31. Jahrgang Juni 2011 GIT. Spezial. Forschung Entwicklung Produktion. Chromatographie. Kopplungstechnik. Extraktion. Mechanische Trennverfahren

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1 31. Jahrgang Juni 2011 GIT Spezial Forschung Entwicklung Produktion Chromatographie Kopplungstechnik Extraktion Mechanische Trennverfahren

2 Präzision ist Vertrauenssache «Wenn es um applikative Fragestellungen geht, haben wir bei Metrohm immer konkrete Ansprechpartner, im Aussendienst und in der Zentrale.» Dieter Bossmann, SGS INSITUT FRESENIUS - - Metrohm. People you can trust.

3 Editorial HPLC Symposium 2011 Wie jedes Jahr treffen sich Experten der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf dem HPLC Symposium um neueste Trends aus dem Bereich der analytischen Trenntechniken zu besprechen und zu diskutieren. Gastgeber ist dieses Jahr die Ungarische Gesellschaft für Separationswissenschaften, welche zur HPLC 2011 vom 19. bis 23. Juni 2011 in die Stadt einlädt, in welcher Csaba Horváth, der Vater der HPLC, studiert hat. Wie Sie sich schon denken können sprechen wir hier von Budapest. Die HPLC entwickelt sich sehr schnell und neue verbesserte Geräte ermöglichen heute Trennungen, die noch vor wenigen Jahren Techniken wie der Massenspektrometrie vorbehalten waren. Schon seit 20 Jahren wird die Überkritische Flüssigkeitschromatographie (SFC) als vielversprechende Technologie gehandelt. Technische Schwierigkeiten haben die theoretischen Vorteile dieser Technik in den Hintergrund gedrängt. Auf der Pittcon 2011 hat Waters ein neues Gerät für die SFC vorgestellt. Der Ansatz ist ein komplettes System das als Gesamtheit die technischen Probleme überwinden soll und auch die Verwendung von Sub-2-µm Partikelsäulen zulässt (Seite 10). Weitere Themen des HPLC Symposiums sind vor allem die verschiedensten Anwendungsbereiche in der Flüssigphasenseparation, aber auch andere Trenntechniken wie z. B. Elektrophorese, Elektrochromatographie, Kopplungstechniken (LC-MS) bis hin zu Mikrofluidics und Lab-on A Chip wird man hier wiederfinden. Plenumsvorträge im wissenschaftlichen Bereich reichen z. B. von Vorträgen zur Partikeltechnologie, Multidimensionales Separation bis hin zu Vorträgen in Erinnerung an Uwe Neue, der Experte vor allem im Bereich der Säulenchemie, und natürlich an Csaba Horváth. Im Ganzen besteht das wissenschaftliche Programm aus acht Plenumsvorträgen, 30 Keynote Vorträgen, und 90 weiteren Vorträgen zu spezifischeren Anwendungen. Poster-Sessions, Kurzlehrgänge und Tutorien runden das Programm ab. Ausstellungs- und Herstellerseminare werden die Teilnehmer über die neuesten Entwicklungen bei Geräten und Instrumenten, Technologien und Anwendungen des Fachgebiets aufklären. Auch wir von der GIT Labor-Fachzeitschrift werden uns diese wichtige Veranstaltung nicht entgehen lassen. Halten Sie nach uns Ausschau auf der HPLC 2011 in Budapest. Ihr GIT Labor-Fachzeitschrift Team Hilpertstraße 20a Darmstadt Tel.: 06151/3972-0

4 Inhalt EDITORIAL HPLC Symposium EVENT Chrom Forum Hamburg TITELSTORY Steigerung der Effizienz des Labors Fallbeispiel: Beschleunigte Reinheitsüberprüfung in der Prozesschromatographie Dr. D. Hansen 6 CHROMATOGRAPHIE Hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) Neue Silikagele auf Zuckerbasis Prof. A. Marra 8 UltraPerformance Supercritical Fluid Chromatography (UPSFC) Eine Einführung R. Chen, A. Aubin 10 Oftmals unbekannt: GPC-Kalibration mit breiten Proben Bedeutung für die Materialanalytik Dr. W. Radke et al. 12 Fluch des Pharaos? Analyse von Mykotoxinen 15 Exposition und Wirkung organischer Spurenstoffe in der aquatischen Umwelt HPTLC/AMD in Kombination mit Biolumineszenz-Detektion Dr. W. Seitz et al. 18 Simultane Bestimmung von Mineralsäuren, Fluorid und Silikat in Ätzbädern Ionenchromatographie mit Dualer Detektion für die Solarenergie P. Krebs et al. 22 EXTRAKTION Probenvorbereitung für die chemische Analytik Aufkonzentrierung und Trocknung von Extrakten mittels Vakuumzentrifugen Dipl.-Ing. U. Hager 25 Präparative Chromatographie Fallbeispiel: Abtrennung von Benzoin aus einem Reaktionsgemisch 28 M E C H A N I S C H E TRENNVERFAHREN Probenvorbereitung in der Chromatographie Die besten Praktiken für die Vorbereitung von Proben und mobilen Phasen V. Joshi 30 Kapillar-Ionenchromatographie Kapillar-Ionenchromatographie Eine neue Technik für die Ionenanalytik Dr. F. Höfler 32 KOPPLUNGSTECHNIK Mineralölkontaminationen Bestimmung in Lebensmitteln und Verpackungsmaterialien durch LC-GC-Kopplung Dr. R. Kohl 34 Methodentransfer Bestimmung von Verunreinigungen im Wirkstoff Clindamycinphosphat On-line Analytik in der pharmazeutischen Qualitätskontrolle und Bioprozesstechnik Dr. S. Marten 36 Bioseparation Autophosphorylierung von Proteinkinase A Neue Phosphorylierungsstellen und deren Phosphorylierungsgrad J. Seidler, W. Lehmann 41 KOPPLUNGSTECHNIK Neue Methoden für die Rückstandsanalytik mit GC-MS/MS Untersuchung von Hopfen F. GroSSmann et al. 44 Produkte 46 Index/Impressum 3. US 4 GIT Spezial Separation 1/2011

5 Events Chrom Forum Hamburg 2011 Mit einer attraktiven Mischung von Vorträgen aus Forschung und Praxis für AnwenderInnen und WissenschaftlerInnen aus Instituten, Behörden und der Industrie kann diese Veranstaltung auf eine lange Tradition in Hamburg zurückblicken. Der Hörsaal war sehr gut gefüllt. Die begehrten Workshops konnten nach einem Jahr Abstinenz wegen Umbau und Neuausstattung der Labore wieder stattfinden und waren schon wenige Tage nach Anmeldebeginn ausgebucht. Im Eröffnungsvortrag navigierte Petra Lewits, (Merck), das Publikum mittels Analyt und Matrix durch den Dschungel der Säulen, denn vor allem die Säulenchemie und -physik und weniger der Eluent werden durch die Probe beeinflusst. Die Welt der Chromatographie lässt sich danach für den Anwender vereinfacht in HILIC und RP einteilen, um eine gute, schnelle Problemlösung zu erzielen. Ergänzend greift Frau Lewits auch mal in die Trickkiste der mobilen Phase. Umfangreicher Input für den Alltag ergab sich aus dem Vortrag von Prof. Dr. Thomas Simat (Lebensmittelkunde und Bedarfsgegenstände an der TU Dresden) mit dem Thema: Lebensmittelkontaktmaterialien, eine unterschätzte Quelle für Kontaminationen? Im Zentrum seiner Untersuchungen stehen Silikonelastomere, die in unterschiedlichsten Produkten wie Backformen aber auch Saugern und Beißringen für Babys eingesetzt werden. Über Simulationen sollen die gesundheitlichen Gefahren eingeschätzt wie auch sensorische Veränderungen der Lebensmittel erfasst werden. Prof. Dr. Wolfgang Maison, Institut für Organische Chemie der Justus Liebig Universität Gießen, sieht sich selbst trotz seines Vortragstitels Enantioselektive Chromatographie in der medizinischen Chemie weniger als Analytiker. Im Mittelpunkt seiner Arbeit steht die organische Synthese von Krebsdiagnostika. Die Natur hat über Jahrmillionen ihre Interaktion (von kleinen Molekülen mit Membranproteinen) modelliert und optimiert wir fangen mit der Suche an, und so entwickelt die Arbeitsgruppe neue Synthesewege für erfolgversprechende spirocyclische Verbindungen. OpenLab CDS EZChrom Edition, die neue Softwareplattform für die Chromatographie, soll laut Dr. Wolfgang Günther (VWR International) helfen, die heutzutage sehr umfangreiche Ergebnis- und Datenverwaltung ebenso zu erleichtern wie ihre Bearbeitung durch komfortable Navigation auf einer gemeinsamen Plattform, die neue Dienste mit alter Software verknüpft. Der Nachmittag stand dann ganz im Zeichen der Kopplungsmöglichkeiten in der Chromatographie. Im Zeitalter der ultraschnellen Trennungen sollten wir die DC nicht aus den Augen verlieren, wie Dipl. Chem. Kathrin Tscherch vom Institut für Lebensmittelchemie der Universität Hamburg mit ihrem Vortrag unterstreicht. Sie beschreibt die Annäherung der Dünnschichtchromatographie an die hochauflösende Säulenchromatographie und ihre Kopplungsmöglichkeiten mit Bioassays, der Bioautographie sowie der Massenspektrometrie. Auch in der Forensik wird auf die Kopplung chromatographischer Methoden mit der Massenspektrometrie gesetzt, gerade bei den bestätigenden analytischen Verfahren GC und LC, u. a. für Nachweis und Bestimmung von Alkolholkonsummarkern. Heike Gnann vom Institut für Rechtsmedizin der Universität Freiburg konnte sehr anschaulich zeigen, dass ihr keine Partydroge verborgen bleibt. Anwendungsorientierte Forschung im Bereich der Umweltanalytik, wie sie auch an der Fakultät Life Sciences etabliert ist, stellte Prof. Dr. Günter Stein von der Hochschule RheinMain vor. In Zusammenarbeit mit dem Hessischen Landesamt für Umwelt und Geologie wurde in vielen kleinen Bausteinen aus Studienprojekten und Bachelorarbeiten eine Analysenmethode auf Basis der Pyrolyse GC/MS zur Bestimmung des Reifenabriebs in Feinstaub entwickelt und erprobt. Mit ca. 40 % ist Kautschuk die Hauptkomponente des Laufstreifens von Reifen. Für die Quantifizierung wurden Leitsubstanzen wie Limonen für Naturkautschuk bzw. spezifische Cyclohexene für Synthesekautschuke identifiziert. Ein ganz anderes Arbeitsfeld erschließt sich durch den Bericht aus der Praxis von Dr. Helga Neumann- Hensel (Eurofins). Eurofins bietet bioanalytische Dienstleistungen im Bereich Umwelt, Lebensmittel und Pharmazeutika an. Die analytischen Labore des Unternehmens unterliegen damit höchsten Qualitätsanforderungen. K ontakt Prof. Dr. Susanne Töfke Fakultät Life Sciences der HAW Hamburg susanne.toefke@haw-hamburg.de ICECUBE PTV/ICECUBE 30 C GC 30 C 0 T[ C] t[min] Multikühleinheit für GC-Module temperaturprogrammierbare GC-Injektoren wie Agilent PTV u. Multimode-Inlet (MMI) Agilent Headspace-Sampler u. Autosampler Tray PTV-Kühlung von 350 C auf 30 C in nur 6,5 min GC [ C] PTV/ICECUBE [ C] PTV [ C]

6 Titelstory Steigerung der Effizienz des Labors Fallbeispiel: Beschleunigte Reinheitsüberprüfung in der Prozesschromatographie Eine Lösung, die von Herstellern von Chromatographiesystemen schon seit einigen Jahren forciert wird, ist die Anschaffung neuer UHPLC Systeme. Der Vorteil dieser Systeme beruht auf der Optimierung der Systeme bezüglich des Totvolumens sowie der Empfindlichkeit und Geschwindigkeit der Detektoren. Zusätzlich erlauben diese Systeme die Verwendung von sub-2 µm Partikeln, da Sie deutlich höheren Drücken widerstehen als traditionelle HPLC Systeme. Core-Shell Technologie Konsequente Weiterentwicklung der Herstellungstechniken für Kieselgel basierte Partikel hat jetzt einen zusätzlichen Weg für Laboratorien aufgezeigt, ohne große Investitionen in Systeme die Effizienz signifikant zu steigern. Die innovativen Kinetex Core-Shell Materialien von Phenomenex greifen eines der etablierten Modelle für das Erzielen hoher chromatographischer Trennleistungen auf. Bei Core-Shell Materialien wird das Trägermaterial auf reduzierte Diffusionskoeffizienten hin optimiert. Dies führt dazu, dass sich diese Materialien von Ihren chromatographischen Eigenschaften her deutlich näher am theoretischen Ideal befinden als vollporöse sub-2 µm Kieselgel Materialien. Diese Tatsache führt dazu, dass Partikel mit einem Durchmesser von 2,6 µm vergleichbare Trennleistung wie vollporöse sub-2 µm Partikel liefern. Allerdings geschieht dies bei einem deutlich niedrigeren Rückdruck, da dieser umgekehrt proportional zur Partikelgröße des Packungsmaterials ist. Dies ermöglicht es, dass diese Säulen auch auf klassischen HPLC- Systemen mit einem maximal zulässigen Rückdruck von 400 bar eingesetzt werden können [1]. Um die Anwender von klassischen HPLC Systemen bei der Verwendung der Core-Shell Säulen zu unterstützen, hat Phenomenex Hilfsmittel entwickelt. Zu diesen Hilfsmitteln gehören unter anderem Applikationsmitteilungen aus spezifischen Anwendungsbereichen. Einfluss und Optimierung des HPLC-Systems Bevor nun an einem Beispiel die Möglichkeiten, die diese Säulen den Anwendern bieten, aufgezeigt werden, wird zuerst noch auf ein paar Dinge eingegangen, die einem erfolgreichen Einsatz im Labor im Wege stehen können. UHPLC Trennungen zeichnen sich dadurch aus, dass die Laufzeiten kurz und die erhaltenen Peaks schmal sind. Wenn man ein HPLC System In den letzten Jahren stehen immer mehr Laboratorien unter Druck mehr Proben mit weniger Personal durchzuführen. Grund für diese Entwicklung ist zum einen der Konkurrenzdruck in vielen Bereichen aufgrund der geringen Kosten in Ländern wie China und Indien. Gerade die pharmazeutische Industrie hat viele Standorte in Hochlohnländern zugunsten von Standorten in Indien und China geschlossen. Auch die Konkurrenzsituation im Bereich der unabhängigen Untersuchungslaboratorien sowie der Lohnhersteller von Wirkstoffen ist durch Fusionen verschärft worden. Unternehmen die zum einen Ihre Standorte in Ländern wie Deutschland, Österreich und der Schweiz sichern wollen, beziehungsweise gar nicht die Möglichkeit haben, neue Standorte in Indien und China aufzubauen, können dieser Situation nur durch Effizienzsteigerung begegnen. Abb. 1: Präparative Aufreinigung von Bivalirudin einsetzt, dass bisher nur mit Säulen, die mit 3 µm, 5 µm oder sogar 10 µm Materialien gepackt waren, betrieben wurde, sind die Systemeinstellungen in der Regel für diesen Einsatz optimiert. Den größten Einfluss auf das Ergebnis hat der Detektor. Zum einen kann ein großes Detektorzellvolumen dazu führen, dass die Peaks verbreitert werden. Für UHPLC Trennungen sind Detektorzellvolumina von 1,5 µl und kleiner von Vorteil. Die Standard Detektorzellen in vielen HPLC-Systemen haben häufig noch deutlich größere Volumina. Zum anderen kann der Detektor einfach zu langsam sein, um die schmalen Peaks zu erfassen. Ein Peak kann gut erfasst werden, wenn mindestens 20 Messpunkte zur Verfügung stehen. Die Detektoren erlauben es, über Einstellung der Scanrate oder Zeitkonstante (Time Constant) möglichst viele Messpunkte pro Zeiteinheit zu erhalten. Hat man zu wenige Messpunkte werden die Peaks breiter und flacher, außerdem lässt die Reproduzierbarkeit von Messung zu Messung nach. Da bei UHPLC Trennungen die Peakbreiten im niedrigen Sekundenbereich liegen, sind Scanraten von 10 Scans/s und besser nötig, um maximale Ergebnisse zu erzielen. Zusätzlich zur Detektorzelle tragen die Kapillaren und das Injektionssystem zum Totvolumen des Systems und somit breiteren Peaks bei. Standardmäßig sind in vielen HPLC-Systemen Kapillaren mit einem Innendurchmesser von 0,254 mm (0,010 Zoll) installiert. Diese haben ein internes Volumen von 0,51 µl je Zentimeter Länge. Bei der Verwendung von Kapillaren mit 0,127 mm (0,005 Zoll) Innendurchmesser reduziert sich dieses Volumen um ca. 75 % auf 0,13 µl je Zentimeter. Außerdem sollte auch das Injektionssystem auf möglichst geringes Totvolumen hin optimiert werden. Denn dieses Volumen führt dazu, dass die Aufgabezone auf der Säule breiter wird je größer das Volumen ist. Je breiter die Aufgabezone ist, umso breiter sind die erhaltenen Peaks. Fallbeispiel Im Folgenden wird aufgezeigt wie der Einsatz einer Kinetex Core-Shell Säule die Reinheitsüberprüfung in der Prozesschromatographie beschleunigt. Hierbei werden die Fraktionen, die bei der präparativen Umkehrphasen-Aufreinigung von rohem Bivalirudin, einem direkten Thrombin Inhibitor, auf einer Luna 10 µm PREP C8(2) angefallen sind, auf ihre Reinheit untersucht. Experimenteller Teil Alle chromtographischen Trennungen erfolgten auf einem Agilent HP 1100 System mit automatischem Probengeber und UV-Detektor. Die verwendeten Laufmittel waren 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (Laufmittel A) und 0,1 % 6 GIT Spezial Separation 1/2011

7 Titelstory Abb. 2: Gegenüberstellung der erhaltenen Chromatogramme für die Fraktionen (28,8 min, 32,2 min und 33,2 min). Die Chromatogramme A, C und E wurden mit der Kinetex Säule erhalten. Chromatogramme B, D und F zeigen die Chromatogramme, die mit der klassischen Säule erhalten wurden. TFA in Acetonitril (Laufmittel B). Die präparative Trennung wurde auf einer Luna 10 µm PREP C8(2) 250 x 4,6 mm durchgeführt. Hierbei wurden 5 ml einer Lösung von rohem Bivalirudin mit der Konzentration 7 mg/ml auf gegeben. Die Trennung erfolgte mittels eines 40-minütigen Gradienten von 15 % B auf 35 % B. Anschließend wurde die Säule mit 80 % B gespült und wieder auf die Ausgangsbedingungen äquilibriert was zu einer Zykluszeit von 55 Minuten führte. (Abb. 1) Die Elution der Analyten wurde mit einem UV Detektor bei 220 nm erfasst. Es wurden Fraktionen mit einer Dauer von 0,2 Minuten gesammelt. Die Reinheitsüberprüfung der Fraktionen erfolgte zum einen auf einer Säule in den Dimensionen 250 x 4,6 mm gepackt mit einem 5 µm vollporösen C8-Material. Zum anderen wurde eine Kinetex 2,6 µm C x 4,6 mm Säule verwendet. Für die C8 Säule wurde ein 30-minütiger Gradient von 20 % B auf 50 % B gefahren. Die Zykluszeit betrug 45 Minuten. Für die Kinetex Säule (C18) wurde ein 8-minütiger Gradient von 23 % B auf 31 % B gefahren. Hier betrug die Zykluszeit 11 Minuten. Ergebnisse und Diskussion Die Analysenergebnisse der Trennungen der C18 Säule und der C8 Säule, die mit einem klassischen vollporösen Material gepackt war, wurden verglichen. Dazu wurden die Ergebnisse unterschiedlicher Fraktionen aus dem gesamten Elutionsprofil der präparativen Trennung einander gegenübergestellt (Abb. 2). Die C18 Säule zeigte durch ihre hohe Trenneffizienz eine sehr gute Abtrennung der Verunreinigungen vom Wirkstoffmolekül sowie deutlich höhere und schärfere Peaks. Dies ermöglichte eine genauere und empfindlichere Bestimmung des Wirkstoffgehalts in den einzelnen Fraktionen. Im Endergebnis ergaben die Analysen für Tabelle 1: Vergleich der geschätzten Reinheit der Fraktion anhand von HPLC Messungen mit einer Core-Shell Säule (C18) und einer mit vollporösen 5 µm Partikeln gepackten Säule (C8). Fraktion Retentionszeit [min] Reinheit [%] Vollporöse 5 µm C8 28, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , Kinetex Core-Shell C18 alle Fraktionen eine exaktere Angabe des Reinheitsgrades und half dabei die Fraktionen mit ausreichender Reinheit besser einzugrenzen (Tabelle 1). Zusammenfassung Die Analyse der Fraktionen präparativer Trennungen ist Standard für die Bestimmung der Reinheit von Peptiden. Kinetex Säulen (C18) liefern wegen ihrer Trenneffizienz deutlich exaktere Ergebnisse und das auch in einer deutlich kürzeren Zeit. Die 27 Hauptfraktionen konnten innerhalb von 5 Stunden analysiert werden, während für die klassische Analytik 14,5 Stunden benötigt wurden. Zusätzlich waren die Ergebnisse genauer, was eine Entscheidung darüber erleichtert, welche Fraktionen zusammengefasst werden können um die gewünschte Reinheit zu erhalten. Bei Umstellung der Analytik können mit einem analytischen HPLC System dreimal so viele Fraktionen analysiert werden und somit der Ausstoß an Peptiden mit der gewünschten Reinheit deutlich erhöht werden. Literatur [1] Grittia F. et al.: G. Journal of Chromatography A, 1217(10), (2010) K ontakt Dr. rer. nat. Dirk Hansen Marketing Manager Europe Phenomenex, Aschaffenburg Tel.: 06021/ Fax: 06021/ GIT Spezial Separation 1/2011 7

8 Chromatographie Hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) Neue Silikagele auf Zuckerbasis Die hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) [1,2] ist eine alternative HPLC-Technik, die auf einer Kombination von polaren stationären Phasen und wässrigen/organischen mobilen Phasen basiert und hauptsächlich für die Trennung von stark polaren Verbindungen wie Aminosäuren, Glycopeptiden, Oligonucleotiden und hochgradig polaren Naturstoffen verwendet wird [3]. Von links nach rechts: Prof. A. Dondoni, I. D Acquarica, Prof. A. Marra, A. Ciogli, Prof. F. Gasparrini, L. Moni Kürzlich wurde die kovalente Immobilisierung von Kohlenhydraten auf Feststoffträgern mittels kupferkatalysierter Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) [4] entwickelt, was mit dem nachgewiesenen Potential dieser Reaktion bei Oberflächenmodifizierungen [5] im Einklang steht. Bei den Click-Sacchariden [6], die für HILIC-Anwendungen unter Verwendung des Click-Chemie-Ansatzes hergestellt wurden, wurden die in zwei Schritten azido-modifizierten Silikagele in Gegenwart eines Kupferkatalysators an Zuckeralkine gekoppelt, um die obigen Füllmaterialien zu erhalten, wobei die gebundenen Kohlenhydrate ihre natürliche Konfiguration und ihre Eigenschaften beibehalten. Synthese der stationären Phase auf Zuckerbasis Wir berichteten [7] kürzlich über die Herstellung eines neuen Silikagels auf Zuckerbasis unter Verwendung der CuAAC-Reaktionen von Propargyl- O-Lactosid, einem Zuckeralkin, mit einem neuen azido-aktivierten Silikagel unter Bildung einer vollständig charakterisierten stationären Phase (Schema 1), die für die Trennung von Monosacchariden mittels HILIC und dynamischer HILIC (DHILIC) geeignet ist. Eine entscheidende Besonderheit des Aktivierungsprozesses besteht in der Einführung von azido-terminierten Gruppen auf der Kieselsäureoberfläche in einem einzigen Schritt, durch eine Dipropylethergruppe auf Abstand gehalten, und der gleichzeitigen Bildung einer Hydroxygruppe. Die Reaktionen wurden mittels FT-IR-Spektroskopie, Elementaranalyse und Differential-Scan-Kalorimetrie (DSC) überwacht. Über den von uns entwickelten Syntheseweg (Azido-Aktivierung der Kieselsäure in einem statt in zwei Schritten) ist das Material auf Zuckerbasis schneller und leichter zugänglich und die erhaltene Matrix ist hydrophiler. Mit diesem Material wurde unter Verwendung des schon beschriebenen [8] Packverfahrens eine rostfreie Stahlsäule (150 mm 4,1 mm Innendurchmesser) gepackt. HILIC-Verhalten Um die Trennfähigkeit des Silikagels auf Zuckerbasis bei der HILIC-Methode zu untersuchen, wurden chromatographische Untersuchungen mit polaren Analyten als Messproben durchgeführt. Es wurde ein Vergleich zu einer aminopropyl-gebundenen Kieselsäure-Säule (APS) angestellt, welche als erste gebundene stationäre Phase für die routinemäßige Trennung von Kohlenhydraten mit der HILIC-Methode verwendet wurde. In die vergleichende Untersuchung wurde eine mit einem diol-modifizierten Silikagel gepackte Säule (DIOL) einbezogen. Dies ist aufgrund der hohen Polarität und der Wasserstoffbindungseigenschaften eine nahezu ideale Phase für HILIC-Anwendungen. Die Untersuchung der Retentionsdaten für polare Testverbindungen (Uracil, Adenosin, Cytosin) und Naphthalen unter Phasenumkehr- Bedingungen (RP) ergab dieselbe Elutionsreihenfolge bei dem hergestellten Zucker-Silikagel wie bei den typischen HILIC-Säulen: Naphthalen wurde mit der Front eluiert (k = 0) und immer vor dem Uracil, welches in der RP-HPLC ein gängiger Totzeitmarker ist. 8 GIT Spezial Separation 1/2011

9 Chromatographie Schema 1: Synthese des Silikagels auf Zuckerbasis. Abb. 1: DHILIC von d-fructose unter Verwendung von Zucker-Silikagel. Eluent: Acetonitril/Wasser 85/15 (v/v); Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min. Detektion: ELSD (T drift = 60 C; T neb = 46 C; P = 45 psi). Entnommen aus Abb. 5 von Ref. [7] mit Genehmigung des Wiley-VCH-Verlags. Copyright 2010 Abb. 2. Trennung von Aminosäuren unter Verwendung von Zucker-Silikagel. Eluenten: (A) Wasser/Acetonitril 95/5 (v/v) + 0,1% Essigsäure; (B) Acetonitril + 0,1 % Essigsäure. Elution bei 20 % A für 1 min (isokratisch), bis 40 % A in 10 min (linearer Gradient), bei 40 % A für 3 min (isokratisch). Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min. Detektion: ELSD. Entnommen aus Abb. 7 von Ref. [7] mit Genehmigung des Wiley-VCH-Verlags. Copyright HILIC-Anwendungen Wir begannen unsere Untersuchung mit der Analyse von zwei azyklischen Zucker-Polyolen, d-arabitol und d-mannitol, bei Raumtemperatur. Es ergaben sich aufgrund ihres nichtreduzierenden Verhaltens einzelne scharfe Peaks [mobile Phase: Acetonitril/Wasser (85:15 v/v); Verdampfungs-Lichtstreudetektion (ELSD)]. Als wir anschließend reduzierende Monosaccharide analysierten (drei Aldopentosen, fünf Aldohexosen, einschließlich zweier Deoxy-Zuckern und einer Ketohexose), beobachteten wir verschiedene, veränderte Peakformdeformen, ein Hinweis auf aktive Interkonversionsprozesse zwischen zwei anomeren Peaks während ihrer chromatographischen Trennung (Mutarotation). Da gezeigt worden ist, dass für eine vollständige HPLC-Trennung von Zuckeranomeren sehr geringe Säulentemperaturen notwendig sind [9], führten wir Cryo-HPLC-Trennungen der Modellkohlenhydrate durch (T = -5 C) und erhielten Grundlinienauflösungen für alle Pyranose-Isomere, obwohl die typischen Säulentemperaturen zwischen ~60 und ~25 C liegen sollten, um eine Grundlinienauflösung der Zuckeranomere zu erhalten [9]. Wir fanden heraus, dass die Aldohexosen die am längsten zurückgehaltenen Monosaccharide waren, wobei die Epimere einen erheblichen Unterschied aufwiesen (d.h. Galactose, Mannose und Glucose). Die Aldopentosen wurden viel weniger zurückgehalten, die drei Epimere zeigten leichte Unterschiede in der Retention (Ribose, Arabinose und Xylose). Fucose (6 Deoxygalactose) war der Zucker, der von der ganzen Serie am wenigsten zurückgehalten wurde und zeigte eine verkürzte Retentionszeit in Bezug auf den entsprechenden nativen Zucker (Galactose), in Übereinstimmung mit dem ermittelten HILIC-Retentionsverhalten von Cyclodextrinphasen, wo die Retention mit der Anzahl der verfügbaren Hydroxylgruppen im Saccharid zunimmt [10]. Außerdem wiesen Fucose, Fructose, Galactose und Arabinose sowohl Pyranose- als auch Franoseanomere auf, wie schon berichtet wurde [9]. Dies ist jedoch das erste Mal, dass alle ineinander umwandelbaren Anomere in einem einzigen Chromatographielauf aufgelöst wurden, wobei insgesamt vier Peaks erhalten wurden. Über die HILIC-Trennung von d- Fructose mit variabler Temperatur (Abb. 1) waren alle vier Anomere (zwei Pyranosen und zwei Furanosen) leicht zugänglich, wohingegen die beiden Furanose-Isomere dieses Zuckers früher nur als nicht-aufgelöstes Gemisch detektiert worden sind [9]. Mit dem Ziel, den Anwendungsbereich des Materials auf Zuckerbasis zu erweitern und die potentielle Anwendung bei der Trennung von sehr polaren Verbindungen aufzuzeigen, haben wir auch andere Verbindungsklassen [7], wie nicht derivatisierte Aminosäuren (Abb. 2), die typische HILIC-Anwendungen sind, und hochgradig polare Naturstoffe, z.b. Flavonoide der Passiflora incarnata L., untersucht. Schlussfolgerungen Wir haben ein neues Material auf Zuckerbasis für die stereoselektive HILIC-Trennung von sehr polaren Verbindungen, wie Kohlenhydrate, Aminosäuren und Flavonoide, entwickelt und angewendet. Dabei stand insbesondere das Auftreten von chromatographischen Peakformdeformationen im Fokus, welche auf die Interconversion der Zuckeranomere zurückzuführen sind. Literatur ist direkt bei den Autoren erhältlich Autoren Lisa Moni 1, Alessia Ciogli 2, Ilaria D Acquarica 2, Alessandro Dondoni 1, Francesco Gasparrini 2, Alberto Marra 1 1 dipartimento di Chimica, Università di Ferrara, Roma, Italy 2 dipartimento di Chimica e Tecnologie del Farmaco, Sapienza Università di Roma, Roma, Italy K ontakt Prof. A. Marra Dipartimento di Chimica Università di Ferrara Ferrara, Italy mra@unife.it BEWÄHRTES FILTERSYSTEM, HERVORRAGENDE LEISTUNG. Ihr Schweizer Hersteller von Chemap-Filteranlagen und Spezialist für FUNDA-Filter-Technologie! Filter Spares Service by INFOLABEL AG Grossrietstrasse 7, CH-8606 Nänikon T. +41 (0) , F. +41 (0) info@filterspares.ch, GIT Spezial Separation 1/2011 9

10 Chromatographie UltraPerformance Supercritical Fluid Chromatography (UPSFC) Eine Einführung Bei der Chromatographie mit überkritischen Fluiden (SFC, supercritical fluid chromatography) besteht die mobile Phase aus einem Stoff im überkritischen Zustand, meist CO 2, und zugesetzten organischen Lösungsmitteln (Modifier) wie Methanol oder Ethanol. Durch die niedrige Viskosität und den hohen Diffusionskoeffizienten der überkritischen Fluide werden schnelle Trennungen mit hoher chromatographischer Effizienz erreicht. Einleitung Da CO 2 im überkritischen Zustand ähnliche Eigenschaften wie die Alkane hat und die SFC oft mit polaren stationären Phasen durchgeführt wird, wird sie in der Regel als Normalphasenchromatographie angesehen [1], die, was Selektivität und anwendbare Substanzklassen angeht, komplementär zur Umkehrphasen-HPLC ist. Die steigende Wichtigkeit der Chiralität bei der Wirkstoffsuche und weltweite Initiativen für mehr Umweltfreundlichkeit in der pharmazeutischen Industrie haben dazu geführt, dass sowohl für chirale Trennungen als auch für die Trennung achiraler Verbindungen die Normalphasen-HPLC zunehmend von der analytischen SFC abgelöst wird [2]. Probleme der überkritischen Fluidchromatographie Hochdurchsatzanalysen nicht möglich sind. Ungleichmäßige Zuführung der Modifier bei niedrigen Konzentrationen, ungenaue Injektionen und begrenzte Probenformate und auch eine relativ niedrige Detektionsenpfindlichkeit. Die apparative Entwicklung In den letzten 20 Jahren ist die Entwicklung von SFC-Geräten nur wenig vorangekommen; die technologischen Fortschritte, die die HPLC im letzten Jahrzehnt revolutioniert haben, wurden kaum übernommen. Einer der wichtigsten Durchbrüche für die HPLC im vergangenen Jahrzehnt war der Einsatz von Säulen mit Sub-2-µm-Partikeln. Bei Systemen, in denen Sub-2-µm-Partikel eingesetzt werden können, bleiben Bedienung und Prinzipien der HPLC, bei gleichzeitig erhöhter Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und Auflösung erhalten [3]. Die van-deemter-gleichung beschreibt, dass bei steigender Flussrate die Effizienz umso größer ist, je kleiner die Partikel sind (Abb. 1). Dieser Effekt ist für die HPLC gut untersucht und sollte auch für die SFC genutzt werden können. Die Standardpartikelgröße in der analytischen SFC liegt aber weiterhin bei 5 µm, was die möglichen Effizienzgewinne, die heute im Chromatographielabor erwartet werden, begrenzt. Ziel der Entwicklung des Acquity UPSFC-Systems war es, ein System ohne die Nachteile der bislang existierenden Geräte zu schaffen, mit dem die Leistungsfähigkeit kleiner Partikel genutzt werden kann. Dieses neuartige, ganzheitlich konzipierte analytische SFC-System besteht aus folgenden Komponenten: binärer Lösungsmittelmanager, Probenmanager, Photodiodenarray-Detektor, Säulenmanager und UPSFC-Steuerungsmodul mit Rückdruckregler und Komponenten zur Systemsteuerung. Die Atmosphäre der Venus besteht zu 96,5 % aus CO 2 und zu 3,5 % aus Stickstoff. Die Oberflächentemperatur beträgt über 460 C. Der Druck auf der Oberfläche beträgt 93 bar. Unter diesen Bedingungen liegen die Bestandteile der Atmosphäre in überkritischem Zustand vor. Neue Wege In Abbildung 2 sind die SFC-Chromatogramme der chirale Trennungen von (A) trans-stilbenoxid und (B) Triadimefon mit 3-µm-Partikeln und einem Gradientenprogramm gezeigt. Die Verbindungen wurden in weniger als 1 Minute getrennt. Dies verdeutlicht die verbesserte Systemleistung durch das verkleinerte Systemvolumen und das Potenzial dieser Technik für chirale Trennungen im Hochdurchsatzbetrieb. Abbildung 3 zeigt die übereinandergelegten Chromatogramme von sechs Injektionen eines 18-Komponenten-Gemischs, das mit einem Gradientenprogramm auf einer Säule mit 1,7-µm- Partikeln aufgetrennt wurde, ein gutes Beispiel für die hohe Auflösung und erhöhte Peakkapazität durch den Einsatz von Sub-2-µm-Partikeln. Technische Details Der binäre Lösungsmittelmanager verwendet zwei separate Zweikolbenpumpen zur Mischung und Förderung von zwei Lösungsmitteln (CO 2 und Modifier) unter hohem Druck. Außerdem verfügt der UPSFC-BvSM über ein eingebautes Entgasungsmodul für den Modifier sowie Lösungsmittelauswahlventile für den Einsatz von bis zu vier Modifiern. Die Pumpe liefert einen Bis vor kurzem wurden analytische SFC-Geräte hauptsächlich in Vorversuchen zur Ermittlung der optimalen mobilen und stationären Phasen für spätere präparative Anwendungen eingesetzt. Diese analytischen SFC-Geräte basieren in der Mehrzahl auf älterer HPLC-Technologie und sind für solche Vorversuche geeignet, allerdings längst nicht so robust und verlässlich wie HPLC-Geräte. Historisch bedingte Schwächen der bisherigen analytischen SFC-Geräte sind beispielsweise [2] große Systemvolumina, durch die die Nutzung kleiner Säulenpartikel und die Durchführung von Abb. 1: Van-Deemter-Kurven für das UPSFC-System mit Säulen verschiedener Partikelgröße. Bei jeder getesteten Flussrate steigt die chromatographische Effizienz mit sinkender Partikelgröße. Abb. 2: Chromatogramme der schnellen UPSFC- Trennung von (A) trans-stilbenoxid und (B) Triadimefon. Säule Chiralpak IA (100 x 4,6 mm, 3 µm), Flussrate 4 ml/min, 5-45 % Methanol i n 2 min, 5 µl Injektionsvolumen, Rückdruck auf 150 bar, Temperatur auf 40 C. 10 GIT Spezial Separation 1/2011

11 Chromatographie gleichmäßigen und reproduzierbaren Lösungsmittelstrom mit Drücken von bis zu 6000 psi im isokratischen Modus sowie im Gradientenmodus und gleicht automatisch die Kompressibilität der Lösungsmittel aus. Die Werte für die Reproduzierbarkeit der Injektionen in Abbildung 3 liegen zwischen 0,055% und 0,38% RSD (relative Standardabweichung), was auf eine extrem präzise Lösungsmittelförderung bei niedrigen Modifier- Konzentrationen hinweist. Die Peakbreiten bleiben über den gesamten Gradienten konsistent was ein Hinweis für einen wirklich linearen Gradienten darstellt. Die Probenzuführung unter SFC-Bedingungen stellt besondere Anforderungen. Wenn die Probenschleife während der Injektionssequenz aus dem Hochdruckfluss herausbewegt wird, führt der Druckabfall des flüssigen CO 2 in der Probenschleife typischerweise zu einer geringen Präzision der Injektion. In der Vergangenheit wurde dieses Problem oft durch Vollschleifeninjektionen umgangen. Der Probenmanager des UPSFC-Systems (SM, Sample Manager) verfügt stattdessen über ein Entlüftungsventil, über das sich ausdehnendes Gas und überschüssiger Modifier abgeleitet wird. Nach der Entlüftung wird das Ventil abgetrennt und das Ansaugen der Probe erfolgt ohne Störung. Die Präzision des Injektors ist mindestens so gut wie die herkömmlicher HPLC-Systeme (RSD der Peakfläche typischerweise unter 0,5%). Es können verschiedene Miktrotiterplattenformate (Deep-Well, mittlere Höhe) und Vials in einer temperaturgeregelten Umgebung eingesetzt werden. Die historisch bedingten Unterschiede der Probenformate zwischen SFC und HPLC werden damit beseitigt, was für flüssigere Arbeitsabläufe sorgt. Das Injektionsvolumen des UPSFC-SM ist im Bereich zwischen 1 und 10 µl wählbar, wobei mit einer 10-µL-Schleife in der Regel lineare Kalibrierkurven mit r2 > 0,999 erhalten werden. Diese besonders gute SFC-Leistung bei Teilschleifeninjektionen sollte bei Laboren, die quantitative Routineanalysen durchführen, auf besonderes Interesse stoßen. Das UPSFC System arbeitet in erster Linie mit einem Photodiodenarray-Detektor (PDA-Detektor). Eine der Herausforderungen für Detektoren in der SFC ist die benötigte hohe Druckfestigkeit der Durchflusszelle. Anders als bei der HPLC, wo der Druck über die Säule abfällt, bleibt der Druck bei der SFC im gesamten System stabil, um das CO 2 in flüssigem Zustand zu halten. Aus diesem Grund enthält die Durchflusszelle hochfeste Quarzglaslinsen. Dies ist eine Verbesserung gegenüber bisherigen SFC-Detektoren, in denen üblicherweise Saphirlinsen verwendet wurden, die zwar ebenfalls stabil sind aber bei niedrigen Wellenlängen einen schlechteren Energiedurchsatz hatten. Die Durchflusszelle des UPSFC-PDA ist für 6000 psi ausgelegt, hat eine Weglänge von 10 mm und verfügt über einen hohen Energiedurchsatz bei allen Wellenlängen. Aufgrund einer integrierten Temperaturregelung und verbesserter Elektronik ist dieser Detektor weniger empfindlich gegenüber Umgebungsbedingungen wie Temperatur und Luftfeuchtigkeit und liefert eine stabilere Basislinie. Durch hohe Abtastfrequenzen und eine unabhängige Steuerung der Zeitkonstante können schmale Chromatographiepeaks (wie sie bei Einsatz von Sub-2-µm- Partikeln üblicherweise erhalten werden) exakt detektiert und integriert werden. Abbildung 4 zeigt ein UPSFC-Chromatogramm zur Beurteilung der Reinheit von Estradiol. Es werden Verunreinigungen detektiert, die nur zu einem Anteil von bis zu 0,01% der Fläche des Hauptpeaks vorhanden sind, bei ausgezeichnetem Signal- Rausch-Verhältnis (S/N). Die für die Analyse von Verunreinigungen erforderliche Empfindlichkeit des UPSFC-Systems ist also gegeben. Zusammenfassung Das UPSFC-System wurde speziell zur Lösung vieler Probleme konstruiert, die vorherige Generationen von analytischen SFC-Systemen mitbrachten. Es beinhaltet wichtige technologische Neuerungen in den Bereichen Pumpe, Probeninjektion und Detektion. Verglichen mit bisherigen analytischen SFC-Geräten verfügt das UPSFC-System über ein kleineres Systemvolumen, was die Chromatographie mit kleinen Partikeln und den Hochdurchsatzbetrieb ermöglicht. Der vom binären Lösungsmittelmanager des UPSFC-Systems gelieferte Fluss hat eine hohe Präzision, was zu einer hohen Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten führt, wie sie in der modernen Chromatographie, sowohl bei Gradienten- als auch bei isokratischen Trennungen verlangt wird. Der Probenmanager des UPSFC-Systems ermöglicht Injektionen mit variablem Volumen und großer Präzision und Linearität. Bei Verwendung eines UPSFC-PDA-Detektors ist die Empfindlichkeit für den Einsatz dieser Chromatographietechnologie kein begrenzender Faktor mehr. Als Gesamtsystem erfüllt das System die strengen analytischen Anforderungen jedes Labors, auch denen von QA/QC-Laboren in einer GMP-Umgebung. Die UPSFC ermöglicht für die SFC die erhöhter Auflösung, Geschwindigkeit und Empfindlichkeit, die die UPLC in die Flüssigkeitschromatographie ermöglicht hat. Literatur ist bei den Autoren erhältlich. K ontakt Rui Chen Waters Corporation, New Castle, DE, USA Andrew Aubin Waters Corporation, Milford, MA, USA Abb. 3. UPSFC-Chromatogramme (n = 6) eines Gemischs von 18 achiralen Komponenten. Säule Viridis Hybrid (150 x 2,1 mm, 1,7 µm), Flussrate 1,2 ml/min, 2-16 % Methanol in 7 min, dann 16-2 % in 1 min, 2 µl Injektionsvolumen, Rückdruck auf 130 bar, Temperatur auf 40 C. Abbildung 4. UPSFC-Chromatogramm von Estradiol und Verunreinigungen. Säule Viridis Hybrid (150 x 2,1 mm, 1,7 µm), Flussrate 1,2 ml/min, konkaver Gradient von 3-7 % Methanol/Isopropanol in 15 min, 2 µl Injektionsvolumen, Rückdruck auf 130 bar, Temperatur auf 45 C. GIT Spezial Separation 1/

12 Chromatographie Oftmals unbekannt: GPC-Kalibration mit breiten Proben Bedeutung für die Materialanalytik Zur Kalibration der Größenausschlusschromatographie (Gelpermeationschromatographie, SEC, GPC) werden i.a. Polymerstandards enger Molmassenverteilung verwendet. Für Analyten bei welchen engverteilte Standards nicht kommerziell verfügbar sind, werden dabei an Stelle der wahren Molmassen, nur solche relativ zum verwendeten Kalibranten erhalten, was oftmals die Vergleichbarkeit von Molmassen erschwert. Eine verlässliche und kostengünstige Bestimmung der wahren Molmassen kann jedoch auch durch die Kalibration mit breit verteilten Proben erfolgen. Peter Kilz, Geschäftsführer, PSS Dr. Wolfgang Radke, Leiter der Abteilung Analytik, Deutsches Kunststoff-Institut Sandra Strunz, wissenschaftliche Mitarbeiterin, Deutsches Kunststoff-Institut Die Größenausschlusschromatographie (GPC, SEC) stellt eine einfache und robuste chromatographische Methode zur Bestimmung von Molmassen und Molmassenverteilungen dar [1]. Die Trennung in der GPC basiert auf der Größe der gelösten Moleküle, wobei große Moleküle zuerst, kleine Moleküle später eluieren. Um einem Elutionsvolumen eine Molmasse zuzuordnen (Kalibration), werden i. A. engverteilte Polymerstandards bekannter Molmassen verwendet. Chemisch unterschiedliche Polymere weisen jedoch in Lösung bei gleicher Molmasse teilweise deutlich unterschiedliche Molekülgrößen auf. Daher sind die gegen eine Kalibrierung ermittelten Molmassen immer relativ zum verwendeten Standardpolymeren zu sehen. Die GPC stellt damit eine Relativmethode dar. Um absolute Molmassen zu bestimmen, müssen daher Kalibrant und Analyt identische chemische Strukturen aufweisen. Für viele Polymere wie beispielsweise Polyamide, Polyester und Polyolefine sind jedoch kommerziell keine engverteilten Standards erhältlich. Die Methode der breiten Kalibration bietet hier einen Ausweg. Beschreibung der Methode Benötigt werden eine Basiskalibration, die mit beliebigen GPC-Standards enger Molmassenverteilung erstellt wird, sowie mindestens zwei Proben der gleichen chemischen Struktur wie der des zu untersuchenden Analyten [2]. Von diesen Proben muss jeweils ein Molmassenmittelwert bekannt sein. Sie dürfen jedoch eine beliebige Molmassenverteilung besitzen. Von diesen Proben werden die GPC-Chromatogramme unter identischen Bedingungen, wie sie zur Erstellung der Basiskalibration verwendet wurden, aufgenommen. Aus diesen Informationen kann eine polymerspezifische Kalibration erstellt werden[3]. Dabei wird zwischen den Molmassen des Kalibranten (1) und des Analyten (2) bei einem gegebenen Elutionsvolumen (V) ein Zusammenhang der Form logm 2 (V) = B logm 1 (V)+logA (1) Abb. 1: Einfluss der Parameter A und B aus Gleichung 1 auf die Lage und Steilheit der erzeugten Kalibrierkurve. Rot: Basiskalibration; Schwarz: Veränderung des Parameters A; Blau: Veränderung des Parameters B. angenommen [4]. Dieser ist immer dann erfüllt, wenn unter den experimentellen Bedingungen eine Trennung rein nach der Molekülgröße erfolgt. Eine Veränderung des Parameters A führt zu einer Parallelverschiebung, während aus der Variation des Parameters B eine Änderung der Steigung der Kalibrationskurve relativ zur Basiskalibration resultiert (s. Abb. 1). Zur Ermittlung der unbekannten Parameter A und B werden diese systematisch so lange variiert bis die aus den Chromatogrammen der breiten Proben unter Verwendung der Kalibrierkurve nach Gleichung 1 berechneten Molmassenmittelwerte mit den Sollwerten übereinstimmen. Obwohl dieses Verfahren eine verlässliche Kalibration für Proben erlaubt, für welche keine engverteilten Polymerstandards zur Verfügung stehen, und zudem in kommerziellen Softwarepaketen enthalten ist, ist es dennoch 12 GIT Spezial Separation 1/2011

13 Chromatographie häufig unbekannt. Daher soll seine Anwendung nachfolgend am Beispiel von Polylactiden (Polymilchsäure, PLA) demonstriert werden. Engverteilte Polylactidstandards sind bislang nur in einem Molmassenbereich von 144 bis g / mol kommerziell erhältlich [5]. Dieser Molekulargewichtsbereich deckt jedoch oftmals nicht den Molekulargewichtsbereich ab, der von technischen PLAs für Verpackungsanwendungen überstrichen wird, womit alternative Kalibrationswege benötigt werden. Im vorliegenden Fall wurde zunächst eine PS-Basiskalibration erstellt und mit Hilfe der gewichtsmittleren Molekulargewichte und Elugramme zweier breitverteilter Proben eine PLA-Kalibrationskurve erstellt. Basierend auf dieser Kalibrationskurve wurden anschließend aus den Chromatgrammen die Molekulargewichte weiterer PLA-Proben ermittelt und diese mit den Ergebnissen unabhängiger Lichtstreumessungen verglichen, um die Verlässlichkeit der Methode zu belegen. Tab. 1: Vergleich der gewichtsmittleren Molekulargewichte M w aus Lichtstreuung sowie berechnet aus der PS-Kalibrationskurve unter Verwendung verschiedener Parameter A, B. PLA-Probe 1 M w [g/mol] PLA-Probe 2 M w [g/mol] Lichtstreuung Polystyrolkalibration (A = B = 1) manuelle Anpassung (A = 0.5, B = 1) manuelle Anpassung (A = 0.5; B = 8) automatische Optimierung (A = 0,717; B = 0,957) Experimentelles Die GPC-Messungen wurden in Chloroform (VWR) mit einem Micro-GPC-System EcoSEC von Tosoh Biosystems durchgeführt. Die Datenerfassung und -auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms PSS WinGPC Unity (PSS Polymer Standards Service). Die chromatographische Trennung wurde auf einem Säulensatz bestehend aus zwei 5µ SDV-Säulen (10 5 Å und 1000 Å, PSS) durchgeführt. Kalibriert wurde mit Polystyrolstandards (PSS). Die PLA-Proben wurden durch die Firma Boehringer Ingelheim zur Verfügung gestellt. Die Bestimmung der gewichtsmittleren Molekulargewichte der PLAs erfolgte durch GPC-Lichtstreumessungen in Hexafluoroisopropanol (HFiP) Ergebnisse Abbildung 2 zeigt die Basiskalibration, die mit Polystyrolstandards in Chloroform als Eluent erstellt wurde, sowie die Chromatogramme der beiden breitverteilten Polylactidproben, welche zur Erstellung der PLA-Kalibrationskurve herangezogen wurden. Die gewichts- DAS NEUE WATERS ACQUITY UPSFC SYSTEM Diese Systemlösung für die Normalphasen-Chromatographie verwendet CO 2 in der mobilen Phase. Es reduziert den Verbrauch von Lösungsmitteln und erhöht Ihre Erfolgsaussichten. Das erste holistisch entwickelte und auf der UPLC Plattform basierende SFC System ermöglicht Ihnen, Ihren Erfolg bei chiralen und achiralen Applikationen signifikant zu steigern. Wie? Die Antwort finden Sie auf waters.com/upsfc 2011 Waters Corporation. Waters und UPLC sind registrierte Warenzeichen der Waters Corporation. ACQUITY UPSFC und The Science of What s Possible siond Warenzeichen der Waters Corporation. GIT Spezial Separation 1/

14 Chromatographie Abb. 2: PS-Basiskalibration (schwarz) und angepasste PLA-Kalibration (blau), die zu den besten Molekulargewichtsmittelwerten für die beiden Chromatogramme korrespondiert. Tab. 2: Vergleich der unter Verwendung der PLA-Kalibration bestimmten gewichtsmittleren Molekulargewichte M w, mit denen aus Lichtstreuung Strunz Probe 3 M w [g/mol] mittleren Molmassen der PLAs wurden mittels GPC-Lichtstreuung zu M w = g / mol bzw. M w = g / mol bestimmt. Die Verwendung einer Polystyrolkalibrationskurve (A =1; B=1) resultiert in den Molekulargewichten, die in der 3. Zeile in Tab. 1 wiedergegeben sind. Man erkennt, dass diese Molmassen erheblich höher sind, als die wahren Werte. Wählt man einem Wert A = 0,5 (loga = -0,33) verschiebt sich die Kalibrationskurve gemäß Gleichung 1 nach unten. Man erhält nun aus den Chromatogrammen die Molmassen, die in der 4. Zeile von Tabelle 1 wiedergegeben sind. Da eine der beiden Molmassen zu niedrigeren, die andere nach zu hohen Werten abweicht, erscheint nun eine Anpassung der Steigung sinnvoll. Durch Wahl des Parametersatzes A = 0,5, B = 0,8 erhält man die in Zeile 5 stehenden Molekulargewichte. Durch weitere systematische Variation der beiden Parameter, die zweckmäßiger Weise mit nichtlinearen Fit-Algorithmen ausgeführt wird, wie sie in der verwendeten GPC-Software enthalten sind, erhält man in wenigen Sekunden Parametersätze, die ein bestmögliche Anpassung der berechneten mit den vorgegeben Molekulargewichten ergeben. Im vorliegenden Falle ist dies für A = 0,717 und B = 0,957 der Fall. Die so erhaltenen Parameter wurden nun verwendet, um eine PLA-Kalibrationskurve zu erstellen, und diese zur Bestimmung der Molmassen weiterer Proben zu nutzen. Wie in Tabelle 2 zu sehen, stimmen die Ergebnisse sehr gut mit den absoluten Molmassen aus den Lichtstreumessungen überein. Da die notwendige Absolutbestimmung der Molekulargewichte für die beiden Proben, welche als Referenzmaterialien verwendet werden, kostengünstig bei Instituten und Firmen durchgeführt werden kann, stellt die Kalibration mit breiten Proben somit ein einfaches und zuverlässiges Verfahren zur GPC-Kalibration dar. Danksagung Wir danken dem Bundesministerium für Wirtschaft und Arbeit (BMWA), aus dessen Haushaltsmitteln dieses Forschungsvorhaben über die Arbeitsgemeinschaft industrieller Forschungsvereinigungen Probe 4 M w [g/mol] Probe 5 M w [g/mol] Lichtstreuung Polystyrolkalibration PLA-Kalibration Otto von Guericke e.v. (AiF) unter der Nummer 8EN gefördert wurde. Ferner danken wir der Forschungsgesellschaft Kunststoffe e.v. für die zusätzliche Unterstützung dieser Arbeit. Literatur [1] Hofe T. und Reinhold G.: Grundlagen der GPC, Prinzipien und Möglichkeiten, Chemie in Labor und Biotechn. 50, 14 (1999) [2] Gilding D.K. et al.: Polymer 22, (1981). [3] Mahabadi H.K. und O`Driscoll K.F., J. Appl. Polym. Sci. 21, (1977) [4] Radke W.: Macromolecular Engineering, Wiley- VCH, 2007, 1889ff. [5] Verfügbarkeit von polymeren Referenzmaterialien und Standards, siehe: K ontakt Sandra Strunz Dr. Wolfgang Radke Deutsches Kunststoff-Institut Darmstadt Tel.: 06151/ Fax: 06151/ wradke@dki.tu-darmstadt.de Peter Kilz PSS Polymer Standards Service GmbH Mainz Tel.: 06131/ Fax: 06131/ GIT Spezial Separation 1/2011

15 Chromatographie Fluch des Pharaos? Analyse von Mykotoxinen Abb. 1: Strukturformeln für Aflatoxin B1 und Orchratoxin A. Waren Mykotoxine schuld an einer rätselhaften Todesserie nach der Öffnung des Grabs des ägyptischen Pharaos Tutanchamun? Über die Ursache kursieren viele Bücher und Theorien, und die Wissenschaft ist sich letztendlich noch uneins. Sicher ist: Schimmelpilzgifte (Mykotoxine) sind überall: in der Luft, in Lebensmitteln und zwar in geringsten Konzentrationen. Ihre Gefährlichkeit wird zumeist unterschätzt; auch in vermeintlich kleineren Konzentrationen sind Allergien und Atembeschwerden nur einige der beschriebenen Reaktionen. Über die Tatsache besteht Einigkeit, dass bei hinreichend hoher Konzentration von Mykotoxinen in der Luft und entsprechend schneller Aufnahme (etwa durch Einatmen der stehenden Luft wie zum Beispiel In den Pharaonengräbern) lebensbedrohliche und gar tödliche Konzentrationen erreicht werden können. Auch in täglichen Nahrungsmitteln sind Mykotoxine anzutreffen, zum Beispiel Getreide, Nüsse, Kaffee oder Weintrauben. Für die Überwachung der Qualität von Lebensmittel wurden Grenzwerte für die verschiedensten Mykotoxine erlassen, die entweder als Einzel- oder als Summenparameter nicht überschritten werden dürfen. Im Falle von Baby- oder Kindernahrung sind sie noch schärfer gefasst, um mögliche Langzeitschäden weitestgehend auszuschließen. Unglücklicherweise sind belastete Nahrungsmittel nicht ohne weiteres als solche zu erkennen, und die unbeabsichtigte Aufnahme kann nicht ausgeschlossen werden. Umso wichtiger ist es, einfache und schnelle Methoden für den Nachweis von Mykotoxinen zu etablieren. Vom analytischen Standpunkt aus gesehen, ist der Nachweis von Mykotoxinen eine komplexe Aufgabenstellung, da die chemische Struktur und die Konzentrationen der einzelnen Toxine sehr stark variieren. Das Auge isst mit Der äußere Eindruck ist bei Lebensmitteln essentiell; selbst geschmacklich herausragende Qualität vermag ein schlechtes oder zweifelhaftes Aussehen nicht wettzumachen. Schimmel ist, mit Ausnahme von bestimmten Käsesorten, zumeist als kritisch oder qualitätsmindernd angesehen, auch wenn im Einzelfall gerade das die Ursache für den exzellenten Geschmack ist GIT Spezial Separation 1/

16 Chromatographie etwa bei den berühmten Steaks von Wolfgang s in New York, wo allerdings die bei der mehrwöchigen Reifung des Fleischs (Dry Ageing) entstandene Edelschimmelschicht vor der Zubereitung des Steaks abgeschnitten wird. Doch neben solchen Fällen, die einer akribische Kontrolle bedürfen, um Qualität sicherzustellen und Risiken auszuschließen, ist schon Vorsicht angebracht, wenn von Schimmelpilzen die Rede ist. Neben dem äußerlich sichtbaren Schimmel, produzieren Schimmelpilze Mykotoxine, die bereits in kleinen Mengen gefährliche Wirkungen haben können. Umgekehrt werden die Stoffwechselprodukte der Schimmelpilze Penicillin und Cephalosporin wegen ihrer antibiotischen Wirkung breit genutzt. Problematisch ist bei der Betrachtung außerdem, dass keine einfache Zuordnung nach Pilzarten möglich ist, da zum Beispiel Penicillium-Arten sowohl Penicillin als auch Ochratoxin A produzieren können und somit nicht von vornherein als gut gelten können. Gemeinsam ist den unterschiedlichen Mykotoxinen ein vergleichsweise hohes Molekulargewicht und ein oder mehrere oxigenierte alicyclische Ringe (Abb. 1). Zwei wichtige Gruppen von Mykotoxinen Wie bereits angemerkt: Schimmelpilze kommen nahezu überall vor, ihre Ausbreitung hängt jedoch stark davon ab, ob sie Wachstum fördernde Bedingungen vorfinden zum Beispiel hohe Temperaturen und Feuchtigkeit. Aflatoxine werden von Pilzen der Arten Aspergillus flavus und Aspergillus parasiticus gebildet, in Nahrungsmitteln werden Aflatoxin B1, B2, G1, G2 und M1 nachgewiesen. Sie haben bereits bei geringen Konzentrationen eine toxische Wirkung und wirken vor allem bei wiederholter Aufnahme karzinogen. Aflatoxin B1 gilt als der am stärksten Krebs erzeugende Pflanzenstoff. Für Aflatoxine gibt es keine Konzentration unterhalb derer es keine schädlichen Wirkungen gibt. Daraus folgt, dass keine tägliche Minimaldosis festgesetzt werden kann. Aflatoxin M1 ist ein Abbauprodukt von Aflatoxin B1 und kommt in Milch oder Milcherzeugnissen von Tieren vor, die kontaminiertes Futter zu sich genommen haben. Aflatoxine finden in Lebensmitteln, Getreide, Nüssen und in Milchprodukten. Ochratoxin A ist ein Mykotoxin verschiedener Penicillium- und Aspergillus-Arten, etwa Aspergiluus ochraceus oder Penicillium verrucosum. Es weist u.a. karzinogene, nephrotoxische und immuntoxische Eigenschaften auf und verfügt über eine lange Halbwertszeit beim Menschen. Im Unterschied zu Aflatoxinen wird Ochratoxin A meist schon während des Pflanzenwachstums gebildet, spätestens jedoch bei der Lagerung. Die Häufigkeit des Nachweises im menschlichen Blut lässt darauf schließen, dass viele Lebensmittel kontaminiert sind. Ochratoxin A kommt u.a. in Getreide, Kaffeebohnen, Kakao, Nüssen und getrockneten Früchten vor, aber auch in fertigen Produkten wie Getreideerzeugnissen, Gewürzen, Kaffee, Wein, Bier oder Traubensaft. Die Untersuchung dieser Toxine ist bedeutend, weil viele von ihnen Lebensmittel verunreinigen und in einigen Ländern die Gesundheit von Menschen und Tieren gefährden. Das wachsende Gefahrenbewusstsein hat dazu geführt, dass zahlreiche Verfahren für ihre Aufreinigung und Analyse entwickelt wurden. Menschen und Tiere gefährdet Die Ernährungs-und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO) schätzt, dass etwa 25 % der Weltnahrungsproduktion Mykotoxine enthalten. Auch können sie von Nutztieren aufgenommen werden und über deren Produkte (Milch, Eier) in die Nahrungskette gelangen. Der Schein vermeintlich einwandfreier Lebensmittel kann also trügen. In der Europäischen Union gilt ein Grenzwert von 2 µg / kg für Aflatoxine in diversen Lebensmitteln, für diätische Lebensmittel von 0.5 µg / kg. Für Ochratoxin A ist für diätische Lebensmittel ein Grenzwert von 0.1 µg / kg für Lebensmittel festgelegt. Allerdings können je nach Land diese Grenzwerte auch stark variieren. HPLC schnell und empfindlich Die HPLC hat sich als schnelle und empfindliche Methode etabliert. Bereits ein isokratisches System mit einer Standard-Reversed-Phase-Säule (C18) kann hierfür eingesetzt werden. Als Detektion kann zum Beispiel ein Fluoreszenz-Detektor mit entsprechender Nachsäulenderivatisierung Abb. 2: Chromatogramm von Aflatoxinen (wie Abb. 1) Abb. 3: Chromatogramm von Ochratoxin A 16 GIT Spezial Separation 1/2011

17 Abb. 4: LCMS SIM- Chromatogramme eines Aflatoxine Standards mit 2,5 bzw. 0,5 ppb (unteres Bild). Zur Illustration ist für jeden Peak das Signal/Rausch Verhältnis angegeben. GPC/SEC Wir bringen s voran! PSS Lösungen für Polymer- Charakterisierung verwendet werden. In jüngster Zeit hat sich alternativ der Einsatz eines MS- oder MS/MS- Detektors bewährt; letzterer bietet den Vorteil, keine Derivatisierung vornehmen zu müssen, da die Nachweisgrenzen im SIM-Mode ausreichen, um auch Spuren von Aflatoxinen oder Ochratoxin A sicher zu detektieren. Bezüglich der Probenvorbereitung wird vielfach eine Immunaffinitäts-Chromatographie eingesetzt. Die typische Probenaufbereitung bestand aus einigen einfachen Schritten: Toxine in einer Probe werden extrahiert, gefiltert, verdünnt und langsam über eine Immunaffinitätssäule gelenkt, wobei sich Antikörper und Toxine binden. Anschließend wird die Immunaffinitätssäule gespült, um jegliches ungebundenes Material zu entfernen. Dann werden die Toxine mittels Methanol von der Säule abgelöst. Danach ist die Injektion in eine HPLC möglich. Im Folgenden sei exemplarisch der Nachweis von Aflatoxin B1,B2, G1 und G2 sowie Ochratoxin in einer Probe von Weizengraupen dargestellt. Für die Bestimmung der Aflatoxine wurde das Säuleneluat in einer Kobra-Zelle (Coring Systems) bromiert und anschließend mit einem Fluoreszenz- Detektor EX= 365 nm / EM = 440 nm detektiert. Für den Nachweis von Ochratoxin A wurde ebenfalls ein Fluoreszenz-Detektor, allerdings ohne zusätzliche Derivatisierung genutzt EX = 333 nm / EM = 460 nm. Die Chromatogramme zeigen, dass beide Mykotoxine mit hinreichender Empfindlichkeit nachgewiesen werden können (Abb. 2 und 3). Bei Einsatz eines Massendetektors können die jeweiligen Aflatoxine im SIM-Mode detektiert werden, was matrixbedingte Störungen nahezu ausschließt. Auch in einem 0,5 ppb Standard sind so relativ große Signale festzustellen, die die Grenzwerte für die Detektion problemlos erreichen lassen (Abb. 4). Zusammenfassung Um den in den Europäischen Richtlinien geforderten Nachweisgrenzen für Aflatoxine und Ochratoxin A Rechnung zu tragen, ist die HPLC eine geeignete, einfache und vergleichsweise schnelle und sichere Methode. Neben der komfortableren MS-Methode ist die klassische HPLC mit Floureszenz-Detektor keinesfalls eine low cost = low performance Alternative, da sich durch die spezifische Nachweismethode die geforderten Grenzwerte problemlos erreichen lassen. Das von Mykotoxinen ausgehende Gefährdungspotenzial ist durch Grenzwerte und Richtlinien beschrieben worden, selbst wenn der Verbraucher nur bedingt über die Risiken informiert ist. Gerade im Hinblick auf mögliche Langzeitschäden durch Aflatoxine und Ochratoxin A wird es notwendig, spezielle analytische Methoden zu vereinfachen und deren Nachweisempfindlichkeit zu steigern. Gleichsam gilt es allerdings, Kontrollen für Lebensmittel zu verschärfen, und den Produktionsprozess zu optimieren, um die Ausbildung von Mykotoxinen zu stoppen. K ontakt Shimadzu Europa GmbH info@shimadzu.de Maßgeschneiderte Anlagen & Detektoren Hochauflösende Säulen Standards & Referenzmaterialien Software-Lösungen bis zu Client/Server Analytische Dienstleistungen Kurse und Consulting info@polymer.de

18 Chromatographie Exposition und Wirkung organischer Spurenstoffe in der aquatischen Umwelt HPTLC/AMD in Kombination mit Biolumineszenz-Detektion Der Eintrag von anthropogenen organischen Stoffen in die Umwelt stellt eine potenzielle Gefährdung der Rohwasserressourcen und somit auch des Trinkwassers dar. Ihr Vorkommen hängt u. a. von der Produktionsmenge, vom Anwendungsspektrum und dem Verhalten in der Umwelt ab. Industrie- und Haushaltschemikalien, Arzneimittel, Pflanzenschutzmittel (PSM) und deren Metabolite gehören zu den am häufigsten vorkommenden anthropogenen Stoffen in der aquatischen Umwelt [1-3]. Ihr Haupteintrag erfolgt je nach Anwendung direkt, wie beispielsweise durch Ausbringung von PSM, oder indirekt über die Kläranlagen, wie im Fall von Arzneimitteln und Haushaltschemikalien. Außerdem können organische Verunreinigungen über Altlasten oder Deponiesickerwasser sowie durch Unfälle in die Umwelt gelangen. Aus diesen Gründen ist es für einen Wasserversorger notwendig, die zur Trinkwassergewinnung genutzten Wasserressourcen regelmäßig und umfassend zu überwachen. Mittels moderner physikalisch-chemischer Analysentechniken, wie der Gaschromatographie (GC) oder der Flüssigkeitschromatographie (LC) gekoppelt mit der Massenspektrometrie (MS), ist es heute möglich, Proben auf einige hundert Verbindungen simultan zu untersuchen. Diese klassischen Screening-Verfahren können nur Substanzen detektieren, die gezielt gesucht werden. Hierbei nicht berücksichtigte oder bisher noch unbekannte Substanzen bzw. Abbauprodukte werden mit diesen Methoden nicht erfasst. Eine Alternative stellt die Hochleistungs- Dünnschichtchromatographie mit automatisierter Mehrfachentwicklung (HPTLC/AMD) und ihren unterschiedlichen Detektionsmöglichkeiten dar [4, 5]. Die Messung der Lichtabsorption bei unterschiedlichen Wellenlängen (Mehrwellenlängenscan, MWL) ist eine effektive Möglichkeit des Screenings auf unbekannte Substanzen. Doch liefert die Detektion mittels physikalischchemischer Verfahren keine Aussage über die Wirkungen der Substanzen. Diese können nur Abb. 1: Schematischer Ablauf des Biolumineszenz-Tests auf der TLC-Platte durch biologische Testverfahren ermittelt werden, wobei hier unter Anwendung der klassischen Methoden lediglich der Summeneffekt mehrerer Substanzen festgestellt werden kann. Deshalb nutzt die Landeswasserversorgung (LW) neben der herkömmlichen Target-Analytik mittels physikalisch-chemischer Detektion die wirkungsbezogene Analytik (WBA) nach Trennung der Substanzen auf der HPTLC-Platte als Teil eines multidimensionalen Screenings zur Überwachung ihrer Rohwässer, um auf diese Weise auch die biologische Wirkung einzelner Substanzen oder Substanzgruppen bestimmen zu können. 18 GIT Spezial Separation 1/2011

19 Chromatographie Die WBA koppelt physikalisch-chemische Trennverfahren mit biologischen Testsystemen. Durch diese Kombination ist es möglich, Aussagen über die Probenzusammensetzung und die biologische Wirkung der Inhaltsstoffe zu erhalten. Als besonders erfolgreich hat sich bisher die HPTLC/AMD in Kombination mit der Biolumineszenz-Detektion unter Verwendung des Leuchtbakteriums Vibrio fischeri erwiesen [6-10]. Methodik Allgemeines Bei der HPTLC/AMD-Trennung erfolgt die Entwicklung der Platte grundsätzlich mehrfach. Dabei wird jeweils die Höhe der Laufstrecke vorher definiert. Nach Erreichen der jeweiligen Stufenhöhe wird das Fließmittel aus der Entwicklungskammer entfernt und die HPTLC-Platte unter Vakuum getrocknet. Anschließend wird die Platte mit einer neuen Fließmittelzusammensetzung auf die nächst höhere Stufe entwickelt. Die Mehrfachentwicklung in Kombination mit einer Gradientenelution führt zu einer Fokussierung der Banden und steigert damit die Trennleistung [4, 5]. Da es sich bei der HPTLC/AMD um ein offenes Trennsystem handelt, lassen sich verschiedenste Detektionsarten anwenden: Alle UV/VIS-aktiven Substanzen können durch das Messen der Remission über die Laufstrecken der Proben mittels eines Mehrwellenlängenscans ortsabhängig erfasst werden. Auch ist die Aufnahme eines UV/VIS-Remissions- und Fluoreszenzspektrums der einzelnen Substanzen möglich (TLC-Scanner, Camag). Durch Tauchen der entwickelten Platte in eine Leuchtbakterien-Suspension (Vibrio fischeri) können bioaktive Substanzen erkannt werden. Hierbei wird das von den Bakterien emittierte Licht in Abb. 2: Vergleich der Sensitivität des Leuchtbakterien-Tests am Beispiel von Bromoxynil a) auf der TLC-Platte (links) und b) im Küvettentest (rechts) einer Dunkelkammer (Bioluminizer, Camag) detektiert. Die Substanzen, die eine toxische Wirkung auf den Stoffwechsel von Vibrio fischeri besitzen und dadurch die Biolumineszenz hemmen, erscheinen als dunkle Banden im digitalen Bild. Aus den Graustufen der Pixel des digitalen Bildes erfolgt eine Berechnung der Hemmwerte, die sich ortsaufgelöst als Hemmwert-Chromatogramm oder als Gamma-Wert-Chromatogramm ( Γ-Wert = Hemmung [%] / (100 - Hemmung [%] ) darstellen lassen [9]. Verschiedentlich werden auch Biolumineszenz-Intensivierungen beobachtet. Substanzen aus einzelnen Banden können durch Extraktion von der Platte (TLC-MS Interface, Camag) der Massenspektrometrie zugänglich gemacht werden. Eine Identifikation der extrahierten unbekannten Verbindungen ist z.b. durch die Verwendung eines Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometers (QTOF-MS, Agilent, oder AB Sciex) grundsätzlich möglich und auch bereits mehrfach gelungen [10-12]. Vergleich der Leuchtbakterientests in der Küvette und auf der TLC-Platte Der nach DIN EN ISO (2009) [13] standardisierte Biotest mit Leuchtbakterien (Küvettentest) findet routinemäßig Anwendung in der Abwasserüberwachung. In Kläranlagen dient er Prof. Dr. Torsten C. Schmidt, Uni Duisburg-Essen 2 92 % Lösungsmittel eingespart Wir nutzen das PLATINblue UHPLC-System von KNAUER, um Aldehyd-Derivate (DNPH) zu trennen. Diese Applikation haben wir vorher an einer herkömmlichen HPLC durchgeführt. Die UHPLC bringt uns zwei entscheidende Vorteile: Zeitersparnis und geringeren Lösemittelverbrauch. Wir konnten auf einer 5 cm langen BlueOrchid C18-Säule die Laufzeit je Probe von 31 auf 5 Minuten verkürzen und benötigen 92 % weniger Lösemittel. Wir werden weitere Trennungen auf das PLATINblue System übertragen, da es sich für unsere Forschungs- und Routineanalytik sehr gut bewährt hat. 2

20 Chromatographie Abb. 3: Vergleich der Untersuchungsergebnisse einer Deponiesickerwasserprobe hinsichtlich der Exposition (links) und der Wirkung auf Vibrio fischeri (rechts) sowie der AChE-Hemmung (Mitte) Abb. 4: Detektion der Biolumineszenz-Hemmung nach HPTLC/AMD-Entwicklung (Auftragevolumen: 60 μl des TBME-Extraktes des Eluats der Elastikschicht): A: Aufnahme der Biolumineszenz; B: Gamma-Wert-Chromatogramm unter anderem dazu, den Zulauf zu überwachen und die biologischen Reinigungsstufen vor toxischen Einleitungen zu schützen. Außerdem wird der Leuchtbakterien-Test schon seit längerer Zeit nach der Chromatographie und Trennung der Substanzen direkt auf der TLC-Platte angewandt (Abb. 1) [6-9]. Durch das im Betriebs- und Forschungslaboratorium der LW entwickelte Auswerteverfahren ist es möglich, die Stärke der Hemmung von Vibrio fischeri durch die auf der Platte getrennten Substanzen selektiv zu bestimmen. Um die beiden Testverfahren in Bezug auf ihre Sensitivität miteinander zu vergleichen, wurden mittels Konzentrationsreihen die Dosis-Wirkungsbeziehungen von Bromoxynil mit dem Küvettentest] und dem TLC- Test bestimmt (Abb. 2). Hierfür waren im TLC-Test unterschiedliche Volumina einer methanolischen Bromoxynil-Lösung auf quadratische Flächen aufzusprühen, dabei verdampfte das Lösemittel und hatte keinen Einfluss mehr auf die Biolumineszenz von Vibrio fischeri. Aufgrund der Flächenauftragung wird die Konzentration als Flächenmasse in ng / cm² angegeben. Für den Vergleich der Sensitivität wurde die Konzentration, die im Küvettentest notwendig ist, um die gleiche Hemmung wie im TLC-Test zu erreichen, gegen die Flächenmasse auf der TLC-Platte in einem Iso-Hemmdiagramm aufgetragen. Dabei konnte festgestellt werden, dass der Leuchtbakterientest auf der TLC- Platte für Bromoxynil um einen Faktor von ca empfindlicher als der klassische Test in der Küvette ist. Anwendungen Überwachung von Deponiesickerwässern Einen potenziellen Eintragspfad von anthropogenen Stoffen in das Grund- und Oberflächenwasser stellen Sickerwässer von Deponien dar. Dadurch können auch Trinkwasserressourcen beeinflusst werden. Je nach Art der Deponie kann die Substanzpalette aus einer Vielzahl unterschiedlichster Verbindungen und Umwandlungsprodukten bestehen. Im vorliegenden Fall wurden in einer Deponiesickerprobe alle extrahierten UV/VIS-aktiven Substanzen mittels eines Mehrwellenlängenscans nach der HPTLC/AMD-Entwicklung erfasst Abb. 5: UV-Spektrum (A), HPLC-MS-Chromatogramm der extrahierten Bande (B) und das Isotopenmuster (C) der identifizierten Verbindung 2-Hydroxy-benzothiazol (Abb. 3). Durch eine Aufnahme der Biolumineszenz auf der mit einer Vibrio fischeri-suspension benetzten HPTLC-Platte mit Hilfe einer CCD-Kamera konnten zudem noch bioaktive Substanzen aus den Proben detektiert werden. Aus den Daten der digitalen Aufnahme ließen sich die Hemmwerte ortsaufgelöst als Γ-Wert- Chromatogramm berechnen und darstellen. Je größer der Gamma-Wert ist, desto stärker ist die Hemmung der Biolumineszenz der Leuchtbakterien einzustufen. Diese Methodenkombination zur Erfassung von Expositon und Wirkung ist exemplarisch in Abbildung 3 dargestellt. Hier zeigt sich, dass die UV-Absorption erwartungsgemäß nicht immer mit der Leuchtbakterien-Hemmung korreliert. Zusätzlich zum Leuchtbakterientest wurde auf einer parallel entwickelten HPTLC- Platte der Acetylcholinesterase-Hemmtest (AChE-Hemmtest) durchgeführt [7]. Dabei erscheinen potenziell neurotoxische Substanzen als helle Banden auf einem rötlichen Untergrund. Die Stärke dieser Hemmung korrelierte in dem dargestellten Beispiel wiederum nicht mit der Biolumineszenz-Hemmung von Vibrio fischeri. Auch zeigten die die AChE-Hemmung bewirkenden Substanzen keine starke UV-Absorption. Untersuchung von Kunstrasen-Eluaten Die Qualität des Grundwassers kann auf unterschiedlichste Weise beeinflusst werden. So können selbst aus Kunstrasen-Sportplatzbelägen umweltrelevante Substanzen durch den Regen ausgewaschen werden und bei einer fehlenden Drainage in das Grundwasser gelangen. Kunstrasenflächen finden zunehmend für Fußball und andere Sportarten Verwendung. Die Elastikschicht des Kunstrasens besteht meist aus polyurethan-gebundenen Gummigranulaten. Für diese Schicht werden außer neuen synthetischen Gummigranulaten (Ethylen-Propylen-Dien-Kautschuk, EPDM) auch Gummirecyclate, die beispielsweise von Altreifen stammen, eingesetzt. Neben der Erfüllung der Sportfunktion für die einzelnen Sportarten und der Schutzfunktion des Sportlers muss der Belag bestimmte Umweltanforderungen erfüllen [14]. Zur Simulation der Auswaschung durch Regen wurde eine Probe der Elastikschicht des frisch verlegten Kunstrasens 24 h mit Laborreinstwasser eluiert. Anschließend erfolgte eine Extraktion des wässrigen Eluates mit tertiär-butyl-methylether (TBME) und die Auftragung eines aliquoten Extraktanteils auf eine HPTLC-Platte. Nach der HPTLC/AMD-Entwicklung und Tauchung der Platte in eine Leuchtbakterien-Suspension erfolgte die Aufnahme der Leuchtaktivität der Bakterien mittels einer CCD-Kamera, wobei sich eine Vielzahl von Hemmbanden zeigte (Abb. 4 A) Um auch massenspektrometrische Informationen zur Identifizierung der einzelnen Hemmsubstanzen zu erhalten, erfolgte eine Entwicklung auf einer zweiten Platte unter den gleichen Trennbedingungen. Von dieser wurden die einzelnen Substanzbanden mittels eines TLC-MS-Interface zu- 20 GIT Spezial Separation 1/2011

21 Chromatographie Abb. 6: Untersuchung der Wirkung auf Vibrio fischeri von mit Röntgenkontrastmitteln belastetem Prozessabwasser bei der Behandlung mit UV-Licht nächst in ein Vial extrahiert und anschließend mit einem HPLC-QTOF- System weiter untersucht. Nach der Aufnahme der UV/VIS-Remissionsspektren direkt auf der Platte wurde eine UV/VIS-Spektrenbibliotheksabfrage (ca. 300 Substanzen) durchgeführt. Weiterhin konnten mit Hilfe der HPLC-QTOF-Analyse aus den exakten Massen und den Isotopenmustern Summenformeln generiert werden. Durch die Kombination der Ergebnisse, die mit diesen beiden Methoden erhalten werden können, ist es möglich, neue Umweltkontaminanten nachzuweisen. So wurde beispielsweise im beschriebenen Fall die Substanz 2-Hydroxybenzothiazol identifiziert (Bande 9, markiert in Abb. 4; siehe auch Abb. 5) Kontrolle der Abwasserreinigung Iodierte Röntgenkontrastmittel (RKM) werden in der medizinischen Diagnostik zur Darstellung von Blutgefäßen oder Hohlräumen eingesetzt. Nach der Anwendung und Ausscheidung gelangen sie weitgehend unverändert über das Abwasser und die Kläranlagen in die als Vorfluter genutzten Oberflächengewässer. Aufgrund ihrer großen Einsatzmenge und ihrer Persistenz sind RKM verhältnismäßig häufig in der aquatischen Umwelt zu finden. Es gibt verschiedenste Strategien zur Verminderung des Eintrags von RKM in die Umwelt. Unter anderem wurde die Bestrahlung von Abwasserteilströmen mit UV-Licht erprobt. Jedoch ist bisher die Bildung von Oxidationsnebenprodukten bei der UV-Lichtbehandlung und deren biologische Wirkung weitgehend unbekannt. Am Beispiel eines Prozesswassers wurde dies mit Hilfe des Leuchtbakterientests auf der TLC-Platte untersucht. Das Bild der entwickelten und getauchten Platte zeigt Abb. 6, wobei für die Referenzstandards (Bahnen 8 und 9) keine Wirkung auf die Biolumineszenz von Vibrio fischeri zu beobachten war. Jedoch hatten einige während der UV- Lichtbestrahlung entstehende und bis jetzt unbekannte Nebenprodukte einen erheblichen Einfluss auf den Stoffwechsel und somit auf das Leuchten der Bakterien. So konnte eine Verstärkung aber auch eine Hemmung der Biolumineszenz beobachtet werden. Ein Anstieg der Hemmung trat bei den Substanzen mit den Rf-Werten von ca. 0,7 und ca. 1 auf. Die Toxizität auf Vibrio fischeri von der Substanz bei Rf = 0,7 nahm mit zunehmender Bestrahlungszeit zu, während gleichzeitig die RKM Iopamidol und Iopromid abgebaut wurden. Zusammenfassung und Ausblick Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die bisher in der organischen Spurenanalytik wenig beachtete HPTLC/AMD-UV/VIS in Kombination mit der Biolumineszenz-Detektion in den verschiedensten Umweltbereichen zur Ermittlung des Vorkommens und der Wirkung von organischen Substanzen erfolgreich eingesetzt werden kann. Dies ist in der Tatsache begründet, dass es sich bei der TLC um ein offenes Trennsystem handelt, wodurch sich vielfältige Detektionsmöglichkeiten eröffnen, die bei geschlossenen Trennsystemen nur schwer mit ausreichender Empfindlichkeit realisierbar sind. Nach der Trennung der organischen Spurenstoffe auf der TLC-Platte ist die Anwendung weiterer Wirktests, wie beispielsweise des Acetylcholinesterase-Hemmtests, möglich. In der kombinierten Anwendung mit der QTOF-Massenspektrometrie kann es weiterhin gelingen, gezielt unbekannte bioaktive Substanzen zu identifizieren. Der Analytiker hat somit ein empfindliches Werkzeug zur Ermittlung von Exposition und Wirkung als Ergänzung zu den etablierten Analysenmethoden zur Verfügung. Literatur ist direkt bei den Autoren erhältlich. K ontakt Dipl.-Ing. (FH) Stefan C. Weiß Dr. Wolfram Seitz Dr. Wolfgang Schulz Dr. Walter H. Weber Zweckverband Landeswasserversorgung, Betriebs- und Forschungslaboratorium, Langenau Tel.: 07345/ Fax: 07345/ weber.w@lw-online.de GIT Spezial Separation 1/

22 Chromatographie Simultane Bestimmung von Mineralsäuren, Fluorid und Silikat in Ätzbädern Ionenchromatographie mit dualer Detektion für die Solarenergie Thaut Images / Fotolia.com Eine ionenchromatographische Methode zur simultanen Bestimmung von HF, HNO 3, H 2 SO 4, kurzkettigen organischen Säuren sowie von H 2 SiF 6 in sauren Texturierungsbädern wird vorgestellt und ihr Einsatz im nasschemischen Ätzprozess von Solarzellen beschrieben. Fluorid, Nitrat, Sulfat und Acetat werden mittels Leitfähigkeitsdetektion nach chemischer Suppression bestimmt, während das in Form von Hexafluorid vorliegende Silicium in derselben Analyse nach Derivatisierung spektrophotometrisch als Molybdokieselsäure nachgewiesen wird. Die Validierung der Analysenergebnisse erfolgt mittels Titration. Die Energiegewinnung aus erneuerbaren Energiequellen, wie zum Beispiel Biomasse, Biogas, Biokraftstoffe, Wasser, Wind- und Sonnenenergie, gewinnt in unserer energiehungrigen Gesellschaft zunehmend an Bedeutung. Ein spezielles Interesse gilt der scheinbar unerschöpflichen Sonnenenergie. In Photovoltaikanlagen eingesetzte Solarzellen wandeln die im Sonnenlicht enthaltene Strahlungsenergie direkt in elektrische Energie um. Die Herstellung der Solarzellen erfolgt aus hochreinen multi- oder monokristallinen Silicium-Wafern, deren Oberfläche vor der Dotierung mit Fremdatomen (P, B) in sauren Ätzbädern (auch als Texturierungsbäder bezeichnet) vorbehandelt wird. Die Ätzlösungen bestehen aus verschiedenen Säuren, die als Oxidationsmittel (HNO 3 ), Komplexbildner (HF), Stabilisatoren und Netzmittel (CH 3 COOH) oder Puffer (H 3 PO 4, CH 3 COOH) fungieren und die Oberflächenstruktur und somit den Wirkungsgrad der Wafer bestimmen. Ein Nachdosieren der im Ätzprozess verbrauchten Komponenten erhöht die Lebensdauer der Bäder und spart Kosten, setzt jedoch die Kenntnis der genauen Badzusammensetzung, insbesondere der Silicium- und Fluorosilikatkonzentration, voraus. Mittels Titration und Ionenchromatographie (IC) lassen sich die wesentlichen Inhaltstoffe schnell und präzise bestimmen. Die vorliegende Arbeit beschreibt ein ionenchromatographisches Verfahren, das alle relevanten Badbestandteile auf einer Anionenaustauschersäule trennt und mittels dualer Detektion in einer einzigen Analyse erfasst. Nach der suppressierten Leitfähigkeitsdetektion der Säureanionen reagiert die undissoziierte Kieselsäure in einer Nachsäulenreaktion (post-column reaction, PCR) zu Molybdokieselsäure, die spektrophotometrisch bei 410 nm bestimmt wird. Abb.1: Ionenchromatographiesystem mit Probengeber Abb. 2: Leitfähigkeits-Chromatogramm eines simulierten Ätzbades mit 25 mg/l Fluorid, 20 mg/l Acetat und 10 mg/l Nitrat. Die undissoziierte Orthokieselsäure wird im Leitfähigkeitsdetektor nicht registriert. 22 GIT Spezial Separation 1/2011

23 Chromatographie Die Ermittlung der Fluorid- und Hexafluorosilikatkonzentration erfolgt über eine einfache, von der Chromatographiesoftware durchgeführten stöchiometrischen Berechnung. Reagenzien und Eluent Zur Herstellung der Standardlösungen wurden die CertiPUR-Standards von Merck (SiO 2 in NaOH sowie wässrige NaF- und NaNO 3 - Lösungen) und der TraceCERT- Standard von Fluka (Acetatlösung) verwendet. Alle Standard- und Eluentlösungen wurden mit Reinstwasser mit einem spezifischen Widerstand von mehr als 18 MΩ cm hergestellt. Proben der Ätzbäder stammen von einem Solarzellenhersteller aus Deutschland. Ätzen von Silicium Beim nasschemischen Ätzen von Siliciumflächen dient die Salpetersäure zur Oxidation des Siliciums zum Siliciumdioxid und die Flusssäure zu dessen Ätzen. 3 Si + 4 HNO HF => 3 H 2 SiF NO + 8 H 2 O Während des Ätzprozesses sinkt die HF- und HNO 3 -Konzentration in dem Maße, wie Wasser und Siliciumhexafluorid sich im Ätzbad anreichern. Um eine konstante Ätzrate und Oberflächenbeschaffenheit zu gewährleisten, kann das Ätzbad durch Nachdosieren der verbrauchten Säuren noch etliche Male regeneriert werden. Allerdings limitiert die steigende H 2 SiF 6 -Konzentration die Anzahl der möglichen Recyclingzyklen. Dies erfordert eine semi-kontinuierliche Überwachung der Badkomponenten, die sicher und anwenderfreundlich mit der automatisierten Ionenchromatographie zu gewährleisten ist. Duale Detektion Die im Ätzbad vorhandenen Säureanionen meist Fluorid und Nitrat, manchmal auch Sulfat und Acetat werden unter alkalischen Elutionsbedingungen getrennt und mittels Abb. 3: UV-VIS-Chromatogramm eines 10 mg/l Kieselsäurestandards, der nach Derivatisierung spektrophotometrisch als Molybdokieselsäure nachgewiesen wird. Leitfähigkeitsdetektion bestimmt (Abb. 2). Das Siliciumhexafluorid wandelt sich im alkalischen Eluenten in undissoziierte und daher im Leitfähigkeitsdetektor nicht sichtbare Orthokieselsäure um. Na 2 SiF NaOH => Si(OH) NaF Die Bestimmung der undissoziierten Orthokieselsäure erfolgt durch Nachsäulenreaktion mit einer sauren Molybdatlösung und anschließender UV/VIS-Detektion bei 410 nm (Abb. 3). H 4 SiO MoO H + => H 4 [Si(Mo 3 O 10 ) 4 ] + 12 H 2 O high speed aviation labor- / biotechnik Healthcare Messen, regeln & automatisieren Prozesstechnik sicherheit photocase /pixelhund schnell, einfach, direkt online! Pro-4-Pro.com ist die online-branchenplattform des git Verlag. Im Durchschnitt nutzen User im Monat PRO-4-PRO.com für ihre berufliche information und zur recherche. Nutzen auch Sie die Vorteile! komfortable suchfunktion keine registrierung notwendig Branchenspezifische Newsletter täglich neue Produkte und anbieter Veranstaltungskalender GIT Spezial Separation 1/

24 Chromatographie Abb. 4: (a) Leitfähigkeits- und (b) UV/VIS-Chromatogramm der 1:2000 verdünnten Probe des Ätzbads 1. Die Chromatographieparameter entsprechen denen der Chromatogramme in Abbildung 2 und 3. Die Injektion von SiF 6 2- ergibt im Leitfähigkeitsdetektor jeweils einen Fluorid- und im UV/VIS-Detektor einen Silikatpeak. Die aus den jeweiligen Peakflächen abgeleitete Massenbilanz bestätigt, dass sich die SiF 6-2 -Konzentration, sofern keine weiteren Fluorid- oder Silikatquellen vorhanden, stöchiometrisch aus den ermittelten Fluorid- und Silikatkonzentrationen ergibt. Somit berechnet sich der Gehalt an freiem HF als Differenz der Fluorid- und Hexafluorosilikatkonzentration: Ätzbadprobe 1 Ätzbadprobe 2 Ätzbadprobe 3 Ätzbadprobe 4 Si HF a HNO 3 b Si HF a HNO 3 b Si HF a HNO 3 b Si HF a HNO 3 b IC [g/l] Titration [g/l] RSD IC [%] RSD Titration [%] Tab. 1: Vergleich der mittels Ionenchromatographie und Titration bestimmten Konzentrationen einiger ausgewählter Badkomponenten. In Ätzbad 1 wurden noch 651 g/l Schwefelsäure nachgewiesen. [HF] = [F ] Gesamt [F ] Hexafluorosilikat Analyse der Texturierungsbäder und Validierung Vier Proben aus verschiedenen Texturierungsbädern werden nach einer 1:1000- bis 1:5000-Verdünnung mittels der beschriebenen IC-Methode mit dualer Detektion auf ihre Inhaltsstoffe analysiert. Abbildung 4 zeigt die mittels Leitfähigkeits- (a) und UV/VIS-Detektion (b) erhaltenen Chromatogramme der Ätzbadprobe 1. Tabelle 1 gibt einen Überblick über die mittels Ionenchromatographie und dualer Detektion bestimmten Konzentrationen der relevanten Badkomponenten. Zum Vergleich sind auch die mittels Titration ermittelten Konzentrationen angegeben. Die potentiometrische Bestimmung der Säurekonzentrationen und des H 2 SiF 6 -Gehalts erfolgte durch wässrige Säure-Base-Titration mit 1 mol/l NaOH-Lösung. Fazit Die Ionenchromatographie mit dualer Detektion erfasst in weniger als 30 Minuten sämtliche relevanten Inhaltsstoffe von im Herstellungsprozess von Solarzellen eingesetzten Texturierungsbädern. Dadurch können die im Texturierungsprozess verbrauchten Säuren gezielt nachdosiert werden. Dies verlängert die Lebensdauer der Ätzbäder, garantiert saubere und reproduzierbare Waferoberflächen, reduziert die Kosten und schont die Umwelt. Literatur [1] Henssge A. and Acker J: Chemical analysis of acidic silicon etch solutions, I. Titrimetric determination of HNO 3, HF and H 2 SiF 6, Talanta 73, (2007) [2] Acker J. and Henssge, A.: Chemical analysis of acidic silicon etch solutions, II. Determination of HNO3, HF and H2SiF6 by ion chromatography, Talanta 72, (2007). [3] Zimmer M. et al.: Inline analysis and process control in wet chemical texturing processes. In 22nd European Photovoltaic Solar Energy Conference and Exhibition, Milan, Italy (2007). [4] Bogenschütz G. et al.: Simultaneous determination of fluoride species plus acid anions in etching baths by ion chromatography with dual detection, Pittcon 2009 ( search for EN) K ontakt Peter Krebs German Bogenschütz Thomas Kolb Deutsche Metrohm GmbH & Co. KG Filderstadt Tel.: 0711/ Fax: 0711/ p.krebs@metrohm.de 24 GIT Spezial Separation 1/2011

25 Extraktion Probenvorbereitung für die chemische Analytik Aufkonzentrierung und Trocknung von Extrakten mittels Vakuumzentrifugen Für die Trocknung von lösemittelhaltigen und wässrigen Pflanzenextrakten werden in unserem Institut seit Jahren sowohl der Rotationsverdampfer als auch ein Rotationsvakuumkonzentrator ( Vakuumzentrifuge ) parallel für jeweilige Anwendungen verwendet. Mittels einer Untersuchungsreihe, in der Extrakte parallel mit beiden Verfahren getrocknet werden, sollte geklärt werden, inwieweit beide Methoden hinsichtlich der Qualität und Reproduzierbarkeit vergleichbar sind und in welchen Anwendungsfällen welche Methode sinnvoller und effektiver verwendet werden sollte. a c Abb. 1: Grünalge 3 und Lutein-Probe, a: vor Vakuumkonzentrator, b: nach Vakuumkonzentrator, c: vor Rotationsverdampfer, d: nach Rotationsverdampfer b d Es zeigte sich, dass beide Methoden alle Anforderungen hinsichtlich Qualität und Reproduzierbarkeit erfüllen. Der Einsatz der Vakuumzentrifuge erfordert wesentlich weniger direkte Aufmerksamkeit. Es können direkt die Gefäße vom vorherigen oder nachgestellten Arbeitsschritt verwendet werden und damit entfallen ein oder zwei Gefäßwechsel. Die Methode ist zeitlich effektiver, sobald einige Proben parallel anfallen oder bearbeitet werden können. Die Zeitersparnis steigt stark mit der steigenden Anzahl von Proben an. Auf Wunsch können die Proben über Nacht getrocknet werden. Einleitung Die Abtrennung von Wasser oder organischen Lösungsmitteln im Bereich der Probenvorbereitung für die chemische Analytik, z. B. nach einer Extraktion, erfolgt traditionell sehr häufig mit einem Rotationsverdampfer. Es handelt sich um eine etablierte und in sich ausgereifte Methode. Das Betreiben des Gerätes erfordert jedoch quasi stete Aufmerksamkeit. Die Proben müssen für den Verdampfungsprozess in kleine Glaskölbchen überführt werden und standardmäßig wird nur 1 Probe getrocknet, die Bearbeitung der Proben erfolgt also nacheinander und es ist der jeweilige Wechsel der Gefäße etc. notwendig. Diese Schritte sind insbesondere bei einem größeren Probenanfall relativ zeitaufwendig. Eine alternative Methode ist die Trocknung von Extrakten mittels eines Rotationsvakuumkonzentrators (RVC). Durch den Einsatz von Vakuum siedet die Probe bei niedrigen Temperaturen und Wasser oder organisches Lösungsmittel kann schonend abgedampft werden. Durch das Rotieren der Proben wie in einer Zentrifuge wird der Siedeverzug so effektiv verhindert, dass ein niedrigerer Druck verwendet werden kann (bis 1 mbar). Das Lösungsmittel wird in einer Kühlfalle aufgefangen. Insbesondere in der Protein- und DNA-Aufbereitung hat es sich seit Jahren zu einer Standardtechnologie entwickelt, in der Rechtsmedizin wird es inzwischen verstärkt eingesetzt. Auch wir nutzen die Methode schon seit längerem, allerdings bisher nur punktuell für einzelne Anwendungen. Mit den hier gezeigten Untersuchungen sollte bestätigt werden, dass die Quantität und die Qualität der Extrakte mit beiden Methoden tatsächlich gleichwertig erhalten werden kann und es sollte geprüft werden, inwiefern sich die Wahl der Trocknungsmethode auf den Arbeitsfluss und den zeitlichen Ablauf auswirkt. Experimentelles Für den Vergleich wurden Life-Extrakte unserer Laboraktivitäten verwendet. Es handelte sich um acetonische farbige Extrakte aus verschiedenen Biomassen von Mikroalgen zur Bestimmung der Chlorophyll- und Carotinoidgehalte. Darüberhinaus wurde ein häufig genutztes Lösungsmittelgemisch Chloroform/Methanol (2:1 v/v) zum Vergleich eingesetzt. Von den Proben wurden jeweils 5 bzw. 25 ml Extrakt zum einen in einem Rotationsverdampfer (Büchi Rotavapor 210, 100 ml Glaskolben, Vakuum bis 20 mbar, Wasserbadtemperatur 35 C) und zum anderen in einer RVC (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen, Alpha RVC mit Kühlfalle alpha 2-4; 50 ml Glasröhrchen; Vakuum 20 mbar; Temperatur 25 C) das Lösungsmittel bis zur Trockne entfernt. In der RVC konnte die Trocknung der Proben nach Beladen des Rotors mit den Gläsern parallel vorgenommen werden, im Rotationsverdampfer erfolgte die Trocknung nacheinander GIT Spezial Separation 1/

26 Extraktion durch jeweiligen Austausch der Glaskölbchen, nachdem eine Probe fertig eingedampft war. Der analytische Vergleich der Zusammensetzung der verbleibenden Substanzgemische nach dem Trocknungsvorgang erfolgte mittels UV-VIS- Spektroskopie (Specord 200, Analytik Jena) nach Wiederaufnahme in Methanol. Ergebnisse Volumen und Lösungsmittel des Extraktes RVC 25 ml Aceton 50 min für alle Proben parallel ohne Aufsicht 5 ml Aceton 15 min für alle Proben parallel ohne Aufsicht 25 ml Chloroform/Methanol 2:1 60 min für alle Proben parallel ohne Aufsicht In beiden Geräten konnten die Extrakte jeweils bis zur Trockne eingedampft werden. In der RVC waren bis zum Erhalt der Trockne der parallel angeordneten Proben wie erwartet ein größerer Zeitraum notwendig. Im Rotationsverdampfer erfolgte die Trocknung der einzelnen Probe wesentlich schneller, die Proben mussten aber nacheinander dem Gerät im Glaskölbchen zugeführt werden. In Tab.1 ist der zeitliche Verlauf der Trocknung zusammenfassend dargestellt. Die absoluten Zeiten hängen natürlich stark von den gewählten Parametern hinsichtlich Vakuum und Temperatur ab, diese sollten entsprechend der Probenbeschaffenheit gewählt werden. Die UV-Spektren der Substanzgemische nach der Trocknung (siehe Abb. 2) sind deckungsgleich oder weisen nur minimale Unterschiede auf, die nach unseren Erfahrungen mit den Extrakten vernachlässigbar sind. Da die einzelnen möglichen Substanzen unterschiedliche Spektren aufweisen, würde sich eine Änderung der Zusammensetzung stärker auf das Mischspektrum auswirken. Die Zusammensetzung der Substanzgemische wurde also von der Methode der Lösungsmittelentfernung nicht beeinflusst, d.h. es verflüchtigten oder zersetzten sich keine Substanzen. Durch die Farbigkeit der Probe war auch gut eine zusätzliche qualitative Bewertung möglich. Wie in Abb. 1 ersichtlich ist, befinden sich die getrockneten Substanzen im unteren Bereich der Glasgefäße und sind nicht bis zum Gefäßrand oder darüber hinaus mitgezogen worden. Auch sind im Vakuumkanal der Geräte keinerlei Substanzspuren ersichtlich. Zeitaufwand für Trocknung * Schlussfolgerungen für den praktischen Einsatz einer Vakuumzentrifuge Reproduzierbarkeit Rotationsverdampfer 5 min/probe + Probenwechsel 2 min/probe + Probenwechsel 4 min 45 s/probe + Probenwechsel Tabelle 1: Übersicht über den zeitlichen Aufwand der verglichenen Methoden der Trocknung. * unter den gewählten Bedingungen zu Vakuum und Temperatur Die Analytik und die Beobachtung bestätigen die korrekte vergleichbare Probenzusammensetzung. Somit kann auch die Vakuumzentrifuge (RVC) für die Probenvorbereitung mit guter Reproduzierbarkeit und ohne die Gefahr der Verflüchtigung und Zersetzung von Substanzen eingesetzt werden. Die Bedingungen hinsichtlich Vakuum und Temperatur sollten natürlich der Probenbeschaffenheit angepasst werden. Bei besonders flüchtigen Substanzen sollte man si- a) b) c) d) Abb. 1a-d: Vergleich der UV-Spektren der Extrakte nach der jeweiligen Trocknung 26 GIT Spezial Separation 1/2011

27 Extraktion cher zusätzlich Vorprüfungen anstellen, die sind aber auch bei anderen Eindampfmethoden mittels Vakuum notwendig. Schonende Bedingungen Das Abdampfen kann bei niedrigeren Temperaturen erfolgen, da der Siedeverzug durch den milden Zentrifugiervorgang sehr effektiv verhindert werden kann und damit ein höheres Vakuum möglich ist (bis 1 mbar). Für ein besonders schonendes Vorgehen können Vakuumund/oder Temperaturrampen vorgegeben werden (Abspeicherung als Programm möglich). Fazit Durch die Untersuchungen wurde gezeigt, dass eine RVC für den breiten Einsatz in unserer Probenvorbereitung geeignet ist. Für Applikationen, in denen mehrere Proben anfallen, werden wir zukünftig verstärkt die Vakuumzentrifuge einsetzen und damit mehr Zeit für andere Arbeitsschritte freisetzen können. Die Untersuchungen der Extrakte wurden von Frau Claudia Oestreich, Biologielaborantin im Institut für Getreideverarbeitung, Bereich Biotechnologie, durchgeführt. K ontakt Dipl.-Ing. Uwe Hager Wissenschaftlicher Mitarbeiter Institut für Getreideverarbeitung Bereich Biotechnolgie Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH Osterode am Harz info@martinchrist.de Paralleles Eindampfen Einzelne Proben können im Rotationsverdampfer wesentlich schneller getrocknet werden. Hat man mehrere Proben, hat die an sich langsamere Trocknung in der RVC aber den Vorteil, dass Proben parallel ohne zusätzliche Zwischenarbeitsschritte eingedampft werden können. Der Zeitgewinn beim Einsatz einer RVC gegenüber einem Rotationsverdampfer ist somit umso größer, je mehr Proben getrocknet werden müssen. Gefäßvariabilität In dieser Untersuchungsreihe wurden klassische Zentrifugengläser verwendet. Proben in der RVC können aber in einer großen Vielzahl von Gefäßen getrocknet werden. Durch die große Variabilität ist es gut möglich, die Gefäße vom Schritt davor oder danach zu benutzen und damit Probenübertragungsvorgänge einzusparen, was wiederum zu Zeitgewinn, Fehlervermeidung etc. führt. Vorprogrammierte unbeaufsichtigte Trocknung Die Vakuumzentrifuge kann unbeaufsichtigt betrieben werden, ein Signalton kann das Ende signalisieren. Wenn die Parameter für Vakuum, Temperatur und Zeit bestimmt sind, können sie als festes Programm abgelegt werden. Auch die Trocknung über Nacht ist gut möglich. Lösungen für die Analyse von hochreinen Gasen Systeme für die Bestimmung von H 2, Ar/O 2, N 2, CH 4, CO, CO 2, C 2 H 6, Kr, Xe und Freonen in den Matrixgasen H 2, Ar, O 2, N 2, CO 2, HCl, SiH 4, BCl 3, N 2 O, CF 4 und SF 6 Jedes System ist für den Einbau in einen 6U 19-Zoll Messschrank konzipiert und individuell für die spezifischen analytischen Bedürfnisse des Kunden konfiguriert. Durch verschiedene Detektorkombinationen können Nachweisgrenzen von 5ppb für Komponenten im Spurenbereich, bis hin zu Prozentkonzentrationen für Matrixgase erreicht werden. Chromatography Solutions Tel: 0049 (0) Fax: 0049 (0) Web: info@ellutia.com GIT Spezial Separation 1/

28 Extraktion Marco Kleine, Büchi Labortechnik Präparative Chromatographie Fallbeispiel: Abtrennung von Benzoin aus einem Reaktionsgemisch Die präparative Chromatographie gehört in nahezu allen Syntheselaboren, ob im universitären Bereich oder in der Industrie, zu einer fest etablierten Methode, um Substanzen aus Gemischen zu isolieren. Neben der klassischen Reihenfolge, zuerst Synthese, dann Auftrennung, können Substanzgemische beispielsweise auch aus einer erfolgten Extraktion vorliegen. Solche Extraktionen können nach traditionellen Vorschriften oder durch Extraktionen unter erhöhtem Druck durchgeführt werden. Allein durch die Vielzahl der Möglichkeiten von Synthesen oder Extraktionen wird schon deutlich, welche unterschiedlichen Substanzmengen und -klassen vorliegen können, die dann getrennt werden müssen. Die nahezu unendlich vielen Gemische weisen alle unterschiedliche Eigenschaften und Komplexitäten auf. Damit werden bei den Trennungen auch die verschiedensten Anforderungen an die Leistung eines Chromatographiesystems gestellt. Der einfachste denkbare Aufbau, mit dem ein Gemisch flüssigkeitschromatographisch getrennt werden kann, stellt eine einfache Säule dar, durch die das Lösungsmittel aufgrund des hydrostatischen Druckes fließt. Ein solches System bietet neben dem Vorteil des einfachen Aufbaus aber auch eine Reihe von Nachteilen: Aufgrund der geringen und nicht einheitlichen Flussrate sowie der meist schlechten Packung der stationären Phase, nimmt eine Trennung mit einem solchen Versuchsaufbau meist viel Zeit in Anspruch und bringt in der Regel Substanzverluste mit sich. Separation von Stoffen Die Sepacorelinie bietet jedem Laboranwender eine Lösung für die anstehenden Trennprobleme und das zur Verfügung stehende Budget. Als günstige Alternative für die handbetriebene Glassäule bietet sich das einfache Flashsystem an: Mit einer Pumpe, die das Lösungsmittel mit bis zu 250 ml/min, pulsationsfrei durch die Dreikolbentechnik, und mit bis zu einem Maximaldruck von 10 bar fördert. Die Flussrate wird durch den einfach zu bedienenden Pumpenkontroller per Drehknopf eingestellt. Zur Sicherheit wird der Systemdruck überwacht, so dass es nicht zum Reißen oder Platzen von Glassäulen oder Kunststoffkartuschen kommen kann. Für komplizierte Trennprobleme steht das Gradientensystem mit dem programmierbaren Pumpmanager zur Verfügung. Die Lösungsmittelzusammensetzung kann einfach während des Laufes automatisch oder per Hand verändert werden. Automation Um den Automatisierungsgrad zu erhöhen, kann ein Flashsystem mit einem Fraktionssammler und UV-Detektor ausgestattet werden. Damit wird eine automatische Separation nach den einzelnen Signalen sichergestellt. Durch die freie Programmierbarkeit ermöglicht der Fraktionssammler ein Sammeln in jeder Art von Gefäßen 28 GIT Spezial Separation 1/2011

29 Extraktion Abb.1: Chromatogramm der Auftrennung des Reaktionsgemisches sowie die anschließende Überprüfung der Reinheit mittels TLC. oder auch in die originalen Racks bzw. Gläser mit einem Volumen bis zu 250 ml. Mit einem Fraktionssammler und UV-Detektor kann auch das einfachste System aufgerüstet werden, so dass sich die Chromatographieanlage selber den Bedürfnissen der Anwender anpassen kann. Bei den Komplettsystemen muss die grundsätzliche Entscheidung getroffen werden, ob ein System manuell, d. h. mit einem Pumpmanager, oder mittels eines Computers gesteuert werden soll. Die zur Steuerung benötigte Software SepacoreControl kann dabei auf jedem normalen und bereits vorhandenen Windowsrechner installiert werden. Ein zusätzlicher Steuerungscomputer ist in der Regel nicht notwendig. Der große Vorteil ist, dass die vergleichsweise empfindliche PC-Hardware nicht direkt dort installiert ist, wo sie direkt mit Chemikalien in Berührung kommt. Entscheidet sich der Anwender für die manuelle Steuerung, dann können die Daten (z. B. die Chromatogramme) auf einen externen PC übertragen und gespeichert werden. Fallbeispiel: Abtrennung von Benzoin aus einem Reaktionsgemisch Trotz der Vielfalt der möglichen zu trennenden Substanzen, sei an dem Beispiel der Abtrennung des Benzoins aus einem Reaktionsgemisch die Leistungsfähigkeit des Systems erläutert: Das Benzoin wird in der Regel mittels der sog. Benzoin-Addition aus Benzaldehyd durch eine Cyanid-katalysierte Addition hergestellt. Die dünnschichtchromatographische Auftrennung erfolgte durch ein Gemisch aus Hexan: Diisopropylether im Verhältnis 3:1. Dasselbe Substanzgemisch wurde auch verwendet, um die Trennung auf einer mit Standard-Kieselgel gepackten Kartusche durchzuführen. Die Zusammensetzung des Eluenten wurde während der Trennung auf 15 % Diisopropylether angehoben. Trennbedingungen: Eluent: Gradient: Flussrate: Substanz: Detektion: Hexan (A) : Diisopropylether (B) 3 min 5 % (B), 5-15% (B) in 17 min, 7 min 15 % (B) 10 ml/min 250 mg Substanzgemisch in Toluol UV bei 254 nm Dieses auf der Dünnschichtplatte auf den ersten Blick kompliziert aussehende Substanzgemisch kann mithilfe der Sepacoreanlage und einer Büchi-Kartusche innerhalb von 27 min vollständig getrennt werden. Um neben der Flexibilität seitens der Geräte den Einsatzbereich der Säulen noch zu erweitern, wurde das Sortiment der Einmalkunststoffkartuschen deutlich erweitert. Bisher gab es vier verschiedene Kartuschengrößen, die entweder mit Normalphasen-Kieselgel oder RP-18-Material mit einer Korngröße von µm gepackt waren. Da sich das Anwendungsspektrum der präparativen Chromatographie gewandelt hat, gibt es ab sofort rund 60 unterschiedliche Kartuschen mit verschieden Größen und Materialen. Um jegliche Art von Applikationen mit den neuen Kartuschen abzudecken, sind folgende stationäre Phasen verfügbar: C-18, Amin, Cyano, Diol und Kationenaustausch. Ob sich der Anwender für wiederverwend- und befüllbare Glassäulen oder Einmalkartuschen mit den oben beschriebenen Materialen entscheidet, es gibt für nahezu jedes erdenkliche Trennproblem die richtige Lösung, so dass einer erfolgreichen Separation eines jeden Substanzgemisches, nichts im Wege steht. Die Aktion quadratisch.praktisch.sepacore soll allen Anwendern, egal ob Einsteiger oder bereits Profi im Umgang mit der präparativen Chromatographie, helfen, das richtige System zu finden. In Verbindung mit der Initiative für die Wissenschaft lässt sich die beste Konfiguration zum besonders günstigen Preis finden. K ontakt Büchi Labortechnik GmbH Essen Tel.: 0201/ kleine.m@buchi.com GIT Spezial Separation 1/

30 Mechanische Trennverfahren mühsam und zeitaufwändig und können mit dem höheren Durchsatz von Chromatographiesystemen nicht Schritt halten. Probenvorbereitung Probenvorbereitung in der Chromatographie Die besten Praktiken für die Vorbereitung von Proben und mobilen Phasen Samplicity Filtrationssystem (Merck Millipore) Neue Chromatographiemethoden wie die UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) bieten allgemein anerkannte Vorteile. Eine Beschleunigung der Arbeitsabläufe und Verbesserung der Auflösung von 30 bis 50 % im Vergleich zu Standard-HPLC-Separationen sind dabei typisch. Der schnellere Ablauf und die höhere Auflösung der UHPLC erfordern jedoch auch eine intensivere Vorbereitung der Proben und mobilen Phasen, um den Prozess zu beschleunigen und Systemstillstandszeiten zu vermeiden. Pittcon Editors Award 2011 Silber Chromatographiedurchläufe, die vor einigen Jahren noch 5 bis 20 Minuten gedauert hätten, erfordern heute nur einen Bruchteil dieser Zeit, und die höhere Auflösung ermöglicht eine bessere Trennung der Bestandteile eines komplexen Gemisches. Der beschleunigte Ablauf und die höhere Auflösung der UHPLC erfordern jedoch auch eine intensivere Vorbereitung der Proben und mobilen Phasen, um Systemstillstandszeiten zu vermeiden und eine hohe Qualität der Ergebnisse zu gewährleisten. Aufgrund der kleineren Partikelgröße des Packmaterials und der kleineren Säulendurchmesser sind diese Systeme äußerst anfällig für Verstopfungen durch Verunreinigungen. Die Wahl der optimalen Filtrationsmethode für Proben und mobile Phasen für die UHPLC ist kritisch. Der schnelle Ablauf der UHPLC erfordert auch einen höheren Durchsatz bei der Probenvorbereitung. Gebräuchliche Probenvorbereitungssysteme wie Spritzenvorsatzfilter sind In der UHPLC sind die Klärfiltration und Abscheidung feiner Partikel unerlässliche Schritte, um eine Verstopfung der Säulen und Systemstillstandszeiten zu vermeiden. Einige andere Probenvorbereitungsmethoden (Festphasenextraktion und Flüssig-Flüssig-Extraktion) reduzieren die Komplexität der Proben, wodurch ein höheres Signal-Rausch- Verhältnis und eine sauberere Basislinie erzielt werden. Proben dürfen keine interferierenden Matrixbestandteile enthalten, die an die stationäre Phase in der UHPLC-Säule binden können. Je nach Art und Anzahl der Proben können für die UHPLC-Probenvorbereitung verschiedene Methoden gewählt werden. Dazu gehören Probenfiltration mit 0,2-µm-Filtern, Proteinausfällung mit nachfolgender Zentrifugation oder Filtration, Festphasenextraktion, Ultrafiltration oder Flüssig-Flüssig-Extraktion. Während der Durchsatz bei Chromatographiesystemen ständig verbessert wird, können Probenvorbereitungsmethoden kaum Schritt halten und bilden Engpässe. Die Filtration mit Spritzenvorsatzfiltern ist eine sehr einfache Methode. Die serielle Probenvorbereitung kann jedoch leicht zum zeitaufwändigsten und mühsamsten Schritt im gesamten analytischen Arbeitsablauf werden (Abb. 1). Am anderen Ende des Probenvorbereitungsspektrums stehen Robotersysteme, die kostspielig sein können und Laboren, die nur einige Dutzend Proben pro Tag verarbeiten, eine zu große Kapazität bieten. Jüngste Innovationen in der Probenvorbereitung wie das Samplicity Filtrationssystem ermöglichen eine simultane Vorbereitung von Proben und bieten eine Durchsatzkapazität, die den Anforderungen der meisten Labore entspricht. Mit dem Samplicity System können bis zu acht Proben gleichzeitig in wenigen Sekunden direkt in LC-Fläschchen vakuumfiltriert werden (Aufmacher). Neben der schnelleren Verarbeitung bieten Vakuumfiltrationssysteme auch einen höheren Durchsatz als Spritzenvorsatzfilter. Der Kolben einer Spritze kann bis zum Boden des Spritzenzylinders herabgedrückt werden. An diesem Punkt kann keine weitere Flüssigkeit durch den Spritzenvorsatzfilter gedrängt werden. Jegliche Flüssigkeit, die im Filtergehäuse zurückbleibt, geht verloren. Bei der Vakuumfiltration wird praktisch die gesamte Flüssigkeit durch das Filtergehäuse gezogen, so dass die Rückgewinnungsraten erheblich höher sind (Abb. 2). Dies ist besonders von Vorteil, wenn mit kleinen Probenvolumina gearbeitet wird. Vorbereitung der mobilen Phase Im Gegensatz zur HPLC, bei der die Anforderungen an die Filtration der mobilen Phase weniger streng 30 GIT Spezial Separation 1/2011

31 Mechanische Trennverfahren Literatur [1] Mabic S. et al.: The misunderstood laboratory solvent: reagent water for HPLC. LCGC North America 23(1):74-82 (2005) [2] Tarun M. et al.: Improving chromatographic performance by using freshly delivered ultrapure water in the mobile phase. LCGC The Peak, June, 7-14 (2009) Abb. 1: Beseitigung des Probenvorbereitungsengpasses mittels simultaner Verarbeitung und Vakuumfiltration. Abb. 2: Aufgrund ihrer höheren Probenrückgewinnungsraten sind vakuumbasierte Filtrationssysteme besonders gut zur Vorbereitung kleiner Probenvolumina geeignet. sind, haben typische UHPLC-Säulen einen kleinen Durchmesser und sind mit 0,2-µm-Fritten ausgestattet, die Partikel zurückhalten und daher verstopft werden können. Die Filtration der mobilen Phase mit dem optimalen Membranfilter schützt UHPLC- Systeme vor partikulären Verunreinigungen, die das System verstopfen und stilllegen können. Die meisten UHPLC-Hersteller empfehlen die Verwendung von Filtern mit einer Porengröße von 0,2 µm zur Vorbereitung der mobilen Phase. In einer von Merck Millipore durchgeführten Studie wurden drei gebräuchliche Lösungsmittel (Wasser, Acetonitril und Methanol) zur Vorbereitung der mobilen Phase verwendet und die Auswirkungen der Filtration auf den Rückdruck des UHPLC-Systems beurteilt. Unter den beurteilten Membranfiltern bot der Filter aus hydrophilem Polytetrafluorethylen (PTFE) die beste Filtrationsleistung, was sich am geringsten Anstieg des Rückdrucks im UHPLC- System zeigte. Filter aus hydrophilem Polypropylen (PP) konnten partikuläre Verunreinigungen in den Lösungsmitteln nicht zurückhalten, was sich am höchsten Anstieg des Rückdrucks unter allen getesteten Filtern zeigte. Filter aus Nylon und hydrophilem Polyvinylidenfluorid (PVDF) zeigten eine mittelmäßige Leistung in Bezug auf die Partikelrückhaltung und den nachfolgenden Druckanstieg. Neben dem geringsten Anstieg des Rückdrucks zeigten hydrophile PTFE-Filter auch die beste chemische Kompatibilität mit verschiedenen Lösungsmitteln und Mobilphasemodifikatoren, die in der UHPLC häufig verwendet werden. Wasserqualität Wenige Faktoren beeinflussen HPLC-Analysen mehr als Verunreinigungen im Wasser, das für die mobile Phase verwendet wird. Während eine unzureichende Wasserqualität eines der am einfachsten zu korrigierenden Probleme darstellt, ist es eines der am wenigsten verstandenen Faktoren im analytischen Labor. Berichten zufolge werden % der Leistungsprobleme bei der Chromatographie letztendlich auf die Wasserqualität in Elutionsmitteln, Proben und Standardlösungen zurückgeführt [1]. Die UHPLC wird durch die gleichen Wasserverunreinigungen wie die HPLC beeinflusst, in einigen Fällen jedoch in größerem Ausmaß. Bei Nachweisgrenzen bis zum ppt-bereich muss das Wasser, das zur Verarbeitung von Blindproben, Verdünnung von Proben, zum Ansetzen von Puffern und Standardlösungen verwendet wird, von höchster Qualität sein. Wasser für die UHPLC sollte frei von partikulären, organischen, bakteriellen und ionischen Verunreinigungen sein. Die Lagerung von Reinstwasser in Kunststoffbehältern kann die UHPLC ebenfalls beeinträchtigen, da die Behälter auswaschbare Stoffe in das Wasser abgeben können. Glasbehälter sind Kunststoffbehältern vorzuziehen, da sie weniger organische Stoffe abge- ben, sie können jedoch Ionen in das Wasser einführen. Die Lagerung von Reinstwasser kann auch die Proliferation von Bakterien anregen. Aus diesen Gründen ist frisch aufbereitetes Reinstwasser vorzuziehen [2]. K ontakt Vivek Joshi, PhD Senior Scientist, Technology Development Group Merck Millipore, Massachusetts, USA vivek.joshi@merckgroup.com GIT Spezial Separation 1/

32 Kapillar-Ionenchromatographie Kapillar-Ionenchromatographie Eine neue Technik für die Ionenanalytik Die Kapillar-IC ist eine neue Technik, die gleiche Säulenmaterialien wie analytische 2- und 4-mm Säulen einsetzt und vergleichbare Ergebnisse erzielt. Durch den geringen Durchmesser von Kapillarsäulen von nur 0,4 mm, werden nur 10 µl/min an Eluens gebraucht. Ein Kapillar-IC- System kann so mit nur 5,25 l Eluensverbrauch im Jahr kontinuierlich betrieben werden. Abfall Probenschleife Load Injekt 4 mm AG/AS16 Wasser 1. Dimension 2. Dimension 4 mm SRS 300 Pumpe EG 4 mm CRD 200 Schematische Darstellung ICxIC 1,0 ml/min Injektions - ventil 1 CD Kapillar Konzentriersäule Injektionsventil 2 Abfall Wasser 0,4 mm AS20 -EG Pumpe Abfall Kapillar CD Kapillar- Suppressor Abfall 10 L/min Einleitung Die Ionenchromatographie wird heute in vielen Laboren weltweit für die qualitative und quantitive Analyse von ionischen Verbindungen in unterschiedlichsten Proben eingesetzt [1]. Zum Nachweis immer niedrigerer Analyt-Konzentrationen neben hohen Konzentration von Matrixbestandteilen werden seit einigen Jahren die IC/ MS- und IC-MS/MS-Kopplung eingesetzt [2]. So kann zum Beispiel Perchlorat im ng/l-bereich neben Chlorid, Carbonat und Sulfat mit Gehalten im g/l-bereich sicher bestimmt werden. Viele Labore scheuen die mit einer MS-Kopplung verbundenen Kosten und Anforderungen an die Anwender, vor allem wenn das Probenaufkommen eine derartige Anschaffung nicht rechtfertigt. Eine echte Alternative ist die IC-Spurenanalytik im Kapillar-Format. Die Kapillar-IC nutzt Techniken, die auch mit analytischen Säulen (4 mm und 2 mm Innendurchmesser) eingesetzt werden. Das schließt die elektrolytische Eluenten-Erzeugung (RFIC- EG) ohne manuelles Ansetzen der Reagenzien und die elektrolytischen, selbstregenerierenden Supressoren mit Leitfähigkeits-Detektion ein. Des Weiteren stehen dem Anwender die gleichen Säulenmaterialien zur Verfügung, was den Methodentransfer vereinfacht. Die mit Kapillar- IC erzeugten Ergebnisse unterscheiden sich zunächst nicht von denen, die mit analytischen Säulen erzielt werden. Besonderheiten der Kapillar-IC Durch den Einsatz von Kapillarsäulen mit 0,4 mm Innnendurchmesser ist nur ein Eluensfluss von 10 µl/min erforderlich. Dies bedeutet, dass nur 15 ml Eluens pro Tag verbraucht werden, was einem Verbrauch von nur 5,25 l im Jahr entspricht. Neben dem Säulendurchmesser und dem Fluss wird auch das Injektionsvolumen auf üblicherweise 0,4 µl verringert, wobei vergleichbare Bestimmungsgrenzen wie mit 4-mm- Säulen und Injektionsvolumina von 40 µl erzielt werden. Im Gegensatz zur konventionellen Spurenanalytik, in der große Probenvolumina bis zu 1 ml direkt auf 4-mm-Säulen injiziert werden, reichen in der Kapillar-IC 10 μl Probe, um gleiche Nachweisgrenzen zu erreichen. Allerdings wird mit einer Injektion großer Probenvolumina auch mehr an Matrixbestanteilen injiziert, so dass bei stark belasteten Proben die Gefahr der Co-elution besteht. Von daher wird diese Technik hauptsächlich für unbelasteste Proben wie beispielsweise Reinstwasser eingesetzt. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel, bei dem 10 µl Probe injiziert wurden und Anionen mit Gehalten zwischen 0,2 und 1,0 µg/l getrennt werden. Die Bestimmungsgrenzen liegen für die meisten Anionen im Bereich von 0,02 bis 0,1 µg/l. Um Ionen im unteren ng/l-bereich zu bestimmen, werden in der Ultraspurenanalytik mit 4-mm-Säulen üblicherweise große Probenvolumina von 10 bis zu 200 ml auf Konzentriersäulen angereichert. Das Anreichern derart großer Probenvolumina ist hierbei der zeitbestimmende Schritt, der zum Beispiel für 100 ml Probe bei einem Fluss der Konzentrierpumpe von 2 ml/min insgesamt 50 Minuten dauert, während die chromatographische Trennung in Minuten erfolgt. Wird für die gleiche Anwendung die Kapillar-IC eingesetzt, so werden nur 2 ml Probe benötigt und die Anreicherung auf einer Kapillar- Konzentriersäule erfolgt in wenigen Minuten. IC x IC-Technik Neben der Ultraspuren-Analyse von Ionen in Reinstwässern müssen Ionen wie Perchlorat und Bromat auch in Proben mit relativ hohem Ionengehalt bestimmt werden. Hierfür bietet sich die zweidimensionale Trennung mit der IC x IC-Technik an. Dafür wird zuerst ein relativ großes Probenvolumen von z. B. 1 ml auf eine Trennsäule mit 4 mm Innendurchmesser injiziert und das zu bestimmende Analyt-Ion von den Matrix-Ionen getrennt. Hinter dem Leitfähigkeits-Detektor befindet sich in dieser Konfiguration ein 6-Port- Schaltventil mit einer Konzentriersäule im Kapillar-Format. Auf dieser wird die Fraktion mit dem Analyt-Ion angereichert und anschließend auf eine Kapillarsäule mit 0,4 mm Innendurchmesser injiziert. Der schematische Aufbau eines IC x IC-Systems ist im Aufmacherbild dargestellt. Der größte Vorteil der IC x IC-Technik mit einer 4-mm und einer 0,4-mm-Trennsäule ist der enorme Empfindlichkeitsgewinn. So können Ionen im mittleren ng/l-bereich in nur 1 ml Probe neben ei- 32 GIT Spezial Separation 1/2011

33 Kapillar-Ionenchromatographie 0, S Intensität Standards in entionisiertem Wasser Entionisiertes Wasser 1 0,36 0 Minuten ,0 Minuten 9,0 Abb. 1: Trennung von Anionen im Spurenbereich mit einer Injektion von 10µl Probe. Trennsäule: IonPac AS19 (0,4 mm x 250 mm); Eluens: Kapilllar EGC-KOH Kartusche, 20 mmol/l; Fluss: 10 µl/min; Säulentemperatur: 30 C; Detektion: Leitfähigkeit nach Suppression. Peaks: 1. Fluorid (0,2 µg/l); 2. Chlorid: (0,3 µg/l); 3. Nitrit (1,0 µg/l); 4. Bromid (1.0 µg/l); 5. Nitrat (1.0 µg/l); 6. Carbonat; Sulfat (1,0 µg/l). Abb. 3: Nachweis von Perchlorat mit IC-MS/MS. Trennsäule: IonPac AS20 (0,4 mm x 250 mm); Eluens: Kapilllar EGC-KOH Kartusche, 40 mmol/l; Fluss: 20 µl/min; Säulentemperatur: 30 C; Detektion: MS/MS: Negativ ESI, MRM m/z 99 m/z 83. Peaks: 1. Perchlorat (50 ng/l) Matrix: 1500 mg/l Chlorid und Sulfat, 800 mg/l, Carbonat und 180 mg/l Nitrat. 0,5 S Entionisiertes Wasser Mineralwasser A (54 ng/l) Standard: 100 ng/l Bromat in entionisiertem Wasser Standard: 30 ng/l Bromat in entionisiertem Wasser 1-0,3 17,0 Minuten 20,0 Abb. 2: Nachweis von Spuren an Bromat in Mineralwasser mit ICxIC. Erste Dimension: Trennsäule: IonPac AS19 (4,0 mm x 250 mm); Eluens: EGC-KOH Kartusche, mmol/l; Fluss: 1,0 ml/min; Injektionsvolumen: 1000 µl; Säulentemperatur: 30 C; Detektion: Leitfähigkeit nach Suppression. Zweite Dimension: Trennsäule: IonPac A20 (0,4 mm x 250 mm); Eluens: Kapilllar EGC-KOH Kartusche, 35 mmol/l; Fluss: 10 µl/min; Transfervolumnen: 2500 µl; Säulentemperatur: 30 C; Detektion: Leitfähigkeit nach Suppression nem fachen Überschuss an Matrix-Ionen bestimmt werden. Das in Abbildung 2 dargestellte Chromatogramm zeigt die Bestimmung von Bromat in Mineralwasser. Mit der IC x IC und Leitfähigkeits- Detektion nach Suppression konnten 54 ng/l Bromat in der analysierten Probe nachgewiesen werden. Bromat Kapillar-IC-MS/MS Für Labore, die eine Kopplung aus Kapillar-IC und MS/MS einsetzen wollen, um die Spezifität der Analytik zu erhöhen, bieten sich weitere Vorteile im Vergleich zu analytischen Säulen. Diese resultieren aus den geringeren Flussraten, die eine Empfindlichkeitssteigerung in der Elektrospray-Ionisierung bewirken. Weiterhin gelangt aufgrund der kleinen Injektionsvolumina weniger Matrix in die Ionenquelle, was sich positiv auf die Reinigungsintervalle auswirkt. Ein Beispiel für die Bestimmung von Perchlorat in Mineralwasser wird in Abbildung 3 gezeigt. Hier wurden 50 ng/l in einer simulierten Mineralwassermatrix mit hohen Matrix-Ionengehalten bestimmt. Weitere Vorteile der Kapillar-IC Der extrem geringe Eluentenverbrauch erlaubt es, ein Kapillar-IC System kontinuierlich über mehrere Monate zu betreiben. Die Vorteile für das Labor sind weniger Zeit und Kosten für das Ansetzen der Eluenten, die Zeit zum Äquilibrieren des Systems nach dem jeweiligen Anfahren fällt weg und es ist weniger Kalibrieraufwand nötig, da das System kontinuierlich Säule und Suppressor mit Eluens spült, selbst wenn keine Proben analysiert werden. Ein Kapillar-IC System ist folglich immer einsatzbereit und kann Proben sofort bearbeiten, so bald sie zur Verfügung stehen. Weiterhin werden Kosten verringert, da weniger Abfall erzeugt wird, weniger Elutionsmittel benötigt wird und im Fall der RFIC die EG-Kartuschen bis zu 18 Monate (selbst im Dauerbetrieb) halten. Im ICS-5000, dem ersten Kapillar-IC System mit Eluenten-Erzeugung sind alle Kapillar- Säulen und Zubehörteile in einem IC-Kubus untergebracht, der die Handhabung von Kapillarsäulen und Suppressoren sehr einfach macht. Neben der Kapillar-IC unterstützt das ICS-5000 auch alle analytischen und selbst semi-preparative Säulen und ist damit ein extrem flexibles System für die Routine-Analytik und das Forschungslabor. Literatur [1] Weiss J.: Ionenchromatographie, Wiley VCH, 2001, 10ff. [2] Trinkwasserverordnung gesundheitsamt.de/alle/gesetz/ tw/twv/f/a02.htm K ontakt Dr. Frank Höfler Senior Product Line Manager Dionex IC Systems Thermo Fisher Scientific Sunnyvale, CA, USA Tel.: Fax: GIT Spezial Separation 1/

34 Kopplungstechnik Mineralölkontaminationen Bestimmung in Lebensmitteln und Verpackungsmaterialien durch LC-GC-Kopplung Frank Rohde / Fotolia In zahlreichen Lebensmitteln werden unerwünschte Mineralölrückstände gefunden. Zurückzuführen ist dies häufig auf die Verpackungsmaterialien. Die Verwendung mineralölhaltiger Druckfarben führt zu einer Migration von Kohlenwasserstoffen in die Lebensmittel. Dies ist besonders bei recycelten, aber auch bei frischfaserhaltigen Verpackungen festzustellen. Voraussetzung ist, dass verpackte Lebensmittel in direktem Kontakt mit der Verpackung stehen, wie dies bei einer Vielzahl von Lebensmitteln wie z. B. Reis der Fall ist. Einführung Besonders die Konzentration gesättigter (MOSH Mineral Oil Saturated Hydrocarbons) und aromatischer Kohlenwasserstoffe (MOAH Mineral Oil Aromatic Hydrocarbons) ist in vielen Produkten stark erhöht. Kohlenwasserstoffe, die im Siedebereich zwischen C16 und C24 liegen, gelten als besonders migrationsintensiv. Die gesundheitliche Bedenklichkeit dieser Kontamination von Lebensmitteln wurde bereits im Dezember 2009 vom Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) deutlich formuliert (1). Das BfR kam in seiner Wertung zu dem Schluss, dass der Übergang von Mineralölen auf Lebensmittel dringend minimiert werden sollte. Messungen werden empfohlen. An entsprechenden Vorschriften wird gearbeitet. Der Nachweis der Mineralölkontaminationen in Lebensmitteln erfährt deshalb seither besondere Aufmerksamkeit. Hier wird eine LC-GC-Kopplung beschrieben, die die sich gut für die Lösung dieser Fragestellung eignet. Geräteaufbau Zur Bestimmung der MOSH/MOAH- Fraktionen aus Verpackungen oder Lebensmitteln findet im ersten Schritt eine Probenaufreinigung und Vortrennung durch Normalphasen-HPLC statt, nachdem die Probe je nach Art und Herkunft mit Hexan extrahiert und ggf. aufgearbeitet wurde. Aufgabe dieses Schrittes ist es, die MOSH- und MOAH-Fraktionen von angrenzenden Fraktionen zu trennen. Dies sind bei der MOSH-Fraktion hauptsächlich Paraffine, während bei der MOAH-Fraktion eine Abgrenzung zu Wachsestern stattfinden muss. Nach der Vortrennung werden die jeweiligen Fraktionen large-volume-on-column auf den GC transferiert, mittels FID detektiert und ein Summenparameter gebildet. Zur Umsetzung der Aufgabe wurden Abb. 1: Beispielchromatogramm einer Injektion des AS-Applikationsstandards (UV-Detektion bei 230 nm) Abb. 2: Kalibrierfunktion 34 GIT Spezial Separation 1/2011

35 Kopplungstechnik Abb. 3: MOSH-Fraktion des Reisextrakts I (10 g mit 10 ml Hexan extrahiert, auf 0,5 ml eingedampft), 30 µl-injektionsvolumen Abb. 5: MOSH-Fraktion eines Nussnougatcreme-Extrakts (8 g mit 20 ml Hexan extrahiert), 50 µl-injektionsvolumen Probe MOSH-Konzentration MOAH-Konzentration Reisextrakt I 8,4 mg / kg 2,1 mg / kg Reisextrakt II 1,0 mg / kg < 0,6 mg / kg Nussnougat- 119 mg / kg < 0,6 mg / kg extrakt Ergebnistabelle Abb. 4: MOAH-Fraktion des Reisextrakts I, 30 µl-injektionsvolumen folgende Komponenten eingesetzt: Binäre HPLC-Pumpe, DANI Master GC, CTC CombiPAL, Mastersoftware Chronos Version 3.1, Data- Apex Clarity Version 3.0. Ergebnisse HPLC-Trennung Abbildung 1 zeigt ein Chromatogramm einer 50 µl-injektion des AS-Applikationsstandards, empfohlen von K. Grob (2), in der Verdünnung 1:250. Der Standard besteht nominell aus den Substanzen C12, C14, C16 (je 200 ppm), Tri-tert-butylbenzol, Biphenyl, Hexylbenzol, Nonylbenzol (je 100 ppm) sowie Cholestan und Perylen (je 500 ppm). Mithilfe dieses Standards ist es möglich, den korrekten Fraktionstransfer zum GC zu verifizieren. Tri-tert-butylbenzol, Cholestan und Perylen zeigen wichtige Eckpunkte der MOSH- und MOAH-Fraktionen an, während C14, C16, Biphenyl und Nonylbenzol als interne Standards verwendet werden können. C12 und Hexylbenzol können zur Diskriminierungsfreiheit stark flüchtiger Substanzen beim Transfer zum GC eingesetzt werden. Die Detektion der LC-Chromatogramme bei 230 nm im UV erlaubt neben der Verfolgung der Gradientenkomposition auch die Überprüfung des Perylen-Peaks. Dieser ist im Chromatogramm bei 5.35 Minuten zu erkennen (s. Abb. 1). Zur Rekonditionierung der Säule wird diese nach 6 Minuten rückgespült (s. Abb.1). Kalibrierung Unter MOSH-Bedingungen wurde mithilfe eines BAM-Schmierölstandards eine Kalibrierfunktion in einem Konzentrationsbereich zwischen ng aufgestellt. Die Kalibrierstufen betrugen 100, 500, und ng. Das Injektionsvolumen betrug jeweils 50 µl. Jedem Standard wurde der AS-Applikationsstandard in einer Verdünnung von 1:250 zugesetzt. Er enthält im MOSH-Fraktionsbereich die Substanzen C12, C14, C16 und Cholestan. Abbildung 2 zeigt die mit diesen vier Standards erzeugte Kalibriergerade. Die Substanzen des AS- Applikationsstandards dienten nur zur Verifizierung des korrekten MOSH-Transfers von der HPLC auf den GC. Die gesamte Kalibrierung erfolgte extern, kann durch den AS-Applikationsstandard aber auch intern erfolgen. Da der FID ein substanzunabhängiges proportionales Massensignal liefert, kann diese Kalibrierung auch für die MOAH- Fraktion verwendet werden. Es wurden zwei Reis- und ein Nussnougatextrakt auf MOSH- und MOAH-Verunreinigungen untersucht. In allen drei Proben konnten MOSH und MOAH nachgewiesen werden (s. Tabelle). Die Abbildungen 3 bis 5 zeigen die entstandenen Chromatogramme. Optimierung des Probendurchsatzes Durch die Erweiterung des GC mit einem zweiten FID ist es möglich, sowohl die MOSH-als auch die MOAH-Fraktion aus einer Injektion in die HPLC zu bestimmen und so den Probendurchsatz zu verdoppeln. Zusammenfassung Die Kopplung von Normalphasen- HPLC und GC-FID erlaubt eine sichere Quantifizierung von Mineralölrückständen in Lebensmitteln und Verpackungen. Die Verwendung hochporöser Kieselgelsäulen ermöglicht die direkte Injektion fetthaltiger Proben, wodurch eine langwierige Fettabtrennung vermieden werden kann. Die in der Fachliteratur angestrebte Bestimmungsgrenze von 0,6 mg/kg kann mit diesem System für nicht-fetthaltige Proben erreicht werden. Für stark fetthaltige Probenextrakte sind möglicher- weise höhere Bestimmungsgrenzen zu berücksichtigen. Die Bestimmung von MOSH und MOAH ist mit der beschriebenen LC- GC Kopplung (GC als Doppelkanalsystem) ohne große Probenvorbereitungsschritte simultan in 30 Minuten möglich. Der hohe Automatisierungsgrad wird durch die Mastersoftware Chronos von Axel Semrau zur Steuerung des gesamten Ablaufs gewährleistet. Literatur [1] Übergänge von Mineralöl aus Verpackungsmaterialien auf Lebensmittel, Stellungnahme Nr. 008/2010 vom 9. Dezember 2009, Bundesinstitut für Risikobewertung [2] Biedermann M. et al.: Aromatic hydrocarbons of mineral oil origin in food: Method of determining the total concentration and first results; J. Agric. Food Chem. 57, (2009) K ontakt Dr. Rüdiger Kohl Applikationschemiker Axel Semrau GmbH & Co. KG Sprockhövel Tel.: 02339/ Fax: 02339/6030 kohl@axel-semrau.de GIT Spezial Separation 1/

36 Methodentransfer Bestimmung von Verunreinigungen im Wirkstoff Clindamycinphosphat On-line Analytik in der pharmazeutischen Qualitätskontrolle und Bioprozesstechnik In der pharmazeutischen Analytik ist die Kontrolle der Wirkstoffreinheit ein sehr wichtiges Anwendungsgebiet für die HPLC, um gleichbleibende Produktqualität zu gewährleisten. Die vorgestellte Methode beschreibt eine schnelle, isokratische UHPLC-Trennung von Clindamycinphosphat zur Beurteilung von Prozessverunreinigungen mit den Ausgangsstoffen Lincomycin und Clindamycin. Ausgangspunkt ist die Analysenvorschrift für Clindamycinphopsphat in der europäischen Pharmakopöe 6.0. Durch den Einsatz einer geeigneten UHPLC-Säule und die Anpassung der HPLC-Methodenparameter kann die Analytik innerhalb von drei Minuten durchgeführt werden. Im Vergleich dazu benötigt die entsprechende HPLC-Analytik mehr als 20 Minuten. Somit ist die UHPLC-Methode prädestiniert für die pharmazeutische Qualitätskontrolle, um ein hohes Probenaufkommen mit der geforderten Schnelligkeit und hoher Verlässlichkeit zu bearbeiten. Dr. Silvia Marten, Knauer Abb. 1: Chemische Strukturen Ob eine analytische Methode zur Bestimmung des Gehaltes und der Reinheit von pharmazeutischen Wirkstoffen angewendet wird, ist abhängig von verschiedenen Kriterien. Die Analysenzeit und die Kosten spielen eine ebenso große Rolle wie Empfindlichkeit, Selektivität und Robustheit. Wenn es im Labor zusätzlich um die Einführung neuer Bestimmungsmethoden geht, stehen meist Verbesserungen der Methode und Effizienzsteigerungen im Mittelpunkt, letztere vor allem wegen der Kosteinsparung. Mehr und mehr kommt aber auch die Umweltverträglichkeit der eingesetzten Analysenverfahren selbst auf den Prüfstand und bietet eine Chance zur Optimierung. Eine Umstellung etablierter HPLC- Methoden kann sich unter Berücksichtigung wichtiger HPLC-Einflussparameter vorteilhaft auf die geforderten Ansprüche auswirken. Zuverlässige Analysendaten helfen dabei, eine gleichbleibende Produktqualität zu gewährleisten, worauf der Hersteller, zuallererst aber der Patient, angewiesen ist. Am Beispiel von Clindamycinphosphat, einem Wirkstoff aus der Gruppe der Lincosamid- Antibiotika, wird der Methodenübertrag nach Vorgaben der europäischen Pharmakopöe 6.0 [1] demonstriert. Produkte mit dem Wirkstoff Clindamycinphosphat werden besonders bei Penicillin-Unverträglichkeit verschrieben und können in einem weiten Bereich von Erkrankungen wirksam sein, wie z. B. bei Entzündungen der unteren Atemwege, Lungenabszessen, Hautinfektionen, gynäkologischen und abdominalen Infektionen und Knochen- sowie Gelenkentzündungen [2]. Dieses breite Anwendungsspektrum unterstreicht die hohe Relevanz von Clindamycinphosphat als pharmazeutisches Produkt. Laut der europäischen Pharmakopöe wird für die Qualitätskontrolle unter anderem die HPLC-Analytik vorgeschrieben. Um die geforderte Auflösung von 6,0 zwischen den Peaks von Clindamycinphosphat und Clindamycin(hydrochlorid) zu erreichen, benötigen konventionelle HPLC- Methoden bei Einsatz einer 250 mm langen HPLC-Säule, gefüllt mit 5 bzw. 10 µm Partikeln, mehr als 20 Minuten pro Analyse. Für eine Routineanalytik mit hohem Durchsatz ist dieser Zeitaufwand heutzutage nicht mehr angemessen. Mit Hilfe kurzer, leistungsfähiger Trennsäulen und entsprechend angepasster Gerätetechnik für die schnelle HPLC kann die Analyse in ein einem Bruchteil der Zeit und mit deutlich weniger Lösungsmittelbedarf durchgeführt werden. ExperimentellerTeil Herstellung der Standardlösung Alle Standardlösungen wurden entsprechend der europäischen Pharmakopöe [2] mit der mobilen Phase als Lösungsmittel hergestellt, die 36 GIT Spezial Separation 1/2011

37 Methodentransfer Abb. 2: Chromatogramme der Referenzlösung B (Vergleich der Auflösung bei Verwendung verschiedener Säulentypen) Abb. 3: Chromatogramm der Referenzlösung B auf der ausgewählten BlueOrchid C18A Säule und Report zur Referenzlösung B aus 20 % Acetonitril und 80 % Kaliumdihydrogenphosphatpuffer (13,6 g/l, mit Phosphorsäure auf ph 2,5 eingestellt) bestand. Für die Referenzlösung A wurden 75 mg Clindamycinphosphat gelöst und auf 25 ml verdünnt. Für die Referenzlösung B wurden 5 mg Lincomycin und 15 mg Clindamycin in 5 ml der Referenzlösung A gelöst und auf 100 ml verdünnt. Referenzlösung C wurde durch Verdünnen eines Milliliters von Referenzlösung A auf 100 ml hergestellt. Pk # Name Retentionszeit Fläche Auflösung (USP) S/N (ASTM) 1 Solvent 0, ,0 4,5 0,000 3 Imp. A (Lincomycin) 0, ,0 368,0 1,300 5 Clindamycin phopsphate 1, ,1 377,8 0,988 6 Imp. E (Clindamycin) 2, ,9 373,4 1,130 Total Asymmetrie Experimenteller Teil Probenvorbereitung Eine Testlösung wurde hergestellt, indem 75 mg Clindamycinphosphat-Probe inklusive unterschiedlicher Prozessverunreinigungen in der mobilen Phase gelöst und auf 25 ml Nennvolumen aufgefüllt wurde. Ergebnisse Um die geforderte Auflösung zwischen Clindamycinphosphat und Clindamycin zu erreichen, wurde die Methodenausarbeitung mit Hilfe der Referenzlösung B und unterschiedlicher Säulentypen/-längen realisiert. Laut der europäischen Pharmakopöe [2] muss darüber hinaus der Lösungsmittelpeak, der vor Lincomycin eluiert, klar abgetrennt werden. Eine weitere Forderung an die Analytik ist die Peak-Symmetrie. So darf für die Zielsubstanz Clindamycinphosphat ein Wert von 1,5 nicht überschritten werden. Da in der europäischen Pharmakopöe eine Octylsilylphase (C8) vorgeschlagen wird, die gegenüber den stärker verbreiteten Octadecylsilylphasen (C18) deutlich polarer ist, wurde sowohl eine C8-Phase als auch eine polare C18A Phase ausgewählt. Mit den an die Säulendimension angepassten Methodenparametern konnte auf allen drei Säulen eine Basislinientrennung der Zielsubstanz und ihrer Verunreinigungen erreicht werden (Abb. 2). Allerdings erreichte die kürzere C8-Säule (50 x 2 mm) mit einer Auflösung von 5,8 zwischen den Peaks von Clindamycinphosphat und Clindamycin unter den gewählten Bedingungen die Vorgabe von 6,0 nicht ganz, wodurch der Einsatz einer längeren 100 x 2 mm C8-Säule erforderlich wurde. Diese Säule erreichte mit einem Wert von 8,4 die höchste Auflösung. Unter konstanten Bedingungen konnte durch die Verwendung einer 100 x 2 mm C18A Säule der beste Kompromiss zwischen Auflösung (6,9) und Geschwindigkeit erreicht werden. Somit wurde die C18A Säule für die nachfolgenden Analysen verwendet. GIT Spezial Separation 1/

38 Methodentransfer Produktionsprobe von Clindamycinphosphat nach den genannten Richtlinien vertretbar. Abbildung 5 zeigt deutlich, dass die verwendete UHPLC-Methodik empfindlich genug ist, um eine Vielzahl unterschiedlicher Produktbegleitstoffe in der vorhandenen Realprobe zu analysieren. Da diese als Einzelstandards nicht vorlagen, konnte keine LOD-Bestimmung durchgeführt werden. Die Robustheit und Reproduzierbarkeit der Analytik wurde anhand von 10 Wiederholungsmessungen der Referenzlösung B berechnet. Die Auswertung der Retentionszeitabweichung ergab für den Clindamycin-Peak mit der längsten Retentionszeit (tr=2,562 min) eine relative Standardabweichung von 0,279 %. Die Peakflächenabweichung für diesen Peak wurde mit 0,474 % bestimmt. Fazit Abb. 4: Chromatogramm der Referenzlösung C mit Report zur Referenzlösung C Pk # Name Retentionszeit Fläche Auflösung (USP) S/N (ASTM) Asymmetrie 1 Solvent 0, ,0 8,7 1,106 2 Clindamycin phopsphate 1, ,0 136,4 0,982 Total Methodenparameter Säule BlueOrchid C18A, 1.8 µm, 100 x 2 mm Eluent A Puffer (13,6 g/l KH2PO4) ph 2,5 eingestellt mit Phosphorsäure Eluent B Acetonitril Gradient isokratisch, 80 % A, 20 % B Flussrate 0,7 ml/min Injektionsvolumen 5 µl Säulentemperatur 30 C Detektion UV bei 210 nm (50 Hz, 10 mm Zelle, 2 µl) Analysenzeit 3 min Die Ergebnisse der Analyse der Referenzlösung C werden in Abbildung 4 und in der angefügten Auswertung gezeigt. Die zur Verfügung gestellte Clindamycinphosphat-Probe wurde analysiert, um Verunreinigungen des pharmazeutischen Wirkstoffes zu quantifizieren. Das resultierende Chromatogramm und die Auswertung sind in Abbildung 5 dargestellt. Als Ausschlusskriterium für die Probe ist definiert, dass jeder zusätzliche Peak in der Flächenauswertung das 2,5fache des Clindamycinphosphat-Peaks in Referenzlösung B nicht überschreiten darf. Der Analysenreport zeigt, dass keine Verunreinigung in der analysierten Probe das kalkulierte Flächenlimit von überschreitet. Der festgelegte Grenzwert für die Summe aller Verunreinigungen darf maximal 4 mal der Fläche des Clindamycinphosphat- Peaks in Referenzlösung B entsprechen und wird mit dem kalkulierten Wert von ebenfalls nicht überschritten. Bei einer zulässigen Vernachlässigung der Peaks, deren Fläche unter dem Limit von 10 % der Fläche des größten Peaks im Chromatogramm von Referenzlösung B liegen, reduzieren sich die kalkulierten Werte für die Produktverunreinigung noch einmal deutlich. Somit ist eine Produktfreigabe der untersuchten Die vorgestellten Ergebnisse präsentieren eine schnelle UHPLC-Methode zur Bestimmung der Reinheit von Clindamycinphosphat. Sie resultiert aus dem erfolgreichen Transfer einer HPLC- zu einer UHPLC-Methode, die quantitativ und präzise ist und eine Reihe nah verwandter Moleküle vom Zielprodukt abtrennen kann. Unter Verwendung des Knauer Platinblue UHPLC Systems und einer BlueOrchid C18A 1.8 µm Säule können die Zielsubstanz Clindamycinphosphat und zwei Hauptverunreinigungen in weniger als drei Minuten erfolgreich getrennt werden, mehr als sechs mal schneller als mit der konventionellen HPLC-Methode. Durch Optimierung der von der europäischen Pharmakopöe definierten Parameter konnte die geforderte Auflösung leicht erreicht werden. Die UHPLC-Methode benötigt nur ¼ des Probenvolumens bei gleichzeitiger Verringerung des Eluentenverbrauchs pro Probe um mehr als 92 %. Falls die von der europäischen Pharmakopöe geforderte hohe Auflösung nicht benötigt wird, kann auf eine kürzere C8-Säule zurückgegriffen werden, wodurch erneut Zeit und Eluent eingespart werden. Wird dagegen an der Octylsilylphase festgehalten, so empfehlen wir den Einsatz einer 100 mm langen Säule, gefüllt mit BlueOrchid C8-Material. Die sehr schnelle Analyse von Clindamycinphosphat und seinen auftretenden Prozessverunreinigungen zeigt wie die Qualitätskontrolle von pharmazeutischen Wirkstoffen vom Übergang von der klassischen HPLC zur UHPLC profitieren kann. Hervorzuheben sind hierbei die deutlich reduzierten Analysenzeiten, die hohe Auflösung trotz kürzerer Säulen, die gesteigerte Empfindlichkeit und der signifikant reduzierte Eluentenverbrauch im Vergleich zu klassischen HPLC Methoden. All diese Fakten illustrieren anschaulich, dass die vorgestellte Methode prädestiniert ist für die On-line Analytik in der Qualitätskontrolle der pharmazeutischen Produktion, in der ein hoher Probendurchsatz selbstverständlich ist. 38 GIT Spezial Separation 1/2011

39 Methodentransfer ERSTE WAHL NEU Abb. 5: Chromatogramm der Probelösung Pk # Name Retentionszeit Fläche Auflösung (USP) 1 Solvent 0, ,8 2 n.n. 0, ,9 S/N (ASTM) 3 Imp. A (Lincomycin) 0, ,0 27,6 1,100 4 n.n. 0, ,8 1,171 5 n.n. 1, ,7 6 n.n. 1, ,7 7 n.n. 1, ,25 0,808 8 n.n. 1, ,8 1,118 9 Clindamycin phopsphate 1, , , n.n. 2, ,1 0, Imp. E (Clindamycin) 2, ,9 22,4 1,251 Total Asymmetrie Kleinzentrifuge EBA 270: Optimale Probenvorbereitung beginnt in der Arztpraxis Die neue EBA 270 ist speziell für die Arztpraxis konzipiert. Sie zentrifugiert Blut- und Urinproben in einem 6-fach-Ausschwingrotor. Dabei liefert sie beste Trennergebnisse und eine horizontale Trennschicht. So sind die Proben optimal für die Analyse vorbereitet. Wir danken Herrn Dr. Christian Langfermann vom Arzneimitteluntersuchungsinstitut-Nord (AMI) für die Bereitstellung der Clindamycin-Standards und -Proben. Autoren: Dr. Silvia Marten, Leitung Abteilung Säulen, Phasen, Applikationen, Knauer Mareike Naguschewski, Abteilung Säulen, Phasen, Applikationen, Knauer Literatur [1] European Pharmacopoeia; 6. Edition (23. Juli 2007), Seiten [2] RxList: The Internet Drug Index, (Recherchedatum: ) K ontakt Dr. Ing. Herbert Knauer GmbH Wissenschaftliche Gerätebau Tel.: Fax: 030 / info@knauer.net Andreas Hettich GmbH & Co.KG D Tuttlingen info@hettichlab.com GIT Spezial Separation 1/

40 Lust auf Chemie MICHAEL GROSS 9 Millionen Fahrräder am Rande des Universums Obskures aus Forschung und Wissenschaft Michael Groß 9 Millionen Fahrräder am Rande des Universums Obskures aus Forschung und Wissenschaft ISBN: Februar S. mit 14 Abb. Gebunden 24,90 Humoresk und mit Esprit geschrieben, versprühen die Texte von Michael Groß den pointierten Humor eines eingeweihten Außenseiters. Seine neueste Sammlung von Querdenkereien kitzelt den Wissen schaftsbetrieb und kompiliert die 100 denkbar unsachlisten Beiträge in einem einzigen Buch. GEORG SCHWEDT Lava, Magma, Sternenstaub Chemie im Inneren von Erde, Mond und Sonne Georg Schwedt Lava, Magma, Sternenstaub ISBN: Februar S. mit 63 Abb. Gebunden 24,90 Chemie im Inneren von Erde, Mond und Sonne Erde und Universum hängen zusammen. Georg Schwedt spannt einen Bogen vom tiefsten Bohrloch bis zur fernsten Galaxie und schildert die Chemie unter der Erdoberfläche ebenso wie die im Kometenschweif. Schauplätze des Geschehens sind sowohl die aktiven Vulkane Südeuropas, als auch der Protonenspeicherring des CERN- Labors in Genf. Das macht Lust auf Wissenschaft. ARNOLD ARNI Grundkurs Chemie I und II Allgemeine, Anorganische und Organische Chemie für Fachunterricht und Selbststudium ISBN: S. Broschur 49,90 Sich im Selbststudium die Grundlagen der Organischen Chemie zu erwerben, kann mühsam sein. Jedoch nicht mit diesem erfolgreichen Lehrbuch! Aufeinander abgestimmte Lerneinheiten und eine Vielzahl von Fragen mit Lösungen so erweitern Sie Schritt für Schritt Ihr Wissen. HEIKE WILL Sei naiv und mach ein Experiment Feodor Lynen Biographie des Münchner Biochemikers und Nobelpreisträgers Heike Will Sei naiv und mach ein Experiment Feodor Lynen ISBN: Februar S. mit 75 Abb. Gebunden 29,90 Biographie des Münchner Biochemikers und Die erste Biographie Nobelpreisträgers des Nobelpreisträgers Feodor Lynen ( ) beleuchtet die vielen Facetten des faszinierenden Menschen und engagierten Forschers: Pionier der modernen Biochemie, diplo matischer Gestalter der internationalen Wissenschaftsszene und bayerisches Urgestein. Ihre Informationsquelle No. 1: Jetzt als Doppelband für nur 49,90! Das offi zielle Buch der GDCh zum IYC 2011 Chemie über den Wolken... und darunter Herausgegeben von Reinhard Zellner und der Gesellschaft Deutscher Chemiker REINHARD ZELLNER und GDCH (Hrsg.) Chemie über den Wolken... und darunter ISBN: April 2011 ca. 180 S. mit 200 Farbabb. Gebunden ca. 29,90 Egal ob Ozonloch, saurer Regen oder Luftverschmutzung wenn das atmosphärische Gleichgewicht gestört ist, sind die Aus wirkungen auch auf der Erdoberfläche deutlich spürbar. Chemie über den Wolken blickt auf die Zusammenhänge und hinterfragt, wie schädlich Treibhausgase und Aerosolpartikel wirklich sind. LUKAS VON HIPPEL und THORSTEN DAUBENFELD Von der Uni ins wahre Leben Zum Karrierestart für Naturwissenschaftler und Ingenieure ISBN: Mai S. mit 2 Abb. Broschur ca. 19,90 Dieser Ratgeber hilft Berufseinsteigern und Mitarbeitern, die aufsteigen wollen, Wissenslücken zu schließen und Fettnäpfchen zu vermeiden _bu

41 Bioseparation Autophosphorylierung von Proteinkinase A Neue Phosphorylierungsstellen und deren Phosphorylierungsgrad Prof. Wolf D. Lehmann, DKFZ Heidelberg Dr. Jörg Seidler, DKFZ Heidelberg In der katalytischen Untereinheit von Proteinkinase A (PKA) wurden mittels 1D-PAGE, In-Gel-Verdau und UPLC-MS/MS sechs neue Autophosphorylierungsstellen entdeckt. Außerdem wurde der Phosphorylierungsgrad an diesen Stellen durch eine Standardfreie, signalintensitätsbasierte Methode mit folgenden Merkmalen bestimmt: (i) Verwendung von drei Proteasen, (ii) Berücksichtigung der Interaktion zwischen Phosphorylierung und Proteolyse sowie (iii) Zusatz von Citrat zur Verbesserung der Detektion von Phosphopeptiden mittels UPLC. Bändermodell der PKA-Cα Kristallstruktur α Helices (violett), ß-Faltblätter (türkis). Reste die phosphoryliert werden können sind farblich hervorgehoben: etablierte Phosphorylierungsstellen (rot); neu entdeckte Phosphorylierungsstellen (gelb; Seidler 2009); (PDB: 1APM visualisiert via VMD ; Susanne Hanke, Abteilung Biochemie, Universität Kassel) Abb. 1: Die PKA Cα-Sequenz (P00517) mit hervorgehobenen Autophosphorylierungsstellen gemäß UPLC-MS/MS-Bestimmung. Die 4 bekannten Stellen sind blau abgebildet, die 6 neu entdeckten in rot. GIT Spezial Separation 1/

42 Bioseparation Abb. 2: Modell zur Erklärung der Adsorption phosphorylierter Peptide an der stationären Phase einer LC-Säule. Das System besteht aus den 3 Komponenten (i) Säulenoberfläche (ii) immobilisierte Metallionen und (iii) Phosphopeptide. Histidin-Gruppen oder Säure-Gruppen enthaltende Peptide können auf ähnliche Weise mit Oberflächen-immobilisierten multivalenten Metallionen interagieren. [3] Abb. 3: Extrahierte Ionenchromatogramme von Peptiden enthaltend ps259 mit den Peakflächen a-d, die Trypsin-generierte Peptide aufweisen, e+f, die AspN-generierte Peptide zeigen, sowie g+h mit Chymotrypsin-generierten Peptiden. Bei Einsatz dieser drei Proteasen wurde ein auf Ionenintensitäten basierender Phosphorylierungsgrad von 26 %, 24 % bzw. 22 % festgestellt. [6] tem aufzulösen und dadurch die Wiederfindungsrate von Phosphopeptiden zu erhöhen, wurden den Proben Metallionen-mobilisierende Liganden hinzugefügt. Dies erwies sich als vielversprechende Strategie [2]. Die Abkürzung mimlc (metal ion-mobilizing LC, Metallionen-mobilisierende Flüssigkeitschromatographie) wurde für LC eingeführt, die unter Zugabe von Metallionenkomplexe-bildenden Probenzusätzen durchgeführt wird [3]. Bei mimlc wird das komplette LC-System einschließlich der stationären Phase von Metallionen befreit. Dadurch wird eine Metallionenvermittelte Adsorption von polaren Analyten wie z. B. Phosphopeptiden minimiert, da adsorbierte Metallionen als Metallionenkomplexe eluiert werden. Schließlich fanden wir drei Metallionenmobilisierende Zusätze zur Steigerung der Wiederfindungsrate phosphorylierter und multiphosphorylierter Peptide insbesondere in subpikomolaren Mengen, und zwar Citrat, EDTA sowie das Tetrapeptid pspspsps. Alle PKA-Analysen wurden daher mit Unterstützung eines Metallionen-mobilisierenden Zusatzes durchgeführt, und zwar mit Citrat. Beim Einsatz von mimlc können die Signalintensitäten phosphorylierter und unmodifizierter Peptide direkt miteinander verglichen werden. Für den standardlosen Ansatz wurden alle Signalintensitäten von, eine bestimmte Stelle enthaltenden Phosphopeptiden und nicht-phosphorylierten Peptiden, die in den verschiedenen Verdauungsexperimenten beobachtet wurden, umfassend berücksichtigt. Außerdem wurden alle Ladungszustände in die Auswertung mit aufgenommen [Abb. 3]. Die Daten zeigen, dass sich die 10 PKA- Cα-Autophosphorylierungsstellen in vier eindeutige Gruppen einteilen lassen, die eine Korrelation zwischen den gemessenen Phosphorylierungsgraden und den Motiven um die phosphorylierten Stellen herum [Abb. 4] herstellen lassen. Bekannte Phosphorylierungsstellen waren fast vollständig phosphoryliert. Neue Phosphorylierungsstellen in einem PKA-Konsensusmotiv (R/K-X-X-pS/T) werden zu ca. 25 % phosphoryliert, Phosphorylierungsstellen, die sich in einem invertierten PKA- Konsensusmotiv befinden, werden auf einem niedrigeren Niveau phosphoryliert, und Stellen in Motiven ohne Ähnlichkeit zum PKA-Konsensusmotiv werden nur marginal phosphoryliert. Ergebnisse PKA ist das wichtigste Kinase-Modell und ist Gegenstand umfangreicher Studien (Überblick in [1]). Für die-katalytische Untereinheit α der PKA sind vier Autophosphorylierungsstellen bekannt, und zwar ps10, ps139, pt197 und ps338. In dieser Studie wurden mittels UPLC-MS/MS sechs neue Autophosphorylierungsstellen entdeckt, nämlich ps14, pt48, ps53, ps212, ps259 und ps325 (Abb. 1). Des Weiteren wurde eine standardfreie Methode zur Einschätzung des Positionsspezifischen Phosphorylierungsgrades entwickelt. Ein Problem bei der Analyse reversibler Proteinphosphorylierung mittels LC-ESI-MS/MS besteht darin, dass bei RP-Säulen häufig niedrige und erratische Wiederfindungsraten von Phosphopeptiden beobachtet werden, insbesondere in Verbindung mit der Analyse von multi-phosphorylierten Peptiden. Dieser Nachteil behindert die direkte Ableitung des stellenspezifischen Phosphorylierungsgrads von unkorrigierten Signalintensitäten. Wir vermuteten, dass die irreversible Adsorption von Metallionen an RP-Säulen (Abb. 2) ein Hauptmechanismus für die unvollständige Wiederfindung von Phosphopeptiden ist. Um das in Abbildung 2 dargestellte Dreikomponentensys- Diskussion Zusammenfassend ist zu sagen, dass die Einschätzung des Phosphorylierungsgrades basierend auf nicht korrigierten Ionenintensitätsverhältnissen (Standard-freie Methode) Daten mit leichter systematischer Unterschätzung liefert [4]. Trotzdem zeichnen sich die erhaltenen Daten durch einen hohen Grad an interner Konsistenz aus. Dadurch lässt sich nachweisen, dass quantitative Daten sogar ohne die Verwendung von isotopenmarkierten Standards, die für jede Stelle individuell generiert werden müssen, erhalten werden können. Diese Standard-freie Methode ist vor kurzem in einer 42 GIT Spezial Separation 1/2011

43 Bioseparation ONLINE! ioannis kounadeas/fotolia.com Abb. 4: In vitro-autophosphorylierungsstellen in der katalytischen Untereinheit α der PKA und ihre Phosphorylierungsgrade. Die Motive linkerhand der phosphorylierten Stellen entsprechen einem klassischen PKA-Konsensusmotiv. Zwei phosphorylierte Stellen zeigen eine Art invertiertes Konsensusmotiv. Stellen mit klassischem Konsensusmotiv weisen Phosphorylierungsgrade von % auf, während die anderen Stellen niedrigere Werte anzeigen. DIE NEUEN GIT LABOR- PORTALE git-labor.de laboratory-journal.com Abb.5: Modell der PKA-Cα Kristallstruktur aus verschiedenen Perspektiven: Reste die phosphoryliert werden können sind farblich hervorgehoben: etablierte Phosphorylierungsstellen (grün); neu entdeckte Phosphorylierungsstellen (gelb; Seidler 2009); Aminosäuren 5-24 des Proteinkinase Inhibitors PKI gebunden an die Substrat-Binde-Tasche der PKA-Cα (orange Helixstruktur). Abb. links: Ansicht von links, Abb. Mitte: Frontansicht, Abb. rechts: Ansicht von rechts. (PDB: 1APM visualisiert via VMD ; Susanne Hanke, Abteilung Biochemie, Universität Kassel). fundamentalen Analyse des Kinase/Substrat-Systems PfCDPK1/PfGAP45 eingesetzt worden[6]. Dadurch konnte z. B. beobachtet werden, dass zwei eng benachbarte Stellen in einer sich gegenseitig ausschließenden Weise phosphoryliert sind. Dieser direkte Ansatz kann auch auf die relative Quantifizierung anderer post-translationaler Modifizierungen ausgeweitet werden. Methoden His-tag markierte Wildtyp-PKA Cα wurde in E. coli BL21(DE3) exprimiert und mittels Ni-IMAC und 1D-PAGE gereinigt. In-Gel-Verdau durch Trypsin, AspN und Chymotrypsin erfolgte in zuvor beschriebener Weise [7]. UPLC-MS/MS wurde in einem Waters-System (nanoacquity, QTOF2) unter Zugabe von 50 mmol Citrat durchgeführt [2]. Literatur [1] Gesellchen F. et al.: Biochim Biophys Acta Proteins & Proteomics 1764, (2006) [2] Winter D. et al.: J Proteome Res 8, (2009) [3] Seidler J. et al.: Amino Acids, DOI /s (2010) [4] Steen H. et al.: Mol Cell Proteomics 5, (2006) [5] Winter D. et al.: Anal Biochem 393, (2009) [6] Seidler J. et al.: Anal Bionanal Chem 395, (2009) [7] Shevchenko A. et al.: Nat Protoc 1, (2006) K ontakt Joerg Seidler Wolf D. Lehmann Molekulare Strukturanalyse Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg Tel: Fax: wolf.lehmann@dkfz.de

44 Kopplungstechnik Neue Methoden für die Rückstandsanalytik mit GC-MS/MS Untersuchung von Hopfen Die Anforderungen an die heutige Rückstandsanalytik steigen in zunehmendem Maße. Nachweisgrenzen werden immer weiter gesenkt, Ergebnisse immer schneller und mit entsprechender Sicherheit erwartet. Dabei wird die Probenvorbereitung immer weiter vereinfacht. Früher wurden Proben unter Verwendung klassischer GC-Methoden mehrfach vermessen. Heutige Multikomponentenmethoden müssen in der Lage sein, z. B Pestizide in einem Analysenlauf zu erfassen. Fanny Großmann, Landesuntersuchungsanstalt für das Gesundheits- und Veterinärwesen Dresden Joachim Gummersbach, Thermo Fisher Scientific Dr. Martin Kaltenecker, Thermo Fisher Scientific Abb. 1: Targetkomponenten-Analytik auf einem Single-Quadrupol im SIM-Modus (obere 3 Spuren) SRM-Modus auf einem TSQ Triple-Quadrupol (untere 2 Spuren) in der gleichen Hopfenmatrix Rainer Sturm / Pixelio.de Im folgenden Artikel wird beschrieben mit welchen Techniken man diese Anforderungen erfüllen kann. Um beispielsweise eine maximale Anzahl an Pestiziden in stark matrixhaltigen Proben in einem Analysenlauf erfassen zu können, empfiehlt sich der Einsatz eines GC-MS/MS Systems. Durch die immer einfachere Probenvorbereitung verbleibt deutlich mehr Matrix in den zu messenden Proben als z. B. bei der Aufarbeitung nach der klassischen S19-Methode. Dies führt zwangsläufig zu mehr Interferenzen und erschwert eine sichere Identifizierung der Analyten oder macht sie gar unmöglich. Eine Lösung dieses Problems ist der Einsatz eines Triple- Quadrupol Systems. Nebenstehend (Abb. 1) der Vergleich einer Pestizidanalyse gemessen auf einem Single-Quadrupol und einem Triple- Quadrupol. 44 GIT Spezial Separation 1/2011

45 Kopplungstechnik Abb. 2: B.E.S.T. PTV mit Backflush off Deutlich zu sehen ist, dass die Matrix in den MS/MS Spuren ausgeblendet wurde. Der Analyt ist dadurch sicherer, einfacher und mit deutlich besserer Nachweisgrenze zu detektieren. Dadurch werden falsch positive/falsch negative Befunde minimiert. Allerdings ist diese Matrix physisch immer noch vorhanden und beeinträchtigt die Robustheit des Analysensystems. Betroffen hiervon sind insbesondere die Ionenquelle, der Liner und die Trennsäule. Beim Messen großer Probenserien hat sich eine Kombination von desaktiviertem Liner in einem PTV-Injektor und einer Vorsäule, die zurückgespült werden kann (Backflush) als robuste und gute Lösung bewährt. Die Abbildungen 2 und 3 zeigen das Funktionsprinzip des B.E.S.T. PTV-Injektors mit Backflush. Technik Das B.E.S.T. PTV-System mit Backflush besteht aus einer Vorsäule und einer Trennsäule, die über ein Abb. 3: B.E.S.T. PTV mit Backflush on T-Stück miteinander gekoppelt sind. Nach erfolgter Injektion und Start des Temperaturprogramms wandern die Pestizide und die leichtflüchtige Matrix in die Trennsäule, der schwerflüchtige Matrixanteil verbleibt in der Vorsäule. Nach Übergang der letzten zu bestimmenden Komponente in die Trennsäule wird der Backflush eingeschaltet und der Gasfluss in der Vorsäule umgekehrt. Während die Analyten weiter durch die Trennsäule wandern, wird der schwerflüchtige Matrixanteil rückwärts über den Injektor aus dem System gespült. Die Vorteile, die durch den Einsatz eines B.E.S.T. PTV Injektors mit Backflush beim Nachweis von Pestiziden in einer Eiermatrix erzielt werden, sind in der Abbildung 4 und 5 zu erkennen. Abb. 4: Analyse ohne Backflush Abb. 5: Analyse mit Backflush GIT Spezial Separation 1/

46 Kopplungstechnik Abb. 6: Ausschnitt aus einer zeitgesteuerten Messmethode (Timed-SRM) Methodik Die Abtrennung der hochsiedenden Matrixanteile bringt Vorteile wie Verlängerung der Lebenszeit der Trennsäule, Schutz der Ionenquelle vor Kontaminationen, verbesserte Nachweisgrenzen und Reproduzierbarkeit sowie eineverkürzung der Analysendauer. Neben der beschriebenen Verbesserung der Aufgabetechnik bietet eine über die Retentionszeit gesteuerte Datenerfassung (Timed-SRM) weiteres Optimierungspotential für die Multikomponenten-Analytik. In der klassischen Methodenerstellung werden die Messfenster linear hintereinander angeordnet. Durch diese segmentierte Arbeitsweise wird die zur Verfügung stehende Messzeit mit zunehmender Anzahl der Komponenten pro Segment drastisch reduziert. Dieser Nachteil wird durch Einführung einer über die Retentionszeit gesteuerten Datenerfassung aufgehoben. Dabei wird jeder Komponente ihr individuelles Messfenster abhängig von ihrer Retentionszeit zugeordnet. Diese Messfenster sind nur kurz vor und nach der zugeordneten Retentionszeit aktiv. Das führt zu einer längeren Messzeit pro Komponente und damit zu besseren Nachweisgrenzen (Abb. 6). Fazit Der Einsatz eines Triple-Quadrupol Massenspektrometers mit PTV/Backflush unter Verwendung einer Timed-SRM Methode ermöglicht dem Anwender eine Vielzahl von Pestiziden mit hoher Empfindlichkeit in einem Trennlauf sicher zu quantifizieren. K ontakt Fanny Großmann Landesuntersuchungsanstalt für das Gesundheits-und Veterinärwesen Dresden Dresden Dr. Martin Kaltenecker Joachim Gummersbach Thermo Fisher Scientific GmbH Dreieich Tel.:06241/ Fax: 06103/ martin.kaltenecker@thermofisher.com Produkte Gaschromatograph für Routine und Fast GC Der Dani Master GC ist ein leistungsfähiger GC, der alle Routineaufgabe problemlos meistern kann und eine schnelle und sichere Analytik bei hohem Bedienkomfort gewährleistet. Es kann flexibel und vielseitig ausgestattet werden. Die komplette Detektor-Palette steht zur Verfügung. Das Instrument kann mit drei Injektoren und bis zu drei Detektoren ausgerüstet werden. Es können zwei Kaltaufgabesysteme installiert werden. Alle Bauteile sind auf hohe Geschwindigkeit ausgelegt. Die Detektoren haben eine Datenaufnahmerate von 300 Hz, der Ofen hat eine Heizrate von 140 C/min (bis 500 C) und eine patentierte digitale Druckregelung bis über 800 kpa. Möglich ist dies durch Einbau modernster Elektronik. Hinzu kommt die Verfügbarkeit eines Time of Flight Massenspektrometers, das als massenspezifischer Detektor ausgerüstet werden kann. Dieses Master TOF hat eine sehr hohe Datenakquisitionsrate. Dieser GC ist damit konsequent für den Einsatz als GC für Fast GC konzipiert. Alle Funktionen des Master GC können über ein GC Datensystem gesteuert werden. Ein anwenderfreundliches Interface mit Touchscreen ermöglicht eine intuitive und besonders einfache Bedienung direkt am Gerät. Vertrieb und Kundendienst erfolgen in Deutschland und Österreich durch Axel Semrau. Axel Semrau GmbH & Co. KG Präparative HPLC Das PLC 2020 Personal Purification System von Gilson ist eine kompakte und unabhängige HPLC- Einheit für präparative Trennungen bei Flussraten von 2 bis 100 ml/min. Das PLC 2020 verfügt über einen integrierten Dual-Wellenlängen UV/ VIS Detektor ( nm), einen Fraktionensammler und einen Touch Screen Controller mit intuitiver graphischer Benutzeroberfläche, um die Bedienung komfortabel zu gestalten. Mit dem motorisierten Schaltventil können Proben bis 5 ml aufgegeben werden. Zur Fraktionierung können bis zu drei Racks für Gefäße von 4 bis 40 ml eingesetzt werden. Die Trennmethoden sowie die Fraktionierungs-Parameter werden über den Touch Screen Controller eingegeben. Die Benutzeroberfläche ist einfach und intuitiv innerhalb kurzer Zeit können Substanzen gereinigt werden. Das System ist für Reverse- sowie Normalphasen-Trennungen geeignet. Ein Adapter ermöglicht den Einsatz von Flash-Kartuschen. Zwei HPLC-Pumpen mit Gradientenmischer ermöglichen Gradientenprofile zur effizienten Trennung. Dank eingebautem Lösungsmittelventil können weitere Eluenten eingesetzt werden. Gilson International www gilson.com 46 GIT Spezial Separation 1/2011

47 Produkte Analyse von hochreinen Gasen Der High-Purity Gasanalysator (HPGA), der Firma Ellutia, wurde mit einem hohen Maß an Flexibilität in seiner Konfiguration konzipiert. Dies ermöglicht den Einbau von bis zu zwei Detektoren, mehreren Trennsäulen in einem Säulenofen und bis zu fünf Säulenschaltventilen. Das System beinhaltet ein 6U 19-Zoll- Schrankmodul mit einem zweiten Modul für die Gasversorgungseinheiten. Die Nachweisgrenzen liegen bei ca. 5 ppb für Spurenverunreinigungen unter Einsatz eines gepulsten Entladungsionisations-Detektor (PDID) und im niedrigen Prozentbereich mit dem Wärmeleitfähigkeits-Detektor (WLD). Weitere Detektorkombinationen sind z. B. PDID/FID für die Bestimmung von Kohlenwasserstoffen über einen breiten linearen Bereich. Das System ist mit zwei Analog-Ausgängen für den leichten Anschluss an Integratoren bzw. Datensystemen ausgestattet. Alle Systeme werden mit verschweißten VCR-Verbindungen ausgestattet. Zielkunden für die neuen Systeme sind z. B. Hersteller von hochreinen Gasen, die Elektronikindustrie einschließlich Halbleiter -Hersteller, die Kernkraftindustrie sowie Stahlhersteller und Produzenten von Eichgasmischungen. Pipetten Portfolio erweitert Die Acura manual XS 826 Pipetten wurden zur Erweiterung der Linie Acura manual entwickelt. Die neuen Instrumente weisen, zusätzlich zu den bereits bestehenden Pipetten Familie, folgende Eigenschaften auf: Gewichtsreduktion und sanfte Betätigung aller Funktionen. Eine verbesserte Instrumentenführung durch das Verhältnis Grösse/Länge, welches eine bessere Handkontrolle bei der Dosierung in schmale Mikroröhrchen garantiert. Messtechnisch erhöhte Leistungen durch den deutlich fühlbaren sensiblen Hubanschlag. Die neuen Pipetten sind einzeln oder in einem budgetfreundlichen TwiXS- Pack erhältlich. Dieser beinhaltet zwei Instrumente und einen kostenlosen Regalhalter. Sechs verschiedene Kombinationen stehen zur Auswahl, welche sich über die komplette Volumenreihe von 0.1 bis 1000 μl erstreckt. Socorex Isba S.A. socorex@socorex.com Ellutia Deutschland Funktion erweitert Dionex erweiterte die Funktionen seines ICS-5000 Kapillar-Ionenchromatographie-Systems, einschließlich eines neuen automatischen Probengebers für schnelle und anwenderfreundliche Trennungen. Das System arbeitet mit Laufzeiten von nur 3 5 Minuten. Da ein Lauf nur 0,4 μl/probe benötigt, ist das ICS-5000 System besonders für biologische Applikationen, wie Metabolomics, geeignet. Dionex Corporation GC-TOF-MS-System für hohen Probendurchsatz Beim Dani Master TOF High-Throughput GC-MS handelt es sich um ein kompaktes GC-TOF-MS-System, das die automatisierte Verarbeitung einer großen Anzahl an Proben ermöglicht. In Kombination mit dem automatischen Probengeber können bis zu 160 Proben sequenziell analysiert werden. Die schnelle Aufnahmerate (1000 Spektren) und die lineare Dynamik (105) sorgen zusammen mit einer leistungsfähigen Datenverarbeitung für eine verlässliche Identifizierung von Spurenelementen, auch in komplexen Matrizes. Das Gerät wurde auf der Pittcon 2011 in Atlanta vorgestellt. Dani Instruments SA Chromatography. Spectronomy. Compound Analysis. Your complete range of consumables from one trusted source. STORAGE Deep Well Blocks SBS footprint and ideal for compound library storage Unique round well geometry reduces crystal creep Sealing Products ImpermaMat Sealing Mats Chemically resistant against DMSO and strong solvents Contains no extractables Tight seal eliminates evaporation, yet syringe pierceable Axymat Sealing Mats Inert silicone mats designed for HTS and storage Autoclavable, reusable and syringe pierceable Genuine Axygen Quality and renowned performance. Rely on Axygen s comprehensive line of products and technologies to meet all of your research needs. From the name you know and trust. PlateMax Sealing Film Aluminum, heat-sealing, pressure-sensitive adhesive, tissue culture, and optically clear films available Available in rolls and strips RESERVOIRS SBS footprint and robot compatible Various formats for many applications Flat bottom, diamond bottom and trough GIT Spezial Separation 1/

48 Produkte Innovatives LC-High Resolution TOFMS Ein Komitee von Wissenschaftlern und Fachjournalisten zeichnete auf der Pittcon 2011 den Citius LC-HRT (High Resolution TOFMS) von Leco mit dem angesehenen 2011 Pittcon Editors Gold Award aus. Die Prämierung geht immer an das innovativste Produkt, das bei der jährlichen Pittcon vorgestellt wurde. Das Gerät, basierend auf der patentierten Folded Flight Path (FFP) Technologie, erlaubt die Aufnahme von Full-Scan-Massenspektren mit einer Massenauflösung von und einer Massegenauigkeit besser als 1 ppm bei Datenaufnahmeraten von maximal 200 Spektren/sec. Diese bei einem TOF Massenspektrometer einzigartige Kombination von Leistungsmerkmalen war für die Preisvergabe entscheidend. Weiterhin stellte Leco bei der Pittcon auch ein GC- HRT System vor. Beide Gerätetypen werden in Kürze in dem neuen Europäischen Life Science and Chemical Analysis Centre in Mönchengladbach für Probenmessungen und Gerätevorführungen zur Verfügung stehen. Leco Instrumente GmbH Makromoleküle trennen und charakterisieren Die neue Eclipse DualTec von Wyatt Technology ermöglicht die Separation mittels Hohlfaser-Technologie (HF 5) und asymmetrischer Feldflussfraktionierung (AF 4). Eine neuartige, patentierte Trennkanal-Technologie (EST: easy sealing technology) dient zur einfachen und sicheren Separation größerer Volumina bis zu semi-präparativem Niveau. Dank neuem Injektionsmodus ( on-the-fly ) wird die Probe ohne Unterbrechung des Flusses zusammen mit dem Laufmittel injiziert, was zu weniger Memory-Peaks und höhere Wiederfindungsrate führt. Das Gerät besitzt eine Temperiermöglichkeit. Die Hohlfaser-Technologie eröffnet ein ganzes Feld neuer Anwendungen durch z. B. geringes Totvolumen, niedrige Probenverdünnung oder hohe Empfindlichkeit bei exzellentem Signal-Rauschverhältnis. Vereinfachte Methodenentwicklung bietet die neuen ISIS-Software, da die Probentrennung zunächst in einer computergesteuerten Simulation erfolgt, in der sämtliche Parameter variiert und somit die besten Trennbedingungen ermittelt werden können. Wyatt Technology Europe GmbH Vielseitiger Protein-Tag für Säugetierzellen Mit drei neuen Systemen, dem HaloTag Mammalian Protein Purification System, dem Mammalian Pull-Down System und dem Mammalian Protein Detection and Purification System von Promega lassen sich mit einem Vektorkonstrukt Proteine aus Säugetierzellen aufreinigen, in Pull- Downs einsetzen und lokalisieren. Mit den Fusionsproteinen können Co- Lokalisationen, Real-Time-Imaging, Durchflusszytometrie und Western Blots durchgeführt werden. Das HaloTag System beruht auf der spezifischen kovalenten Bindung des Tags an Resin und Liganden. Für zahlreiche humane oder Maus-Open Reading Frames (ORF) können validierte Klone über das Kazusa DNA Research Institute ( bestellt werden. Neue HPTLC-Applikationen Das Labor des Schweizer DC- Spezialisten CAMAG hat neue Anwendungen für die Kosmetik- und Pharmaindustrie entwickelt. Die Applikationsschriften für Hochleistungsdünnschicht- Chromatographie (HPTLC) stehen auf der Website zum freien Download bereit. Die Kosmetikindustrie entwickelt laufend neue und innovative Hautpflegeprodukte, deren Wirkstoffe einen Einfluss auf die Lipidzusammensetzung der menschlichen Haut haben können. Die schnelle und zuverlässige Analyse der verschiedenen Hautlipide ist deshalb von grossem Interesse. Im firmeneigenen Labor wurden neue Methoden für die quantitative Bestimmung von apolaren Hautlipiden (A-89.1 HPTLC method for the determination of apolar lipids from human skin) sowie für die Bestimmung von Ceramiden (A-90.1 HPTLC method for determination of ceramides from human skin) entwickelt. Eine weitere HPTLC-Methode eignet sich für die Analyse von Phospholipiden (A-91.1 Determination of phospholipids by HPTLC), welche in der Pharmaindustrie wie auch in der Kosmetik- und Lebensmitteltechnologie verbreitet Einsatz finden. Camag Hochauflösende GPC/SEC Säulen Eine hohe Auflösung und damit eine gute Trennung auf der Trennsäule ist die Grundvoraussetzung für eine präzise Analytik. Das gilt gerade auch wenn LC-Kopplungsmethoden wie GPC/SEC-ESI-MS eingesetzt werden, die hochauflösenden Säulen bei kleinem Säulenvolumen erfordern. PSS hat deshalb neue Suprema Säulen mit einer Partikelgröße von 5 µm entwickelt, die eine deutlich bessere Auflösung als Standardmaterialien mit 10 µm Partikelgröße bieten. Speziell im niedermolekularen Molmassenbereich sind damit Trennungen möglich, wie sie bisher nur mit organischen Systemen möglich waren. Eine der neuen 5 µm 100 Å Säulen reicht bereits aus, um z. B. Dextran dxt T1 teilweise in seine Oligomere zu trennen. Mit 10 µm Säulen wird hier nur ein symmetrischer Peak erhalten. Durch die Kombination zweier 5 µm 100 Å Säulen können die niedermolekularen Bestandteile des Dxt T1 sogar fast basisliniensepariert werden. Einsetzbar sind die Säulen für eine Vielzahl wässriger Applikationen im Molmassenbereich zwischen 100 Da bis 5 Millionen Da. Die Säulen stehen in analytischen (Innendurchmesser 8 mm) und mikro (Innendurchmesser 4,6 mm) Dimensionen mit verschiedenen Porositäten zur Verfügung. Linear-Säulen sind ebenfalls erhältlich. PSS Polymer Standards Service GmbH www polymer.de mehr aktuelle Produkte auf git-labor.de Promega GmbH 48 GIT Spezial Separation 1/2011

49 Produkte Isolierung frei zirkulierender DNA Die Isolierung frei zirkulierender DNA aus Plasma gewinnt in der Medizin immer mehr an Bedeutung. So ist es möglich, Darmkrebs anhand des Methylierungsstatus des Biomarkers Septin9 zu erkennen. Des Weiteren kann zur Pränataldiagnostik die fötale DNA aus maternalem Plasma isoliert werden. Neueste Erkenntnisse zeigen, dass bevor ein transplantiertes Organ abgestoßen wird, ein Anstieg an frei zirkulierender DNA des Spenders im Blut des Transplantierten zu beobachten ist. Diese Methoden benötigen ein sehr sensitives Isolierungsverfahren, um die zellfreie DNA aus 1 4 ml Plasma zu extrahieren. Das chemagic Magnetic Separation Module I der Firma chemagen ermöglicht eine verlässliche Isolierung aus bis zu 24 Proben. Chemagen AG Tel.: , info@chemagen.de, Destillation hochmolekularer Verbindungen Die von W.G.Fischer entwickelten hochwirksamen Trennsäulen werden heute von Pilodist nach dem gleichen Prinzip mit moderner Steuer- und Regelungstechnik als Ringspalt- Kolonnen produziert und für die verschiedensten Anwendungen weltweit verkauft. Die Destillationskolonne dient zur Trennung u.a. von Fettalkoholen, höheren Fettsäuren, verschiedenen Riechstoffen, Harzen sowie tierischen und pflanzlichen Ölen und Fetten. Dieser Kolonnentyp ermöglicht die schonende Trennung dieser Substanzen im atmosphärischen oder Vakuumbetrieb ohne die Gefahr der Zersetzung. Die Ringspalt-Kolonnen werden in verschiedenen Trennsäulen-Längen, abhängig von der zu destillierenden Menge und der erforderlichen Trennleistung hergestellt. Hierbei sind Blasen-Einsatzmengen von wenigen ml bis zu mehreren l möglich. Während die Apparaturen für den Mikro-Betrieb in manueller Ausführung angeboten werden, basieren Systeme für den Halb-Mikro-Bereich oder Pilotanlagen auf einer weitgehenden Automatisierung der Steuerung. Pilodist GmbH Tel.: 0228/ , info@pilodist.de, Refraktometer Das SEC-3010 Refraktometer von WGE Dr Bures wurde entwickelt um die hohen Anforderungen moderner SEC/GPC- und HPLC-Applikationen zu erfüllen. Die hohe Empfindlichkeit und das geringe Basislinienrauschen sind das Ergebnis höherer thermischer und elektronischer Stabilität und gewährleisten die Langzeit- Reproduzierbarkeit, die in der GPC gefordert ist. Der Refraktometer ist besonders geeignet, Konzentrationsinformationen in der Kopplung mit molmassensensitiven Detektoren zu ermitteln. Weitere Merkmale des Geräts sind die monochromatische Lichtquelle und das elektronisch programmierbare Thermostat, das die akkurate Einstellung zwischen 5 C über Raumtemperatur und 80 C erlaubt. WGE Dr Bures GmbH & Co KG Tel.: 03322/ , admin@wge-dr-bures.de, Punkt und Peak Zum zweiten Mal erscheint die Broschüre Punkt Omnilab-Aktionen und mehr. Auf 32 Seiten zeigt Omnilab neben Angeboten aus dem aktuellen Lieferprogramm zusätzlich Informationen aus dem Unternehmen sowie Messe- und Veranstaltungstermine. Erstmalig liegt die Broschüre Peak bei sie zeigt alles rund um Chromatographie mit einem kompakten Überblick über Neuheiten, Topseller, Aktionen und Informationen. Omnilab Tel.: 0421/ , info@omnilab.de, GIT Spezial Separation 1/

50 Welcome to Basel International Symposium for High-Performance Thin-Layer Chromatography HPTLC BASEL (Switzerland), 06 th 08 th July 2011 Media partner:

51 Index Büchi Labortechnik 28, Beilage Kraeber 37 SIM Scientific Instruments Manufacturer 5 Camag 21, 48 Leco Instrumente 31, 48 Socorex Isba 47 Chemagen 29, 49 Dr. A. Maisch 49 Thermo Fisher Scientific 44 Corning BV Life Sciences 47 Merck Millipore Corporation 30 Unicam Chromatography Dt. 27, 47 Dani Instruments 47 Metrohm 22, 2. US Univers. Heidelberg 41 Dionex (Europe) Management 32, 47 Omnilab 49 Univers. of Ferrara 8 DKI Dt. Kunststoff- Inst. 12 Phenomenex Deutschland 6, Titelseite Gilson International 46 Pilodist 49 VWR International 3, 5 Andreas Hettich 39 Promega 48 Waters 10, 13 IGV Inst. f. Getreideverarb. 25 PSS Polymer Standards Service 17, 48 WGE Dr. Bures 49 Infolabel Filter Spares Service 9 Axel Semrau 34, 46 Wyatt Technology Europe 48 Dr. Ing. H. Knauer Wissenschaftliche Gerätebau 19, 36 Shimadzu Europa 15 Zweckverb. Landeswasserversorgung 18 Impressum Herausgeber GIT VERLAG Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA Geschäftsführung Christopher J. Dicks, Bijan Ghawami Managing Director Dr. Michael Schön Anzeigenleitung Dr. Katja Habermüller Tel.: 06151/ katja-carola.habermueller@wiley.com Redaktion Dr. Martin Friedrich (Leitung) Tel.: 06151/ m.friedrich@wiley.com Dr. Arne Kusserow (Chefredakteur) Tel.: 06151/ a.kusserow@wiley.com Dr. Anja Gaugel Tel.: 06151/ a.gaugel@wiley.com Tina Schneider (Assistenz) Tel.: 06151/ tina.schneider@wiley.com Redaktion/Verkauf Oliver Gerber Tel.: 06151/ oliver.gerber@wiley.com Dr. Stefanie Krauth Tel.: 06151/ stefanie.krauth@wiley.com Bettina Willnow Tel.: 06151/ bettina.willnow@wiley.com Andreas Zimmer Tel.: 06151/ andreas.zimmer@wiley.com Herstellung Christiane Potthast Kerstin Kunkel (Anzeigen) Andreas Kettenbach (Layout) Ramona Rehbein (Litho) Elke Palzer (Titelgestaltung) Sonderdrucke Dr. Stefanie Krauth Tel.: 06151/ stefanie.krauth@wiley.com Wissenschaftlicher Beirat Prof. Dr. R. van Eldik, Erlangen/Nürnberg Prof. Dr. H. P. Latscha, Heidelberg Prof. Dr. K. K. Unger, Mainz GIT VERLAG Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA Rößlerstraße Darmstadt Tel.: 06151/ Fax: 06151/ info@gitverlag.com Bankkonten Commerzbank AG, Darmstadt Konto Nr.: , BLZ: Jahrgang erscheinen 12 Ausgaben von GIT Labor-Fachzeitschrift plus 1 Sonderausgabe GIT Spezial Separation und 2 Sonderausgaben "BIOforum" Druckauflage: (IVW-geprüft, 2. Quartal 2010) Einzelheft 13,50 zzgl. MwSt. und Porto Schüler und Studenten erhalten unter Vorlage einer gültigen Bescheinigung 50 % Rabatt. Abonnementbestellungen gelten bis auf Widerruf; Kündigungen 6 Wochen vor Jahresende. Abonnementbestellungen können innerhalb einer Woche schriftlich widerrufen werden, Versandreklamationen sind nur innerhalb von vier Wochen nach Erscheinen möglich. Originalarbeiten: Die namentlich gekennzeichneten Beiträge stehen in der Verantwortung des Autors. Nachdruck, auch auszugsweise, nur mit Genehmigung der Redaktion und mit Quellenangabe gestattet. Für unaufgefordert eingesandte Manuskripte und Abbildungen übernimmt der Verlag keine Haftung. Dem Verlag ist das ausschließliche, räumlich, zeitlich und inhaltlich eingeschränkte Recht eingeräumt, das Werk/den redaktionellen Beitrag in unveränderter Form oder bearbeiteter Form für alle Zwecke beliebig oft selbst zu nutzen oder Unternehmen, zu denen gesellschaftsrechtliche Beteiligungen bestehen, so wie Dritten zur Nutzung übertragen. Dieses Nutzungsrecht bezieht sich sowohl auf Print- wie elektronische Medien unter Einschluss des Internets wie auch auf Datenbanken/Datenträgern aller Art. Alle etwaig in dieser Ausgabe genannten und/oder gezeigten Namen, Bezeichnungen oder Zeichen können Marken oder einge tragene Marken ihrer jeweiligen Eigentümer sein. Druck pva, Druck und Medien, Landau Printed in Germany ISSN

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