00 12,00 12,00 10,00 Log Kopienzahl 10,00 8,00 6,00 4,00 Log Kopienzahl 8,00 6,00 4,00 2,00 2,00 0, , Zyklus Zyklus PCR Reaktionen verlaufen nie optimal, es kommt zu Sättigungseffekten Gründe für den Sättigungseffekt: Produkte reannealen (Kompetition mit Primern) Anhäufung von inhibierenden Nebenprodukten Polymerase, Primer und dntps werden limitierend

7 Kinetik der PCR-Reaktion Plateau Phase Log (Kopienzahl) Frühe Phase Log Phase Realer Verlauf einer Produktassimilationskurve einer PCR-Reaktion Zyklus Frühe Phase - Signal unterhalb des Detektionslimits - Keine optimale Amplifikation, Reaktion muss sich erst einschwingen Log Phase - Amplifikation läuft optimal (exponentielle Vervielfältigung) Plateau Phase - Amplifikation läuft suboptimal wegen limitierender Reagenzien und inhibierender Reaktionsprodukte

8 Das Problem der Quantifizierung a b c d a Log (Kopienzahl) b c d Zyklus Auftrennung im Agarosegel Endpunktanalyse im Agarosegel Schwierig, da nur in einem engen Zyklusfenster möglich nicht quantitativ Quantifizierung nur über real-time PCR möglich

9 Quantitative Real-Time PCR Die Zunahme der Fluoreszenzemission wird während der Reaktion überwacht und als Indikator für Produktakkumulation verwendet. In jedem PCR-Zyklus (in Echtzeit). Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren (Prinzip der PCR) Zusätzlich Möglichkeit der Quantifizierung über Fluoreszenz Erzeugung fluoreszierender PCR-Produkte Zunehmende Menge an PCR-Produkten steigende Fluoreszenz Möglichkeiten: Interkalierende Farbstoffe Sequenzspezifische Sonden

10 Interkalierende Farbstoffe SYBR Green Fluoreszenz nach Einlagern in doppelsträngige DNA: Zunahme Target-DNA korreliert mit Zunahme der Fluoreszenz Keine Sequenzspezifität Zwischen verschieden PCR Produkten kann nicht unterschieden werden Keine Multiplex-Messungen möglich Schmelzkurvenanalyse nötig

11 Schmelzkurvenanalyse Fragmentlängen und somit Spezifität bestimmbar Temperatur langsam kontinuierlich erhöht: Aufschmelzen der DNA Bei fragment-spezifischer Schmelztemperatur denaturiert Doppelstrang in Einzelstrang SYBR Green wird freigesetzt Fluoreszenzabnahme Unterscheidung da PCR-Produkt DNA hat höheren Schmelzpunkt als unspezifisch entstehende Primerdimer

12 Sequenzspezifische Sonden Sonde: (z.b. Taqman) Sequenzspezifisch Fluoreszenz-Farbstoff (Reporter): FAM, VIC, ROX usw. Quencher: dämpft Reporter-Fluoreszenz Polymerase: TAMRA, Black-Hole-Quencher (BHQ) 5-3 -Exonuclease-Aktivität Abbau Sonde bei Synthese des Stranges vom 5 -Ende ausgehend Quencher und Reporter entfernen sich räumlich Fluoreszenz steigt an Messung am Ende der Elongation jedes Zyklus

13 Einsatzgebiete der Detektionsmethoden SYBR Green Assays die nicht der Spezifität von Sonden-basierten Assays bedürfen Singleplex Reaktionen Generelles Screenen von Transkripten Wenn das PCR System voll optimiert ist (keine Primer-Dimere, keine unspezifischen Amplicons) Genspezifische Sonden Allelische Diskrimierung Multiplex Reaktionen Amplifikation gering exprimierter Transkripte Detektion seltener Pathogene Methylierungsspezifische PCR

14 qtower und TOptical qtower TOptical

15 Patentiertes Optisches System Multiplexer Farbmodul Motor 1 8 Optische Fasern LED blau LED rot LED weiss Lichtquelle 8 Optische Fasern Rotierender Modulträger Konkaver Spiegel 8 Kollimatoren CPM Detektor Motor 2 Linsenarray Messkopf Spindel Modulträger rotiert: 6 Umdrehungen/sek. Shuttle mit 8 optischen Fasern liest 96 Wells spaltenweise aus Dauer des Scanvorgangs ist unabhängig von der Zahl der gemessenen Farben Patent Nr. DE B4 PCR Block

16 Aufbau des Multiplexers Scanner Filterrad LED Lichtquelle Photomultiplier

17 Funktionsweise des Multiplexers 6 Umdrehungen/sek Farbmodul grün 8 Kollimatoren Farbmodul gelb LED Fluoreszenzlicht zur Anregung Farbmodul rot Farbmodul blau Enden der 8 optischen Fasern

18 Optischer Weg Detektor Emissionsfilter (Interferenz) Emissionsfilter (Glas) Strahlteiler Lichtquelle Anregungsfilter Linse Kollimatorlinse Ferrule mit optischer Faser Probe

19 Filter Anregung durch drei langlebige, hoch-intensive LEDs (blau, weiss, rot) Farbmodule mit Anregungs- und Emissionsfiltern Aufrüstung mit bis zu 4 (qtower) bzw. 6 (TOptical) Farbmodulen nach Wahl Kein passiver Referenzfarbstoff notwendig Filter Anregung Emission Bsp. Farbstoffe TOptical Filter Modul 1 470nm 520nm FAM, SYBR Green, Alexa488 TOptical Filter Modul 2 515nm 545nm JOE, VIC, HEX, Yakima Yellow TOptical Filter Modul 3 535nm 580nm TAMRA, DFO, Alexa 546, NED TOptical Filter Modul 4 565nm 605nm ROX, TexasRed, Cy3.5 TOptical Filter Modul 5 630nm 670nm Cy5, Alexa 633, Quasar 670 TOptical Filter Modul 6 660nm 705nm LightCycler Red 705, Alexa 680 TOptical FRET Modul 1 470nm 580nm FAM/TAMRA TOptical FRET Modul 2 470nm 670nm FAM/Cy5 TOptical FRET Modul 3 470nm 705nm FAM/Cy5.5 TOptical FRET Modul 4 515nm 670nm JOE/Cy5

20 Fluoreszenzanregung LED Anregung qtower / TOptical vs. Absorption Farbstoffe LED Emission/Absorption nm FAM JOE/HEX/VIC 6-ROX TET TAMRA Cy5 Cy5.5 LED blau LED weiss LED rot Drei LEDs zur bestmöglichen Anregung üblich verwendeter Fluoreszenzfarbstoffe

21 Block qtower TOptical 96 well low profile rapid (LPR) Silberblock Heizrate 12 C/sek, Kühlrate 8 C/sek Geeignet für kleinste Probenvolumina Korrosionsschutz durch Gold- Anodisierung Sample Protection System (SPS) 96 well Silberblock Heizrate 6 C/sek, Kühlrate 4,5 C/sek Geeignet für Standard PCR Tubes, 8er Streifen, Mikrotiterplatten Korrosionsschutz durch Gold- Anodisierung Temperaturgradient (optional)

22 Software Einfaches und übersichtliches Erstellen von Experimenten Inkl. Auswertungsmodulen für: a) Absolute Quantifizierung b) Relative Quantifizierung c) Ct-Quantifizierung d) Allelische Diskrimierung e) Schmelzkurvenanalytik MIQE-konforme Probendokumentation Benutzerverwaltung inkl. Adminstratorfunktion Zahlreiche Exporttools (Excel, REST, qbase, Biogazelle)

23 Zusammenfassung Patentiertes optisches Shuttlesystem mit Hochleistungs-Optikfasern Optimale Anregung durch 3 verschiedenfarbige, langlebige LEDs Anregung und Detektion aller gewöhnlich verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe Einzigartige Flexibität durch kundenspezifische Konfektionierung mit Farbmodulen Kein passiver Referenzfarbstoff notwendig qtower rapidpcr - real time Kleinste Probenvolumina Multiplexing bis zu 4 Farben Geringe Leistungsaufnahme Geringer Platzdebarf TOptical modulares Blocksystem Gradientenfunktion (optional) Multiplexing bis zu 6 Farben Offene Plattform für Kits und Plastikmaterialien aller Art

24 Trends in der real-time PCR Multiplex real-time PCR Kleine Reaktionsvolumina Rapid/Fast real-time PCR Offene Plattformen für alle Kits und Plastikwaren Flexibilität in der Konfiguration der Geräte Barcode-Reading LIMS-basierte Probendokumentation MIQE-konforme Erfassung von Versuchsabläufen

25 Real time PCR Hauptanwendungsgebiete Quantifizierung der Genexpression Qualitätskontrolle und Assayvalidierung Detektion und Quantifizierung von Pathogenen Messung von DNA-Schäden (z.b. Microsatelliten-Instabilitität, Strahlenschäden) Bestimmungen mitochondrialer DNA Genotyptisierungen über allelische Diskriminierung Bestimmung von Copy Number Variations (CNV) Pharmakogenetik Beispiele für neuere Techniken DNA-Methylierungsstudien mirna Messungen Assymetrische lineare Amplifikation zur Bestimmung von low-level Transkripten (LATE-PCR)

26 Neue real-time PCR Techniken DNA-Methylierungsstudien Eukaryoten: - Regulation der Genexpression Prokaryoten: - Schutz vor Fremd-DNA - Fehlerkorrektur bei der DNA-Neusynthese Methode Nachweis der Methylierungsstellen nach Bisulfidkonversion der DNA Verwendung von spezifischen Sonden, die an unkonvertierte oder konvertierte DNA-Abschnitte binden

27 MSP (methylation-specific real-time PCR) Nicht-methylierte DNA Methylierte DNA CH 3 CH 3 CH 3 CGCGTCG ATC CGCGTCG ATC Bisulfidkonvertierung NaHSO 3 CH 3 CH 3 CH 3 UGUGTUG ATU CGCGTCG ATU Sonde 1 Sonde 2 CH 3 CH 3 CH 3 Sonde 1 UGUGTUG ATU CGCGTCG ATU ACACAAC Sonde 2 GCGCAGC Sonde 2 GCGCAGC Sonde 1 ACACAAC Nur Sonde 1 bindet Nur Sonde 2 bindet Real-time PCR

28 Neue real-time PCR Techniken LATE-PCR LATE-PCR wurde spezielle für die Amplifikation von low-copy Targets entwickelt (Gewinn von 1-2 Ct-Werten) Kombination aus exponentieller Amplikation und linearer Amplifikation Verwendung von zwei Primern, wobei Primer 1 im deutlichen Überschuss zu Primer 2 eingesetzt wird Während der ersten Zyklen exponentielle Vermehrung des Produkts Nach Aufbrauchen von Primer 2 nur noch lineare Amplifikation Originalpublikation: Sanchez et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA, 101(7):

29 LATE-PCR (Linear After The Exponential PCR) konventionelle real-time PCR Exponentielle Amplifikation für ca. 40 Zyklen Denaturierung Frühe Phase der Amplifikation Exponentielle symmetrische Amplifikation Amplifikation in Sättigung Extension Annealing Sondenbindung bei hohen Temperaturen Exponentielle Amplifikation für ca. 20 Zyklen LATE-PCR Lineare Amplifikation für ca. 50 Zyklen Exponentielle symmetrische Amplifikation Lineare assymetrische Amplifikation Lineare assymetrische Amplifikation Sondenbindung auch bei niedrigen Temp an Einzelstränge erleichtert

30 Neue real-time PCR Techniken mirna Profiling mirnas spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression bei Eukaryoten (Abbau von mrna - Organogenese, Tumore) mirnas sind kleine, non-coding RNAs, die durch die RNA-Polymerase II synthetisiert werden Sie unterliegen einer Reifung: pri-mirna -> pre-mirna -> mirna mirnas haben keinen PolyA-Tail RISC RISC pri-mirna pre-mirna Dicer Drosha AAAA 3 mrna Zellkern Cytosol

31 Neue real-time PCR Techniken mirna Profiling Stem-Loop basierte cdna-synthese und sondenbasierter Nachweis Oligo(dT) basierte cdna-synthese und SYBR Green Nachweis Bindung eines loop- RT Primers 5 mirna 3 Stem-Loop RT-Primer mirna 5 3 (A) n Polyadenylierung cdna Erststrangsynthese (A) n (T) n cdna- Erststrangsynthese Zweitstrangsynthese Oligo(dT)- Primer mit Tag Amplifikation mirna spezifischer Primer mirna spezifischer Primer (T) n (A) n Zweitstrangsynthese Amplifikation (T) n mirna spezifische Sonde Detektion über SYBR Green

32 Neue real-time PCR Techniken High resolution melting - HRM Hochauflösende Schmelzkurve mit kleinen Temperaturinkrementen Verwendung von quantitativ interkalierenden 3rd Generation Farbstoffen wie SYTO 9, LC Green oder Eva Green Hohe Temperaturuniformität des Thermocycler-Blocks erforderlich Detektion von einzelnen Nukleotidaustauschen Fluoreszenz Normale DNA agtactggactaggttactcttagccta Mutierte DNA agtactggactaggctactcttagccta 55 C 95 C Temperatur HRM und LC Green sind Warenzeichen von Idaho Technologies, SYTO 9 Invitrogen Corporation, Eva Green Biotium Inc

33 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Wir wünschen Ihnen allen einen interessanten und abwechslungsreichen Tag!

34 Technische Spezifikationen TOptical qtower Blockformat 96 well standard, Silber 96 well rapid, Silber Blockwechsel Ja Nein Gradient Optional Nein Max. Heizrate 6,0 C/sek 12,0 C/sek Max Kühlrate 4,5 C/sek 8,0 C/sek Blockhomogenität +/- 0,15 C bei 55 C +/- 0,25 C bei 72 C +/- 0,50 C bei 95 C +/- 0,2 C Kontrollgenauigkeit +/- 0,1 C +/-0,2 C Probenvolumen 5µl bis 80µl 5µl bis 20µl LED blau, warmweiss, rot blau, warmweiss, rot Anregung 8 Hochleistungs-Optikfasern in Shuttle Max. Filteranzahl 6 4 Scandauer 96 well 6 sek 4 sek Software qpcrsoft qpcrsoft Algorithmen Absolute Quantifizierung Relative Quantifizierung Ct-Quantifizierung Allelische Diskrimierung Schmelzkurvenanalytik 8 Hochleistungs-Optikfasern in Shuttle Absolute Quantifizierung Relative Quantifizierung Ct-Quantifizierung Allelische Diskrimierung Schmelzkurvenanalytik