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1 6 Materialien Seite Materialien 6.1 Chemikalien [α- 32 P]-ATP Hartman analytic [γ- 32 P]-ATP Hartman analytic 2-(N-cyclohexylamino)ethansulfonsäure (CHES) 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) 2 -Desoxyadenosin-5 -triphosphat, Natriumsalz (datp) Sigma 2 -Desoxycytidin-5 -triphosphat Natriumsalz (dctp) Sigma 2 -Desoxyguanosin-5 -triphosphat Natriumsalz (dgtp) Sigma 2 -Desoxythymidin-5 -triphosphat Natriumsalz (dttp) Sigma 3-[N-Morpholino]propansulfonsäure (MOPS) 5-[ 32 P]-pCp Hartman analytic Acrylamid/Bisacrylamid (19:1) Adenosin Sigma Adenosin-5 -diphosphat Natriumsalz (ADP) Adenosin-5 -triphosphat Natriumsalz (ATP) Ammoniumpersulfat Ammoniumsulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ) Ampicillin Roche Borsäure (B(OH) 3 ) Calciumchlorid (CaCl 2 ) Sigma Chloroform (CHCl 3 ) Cytidin-5 -triphosphat Natriumsalz (CTP) Dikaliumhydrogenphosphat (K 2 HPO 4 ) Dithiothreitol (DTT) Sigma Essigsäure Ethanol Ethidiumbromid Formaldehyd Formamid (destilliert und deionisiert) Sigma G418 Roche Glukosamin-HCl Fluka Glukose Sigma Glyzerin Sigma Guanosin Sigma Guanosin-5 -triphosphat Natriumsalz (GTP) Roche Hämin Sigma Harnstoff Hygromycin Roche Isoamylalkohol Kaliumchlorid (KCl) L-Alanin Fluka L-Arginin Fluka L-Glutamin Sigma L-Methionin Fluka Low melting Agarose (Type VII) Sigma L-Phenylalanin Fluka

2 6 Materialien Seite 86 L-Prolin L-Serin L-Taurin L-Threonin L-Tyrosin Magnesiumchlorid (MgCl 2 ) Medium 199 MEM MEM-Aminosäuren ohne Glutamin (50x) MEM-nicht essentielle Aminosäuren ohne L-Glutamin (100x) Methanol N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin (TEMED) N-2-Hydroxylethylpiperazin-N -2-Ethansulfonsäure (HEPES) NaCl NaHCO 3 NaOH Natriumacetat Natriumcitrat Natriumethylendiamintetraacetat (Na 2 EDTA) Natriumpyruvat Penicillin/Streptomycin-Stammlösung Phenol (äquilibriert mit TE, ph 7.5) Phleomycin Polyethylenglykol (PEG) Rotiszint Saccharose Spermidin Tris(Hydroxylmethyl)-aminoethan (Tris) Triton X-100 Uridin-5 -triphosphat Natriumsalz (UTP) Vitamin-Mix (100x) Fluka Fluka Fluka Fluka Fluka Gibco BRL Gibco BRL Gibco BRL Gibco BRL Merck Gibco BRL Gibco BRL Gibco BRL Roche Roche Gibco BRL 6.2 Verbrauchsmaterialien Elektroporationskuvetten (Abstand 0,2 cm und 0,4 cm) Nitrocellulosefilter (0,22 µm, 0,45 µm) Nylonmembran, ungeladen (QIABRANE) Sephadex G-50 (Fine) Whatman-Papier 3MM Bio-Rad Millipore Qiagen Sigma Whatman 6.3 Farbstoffe Bromphenolblau Coomassie Brilliant Blue R250 Methylenblau SYBR -Green II Xylencyanol Merck Merck Molecular Probes Merck

3 6 Materialien Seite Enzyme und Inhibitoren Enzyme Alkalische Phosphatase (aus Kälberdarm) DNaseI Restriktionsendonukleasen RNaseT1 S1 Nuklease T4-DNA-Ligase T4-Polynukleotidkinase T4-RNA-Ligase Taq-DNA-Polymerase Roche Fermentas Roche, Fermentas Fermentas Fermentas Fermentas Fermentas Fermentas Invitrogen RNase-/Protease-Inhibitoren Leupeptin Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) Rinder Trypsininhibitor RNasin (RNase-Inhibitor) Trypsininhibitor Roche Sigma Roche Promega Roche 6.5 Standardpuffer und Nährmedien Puffer TE (ph 7,5; Tris/EDTA): 10 mm Tris-HCl (ph 7,5), 1 mm Na 2 EDTA TBE (ph 8,3; Tris/Borat/EDTA): 90 mm Tris (ph 8,3), 90 mm B(OH) 3, 2 mm Na 2 EDTA. Cytomix: 25 mm HEPES (ph 7,6), 10 mm K 2 HPO 4, 120 mm KCl, 0,15 mm CaCl 2, 5 mm MgCl 2, 2 mm Na 2 EDTA. Die Lösung wurde steril filtriert (Nitrocellulosefilter, Porendurchmesser 0,22 µm) Nährmedien Bakterienmedien LB-Medium: 1% (w/v) Bacto-Trypton, 0,5% (w/v) Bacto-Yeast-Extract; 1% (w/v) NaCl. Der ph wurde mit NaOH auf 7,0 eingestellt und für Festmedium 0,15% (w/v) Bacto-Agar zugegeben. Fest- und Flüssigmedien wurden autoklaviert. SOC-Medium: 2% (w/v) Bacto-Trypton, 0.5% (w/v) Bacto-Yeast-Extract, 0,5% (w/v) NaCl, 20 mm Glukose. Das Medium wurde über einen Nitrocellulosefilter (Porendurchmesser 0,22 µm) steril filtriert. GYT-Medium: 10% (v/v) Glyzerin, 0,125% (w/v) Bacto-Yeast-Extract, 0,25% (w/v) Bacto-Trypton. Sterilisation erfolgte wie für SOC-Medium.

4 6 Materialien Seite Trypanosomenmedien SDM79-Medium [Semi Defined Medium (139)]: 7 g MEM, 2 g Medium 199, 1 g Glukose, 8 g HEPES, 5 g MOPS, 2 g NaHCO 3, 100 mg Natriumpyruvat, 200 mg L-Alanin, 100 mg L-Arginin, 300 mg L-Glutamin, 70 mg L-Methionin, 80 mg L-Phenylalanin, 600 mg L-Prolin, 60 mg L-Serin, 160 mg L-Taurin, 350 mg L-Threonin, 100 mg L-Tyrosin, 10 mg Adenosin, 10 mg Guanosin, 50 mg Glukosamin-HCl, 10 ml Vitamin-Mix (100x), 8 ml MEM-Aminosäuren ohne Glutamin (50x), 6 ml MEM-nichtessentielle Aminosäuren ohne L-Glutamin (100x). Der ph wurde mit NaOH auf 7,3 eingestellt und die Lösung steril filtriert (Nitrocellulosefilter, Porendurchmesser 0,22 µm). Es wurden 3 ml Hämin-Stammlösung (2,5 mg/ml in 50 mm NaOH; steril filtriert) und 5 ml Penicillin/Streptomycin-Stammlösung (Endkonzentration: je 50 U/mL) zugegeben. Die Lagerung des Mediums erfolgte bei 4 C. Unmittelbar vor Gebrauch wurde das Medium mit hitzeinaktiviertem (30 min, 55 C) fötalem Kälberserum (FCS) supplementiert. SDM79-Agarose: 6,5% (w/v) low-melting Agarose wurde in deionisiertem Wasser autoklaviert und auf 45 C 50 C abgekühlt. SDM79 Medium mit 7,5 mg/ml Hämin und 20% (v/v) fötales Kälberserum supplementiert, steril filtriert (Nitrocellulosefilter, Porendurchmesser 0,22 µm) und auf 45 C - 50 C erhitzt. Für die Herstellung des Festmediums wurde 1/10 Volumen der Agaroselösung mit 9/10 Volumen SDM79-Medium (Penicillin/Streptomycin und weitere Antibiotika wurden je nach Resistenzmarker kurz vorher supplementiert; Konzentrationen siehe oben und unter ) vermischt und in Kunststoffpetrischalen überführt. Nach Gelieren der Agarose wurden die Platten bei 4 C inkubiert. 6.6 Zelllinien und Plasmidvektoren E. coli Bakterienstämme DH5α GM1674 Genotyp: supe44 lacu169 (Φ80 lacz M15) hsdr17 reca1 gyra96 thi-1 rela1; (140) Genotyp: F' F-lacI q M15 pro + / dam-3 dcm-6 (lac-pro)xiii tsx-78 supe44 galk2 galt22 thi-1; (141) Trypanosomenstämme Trypanosoma brucei brucei Zelllinie TREU 427 (142), prozyklische Form Trypanosoma brucei brucei Zelllinie (116), prozyklische Form Plasmidvektoren pbluescript II SK(+) Stratagene pfat B Ngo et al. [1998, (87)] plew82 Wirtz et al. [1998, (130)] ptimer Clontech pzjm Wang et al. [2000, (118)] 6.7 Längen- und Größenstandards Gene Ruler DNA-ladder Mix (DNA-Standard) Fermentas SDS-PAGE Broad Range (Protein-Standard) Bio-Rad 1 kb RNA-ladder (RNA-Standard) Gibco BRL

5 6 Materialien Seite 89 HWW-Gelfiltration Calibration Mix (Proteinstandard) LWW Gelfiltration Calibration Mix (Proteinstandard) Amersham Amersham 6.8 Oligonukleotide Oligodesoxyribonukleotide #328 AAAAAGCTTATGGTGCGCTCCTCCGGAAC #329 AAAACTCGAGTTACAGGAACAGGTGGTGGCG #370 ACCTGATTAATACGACTCACTATAGGGAG #372 AAGCTTATGGTGCGCTCCTCCAAGAAC #397 ATACACGAGGAAGCCCTGAAG #398 CCAACAACTACGCTCGTGGCCAC #424 ACCTGATTAATACGACTCACTATAGGGAGCGTGGCCACTAC ACCATTGGTAAAGAAAAAGTTACC #425 CTCGTGGCCACTACACCATTGGTAACTTTTTCTTTACC Oligoribonukleotide #5 UUCUGAGGUCGACGGUAUGAUAUCG #8 CACACAUUAACCGAGGAAUUCGAUAUCAUACCGUC #12 GGAUAUACUAUAACUCCA si329 (antisense) GGUCGACGAUCUCCUUACCAAUU si329 (sense) UUGGUAAGGAGAUCGUCGACCUU si956 (antisense) UUUGGCACAACGUCACCACGGUU si956 (sense) CCGUGGUGACGUUGUGCCAAAUU 6.9 Geräte und Verbrauchsmaterialien Axioskop 2 (Mikroskop) CCD-Kamera (Modell 1.4.1) Centrifuge 5417 R (Tischzentrifuge) Eagle Eye (Transilluminator) Evolution RC (Zentrifuge) FACScalibur (FACS) Fluoro Image Analyzer FLA-5000 (Phosphorimager) FPLC Gene Pulser Polytron Dispergator T3-Thermocycler (PCR-Automat) Ultrospec 3100 pro (Spektrophotometer) UV Stratalinker 1800 Vakuumblotter Zeiss diagnostic instruments inc. Eppendorf Stratagene Sorvall BectonDickinson FujiFilm Amersham Bio-Rad Kinematica AG Biometra Amersham Stratagene Appligene

6 6 Materialien Seite Computersoftware EMBOSS Excel 2003 GCG Wisconsin Package Illustrator 11.0 Image Gauge 3.41 IPLab 3.6 MacPlasmap 3.0 Photoshop 8.0 Word 2003 European Molecular Biology Open Software Suite Microsoft Adobe FujiFilm Scanalytics Inc. CGC Scientific Inc. Adobe Microsoft

7 7 Methoden Seite Methoden 7.1 Mikrobiologische Methoden Bakteriologische Arbeiten Kultivierung von Bakterien Bakterienkulturen wurden unter sterilen Bedingungen in Erlenmeyerkolben angezogen. Dafür wurden Einzelkulturen von Festmedien oder Zellen aus Dauerkulturen ( ) in LB-Medium überimpft und bei 37 C unter guter Belüftung h inkubiert. Einzelkolonien wurden auf Festmedien in Kunststoff-Petrischalen ausgestrichen und h bei 37 C inkubiert. Im Fall einer Resistenzselektion wurde Ampicillin (50 µg/ml) supplementiert. Wachstumskurven wurden durch Trübungsmessung bei 600 nm verfolgt Konservierung von Bakterien Für Dauerkulturen wurden 500 µl einer Bakterienkultur ( ) in der stationären Wachstumsphase mit 500 µl Glyzerin (87%, v/v) unter sterilen Bedingungen vermischt und 1 h auf Eis inkubiert. Anschließend wurde die Dauerkultur bei -70 C aufbewahrt Herstellen transformationskompetenter Bakterienzellen Die Herstellung transformationskompetenter Bakterien erfolgte nach Sambrook et al. [2001, (143)]. E. coli-zellen des Stammes DH5α wurden in LB-Medium anzogen ( ) und nach Erreichen einer optischen Dichte (OD 600 mit λ=600 nm) von 0,3-0,4 für min auf Eis inkubiert. Alle weiteren Schritte erfolgten bei 4 C. Nach der Sedimentation (15 min/1000 g) wurden die Zellen in gleichem Volumen deionisiertem Wasser resuspendiert. Nach zweimaligem Waschen des Zellsedimentes mit 0,5 Volumen 10% (v/v) Glyzerin wurden die Zellen in GYT-Medium resuspendiert, so dass die Zelldichte 2, Zellen/mL entsprach (1 OD 600 2, Zellen/mL). Jeweils 40 µl Zellsuspension wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70 C aufbewahrt Transformation von E. coli Plasmid-DNA (10 pg - 25 ng, vgl ) bzw. 2 µl eines Ligationsansatzes ( ) wurden mit 40 µl aufgetauter Zellsuspension kompetenter E. coli-zellen ( ) vermischt und in einer gekühlten Elektroporationskuvette (1 cm² Fläche, 2 mm Elektrodenabstand) einem elektrischen Impuls (2,5 kv/ 25 µf/200 Ω/4 ms τ 6 ms) ausgesetzt. Direkt im Anschluss an die Elektroporation wurden die Zellen in 800 µl SOC-Medium (37 C, 60 min) inkubiert und anschließend auf Festmedium mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert ( ).

8 7 Methoden Seite Parasitologische Arbeiten Kultivierung von Trypanosomenkulturen Es wurden die Prozyklenform der Trypanosoma brucei brucei Zelllinien TREU 427 (142) und (116) in axenischem Medium mit Zelldichten von Zellen/mL kultiviert. Dazu wurden stationäre Zellkulturen ( Zellen/mL) in vorgewärmtes SDM79-Medium transferiert und Antibiotika je nach Resistenzmarker (G418 Endkonzentration 15 µg/ml, Hygromycin 50 µg/ml, Phleomycin 2,5 µg/ml) zugegeben. Die Inkubation erfolgte in sterilen Zellkulturflaschen oder Erlenmeyerkolben bei 27 C (139) Konservierung von Trypanosomen-Stammkulturen Logarithmisch wachsende Zellen ( Zellen/mL) wurden mit fötalem Kälberserum (Endkonzentration 20%, v/v) und Glyzerin (10%, v/v) vermischt und die Temperatur in zwei Schritten abgesenkt: auf Eis (60 min) und anschließend -20 C (2 h bis 12 h). Die Lagerung erfolgte bei -80 C oder in flüssigem Stickstoff. Für die erneute Kultivierung wurden die Zellen zunächst bei Raumtemperatur aufgetaut und in einer 1:5 Verdünnung in SDM79 Medium mit 20% (v/v) fötalem Kälberserum kultiviert ( ) Herstellung klonaler Trypanosomen-Zelllinien Die Klonierung der prozyklischen Trypanosomen erfolgte gemäß Carruthers et al. [1992, (144)] auf SDM79-Agarose. Dazu wurden 100 µl einer Flüssigkultur mit Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase ( Zellen/mL) auf SDM79-Agarose ausgestrichen und 5 7 Tage bei 27 C inkubiert. Für die Herstellung einer klonalen Zelllinie wurden die Zellen einer Kolonie mit Hilfe einer sterilen Pipettenspitze in frisches SDM79-Medium mit 20% (v/v) fötalem Kälberserum transferiert. Die Kultivierung erfolgte gemäß Transfektion von Trypanosomen Folgende prozyklische Trypanosoma brucei brucei Zelllinien wurden für die Transfektionen verwendet: (Transfektion von DNA), prnai-timer (Transfektion von sirna oder dsrna). Für die stabile Integration in den rdna-spacer wurde die Plasmid-DNA vor der Elektroporation mit der Restriktionsendonuklease Not I linearisiert ( ) und mit Ethanol präzipitiert ( ). Alle Schritte bis zu der Elektroporation erfolgten bei 4 C. Trypanosomenzellen wurden in der logarithmischen Wachstumsphase ( Zellen/mL) sedimentiert (1500 g/10 min) und durch zweimaliges Suspendieren und Sedimentieren in 0,5 Volumen eiskaltem Cytomix gewaschen. Nach der Aufnahme des Zellsediments in Cytomix wurde eine Zelldichte von Zellen/mL eingestellt und µg DNA oder RNA kurz vor der Elektroporation mit 10 8 Zellen vermischt. Dieses Gemisch wurde in einer Elektroporationskuvette (4 mm Elektrodenabstand, Fläche 2 cm²) zwei elektrischen Impulsen (1,6 kv/25 µf/24-28 Ω/Zeitkonstante τ: 0,6-0,7 ms) im Abstand von 10 s ausgesetzt und in SDM79-Medium mit 20% (v/v) fötalem Kälberserum transferiert. Die Kultivierung erfolgte gemäß Antibiotika für eine Resistenzselektion wurden erst 18 h nach der Elektroporation

9 7 Methoden Seite 93 zugegeben. Trypanosomenzellen wurden nach der Resistenzselektion wahlweise kloniert ( ) 7.2 Grundlegende Nukleinsäure-Arbeitstechniken Reinigung und Isolierung Extraktion mit organischen Lösungsmitteln Die wässrige Nukleinsäurelösung wurde mit gleichem Volumen äquilibriertem Phenol oder PCI versetzt. Nach Emulgieren der beiden Phasen wurde diese durch Zentrifugation getrennt (2 min/14000 g/rt) und die wässrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Die Extraktion wurde analog mit einem Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) wiederholt und die Nukleinsäurelösung (wässrige Phase) in ein neues Reaktionsgefäß überführt. PCI (Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol): 50% (v/v) Phenol (äquilibriert mit TE ph 7,5), 48% (v/v) Chloroform, 2% (v/v) Isoamylalkohol Fällung von Nukleinsäuren aus wässrigen Lösungen Nukleinsäurelösungen wurden mit 1/9 Volumen 3 M Natriumacetat (ph 4,8) und weiteren 2,2-4 Volumen eiskaltem, absolutem Ethanol gemischt. Nach einer Inkubation bei -20 C (20 min) wurden die Nukleinsäuren sedimentiert (20 min/14000 g/4 C) und mit einem Volumen eiskaltem 70% (v/v) Ethanol gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation (5 min/14000 g/4 C) wurden die Nukleinsäuren in TE (ph 7,5) oder deionisiertem Wasser aufgenommen Gelreinigung von Nukleinsäuren Polyacrylamidgele: RNA-Moleküle wurden in nativen oder denaturierenden Polyacrylamidgelen elektrophoretisch separiert ( ) und durch UV-Löschung oder Autoradiographie detektiert ( ). Die Isolierung der RNA-Fragmente erfolgte durch Ausschneiden des entsprechenden Gelabschnittes. Die RNA wurde durch Inkubation der Gelfragmente in mehr als 5 Volumen TE (ph 7,5) unter ständigem Invertieren (4 h - 16 h/ 20 C - 37 C) eluiert. Die eluierte RNA wurde wie in beschrieben gereinigt und mit Ethanol präzipitiert ( ). Agarosegele: DNA-Moleküle wurden in 1% (w/v) TBE-Agarosegelen elektrophoretisch aufgetrennt ( ). Das Gelfragment mit der DNA-Bande wurde ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß (Volumen ca. 0,5 ml) auf Glaswolle transferiert. Mit einer Kanüle (Durchmesser ca. 0,5 mm) wurde das untere Ende des Reaktionsgefäßes durchstochen und dieses in flüssigem Stickstoff inkubiert (10 min). Nach dem Auftauen des Gelfragmentes wurde das Reaktionsgefäß in einem größeren Reaktionsgefäß (Volumen ca. 1,5 ml) positioniert. Die Elution des DNA-Fragmentes aus dem Gel in das größere Reaktionsgefäß erfolgte durch Zentrifugation (5 min/14000 g/rt). Die DNA wurde anschließend mit Phenol/Chloroform extrahiert ( ) und mit Ethanol gefällt ( ).

10 7 Methoden Seite Entfernung niedermolekularer Verbindungen Für die Entfernung niedermolekularer Substanzen wurde das Prinzip der Gelfiltration auf der Basis unterschiedlicher Säulenmatrizes angewendet. Quervernetztes Dextran (Sephadex G50 Fine): Die Verengung einer Pasteurpipette wurde mit einer Glaskugel (Durchmesser 4 mm) blockiert. Die Pipette wurde mit Puffer-äquilibriertem Säulenmaterial befüllt und die Probe beladen. Moleküle im Ausschlussvolumen wurden zwischen 0,35 und 0,55 Säulenvolumina Puffer eluiert. Die Nukleinsäuren wurden mit Ethanol präzipitiert ( ). Polyacrylamid (Micro-Bio-Spin P6 und P30): Die mit Tris-Puffer (10 mm Tris-HCl, ph 7,4) äquilibierten Säulen wurde zentrifugiert (2 min/1000 g/rt) und der Durchfluss verworfen. Nukleinsäurelösung mit einem Volumen von µl wurde auf die Säulenmatrix aufgetragen und durch Zentrifugation (4 min/1000 g/rt) in ein neues Reaktionsgefäß eluiert Analyse und Detektion von Nukleinsäuren Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren Die Konzentrationbestimmung von Nukleinsäuren in wässrigen Lösungen erfolgte UV-spektroskopisch und basiert auf dem gemittelten Absorptionsmaximum der Basen bei einer Wellenlänge von 260 nm und dem Lambert Beer schen Gesetz A=ε c d (A: Absorption als Quotient der eingestrahlten und transmittierten Intensität; ε: molarer, dekadischer Extinktionskoeffizient; c: molare Konzentration; d: Schichtdicke der absorbierenden Flüssigkeit) Eine Absorption von 1 entspricht dabei einer Massenkonzentration von 50 µg/ml doppelsträngiger DNA, 40 µg/ml einzelsträngiger RNA und 33 µg/ml einzelsträngiger DNA (145). Die Reinheit der Lösungen wurde über ein Absorptionsspektrum im Bereich von 210 bis 350 nm bestimmt. Dabei weisen kleinere Werte als 1,8 für den Quotienten A260nm:A280nm auf Verunreinigungen mit Phenol bzw. Proteinen hin Polyacrylamid-Gelelektrophorese Nukleinsäuren wurden in Polyacrylamidgelen unter denaturierenden und nicht-denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch separiert. Dabei wurden Gele mit Konzentrationen von 6% - 18% (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid (19:1) verwendet. Denaturierende Gelelektrophorese: Die Proben wurden vor dem Auftrag auf das Gel in Auftragspuffer hitzedenaturiert (3 min/95 C) und elektrophoretisch bei konstanter Leistung von 20 W bis 45 W (Geltemperatur: 40 C - 50 C) separiert. Als Größenstandard wurden wahlweise radioaktiv markierte Oligoribonukleotide nach einer alkalischen Hydrolyse ( ) verwendet. Zur gleichmäßigen Wärmeableitung dienten Aluminiumplatten. Die Nukleinsäuren

11 7 Methoden Seite 95 wurden nach der Auftrennung mit Fixierlösung wahlweise präzipitiert und die Gele auf Whatman-Papier getrocknet. Die Detektion der Nukleinsäuren erfolgte gemäß Abschnitt Nicht-denaturierende Gelelektrophorese: DNA oder RNA wurden in Auftragspuffer aufgenommen und bei konstanter Leistung von 8 W bis 12 W (Geltemperatur: unter 20 C) elektrophoretisch separiert. Nach der Auftrennung wurden die Nukleinsäuren wahlweise mit 10% (v/v) Essigsäure präzipitiert und/oder die Gele auf Whatman-Papier getrocknet. Die Detektion erfolgte gemäß Abschnitt Geldimensionen: 200 mm Breite, 200 mm 400 mm Länge, 0,4 mm bis 1 mm Tiefe. Gelzusammensetzung: TBE, 6% - 18% (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid (19:1), 8M Harnstoff (nur bei denaturierenden Gelen). Die Polymerisation erfolgte mit 0,06% (w/v) Ammoniumpersulfat und 0,06% (v/v) TEMED (N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin). Laufpuffer: TBE Auftragspuffer: TBE, 8 M Harnstoff (nur bei denaturierenden Bedingungen), 60% (v/v) Glyzerin (nur bei nicht-denaturierenden Bedingungen), 0,1% (w/v) Bromphenolblau, 0,1% (w/v) Xylencyanol. Fixierlösung: 10% (v/v) Essigsäure, 20% (v/v) Methanol Agarose-Gelelektrophorese Nicht-denaturierende Gelelektrophorese: Nukleinsäuren wurden in Auftragspuffer aufgenommen und in einem 0,7% - 4% (w/v) TBE-Agarosegel mit 7 V/cm für 0,5 h 3 h elektrophoretisch separiert. Die Detektion der Nukleinsäuren erfolgte mit Hilfe von Ethidiumbromid oder SYBR Green II ( ). Geldimension: 80 mm x 80 mm x 5 mm bis 140 mm x 140 mm x 5 mm Gelherstellung: 0,7% - 4% (w/v) Agarose wurden in TBE suspendiert und kurz aufgekocht. Vor dem Gelieren der Agarose wurde wahlweise Ethidiumbromid (Endkonzentration 0,5 µg/ml) zugegeben. Laufpuffer: TBE Auftragspuffer: TBE, 5% (v/v) Glyzerin, 0,05% (w/v) Xylencyanol, 0,05% (w/v) Bromphenolblau. Denaturierende Gelelektrophorese (143): Nukleinsäuren wurden in Denaturierungspuffer aufgenommen und bei 85 C (10 min) hitzedenaturiert. Nach Abkühlung der Proben auf Eis (10 min) wurden diese mit 1/10 Volumen Gelladepuffer vermischt. Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in einem 2,2 M Formaldehyd-Gel mit 4 5 V/cm für 4 5 h. Die Nukleinsäuren wurden mit Hilfe von Ethidiumbromid gefärbt ( ). Geldimension: 140 mm x 140 mm x 5 mm Laufpuffer: 0,2 M MOPS (ph 7,0), 20 mm Natriumacetat, 10 mm Na 2 EDTA. ph 7 wurde mit NaOH eingestellt und der Puffer über einen Nitrocellulosefilter (Porendurchmesser 0,45 µm) steril filtriert. Die Inkubation erfolgte unter Lichtabschluss bei RT. Gelzusammensetzung: 1,5% (w/v) Agarose in Laufpuffer und 2,2 M Formaldehyd. Gelherstellung: Die Agarose wurde in 0,72 Volumen deionisiertem Wasser aufgekocht und vor dem Gelieren mit 0,1 Volumen 10xLaufpuffer und 0,18 Volumen Formaldehyd vermischt. Denaturierungspuffer: Laufpuffer, 2,2 M Formaldehyd, 50% (v/v) Formamid, Ethidiumbromid (10 µg/ml).

12 7 Methoden Seite 96 Gelladepuffer: 50% (v/v) Glyzerin, 10 mm Na 2 EDTA, 0,25% (w/v) Bromphenolblau, 0,25% (w/v) Xylencyanol Detektion von Nukleinsäuren Ethidiumbromid: Die Detektion von Nukleinsäuren in Agarosegelen ( ) erfolgte durch Bestrahlung mit UV-Licht (Wellenlänge λ=254 nm). Dabei werden Ethidiumbromid-Moleküle, die in die gestapelten Basen von DNA oder RNA interkalieren, zu einer sichtbaren Fluoreszenz (λ=560 nm) angeregt. Die hohe Sensitivität dieser Nachweismethode ermöglicht eine Detektion von bis zu 10 ng DNA (146). SYBR Green II: RNA wurde in Agarose- oder Polyacrylamidgelen ( ) mit Hilfe des sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs SYBR Green II (Exzitationsmaximum: 492 nm, Emissionsmaximum 513 nm) detektiert. Dazu wurden die Gele 15 min in Färbelösung inkubiert. Die Detektion der RNA erfolgte mit dem Fluoro Image Analyzer FLA-5000 (FujiFilm) durch Anregung des Farbstoffes bei einer Wellenlänge von 473 nm. Die Fluoreszenz wurde über einen monochromatischen Filter (λ=510 nm) mit Hilfe eines Photomultipliers detektiert und in ein elektrisches Signal umgewandelt. Die Visualisierung und Evaluation der Signale (7.7.3) erfolgte unter Anwendung der Software Image Gauge 3.41 (FujiFilm). Färbelösung: SYBR Green II (Molecular Probes) wurde 1:10000 in TBE verdünnt. UV-Löschung: Größere Mengen von Nukleinsäuren (mehr als 1 µg/bande) in Polyacrylamidgelen ( ) können durch UV-Löschung detektiert werden. Dazu wurde das Polyacrylamidgel in einer Kunststofffolie auf eine Kieselgelplatte transferiert, die mit einem Fluoreszenzfarbstoff beschichtet ist. Durch Bestrahlung mit UV-Licht (Wellenlänge λ=254 nm) erschienen die Nukleinsäurebanden als Schatten auf der Kieselgelplatte. Autoradiographie: Nach der Auftrennung radioaktiv markierter Nukleinsäuren in Polyacylamidgelen ( ) wurden die Gele auf Whatman-Papier transferiert, mit einer Kunststofffolie bedeckt und vakuumgetrocknet. Die getrockneten Gele wurden mit einer Imaging Plate (IP, FujiFilm) in einer Filmkassette inkubiert (RT/30 min 3 Tage). Das Auslesen und die Auswertung der IP erfolgten wie bereits für SYBR Green II beschrieben, jedoch mit abweichenden Wellenlängen bei der Exzitation (λ=632 nm) und der Detektion (λ=390 nm). Im Fall einer Gelelution wurde das Gel gegen röntgensensitive Filme in einer Filmkassette exponiert (RT/5-30 min). Die Entwicklung erfolgte in einem chemischen Automaten Szintillationsmessung Lösungen mit radioaktiv markierten Nukleinsäuren wurden mit mindestens 100-fachem Volumen an Szintillationsflüssigkeit gemischt. Die Proben wurden maximal 30 Minuten im Szintillationszähler gemessen. Die Messung wurde vorzeitig abgeschlossen, wenn eine Standardabweichung der Messwerte von weniger als 2% erreicht wurde. Der Wert der Hintergrundstrahlung wurde abgezogen und betrug maximal 3% des Messwertes.

13 7 Methoden Seite Kinasierung und Dephosphorylierung von Nukleinsäuren Kinasierung von Nukleinsäuren Das Enzym T4-Polynukleotidkinase (PNK) katalysiert den Transfer des γ-phosphates von ATP auf die terminale 5 -Hydroxylgruppe von Oligonukleotiden (147). Die Kinasierung (Reaktionsvolumen: 20 µl 50 µl) erfolgte in Reaktionspuffer mit 1 pmol - 10 pmol RNA bzw. DNA, 1 mm ATP und U T4-Polynukleotidkinase. Der Reaktionsansatz wurde für 1 4 h bei 37 C inkubiert und die Nukleinsäuren mit Phenol/Chloroform extrahiert ( ). Anschließend wurden eine Gelfiltration ( ), eine Gelelution ( ) oder eine Ethanolpräzipitation ( ) mit den Nukleinsäuren in der wässrigen Phase durchgeführt. Reaktionspuffer: 50 mm Tris-HCl (ph 7,6), 10 mm MgCl 2, 5 mm DTT, 1 mm Spermidin und 1 mm Na 2 EDTA Dephosphorylierung von Nukleinsäuren Für die Dephosphorylierung von RNA und DNA wurden zwei unterschiedliche Enzyme verwendet. Die T4-Polynukleotidkinase besitzt neben der Kinase-Aktivität (vgl ) auch eine 3 -Phosphatase-Aktivität, indem sie die Hydrolyse der terminalen Phosphatgruppe von 3 -Phosphorylpolynukleotiden katalysiert. Dagegen werden durch die alkalische Phosphatase (isoliert aus dem Kälberdarm) sowohl terminale 5 - als auch 3 -Phosphatgruppen von RNA und DNA hydrolysiert. T4-Polynukleotidkinase: Es wurden bis zu 10 pmol RNA mit 10 U T4-Polynukleotidkinase in Reaktionspuffer (siehe ) gemischt. Nach einer Inkubation von 1 h bei 37 C wurden die Nukleinsäuren mit Phenol/Chloroform extrahiert ( ) und mit Ethanol präzipitiert ( ). Alkalische Phosphatase: Es wurden bis zu 1 pmol DNA oder RNA mit 1 U - 5 U alkalischer Phosphatase in Reaktionspuffer für 30 min - 60 min bei 37 C inkubiert. Im Anschluss wurden die Nukleinsäuren mit Phenol/Chloroform extrahiert ( ) und mit Ethanol präzipitiert ( ). Reaktionspuffer: 50 mm Tris-HCl (ph 8,5) und 1 mm Na 2 EDTA. 7.3 DNA-Arbeitstechniken Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli Für die Präparation von Plasmiden aus E. coli-zellen wurde das NucleoSpin Plasmid Kit (Macherey-Nagel) nach Herstellerangaben angewendet. Die Methode basiert auf der alkalischen Detergenzlyse nach Birnboim und Doly [1979, (148)]. Es wurden 5 ml einer stationären Bakterienkultur ( ) sedimentiert (30 s/14000 g/rt) und unter alkalischen Bedingungen in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) lysiert. Durch die rasche Neutralisation präzipitieren die Proteine und chromosomale DNA mit dem schwerlöslichen Kaliumsalz des Detergenz. Durch Sedimentation werden diese von der gelösten Plasmid-DNA getrennt. Die Reinigung der

14 7 Methoden Seite 98 Plasmid-DNA erfolgt durch die Bindung an eine Silica-Membran und das Waschen mit ethanolhaltigem Puffer. Die gereinigte Plasmid-DNA wird von der Membran mit einem Niedrigsalzpuffer (5 mm Tris-HCl, ph 8,5) im leicht alkalischem ph eluiert. Die Plasmide wurden durch Restriktionsverdau mit geeigneten Restriktionsendonukleasen ( ) oder mittels DNA-Sequenzierung überprüft (7.3.5) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die zu amplifizierende DNA-Matrize ( ng) wurde in 100 µl Reaktionsvolumen mit 1 U Taq-DNA-Polymerase, Desoxynukleosidtriphosphaten (je 0,25 mm datp, dctp, dgtp, dttp) und je 1 µm der komplementären Oligodesoxynukleotide (6.8.1) in Reaktionspuffer gemischt. Nach einer Denaturierung der DNA (5 min/95 C) wurden Zyklen der folgenden Inkubationsschritte durchgeführt: Denaturierung (1 min/95 C), Hybridisierung (1 min/40 C - 65 C), Polymerisation (30 s 3 min/72 C). Nach einer weiteren Inkubation bei 72 C (10 min) wurden die Produkte der Reaktion auf einem nicht-denaturierenden Agarosegel ( ) oder einem denaturierenden Polyacrylamidgel ( ) analysiert. Alle Inkubationsschritte erfolgten in einem PCR-Automaten. Reaktionspuffer: 10 mm Tris-HCl (ph 9,0), 50 mm KCl, 6 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 1,5 mm MgCl 2, 1% (v/v) Triton X Modifikation von DNA Restriktionsverdau von doppelsträngiger DNA In einem Mindestvolumen von 20 µl wurden die DNA und das Restriktionsenzym (1 U 10 U/µg DNA) unter enzymspezifischen Pufferbedingungen bei 25 C - 65 C für 1 h 24 h inkubiert. Die Nukleinsäuren wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert ( ) und mittels Ethanol gefällt ( ). Die Vollständigkeit der Restriktion wurde durch elektrophoretische Auftrennung in TBE-Agarosegelen überprüft ( ) Ligation von DNA-Fragmenten Die T4-DNA-Ligase katalysiert die Ausbildung einer Phosphodiesterbindung zwischen benachbarten 5 -Phosphat- und 3 -Hydroxylgruppen in doppelsträngiger DNA oder RNA (149). Es wurden DNA-Moleküle mit kohäsiven Enden oder mit glatten Enden nach unterschiedlichen Protokollen ligiert. Für die Ligation kohäsiver DNA-Termini wurden 100 fmol Plasmid-DNA mit 300 fmol 600 fmol Insertionsfragment in Reaktionspuffer mit 1 U 2 U (149) T4-DNA-Ligase in einem Reaktionsvolumen von 10 µl 20 µl gemischt. Im Fall von DNA-Molekülen mit glatten Termini enthielt der Reaktionsansatz analog 5 U T4-DNA-Ligase und zusätzlich 5% (w/v) PEG Nach einer Inkubation bei 22 C (1 h 24 h) wurden die Nukleinsäuren wahlweise mit Phenol/Chloroform extrahiert ( ) und mit Ethanol gefällt ( ). Die

15 7 Methoden Seite 99 Ligation wurde durch Gelelektrophorese in einem TBE-Agarosegel überprüft ( ). Reaktionspuffer: 40 mm Tis-HCl (ph 7,8), 10 mm MgCl 2, 10 mm DTT, 0,5 mm ATP Klonierung von Plasmid-Vektoren Herstellung des Insertionsfragmentes Bei der Klonierung wurden Plasmide mit Insertionsfragmenten ligiert, die entweder glatte oder kohäsive Enden aufwiesen: Kohäsive Enden: Falls die DNA-Sequenz bereits mit geeigneten Restriktionsschnittstellen in einem Plasmid-Vektor vorlag, wurde dieses mittels Restriktionsverdau ausgeschnitten ( ). Andernfalls wurden das Insertionsfragment in einer PCR amplifiziert (7.3.2), in der geeignete Restriktionsschnittstellte durch die Sequenz der synthetischen Oligodesoxyribonukleotide eingeführt wurden. Nach einer Extraktion des Amplikons mittels Phenol/Chloroform ( ) erfolgte eine Ethanolfällung ( ) und die Hydrolyse mit Restriktionsenzymen ( ). Glatte Enden: Die Insertionsfragmente wurden in einer PCR mittels geeigneter Oligodesoxyribonukleotide amplifiziert (7.3.2). Nach einer Extraktion des Amplikons mit Phenol/Chloroform ( ) erfolgte eine Ethanolfällung ( ) und die Kinasierung des Amplikons ( ) Vorbereitung des Plasmid-Vektors Der Plasmid-Vektor wurde nach einem Restriktionsverdau ( ) mit Phenol/Chloroform extrahiert ( ). Nach der Fällung des Plasmid-Vektors mit Ethanol ( ) wurde dieser mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert ( ) Rekombination der DNA Die Insertionsfragmente ( ) und der restringierte, dephosphorylierte Plasmid-Vektor ( ) wurden mittels Gelelution aus TBE-Agarosegelen isoliert ( ), ligiert ( ) und transformiert ( ). Nach der Resistenzselektion auf Festmedien ( ) wurden positive Transformanten mittels PCR und geeigneten Oligodesoxyribonukleotiden identifiziert. In Abwandlung der unter beschriebenen Methode wurde anstelle der Matrizen-DNA Bakterienzellen einer vereinzelten Kolonie in den Reaktionsansatz transferiert. Die Identifizierung positiver Transformanten erfolgte durch Amplifikation eines DNA-Fragmentes mit erwarteter Größe. Nach der Isolierung der Plasmid-DNA aus der entsprechenden Bakterienkultur (7.3.1) wurde diese durch Hydrolyse mit unterschiedlichen Restriktionsendonukleasen untersucht ( ) und die Sequenz des inserierten DNA-Fragmentes bestimmt (7.3.5).

16 7 Methoden Seite DNA-Sequenzierung Die Sequenzierung der DNA wurde durch die Medigenomix GmbH durchgeführt. Die angewendete Methode basiert auf der so genannten cycle-sequencing Technik (150) und der Didesoxy-Kettenabbruchsequenzierung (151) in Gegenwart fluoreszenzmarkierter Didesoxyribonukleosidtriphosphate (ddntp). Die Sequenz wurde mit Hilfe eines Kapillarsequenzierers (ABI 3700 Kapillarsystem, Applied Biosystems) determiniert. 7.4 RNA-Arbeitstechniken Synthese von RNA-Molekülen Die Synthese von RNA-Oligoribonukleotide erfolgte chemisch oder enzymatisch durch die Transkription einer DNA-Matrize mit Hilfe der DNA-abhängigen T7-RNA-Polymerase. Chemische Synthese: RNA-Oligoribonukleotide wurden nach der Phosphoramiditmethode (152) durch Ambion Inc. synthetisiert und HPLC gereinigt. Nach der Aufnahme der lyophilisierten Nukleinsäuren in TE (ph 7,5) wurden einzelsträngige RNA-Oligonukleotide aus denaturierenden Polyacrylamidgelen geleluiert ( ). T7-Transkription: Die in vitro Transkription der RNA erfolgte mit Hilfe der DNA-abhängigen T7-RNA-Polymerase (153) und wurde mit unterschiedlichen Transkriptionsmatrizen durchgeführt. Im Fall von Plasmiden wurden diese vor der in vitro Transkription mit geeigneten Restriktionsendonukleasen linearisiert ( ), mittels Phenol/Chloroform extrahiert ( ) und mit Ethanol gefällt ( ). Dagegen wurden PCR-Produkte (7.3.2) direkt nach der Aufreinigung mittels Phenol/Chloroform-Extraktion ( ) und Ethanolpräzipitation ( ) als Transkriptionsmatrize eingesetzt. Die Transkription erfolgte in einem Reaktionsvolumen von 20 µl 4 ml mit 0,5 µg - 50 µg DNA, 1 mm NTP, 0,1 1 U/µL RNasin und U T7-RNA-Polymerase in Reaktionspuffer. Nach einer Inkubation von 30 min 2 h wurde die DNA durch Zugabe von U DNaseI (30 min/37 C) degradiert und die RNA auf einem denaturierenden Polyacrylamidgel analysiert ( ). Die Aufreinigung der RNA erfolgte durch Extraktion mit Phenol ( ) und durch eine nachfolgende Gelfiltration ( ). Die Nukleinsäuren wurden wahlweise mit Ethanol präzipitiert ( ) und in TE (ph 7,5) aufgenommen. Reaktionspuffer: 40 mm Tris-HCl (ph 8,1), 6 mm MgCl 2, 5 mm DTT, 1 mm Spermidin, 0.01% (v/v) Triton X-100.

17 7 Methoden Seite Modifikation von RNA-Molekülen Enzymatische Hydrolyse von RNA-Molekülen RNaseT1 und S1 Nuklease katalysieren die Hydrolyse von einzelstängiger RNA. Während die S1 Nuklease keine Sequenzspezifität bei dieser Reaktion aufweist, spalten RNaseT1 die Phosphodiesterbindung zwischen 3 -Guanylsäureresten und 5 -Hydroxylresten der angrenzenden Nukleotide. S1 Nuklease: In einem Reaktionsansatz von 20 µl 50 µl wurde RNA mit S1 Nuklease (1 U/µg RNA) in Reaktionspuffer 10 min 60 min bei 37 C inkubiert. Die Nukleinsäuren wurden mit Phenol/Chloroform ( ) extrahiert und mit Ethanol gefällt ( ). Reaktionspuffer: 40 mm Natriumacetat (ph 4,5), 300 mm NaCl, 2 mm ZnSO 4. RNaseT1: In einem Reaktionsansatz von 50 µl µl wurde RNA mit RNaseT1 (5 U/µg RNA) in Reaktionspuffer inkubiert (30 min/27 C - 37 C). Die Nukleinsäuren wurden durch Phenol/Chloroform ( ) extrahiert und Ethanol gefällt ( ). Reaktionspuffer: 10 mm HEPES (ph 7,6), 100 mm NaCl, 10 mm MgCl Limitierte alkalische Hydrolyse von RNA-Molekülen Zur Herstellung eines Größenstandards ( Alkali-Leiter ) wurden endständig radioaktiv-markierte Oligoribonukleotide (7.4.3) unter alkalischen Bedingungen partiell hydrolysiert. Unter idealen Bedingungen erhält man eine gleichmäßige statistische Verteilung von radioaktiv markierten RNA-Fragmenten über die gesamte Länge des Moleküls. In einem Reaktionsvolumen von 50 µl wurden 1 pmol - 10 pmol radioaktiv markierte Oligoribonukleotide (ca cpm) in Hydrolysepuffer bei 95 C für 20 min inkubiert und anschließend 5 min auf Eis abgekühlt. Bis zu cpm wurden unter denaturierenden Bedingungen in 10% 18% (w/v) Polyacrylamidgelen elektrophoretisch separiert ( ). Hydrolysepuffer: 50 mm Na x H y CO 3 (ph 9,2), 1 mm Na 2 EDTA Methoden zur radioaktiven Markierung von RNA-Molekülen Interne radioaktive Markierung Für die interne radioaktive Markierung der RNA wurde während der Transkription ATP teilweise durch [α- 32 P]-ATP ersetzt. Die Transkriptionsreaktion wurde gemäß in einem Reaktionsvolumen von 20 µl, mit 50 U T7-RNA-Polymerase und einer abweichenden ATP-Konzentration von 50 µm durchgeführt. Zusätzlich wurde 25 pmol [α- 32 P]-ATP (spez. Aktivität 3000 Ci/mmol, Volumenaktivität 10 µci/µl) eingesetzt. Nach einer Inkubation von 2 h bei 37 C wurde die DNA durch Zugabe von 10 U DNaseI (30 min/37 C) degradiert und die Nukleinsäuren mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die Abtrennung nicht-inkorporierter Nukleotide erfolgte durch eine Gelfiltration (Micro-Bio-Spin P6, ). Die RNA wurde mit Hilfe eines

18 7 Methoden Seite 102 denaturierenden 6% 12% (w/v) Polyacrylamidgel ( ) und nachfolgender Autoradiographie analysiert ( ) Terminale radioaktive Markierung Markierung des 5 -Terminus: Oligoribonukleotide (1 pmol - 10 pmol) wurden wie in beschrieben in einem Reaktionsvolumen von 20 µl mit folgenden Abweichungen kinasiert. Anstelle von ATP wurden 7,5 pmol [γ- 32 P]-ATP (spez. Aktivität: 3000 Ci/mmol; Volumenaktivität: 10 µci/µl) in den Reaktionsansatz zugegeben. Nach einer Inkubation von 2 h bei 37 C wurden die Nukleinsäuren mit Phenol/Chloroform extrahiert und nicht-inkorporierte Nukleotide durch eine Gelfiltration (Micro-Bio-Spin P6, ) abgetrennt. Die radioaktiv markierten RNA-Fragmente wurden durch Gelelution aus denaturierenden Polyacrylamidgelen isoliert ( ). Die Überprüfung der Kinasierung erfolgte mittels eines denaturierenden 18% (w/v) Polyacrylamidgels ( ) und einer nachfolgenden Autoradiographie ( ). Markierung des 3 -Terminus: Die Markierungsreaktion wurde in einem Volumen von 20 µl durchgeführt. Es wurden 1 10 pmol Oligoribonukleotide mit 17 pmol 5 -[ 32 P]-pCp (spez. Aktivität: 3000 Ci/mmol; Volumenaktivität: 10 µci/mmol) und 10 U T4 RNA-Ligase in Reaktionspuffer 1 h - 4 h (37 C) inkubiert. Die Aufreinigung der Nukleinsäuren und die Überprüfung der Markierung erfolgte wie oben beschrieben (Markierung des 5 -Terminus). Reaktionspuffer: 50 mm Tris-HCl (ph 7,5), 10 mm MgCl 2, 10 mm DTT, 1 mm ATP Hybridisierung von RNA-Molekülen Für die Hybridisierung wurden äquimolare Konzentrationen an komplementären RNA-Molekülen in 50 µl µl Hybridisierungspuffer (1 min/95 C) hitzedenaturiert. Anschließend wurden die Temperatur mit einer Rate von 0,05 C/s auf 25 C in einem PCR-Automaten abgesenkt. Die Hybridisierung wurde durch native Gelelektrophorese überprüft. Je nach Länge der RNA-Moleküle erfolgte diese unter Verwendung von Polyacrylamid- oder Agarosegelen ( , ). Hybridisierungspuffer: 10 mm HEPES (ph 7,6), 100 mm NaCl, 10 mm MgCl Analyse von Transkripten (Northern-Blot) Isolierung von Gesamt-RNA aus T. brucei Das Protokoll zur Isolierung von Gesamt-RNA wurde leicht modifiziert von Chomcynski und Sacchi übernommen [1987, (154)]. Das Zellpellet von 10 9 Trypanosomen wurde in 500 µl Lösung D vollständig gelöst und mit 100 µl 2 M Natriumacetat/Essigsäure (ph 4,0) gemischt. Nach Zugabe von 500 µl äquilibriertem Phenol und 100 µl Chloroform/Isoamylalkohol (49:1, v/v) wurde das Gemisch emulgiert, 15 min bei 4 C inkubiert und anschließend zentrifugiert (20 min/14000 g/4 C). Nach der Phasentrennung erfolgte die

19 7 Methoden Seite 103 Präzipitation der RNA im wässrigen Überstand durch Zugabe des gleichen Volumens an Isopropanol und Inkubation für 1 h bei -20 C. Nach der Zentrifugation (20 min/10000 g/4 C). wurde das Nukleinsäuresediment in 270 µl Lösung D gelöst und mit 30 µl 2 M Natriumacetat (ph 4) gemischt. Die anschließende Präzipitation mit 300 µl Isopropanol und Sedimentation erfolgte wie oben beschrieben. Das Nukleinsäurepellet wurde mit 800 µl kaltem absolutem Ethanol gewaschen, zentrifugiert (5 min/14000 g/4 C) und in TE (ph 7,5) gelöst. Lösung D: 4 M Guanidiniumthiocyanat, 25 mm Natriumcitrat (ph 7,0), 0,5% (w/v) Lauroylsarcosin, 100 mm 2-Mercaptoethanol Herstellung der radioaktiv-markierten Sonden Für die Detektion der Timer- und der α-tubulin-mrna wurde radioaktiv markierte RNA mit der jeweils komplementären Sequenz synthetisiert. Die Transkriptionsmatrizen wurden mittels PCR amplifiziert und umfassten neben der komplementären mrna-sequenz einen T7-Promotor. Für die PCR (7.3.2) wurden folgende DNA-Matrizen und Oligodesoxyribonukleotide verwendet: Vektor ptubtrrnai-tubtimer (10.1.3) und Oligodesoxyribonukleotide #370, #398 (α-tubulin); Vektor pzjm-timer (10.1.2) und Oligodesoxyribonukleotide #370, #387 (Timer). Die PCR-Fragmente wurden mit Phenol extrahiert ( ), nicht-inkorporierte Nukleotide mittels Gelfiltration abgetrennt ( ) und mit Ethanol präzipitiert ( ). Die radioaktive Markierung der jeweiligen RNA-Sonden erfolgte wie in beschrieben mit 500 ng der entsprechenden Transkriptionsmatrize. Nach der Aufreinigung der Transkripte wurden diese aus einem denaturierendem 6% (w/v) Polyacrylamidgel eluiert ( ) Detektion und Quantifizierung der mrna Die Detektion der mrna erfolgte nach dem modifizierten Protokoll von Sambrook et al. [2001, (143)]. Nach der elektrophoretischen Auftrennung von 5 20 µg Gesamt-RNA ( ) aus T. brucei wurde das denaturierende 1,5% (w/v) Agarosegel ( ) 1 min in deionisiertem Wasser, 20 min in 0,05 M NaOH und abschließend 40 min in 20xSSC-Puffer inkubiert. Der RNA-Transfer auf eine ungeladene Nylonmembran (mit 10xSSC-Puffer äquilibriert) erfolgte in Transferpuffer durch Anlegen eines Vakuums (60 mbar). Nach einer Transferzeit von 1 h 2 h wurde die Membran 5 min in 6xSSC-Puffer inkubiert und auf Whatman-Papier getrocknet. Die mrna wurde durch UV-Licht an die Nylonmembran kovalent gebunden (105 s/λ=254 nm/1,5 J/cm²). Der gleichmäßige Transfer der ribosomalen RNA wurde durch Färben (5 min/rt) der Membran in Färbelösung analysiert. Nach der Inkubation in Entfärbungslösung (15 min/rt) wurde die Membran auf Whatman-Papier getrocknet und 2 h bei 68 C in Prähybridisierungspuffer inkubiert. Radioaktiv markierte RNA (100 ng, spezifische Aktivität: mind cpm/µg, ) wurde als Sonde zugegeben und bei 37 C unter gleichmäßiger Durchmischung mit der mrna hybridisiert. Nach 12 h 16 h wurde die Membran mit folgenden Puffern gewaschen: SSC-Puffer mit 1% (w/v) SDS (10 min/rt) und 0,5xSSC-Puffer mit 0,1% (w/v) SDS (3x10 min/68 C). Nach dem Trocknen der Membran auf Whatman-Papier

20 7 Methoden Seite 104 wurde die radioaktiven Signale mittels Autoradiographie detektiert und quantifiziert ( ). SSC-Puffer (ph 7,0; salt sodium citrate) : 300 mm Natriumcitrat (ph 7,0) und 3 M NaCl. Färbelösung: 0,02% (w/v) Methylenblau in 0,3 M Natriumacetat (ph 5,5) Entfärbelösung: 0,2xSSC und 1% (w/v) SDS. Prähybridisierungspuffer: 0,5 M Na x H y PO 4 (ph 7,2), 7% (w/v) SDS, 1 mm Na 2 EDTA. Transferpuffer: 20xSSC-Puffer. 7.5 Proteinarbeitstechniken Konzentrationsbestimmungen von Protein-Lösungen Die Konzentrationsbestimmung von Proteinen in wässrigen Lösungen erfolgte nach der Methode von Bradford (155). Das Prinzip dieser Methode beruht auf der Absorptionsänderung (bei λ=595 nm) des Farbstoffes Coomassie Brilliant Blue, die nach der Anlagerung an Aminosäurereste auftritt. Für die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde das Fünffachkonzentrat des Farbstoffes 1:5 mit Wasser verdünnt. Proteinlösung (1 µl) wurde mit 1 ml der verdünnten Farblösung gemischt und nach einer Inkubation von 5 min (RT) spektroskopisch vermessen. Als Referenz diente die verdünnte Farblösung in Abwesenheit von Protein. Die Proteinkonzentration wurde anhand einer Standardkurve über eine lineare Regression berechnet, die mit bekannten Konzentrationen an BSA (bovine serum albumin) im Bereich von 0,1-20 µg/µl ermittelt wurde Präparation zytoplasmatischer Extrakte Es wurden 1 6 L einer Trypanosoma brucei Kultur (Zelllinie 427, Zelldichte: Zellen/mL) sedimentiert (10 min/6000 g/4 C). Alle weiteren Schritte erfolgten bei 4 C. Das Zellpellet wurde in 0,5 Volumen eiskaltem, isotonischen Puffer resuspendiert und wie oben beschrieben sedimentiert. Dieser Schritt wurde noch zweimal wiederholt. Die sedimentierten Zellen wurden in hypotonischem Puffer resuspendiert und eine Zelldichte von Zellen/mL eingestellt. Nach dem Zellaufschluss mit Hilfe eines Polytron- Dispergators (1 min/10000 upm/auf Eis) wurde die Zellsuspension mit ¼ Volumen 5xIsotonischem Puffer gemischt und die Vollständigkeit des Aufschlusses durch Mikroskopie kontrolliert. Zellfragmente wurden in zwei Zentrifugationsschritten sedimentiert (10 min/3000 g und 10 min/14000 g). Die Proteinkonzentration (Massenkonzentrationen ca. 5 µg/ml) wurde bestimmt und die Extrakte in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Hypotonischer Puffer: 1 mm HEPES (ph 8,0), 1 mm Na 2 EDTA, 2,5 mm DTT, 100 µg/ml PMSF, 20 µg/ml Trypsininhibitor, 20 µg/ml Leupeptin. 5xIsotonischer Puffer: 125 mm HEPES (ph 8,0), 750 mm KCl, 500 mm Saccharose, 25 mm MgCl 2.

21 7 Methoden Seite Dialyse von Proteinlösungen Für die Entfernung niedermolekularer Verbindungen wurden Proteinlösungen unter Verwendung von Membranen aus regenerierten Cellulose (Ausschlussvolumen: Da) dialysiert. Dazu wurden die Dialysemembranen in 6 mm NaHCO 3 /1 mm Na 2 EDTA (2 h 4 h/60 C) und anschließend in deionisiertem Wasser (5 min/rt) inkubiert. Die Proteinlösung wurde in den Dialysemembranschlauch transferiert, dieser verschlossen und in mindestens 1000-fachem Volumen des entsprechenden Puffers inkubiert (4 h - 24 h/4 C) Trennverfahren Ultrazentrifugation Partikel mit einem Sedimentationskoeffizienten von 30 S S wurden durch Ultrazentrifugation sedimentiert. Jeweils 50 µl des Überstandes wurden auf die Aktivität in einem DIVA untersucht ( ). Die Zentrifugationszeit t wurde nach folgender Formel ermittelt: v t = k s max v 2 t: Zentrifugationszeit in Stunden, v: Rotationsgeschwindigkeit (in upm), v max : maximale Rotationsgeschwindigkeit, k: Rotor-spezifischer Faktor, s: Sedimentationskonstante (in Svedberg-Einheiten; S=10-13 s). Rotor: TLA (Beckman), v max : upm, k= Dichtegradientenzentrifugation Zytoplasmatischer Extrakt (0,5 ml - 1 ml) wurden auf einen linearen Glyzeringradienten aufgetragen und 5 h bei g sedimentiert. Nach der Zentrifugation wurden 1 ml-fraktionen auf den Proteingehalt (7.5.1) und die Proteinzusammensetzung mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese überprüft ( ). Die Detektion der Proteine erfolgte über Coomassie- oder Silberfärbung ( ). Jeweils 50 µl der einzelnen Fraktionen wurden auf die Aktivität in einem DIVA untersucht ( ). Gradient: Linearer Glyzeringradient 5% - 35% (v/v) in 25 mm HEPES (ph 8,0), 150 mm KCl, 100 mm Saccharose, 5 mm MgCl 2. Volumen: 12 ml. Zentrifugationsbedingungen: 5 h/ g/rotor SW41 Ti Ammoniumsulfatfällung Es wurden Partikel in zytoplasmatischem Extrakt (7.5.2) mit einem Sedimentationskoeffizient größer 100 S sedimentiert ( ) und die Proteine des Überstandes mit Ammoniumsulfat präzipitiert. Die Einstellung der gewünschten Ammoniumsulfatkonzentration erfolgte durch langsame Zugabe von ASD-Puffer zu der Proteinlösung, die unter ständigem Rühren auf Eis gekühlt wurde. Nach Erreichen der Endkonzentration wurde die

22 7 Methoden Seite 106 Proteinlösung 15 min unter ständigem Rühren bei 4 C inkubiert und anschließend zentrifugiert (15 min/14000 g/15 min). Präzipitierte Proteine wurden wahlweise in isotonischem Puffer resuspendiert. Ammoniumsulfat in der Proteinlösung wurde durch Dialyse (12 16 h/4 C/vgl ) oder Gelfiltration ( ) entfernt. Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte gemäß und die Proteinzusammensetzung wurde mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese überprüft ( ). Jeweils 50 µl der dialysierten Lysate wurden auf ihre Aktivität in einem DIVA untersucht ( ). ASD-Puffer: 25 mm HEPES (ph 8,0), 250 mm KCl, 100 mm Saccharose, 5 mm MgCl 2 4 M Ammoniumsulfat (entspricht 100% Sättigung bei 20 C). Isotonischer Puffer: 25 mm HEPES (ph 8,0), 150 mm KCl, 100 mm Saccharose, 5 mm MgCl Gelfiltration Nach Herstellung von zytoplasmatischen Extrakten (7.5.2) aus 1 L Zellkultur wurde die KCl-Konzentration auf 250 mm eingestellt und Partikel größer 100 S sedimentiert ( ). Proteine des Überstandes wurde nachfolgend mit Ammoniumsulfat präzipitiert ( ). Dabei wurden Proteine isoliert, die ausschließlich bei einer Sättigung zwischen 35% und 55% Ammoniumsulfat präzipitieren. Nach Aufnahme der Proteine in 500 µl Elutionspuffer wurden diese über eine Gelfiltrationsäule aufgetrennt. Die eluierten Proteine wurden beginnend mit dem Ausschlussvolumen in 500 µl-fraktionen gesammelt. Die Elution der Proteine wurde mittels Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von λ=280 nm detektiert. Für alle Fraktionen wurde die Proteinkonzentration gemäß bestimmt und die Proteinzusammensetzung mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert ( ). Jeweils 50 µl der Fraktionen wurde in einem DIVA auf ihre Aktivität untersucht ( ). Für die Abschätzung der apparenten molekularen Masse wurde eine Standardkurve erstellt. Dazu wurden folgende Proteine mit bekannten Molekularmassen über eine Gelfiltration aufgetrennt: Thyroglobulin (669 kda, 3 mg/ml), Apoferritin (440 kda, 2,5 mg/ml), Katalase (232 kda, 6 mg/ml), Albumin (67 kda, 3 mg/ml) und RNaseA (13,7 kda, 5 mg/ml). Die Berechnung der relativen Elutionsvolumina erfolgte nach folgender Formel: K av V = V el G V V A A K av : relatives Elutionsvolumen; V G : Gesamtvolumen; V A : Ausschlussvolumen; V el : Elutionsvolumen des Proteins (anhand der maximalen Absorption bei λ=280 nm für das jeweilige Protein determiniert). Da ein linearer Zusammenhang zwischen den relativen Elutionsvolumina (für 0,2<K av <0,8) und dem dekadischen Logarithmus der molekularen Massen besteht (156), wurde für die o. g. Proteine eine lineare Regression der entsprechenden Werte erstellt. Die apparente molekulare Masse weiterer

23 7 Methoden Seite 107 Proteine wurde anhand des ermittelten K av und der linearen Regression bestimmt (vgl ). Gelfiltrationssäule: Superdex 200 HR 10/30, Säulenmatrix: quervernetztes Dextran und Agarose, Gesamtvolumen (V G ) 24 ml, Ausschlussvolumen (V A ) 8 ml. Elutionspuffer: 25 mm HEPES (ph 8,0), 250 mm KCl, 100 mm Saccharose, 5 mm MgCl 2. Der Puffer wurde über eine Nitrocellulosemembran (Porendurchmesser: 0,45 µm) steril filtriert und entgast Anionenaustauschchromatographie Zytoplasmatische Extrakte aus T. brucei (7.5.2) wurden zunächst zentrifugiert (20 min/ g/4 C) und die Proteine des Überstandes an die Anionenaustauschsäule gebunden. Nach Waschen der Säule mit mindestens 5 Säulenvolumen Niedrigsalzpuffer wurden die Proteine schrittweise eluiert. Dazu wurde die KCl-Konzentration durch die Veränderung des Mischungsverhältnisses von Niedrig- zu Hochsalzpuffer um jeweils 95 mm KCl sukzessiv angehoben. Die gesammelten 1 ml Fraktionen wurden gegen isotonischen Puffer dialysiert (7.5.3) und der Proteingehalt wie in beschrieben bestimmt. Jeweils 50 µl der einzelnen Fraktionen wurde in einem DIVA auf die Aktivität überprüft ( ). Die Zusammensetzung der Proteine wurde auf einem SDS-Polyacrylamidgel ( ) mittels einer Silberfärbung analysiert ( ). Anionenaustauschsäule: MonoQ HR 5/5, Säulenvolumen: 1 ml; geladene Gruppe: quaternäres Ammoniumion CH 2 -N + (CH 3 ) 3. Niedrigsalzpuffer: 25 mm HEPES (ph 8,0), 50 mm KCl, 100 mm Saccharose, 5 mm MgCl 2. Der Puffer wurde über eine Nitrocellulosemembran (Porendurchmesser: 0,45 µm) steril filtriert und entgast. Hochsalzpuffer: 25 mm HEPES (ph 8,0), 1 M KCl, 100 mm Saccharose, 5 mm MgCl 2. Der Puffer wurde über eine Nitrocellulosemembran (Porendurchmesser: 0,45 µm) steril filtriert und entgast Analyse von Proteinen Denaturierende Gelelektrophorese von Proteinen Die Proben wurden in Auftragspuffer aufgenommen, hitzedenaturiert (2 min - 5 min/95 C) und auf einem 7,5% 12% (w/v) SDS-Polyacrylamidgel bei 150 V elektrophoretisch aufgetrennt. Nach der Trennung wurden die Proteine durch die unter beschriebenen Methoden gefärbt. Geldimension: 8 cm x 10 cm x 0,5 mm 1,5 mm. Trenngel: 0,1% (w/v) SDS, 375 mm Tris-HCl (ph 8,8), 7,5% 12% (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid (37,5:1). Polymerisation mit 0,05% (w/v) APS und 0,01% (v/v) TEMED. Sammelgel: 0,01% (w/v) SDS, 125 mm Tris-HCl (ph 6,8), 4% (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid (19:1), Polymerisation wie bei Trenngel. Laufpuffer: 190 mm Glycin, 25 mm Tris (ph 8,3), 0,1% (w/v) SDS. Auftragspuffer: 50 mm Tris-HCl (ph 6,8), 1% (w/v) SDS, 0,1% (w/v) Bromphenolblau, 0,1% (w/v) Xylencyanol, 10% (v/v) Glyzerin, 1% (v/v) β-mercaptoethanol.

24 7 Methoden Seite Detektion von Proteinen in Gelen Coomassiefärbung: SDS-Polyacrylamidgele wurden (30 min - 12 h/rt) in Färbelösung und anschließend in Entfärber (2 h - 12 h/rt) inkubiert. Färbelösung: 0,1% (v/v) Coomassie Brilliant Blue R250, 50% (v/v) Methanol, 10 (v/v) Essigsäure. Entfärber: 50% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure. Silberfärbung: Das SDS-Polyacrylamdidgel wurde in deionisiertem Wasser gewaschen und anschließend in folgenden Lösungen bei Raumtemperatur inkubiert: Fixierungslösung (2x15 min), Thiosulfatpuffer (30 min), deionisiertem Wasser (3x10 min), Silberfärbungslösung (25 min), deionisiertem Wasser (30 s). Die Inkubation in der Entwicklerlösung wurde so lange durchgeführt, bis die Proteinbanden die gewünschte Intensität zeigten. Der Entwicklungsprozess wurde durch Zugabe 1/10 Volumen Essigsäure gestoppt und das Gel in 5% (v/v) Glyzerin gewaschen. Fixierungslösung: 30% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure. Silberfärbungslösung: 0,1% (w/v) AgNO 3, 3 mm Formaldehyd. Entwicklerlösung: 2,5% (w/v) Na 2 CO 3, 6 mm Formaldehyd. Thiosulfatpuffer: 0,1 M Natriumacetat, 0,1% (w/v) Natriumthiosulfat, 30% (v/v) Ethanol. 7.6 Analyse und Induktion von RNA interference Klonierung der RNAi-Vektoren Folgende Plasmide wurden für die RNAi-Versuche in Trypanosoma brucei kloniert (7.3.4): pzjm-timer, ptubtrrnai-tubtimer, prnai-timer, ptubrnai-tubtimer, pago1tubrnai-tocrl und ptubrnai-tocrl. Diese Plasmide basierend auf den Vektoren pzjm (118), plew82 (130) und ptimer (Clontech). Sequenzen und Plasmidkarten sind in Abschnitt 10.1 dargestellt und auf der beiliegenden CD gespeichert Transientes RNAi in Trypanosomen Herstellung von sirnas und doppelsträngiger RNAs Transientes RNAi wurde durch die Transfektion ( ) von sirnas oder dsrnas in T. brucei induziert. Während die sirnas si329 und si956 chemisch synthetisiert wurden (7.4.1), wurden dsrnas und sirna si315 mittels in vitro Transkription hergestellt. α-tubulin dsrna: Die Transkription und Aufreinigung der RNA erfolgte wie in Abschnitt beschrieben mit folgenden Abweichungen: Die Reaktion fand in einem Reaktionsvolumen von 1 ml, mit 1000 U T7-RNA-Polymerase und 2,5 mm NTP statt. Als Transkriptionsmatrize wurde 20 µg linearisiertes Plasmid pfat B (12) nach der vollständigen Restriktion mit EcoRI ( )

25 7 Methoden Seite 109 eingesetzt. Die DNA wurde nach der Transkription mit 60 U DNaseI hydrolysiert, die RNA mit Phenol/Chloroform extrahiert ( ) und mit Ethanol präzipitiert ( ). Nach einer Gelfiltration (Sephadex G50, ) wurde die RNA hybridisiert (7.4.4) und anschließend einzelsträngige RNA durch Inkubation mit 4000 U RNaseT1-Verdau hydrolysiert ( ). Die Reinigung der dsrna erfolgte durch Extraktion mit Phenol/Chloroform ( ) und Ethanolpräzipitation ( ). Die dsrna wurde auf einem nativen 2% (w/v) TBE-Agarosegel analysiert ( ). Timer dsrna: Für die Transkription des sense- bzw. des antisense-stranges wurden zwei DNA-Fragmente durch PCR wie in beschrieben amplifiziert (Oligodesoxyribonukleotide: sense: #370 und #329, antisense: #370 und #328; DNA-Matrize: pzjm-timer, ). Das Amplikon wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert ( ) und nach einer Gelfiltration (Sephadex G50, ) mit Ethanol präzipitiert ( ). Die Transkription der beiden RNAs mit 20 µg des jeweiligen PCR-Produktes als Matrize und alle weiteren Schritte erfolgten wie für die α-tubulin dsrna beschrieben. Bei der Hybridisierung wurden äquimolare Konzentrationen (10 µm) an sense- und antisense-rna eingesetzt. sirnas si315: Eine PCR wurde in einem Reaktionsvolumen von 2 ml mit den Oligodesoxyribonukleotiden #424 und #425 durchgeführt (Hybridisierung: 45 C, Polymerisation: 30 s; vgl ). Das Amplikon wurden Phenol extrahiert ( ) und nicht inkorporierte Nukleotide durch Gelfiltration (Sephadex G50, ) abgetrennt. Nach einer Ethanolpräzipitation der DNA wurden alle weiteren Schritte wie für die α-tubulin dsrna beschrieben durchgeführt. Die Transkription fand in einem Reaktionsvolumen von 2 ml mit 25 µg PCR-Produkt als Transkriptionsmatrize statt. Im Anschluss an den RNaseT1-Verdau und die Ethanolpräzipitation wurde die sirna wie in beschrieben kinasiert (Reaktionsvolumen: 120 µl; 60 U T4-Polynukleotidkinase). Nach einer Extraktion mit Phenol wurde die sirna mit Ethanol präzipitiert und geleluiert ( ). Die eluierte RNA wurde abschließend Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Alle Reaktionsschritte wurden mit Hilfe von denaturierenden 12% (w/v) Polyacrylamidgelen ( ) und SYBR GreenII Färbungen analysiert ( ) Transfektion und Analyse Für transientes RNAi wurden Trypanosomenzellen (Zelldichte ca Zellen/mL) der Zelllinie prnai-timer (vgl ) mit 50 µg sirna oder dsrna elektroporiert ( ). Nach 18 h wurde Gesamt-RNA von ca Zellen präpariert ( ) und 20 µg für einen Northern-Blot verwendet (7.4.5). Die Zellen wurden 24 h nach der Elektroporation mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert (Mikroskop: Zeiss Axioskop 2; Filter: DIC, Filter 13, Filter 15). Die Fluoreszenzaufnahmen erfolgten mit Hilfe einer CCD-Kamera (Modell 1.4.1, diagnostics instruments).

26 7 Methoden Seite Stabiles RNAi in Trypanosomen Folgende RNAi-Plasmide (10.1) wurden mittels Transfektion ( ) stabil in den transkriptionell stillen rdna-spacer von T. brucei (116) integriert: prnai-timer (10.1.1), ptubrnai-tubtimer (10.1.4), pago1rnai-tocrl (10.1.5) und ptubrnai-tocrl (10.1.6). Die Resistenzselektion erfolgte durch Zugabe von Phleomycin (2,5 µg/ml) und die Zelllinien wurden bis zu dreimal kloniert ( ). RNAi wurde durch Zugabe von Tetrazyklin (1 µg/ml) induziert und auf transkriptioneller Ebene mittels Northern-Blot nachgewiesen ( ). Die Fluoreszenzmikroskopie wurde unter Verwendung der Filter 13 (Exzitation: 470 nm; Emission: nm; Zeiss) und Filter 15 (Exzitation: 546 nm; Emission: 590 nm; Zeiss) durchgeführt. Für die Zelllinien prnai- Timer, ptubrnai-tocrl und pago1rnai-tocrl wurden die Fluoreszenzintensitäten durch FACS-Analysen quantifiziert (FACScalibur, BectonDickinson). Nach Sedimentieren und Suspendieren der Zellen in Waschpuffer wurden mindestens 10 5 Zellen hinsichtlich ihrer Fluoreszenz quantifiziert (Exzitation: 488 nm; Detektion: 530 nm und 585 nm). Als Referenz dienten Trypanosomenzellen der Zelllinie Waschpuffer: 10 mm Na 2 HPO 4, 2 mm KH 2 PO 4, 137 mm NaCl, 2,7 mm KCl, 3% (v/v) fötales Kälberserum. Der ph-wert wurde auf 7,4 eingestellt In vitro Analyse des RNAi-Initiationsschrittes Herstellung des radioaktiv markierten dsrna-substrates Als Substrat für die in vitro Reaktion wurde intern radioaktiv markierte α-tubulin dsrna verwendet, die durch eine bimolekulare Hybridisierung von sense- und antisense-rna erzeugt wurde. In zwei PCR-Reaktionen wurden die Transkriptionsmatrizen wie unter beschrieben amplifiziert (DNA-Matrize: ptubtrrnai-tubtimer; Oligodesoxyriboukleotide sense: #370 und #397, antisense: #370 und #398). Die PCR-Produkte wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert und durch Gelfiltration (Sephadex G50) mit nachfolgender Ethanolpräzipitation gereinigt. Die radioaktive Markierung der RNA-Moleküle erfolgte wie in beschrieben mit dem jeweiligen PCR-Produkte als Transkriptionsmatrize. Die RNA wurde wie in hybridisiert und einzelsträngige RNA mit RNaseT1 hydrolysiert ( ). Die Aufreinigung erfolgte mittels Phenol/Chloroform- Extraktion ( ) und Gelelution ( , natives 6% Polyacrylamidgel, w/v) Dicer in vitro Assay (DIVA) Partikel in zytoplasmatischem Extrakt (7.5.2) mit einem Sedimentationskoeffizient größer 100 S wurden sedimentiert ( ). Für den Dicer in vitro Assay wurde 50 µl des Überstandes mit 50 µl DIVA-Reaktionspuffer gemischt und falls nicht anders angegeben 60 min bei 27 C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Mischen mit 400 µl Phenol gestoppt und 5000 cpm 5 -radioaktiv markiertes Oligoribonukleotid #12 (interner Standard) zugegeben. Die Nukleinsäuren wurden mit Phenol extrahiert ( ), mit

27 7 Methoden Seite 111 Ethanol gefällt ( ) und auf einem denaturierenden 6% - 18% (w/v) Polyacrylamidgel separiert ( ). Die Detektion erfolgte mittels Autoradiographie ( ) und es wurden die Intensitäten der sirnas bzw. des internen Standards unter Anwendung des Programms Image Gauge 3.41 (FujiFilm) bestimmt. Die relative Signalintensität S(i) für die einzelne Probe berechnet sich gemäß Formel 1 (Seite 23). DIVA-Reaktionspuffer: 25 mm HEPES (ph 8,0), 150 mm KCl, 100 mm Saccharose, 5 mm MgCl 2, cpm α-tubulin dsrna ( ), 2 mm ATP. Titrationsexperimente: Bei der Herstellung von zytoplasmatischen Extrakten (7.5.2) wurde isotonischer Puffer ohne die jeweilige Substanz verwendet. Die angegebene Endkonzentration der Substanz wurde durch die Zugabe in den DIVA-Reaktionspuffer eingestellt. Für die Titrationen von ATP-Derivaten bzw. MnCl 2 wurde DIVA-Reaktionspuffer in Abwesenheit von ATP bzw. MgCl 2 verwendet. ph-variation: Es wurde zytosolischer Extrakt in 150 mm KCl, 100 mm Saccharose, 5 mm MgCl 2 und 25 mm einer der folgenden Puffersubstanzen dialysiert (7.5.3): CHES (ph 9-10), 25 mm HEPES (ph 7-8), 25 mm MES (ph 6) oder 25 mm NaOAc (ph 5). Für den Dicer in vitro Assay wurde HEPES durch die entsprechende Puffersubstanz im DIVA-Reaktionspuffer substituiert. Der ph wurde auf den jeweils angegebenen Wert eingestellt Analyse der Struktur und des Phosphorylierungsstatus von sirnas Es wurde ein Dicer in vitro Assay mit intern radioaktiv markierter α-tubulin dsrna (10 6 cpm) in einem Reaktionsvolumen von 500 µl wie in beschrieben durchgeführt. Die radioaktiv markierten sirna-molekülen wurde in einem 6% (w/v) nativen Polyacrylamidgel elektrophoretisch separiert ( ) und geleluiert ( ). Für die Kontrollreaktionen wurde Oligoribonukleotid #5 (25 nt) eingesetzt, das 3 - oder 5 -terminal radioaktiv markiert wurde ( ). Phosphorylierungsstatus: Die Dephosphorylierungsreaktionen mit alkalischer Phosphatase (AP) bzw. T4-Polynukleotidkinase (PNK) fanden in einem Reaktionsvolumen von 20 µl unter Bedingungen gemäß statt. Geleluierte sirnas (ca cpm) wurden mit 10 U PNK bzw. 1 U AP für 60 min bei 37 C inkubiert. Nach der Extraktion mit Phenol ( ) und einer Gelfiltration (Micro-Bio-Spin P6, ) wurden die Nukleinsäuren auf einem denaturierenden 18% (w/v) Polyacrylamidgel analysiert ( ). Doppelsträngigkeit: Geleluierte sirnas ( cpm) wurden wahlweise hitzedenaturiert (5 min/95 C) und 5 min auf Eis abgekühlt. Nach einer Inkubation mit 10 U RNaseT1 (1 h/27 C) wurden die Nukleinsäuren mit Phenol extrahiert ( ) und über eine Gelfiltration gereinigt (Micro-Bio-Spin P6, ). Die Analyse der Reaktionsprodukte erfolgte auf einem denaturierenden 18% (w/v) Polyacrylamidgel ( ).

28 7 Methoden Seite In vitro Analyse des RNAi-Effektorschrittes Herstellung des radioaktiv markierten mrna-substrates Als Substrat wurde sense- bzw. antisense-rna eingesetzt, die Sequenzen aus dem α-tubulin codierenden Bereich (Position ) enthielten. Die Synthese der intern radioaktiv markierten RNA-Moleküle erfolgte bis zum Hybridisierungsschritt wie in beschrieben. Die RNA-Moleküle wurden auf einem 6% (w/v) Polyacrylamidgel unter denaturierenden Bedingungen elektrophoretisch separiert ( ) und geleluiert ( ) RISC in vitro Assay (RIVA) In zytoplasmatischem Extrakt (7.5.2) wurden Partikel mit einem Sedimentationskoeffizient größer 300 S sedimentiert ( ). Der Überstand der Ultrazentrifugation (50 µl) wurde mit gleichem Volumen RIVA-Reaktionspuffer in Anwesenheit von 10 nmol 100 nmol sirna si315 und 10 pmol radioaktiv markierter sense- bzw. antisense-mrna ( ) gemischt. Nach einer Inkubation von 90 min bei 27 C wurden die Proben analog zum DIVA gereinigt und analysiert ( ). RIVA-Reaktionspuffer: 25 mm HEPES (ph 7,5), 150 mm KCl, 100 mm Saccharose, 5 mm MgCl 2, 2 mm ATP, 500 µm CTP, 500 µm GTP, 500 µm UTP und 0,2 U/µL RNasin. 7.7 Computeranalysen und Auswertverfahren sirna-sequenzauswahl und Berechnung der thermodynamischen Stabilität Die Auswahl funktionaler sirna-sequenzen erfolgte im codierenden Bereich des α-tubulin Gens. Dabei wurde nach 21 nt langen Sequenzen mit folgendem Profil gesucht: SSN 17 WW (S: G oder C; W: A oder U; N: A, C, G oder U; N 17 : 17 konsekutive N). Dazu wurde das Programm Fuzznuc (EMBOSS) verwendet. Für nicht funktionelle sirnas wurde nach dem Profil WWN 17 SS gesucht. Ausgewählte Sequenzen wurden durch eine Homologiesuche (BLAST) gegen die Genomdatenbank von T. brucei GeneDB auf etwaige Ähnlichkeiten zu unspezifischen Sequenzen überprüft. Die Berechnung der internen thermodynamischen Stabilität wurde nach Khvorova et al. [2003, (2)] durchgeführt und ist in Abschnitt beschrieben Bestimmung der apparenten molekularen Masse Dicers Für die Bestimmung der apparenten molekularen Masse Dicers wurden Proteine aus zytosolischem Extrakt mittels Gelfiltration separiert ( ) und ein Dicer in vitro Assay mit jeder Fraktion durchgeführt ( ). Anhand der relativen Elutionsvolumina K av und der relativen DIVA-Aktivität für jede

29 7 Methoden Seite 113 Fraktion S wurde der Erwartungswert für das apparente Elutionsvolumen E(K av ) nach folgender Formel bestimmt: E( K av ) n K av i= 1 = n k= 1 ( i) S( i) S( k) E(K av ): Erwartungswert des apparenten Elutionsvolumens unter Berücksichtigung von n Fraktionen nach einer Gelfiltration; K av (i): relatives Elutionsvolumen für die i-te Fraktion (Berechnung siehe ); S(i): relative Signalintensität der sirnas in einem DIVA für die i-te Fraktion (3.1.1). Anhand dieses Wertes und der linearen Regression der Standardkurve ( ) wurde die apparente molekulare Masse Dicers errechnet Densitometrie Signalintensitäten einzelner Banden in SYBR GreenII gefärbten Polyacrylamidgelen (LAU: Light Absorption Units) oder Autoradiogrammen (PSL: Photo Stimulated Luminescence) wurden mit Hilfe der Software Image Gauge 3.41 (FujiFilm) bestimmt. Dafür wurden die Signalintensitäten einer definierten Fläche oder eines Profils kalkuliert. Für vergleichende quantitative Analysen wurde stets die relative Signalintensität der einzelnen Proben berechnet. Dazu wurde die Signalintensität eines unabhängigen internen Standards (IS) determiniert. Die Berechnung der relativen Signalintensität erfolgte aus der Quotientenbildung der Signalintensität der einzelnen Probe und des korrespondierenden IS (vgl ).

30 8 Abkürzungen Seite Abkürzungen Chemische Elemente und Verbindungen sowie physikalische Größen und Einheiten werden entsprechend dem internationalen Standard abgekürzt. Abkürzungen für Chemikalien, Puffer, Enzyme etc. werden, sofern sie nicht hier aufgeführt sind, im Materialteil (vgl. 6) erläutert. σ Standardabweichung ε molarer dekadischer Extinktionskoeffizient Σ Summe λ Wellenlänge σ(i) relative spezifische Signalintensität G Gibb sche freie Energie G(i) IT-Stabilität für pentamere Subsequenz an der i-ten Position einer sirna G(X i,y i+1 ) IT-Stabilität für basengepaarte, konsekutive Nukleotide X und Y an den Positionen i und i+1 einer sirna < kleiner > größer A Adenosin oder Absorption ADP Adenosin-5 -diphosphat ADP-β-S Adenosin 5 -[β-thio]diphosphat AMP Adenosin-5 -Monophosphat AMP-CPP Adenosin 5 -(α,β-methylen)triphosphat AP alkalische Phosphatase as antisense ATP Adenosin-5 -triphosphat ATP-γ-S Adenosin 5 -[γ-thio]triphosphat BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Basenpaar BSA Rinderserum-Albumin C Cytidin CCD Charge-coupled Device Ci Curie cpm (counts per minute) radioaktive Zerfälle pro Minute CTP Cytidin-5 -triphosphat D Aspartat Da Dalton datp 2 -Desoxyadenosin-5 -triphosphat dctp 2 -Desoxycytidin-5 -triphosphat ddntp 2,3 -Didesoxynukleosid-5 -triphosphate dgtp 2 -Desoxyguanosin-5 -triphosphat DIC Differentieller Interferenzkontrast DIVA Dicer in vitro Assay DNA Desoxyribonukleinsäure dntp 2 -Desoxynukleosid-5 -triphosphate dsrbd dsrna-bindendes Motiv dsrna doppelsträngige RNA dttp 2 -Desoxythymidin-5 -triphosphat E Erwartungswert oder Glutamat E. coli Escherischia coli ed Editor et al. und andere FACS Fluorescence Activated Cell Sorter FCS fötales Kälberserum FPLC Fast Performance Liquid Chromatography G Guanosin

31 8 Abkürzungen Seite 115 g Erdbeschleunigung oder Gramm GeneDB Genomdatenbank T. brucei ( GTP Guanosin-5 -triphosphat HPLC High Pressure Liquid Chromatography ID Identifikationsnummer in vitro im Laborgefäß in vivo im lebenden Organismus ind. induzierbar Int Integrationskassette IS interner Standard IT intern thermodynamisch K Lysin K av relatives Elutionsvolumen kcal Kilokalorien kda Kilodalton konst. konstitutiv LAU light absorbing unit log dekadischer Logarithmus MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption ionization - Time of Flight mind. mindestens mirna microrna mirnp microrna-ribonukleoproteinkomplex mol 6, Teilchen M r molekulare Masse mrna Boten-RNA NCBI National Centre for Biotechnology Information nt Nukleotid NTP Nukleosid-5 -triphosphat OD Optische Dichte OH Alkali-Leiter ORI (origin of replication) Replikationsursprung PARP procyclic acidic repetitive protein PAZ Piwi Argonaute Zwille PCR Polymerase-Kettenreaktion ph negative dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration PNK, PK T4-Polynukleotidkinase prä-mrna Vorläufer-mRNA PSL photo-stimulated luminescence PTGS posttranskriptionelles gene silencing rdna ribosomale DNA RdRP RNA-abhängige RNA-Polymerase RISC RNA induced silencing complex RISC* aktivierter RISC RITS RNA induced initiation of transcriptional gene silencing RIVA RISC in vitro Assay RNA Ribonukleinsäure RNAi RNA interference RNP Ribonukleoprotein rrna ribosomale RNA RT Raumtemperatur (ca. 20 C) s sense oder Sekunde S Svedberg-Einheit S(i) relative Signalintensität SAS spliced acceptor site SDS Natriumdodecylsuflat sirna short interfering RNA snorna small nucleolar RNA spez. spezifisch ss einzelsträngig T. brucei Trypanosoma brucei

32 8 Abkürzungen Seite 116 Tet TGS trna Tub U upm UTP UTR UV V v/v V A V el V G vgl. W w/v WT Tetrazyklin transkriptionelles gene silencing Transfer-RNA α-tubulin Enzymeinheit oder Uridin Umdrehungen pro Minute Uridin-5 -triphosphat nicht translatierte Region (der mrna) Ultraviolett Volt Volumen pro Volumen Ausschlussvolumen Elutionsvolumen Gesamtvolumen vergleiche Watt Gewicht pro Volumen Wildtyp

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