Pharmazeutische Biologie und Phytochemie Naturstoffe als Inhibitoren c-myb-abhängiger Transkriptionsprozesse Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften im Fachbereich Chemie und Pharmazie der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster vorgelegt von Caroline Schomburg aus Münster - 2013 -
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 9 1 Einleitung 11 1.1 Transkriptionsprozesse im Zusammenhang mit Tumorerkrankungen 12 1.1.1 Transkription und Transkriptionsregulation 12 1.2 Naturstoffe als Inhibitoren von Transkriptionsprozessen 14 1.3 Der Transkriptionsfaktor c-myb 18 1.3.1 Die Mitglieder der Myb-Familie 18 1.3.2 Der Transkriptionsfaktor c-myb 19 1.3.3 Physiologische Funktion von c-myb 20 1.3.4 Beteiligung von c-myb an humanen Tumorerkrankungen 23 1.4 Problemstellung 24 2 Material und Methoden 26 2.1 Geräte und Zubehör 26 2.1.1 Geräte und Zubehör für analytische Methoden 26 2.1.2 Geräte und Zubehör für Zellkultur und proteinchemische Methoden 27 2.2 Verbrauchsmaterialien 28 2.2.1 Verbrauchsmaterialien für analytische Methoden 28
Inhaltsverzeichnis 2.2.2 Verbrauchsmaterialien für Zellkultur und proteinchemische Methoden...29 2.3 Chemikalien und Reagenzien 30 2.3.1 Chemikalien und Reagenzien für analytische Methoden 30 2.3.2 Chemikalien und Reagenzien für Zellkultur und proteinchemische Methoden 30 2.3.3 Lösungen für analytische Methoden 32 2.3.4 Medien, Puffer und Lösungen für Zellkultur 32 2.3.5 Testsubstanzen 34 2.3.6 Puffer und Lösungen für proteinchemische Methoden ^4 2.3.7 Antikörper 36 2.4 Helllinien 36 2.5 Plasmide 37 2.6 Herstellung der DCM-Extrakte 38 2.6.1 Pflanzenmaterial 38 2.6.2 Extraktion und Aufarbeitung der Extrakte 40 2.6.3 Soxhlet-Extraktion 40 2.7 Chromatographische Methoden 41 2.7.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 41 2.7.2 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC/UV-DAD) 41 2.7.3 Säulenchromatographie 43
3 2.7.4 Ultrahochleistungsflüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Kopplung (UHPLC-/ESI-QTOF MS) 49 2.8 Kernresonanzspektroskopie (NMR) 52 2.9 Zellbiologische Methoden 52 2.9.1 Kulturbedingungen 52 2.9.2 Herstellung der Stammlösungen der Testsubstanzen 53 2.9.3 GFP-basiertes zelluläres Assay-System 53 2.9.4 Zellernte GFP-Assay 55 2.9.5 Zellviabilitäts- bzw. Zytotoxizitätstest (MTS-Assay) 56 2.9.6 Transiente Transfektion durch Calciumphosphat-Copräzipitation 57 2.9.7 Zellernte Transfektion 58 2.10 Proteinchemische Methoden 59 2.10.1 Proteinextraktion mittels ELB-Lysispuffer 59 2.10.2 Reportergen-Assays 59 2.10.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 60 2.10.4 Western Blot 61 2.10.5 Immunfärbung von Proteinen 61 2.11 Statistische Auswertung der Daten 62 3 Ergebnisse 63
Inhaltsverzeichnis 3.1 Screening verschiedener Naturstoffgruppen auf ihre c-myb inhibitorische Aktivität 63 3.1.1 Sesquiterpenlactone 69 3.1.2 Naphtho- und Benzochinone 90 3.1.3 Triterpenoide einschließlich Steroide 94 3.1.4 Weitere Substanzen 98 3.2 Zytotoxische Effekte der untersuchten Testsubstanzen 101 3.3 Screening verschiedener Extrakte auf ihre c-myb inhibitorische Aktivität 114 3.4 Isolierung und Identifizierung der für die inhibitorische Aktivität verantwortlichen Inhaltsstoffe aktiver Extrakte 125 3.4.1 Bioaktivitätsgeleitete Fraktionierung des DCM-Extraktes von Arctium lappa 125 3.4.2 Bioaktivitätsgeleitete Fraktionierung des DCM-Extraktes von Cynara scolymus 131 3.4.3 Bioaktivitätsgeleitete Fraktionierung des DCM-Extraktes von Helianthus tuberosus 142 3.4.4 Bioaktivitätsgeleitete Fraktionierung des DCM-Extraktes von Liriodendron tulipifera...148 3.4.5 Isolierung von Helenalinacetat aus Arnica montana cv Arbo" 153 3.4.6 Isolierung von Arglabin und Argolid aus Artemisia glabella 156 3.4.7 Isolierung von Nobilin aus Chamaemelum nobile 167 3.5 Besondere Effekte von Cucurbitacin B 171
5 3.5.1 Einfluss von Cucurbitacin B auf die Expression von v-myb nach Transfektion 172 3.5.2 Einfluss von Cucurbitacin B auf die Expression von C/EBPß nach Transfektion 174 3.5.3 Einfluss von Cucurbitacin B auf die Expression von c-myb und endogenem C/EBPß 177 4 Diskussion 179 4.1 Isolierung der für die inhibitorische Aktivität verantwortlichen Inhaltsstoffe aus aktiven Extrakten 179 4.2 Zusammenhang von inhibitorischer Aktivität und zytotoxischem Potential der Testsubstanzen 181 4.3 Struktur-Wirkungsbeziehungen 185 4.3.1 Allgemeine Struktur-Wirkungsbeziehungen 185 4.3.2 Struktur-Wirkungsbeziehungen von Sesquiterpenlactonen 186 4.3.3 Struktur-Wirkungsbeziehungen von Naphtho- und Benzochinonen 194 4.4 Einfluss von Cucurbitacin B auf verschiedene Transkriptionsfaktoren 198 4.5 Potential von Naturstoffen als Inhibitoren c-myb-abhängiger Transkriptionsprozesse 200 5 Anhang 202 5.1 Strukturen der verwendeten Testsubstanzen 202 5.2 Herkunft der verwendeten Testsubstanzen 206 5.3 Referenzen zu den verwendeten Testsubstanzen 212
1 6 Inhaltsverzeichnis 5.4 Ergänzende Messwerte von Testsubstanzen im GFP-Assay und MTS-Assay, die im Ergebnisteil nicht weiter erläutert wurden 216 5.5 Ergänzende Messwerte von getesteten Extrakten im GFP-Assay, die im Ergebnisteil nicht weiter erläutert wurden 231 5.6 Weitere NMR-Spektren 237 5.7 UHPLC-/ESI-QTOF MS-Spektren einiger isolierter Verbindungen 242 Literaturverzeichnis 244 Veröffentlichungen 254 Danksagung 255 Lebenslauf 257