HPV Screening zur Prävention von Gebärmutterhalskrebs

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1 HPV Screening zur Prävention von Gebärmutterhalskrebs Andreas M. Kaufmann Gynäkologische Tumor Immunologie Frauenklinik Charité Campus Benjamin Franklin, Campus Mitte

2 Programm Biologie und Epidemiologie HPV Screening Neue Methodik

3 35 Jahre HPV Forschung Nobel laureate medicine 2008 Harald zur Hausen

4 Klonierung HPV6/11 Lutz Gissmann Medizin Nobelpreisträger 2008 Harald zur Hausen Klonierung HPV16 Matthias Dürst

5 Zervixkarzinom Vorsorge in Deutschland Trends der Inzidenz und Mortalität bei Gebärmutterhalskrebs

6 Verlauf von HPV Infektionen und Erkrankung 8-18 Monate Infektion! n = 80 spontane Regression: natürliche Immunität HPV Infektion ( n = 100 ) n = 20 CIN n = 1-2 (5?) CA (prämaligne Läsion Persistenz, Progression) Alter Jahre HPV Prophylaxe CxCa Prophylaxe/Therapie Krebsfrüherkennung AMK AMK

7 Die Krebsvorsorge ( Früherkennung!) PAP Abstrich abnormale Zellen im Mikroskop Bei positivem Befund: genaue Abklärung, Beobachtung, chirurgische Entfernung Zytologie/Histologie HPV Genotypisierung Progressionsmarker (?) Genexpressionsprofile (?)

8 ca Neuerkrankungen ca Todesfälle 10. Stelle bei Karzinomen der Frau durchschnittliches Alter bei Diagnose: 52 Jahre 4. Stelle bei Frauen Jahre Impfpräventabel (+HBV) Beispiel: 02 : 33 Jahre, regelm. Zytolog. Krebsvorsorge, 2 cm Tumor HPV18 positiv AMK

9 Humane Papillomaviren Papillomaviridae PV in jeder Wirbeltierspezies >150 Humane PV Typen cutane/mucosale Typen ca. 20 hoch-risiko HPV in 99.7% Gebärmutterhalskrebs Proben nachweisbar ca. 18 niedrig-risiko HPV in 90% Feigwarzen nachweisbar 55 nm HPV Partikel 1/ stel mm) Zirkulär-doppelsträngiges DNA Genom 8 kb AMK

10 HPV-bedingte Erkrankungen nach Geschlecht HPV-bedingter Krebs (+ Genitalwarzen) Europa 32% (51%) 68% (49%) STIKO Empfehlung: Verhinderung von CxCa, Vulvar, Vaginal und AnalCa sowie Vorstufen Stanley 2012 Nature 488:S10

11 Deutschlandweite repräsentative Studie zur HPV-DNA-Prävalenz (prä Vakzine, RKI) Frauen, Alter 20 bis 25 Jahre mittels Selbstabnahme-Set zu Hause plus Fragebogen zum Sexualverhalten Spülprobe für HPV-Test, Fragebogen Delphi Screener Delere et al., BMC Infect Dis. 2014

12 HPV-Prävalenz: Querschnittsstudie Jährige AMK Delere et al., BMC Infect Dis. 2014

13 % untersuchter Frauen HPV-Prävalenz und Alter Frauen in Dänemark HR LR HPV positiv: 33% nach 2 Jahren 60% nach 5 Jahren Alter Krüger-Kjaer, et al AMK 75+

14 HPV Nachweisbarkeit (jeder Typ) per Altersgruppe bei Männern aus Brasilien, Mexico und USA Giuliano et al., Vaccine 26 suppl.10 (2008) AMK K17-K28

15 Progression zum Zervixkarzinom Ca. 50% Infektion CIN 1 CIN 2/3 Invasives CxCa 7-30 Jahre DNA Nachweis RNA Nachweis AMK E6/E7 Proteinnachweis?

16 Sensitivität und Spezifität von HPV Nachweis vs Zytologie HPV Test: hohe Sensitivität Zur Zeit: Zytolog. Screening (hohe Spezifität) HPV als Triage nach Therapie Aber Zytologie: hohe Spezifität Alternative: HPV im primären Screening (hohe Sensitivität) Zytologie als Triage! (hohe Spezifität) NPV als Vorteil!!! Cuzick et al., Int J Cancer 2008

17 GP-PCR Systeme: MY09/11 GP5+/6+ SPF10 Targets für HPV Nachweis 450 bp 150 bp 65 bp General primer amplifizieren alle HPV Typen L1 ist das heterogenste Gen (Selektionsdruck) L1 URR E6 E6-E7: Onkogene E7 Multiplex PCR mrna Onkoproteine L1-L2: Capsid HPV bp E1 E6/E7 sind nie deletiert! L2 Multiplex PCR Sonden-basierte Systeme E5 E4 E2 E1-E5: regulatory genes

18 HPV Screening darf erst Im Alter >30-35 Jahre beginnen Testsystem? DNA RNA Protein Gruppentest (HR/LR) => Genotypisierend Triage Test => Primär Screening AMK

19 >145 kommerziell verfügbare HPV Tests Test HPV Spektrum geno- Firma Sonden-basiert typis. Hybrid Capture 2 HR/LR Qiagen Cervista HPV 14 HR HOLOGIC PCR-basiert Abbott RealTime High Risk HPV 14 HR-HPV G+ Abbott GenoID Real Time PCR HPV Test 14 HR/6 LR G+ Gene ID AMPLICOR HPV Test 13 HR Roche Line Array 19 HR/18LR G+ Roche Papillo Check 18 HR/6 LR G+ GreinerBioOne F-HPV-typing TM Multiplex (E6/7) 13 HR/2LR G+ Genomed CLART HPV2 21 HR/13 LR G+ Genomica Innolipa HPV Genotyping Extra 18 HR/7 LR G+ Innogetics Multiplexed Genotyping MPG (DKFZ) 18 HR/7 LR full G+ Multimetrix RT-PCR-basiert HPV Cobas HR/HPV16;18 G+ Roche mrna-basiert NucliSensEasy HPV 5 HR G+ Biomerieux APTIMA (mrna) 14 HR Genprobe Onkoprotein-basiert AVE6 oncoprotein assay HPV16/18/45 Arbor Vita E7 Test to be 12 HR-HPV/16,18,45 PIPAVIR

20 Sensitivity Detection of p16 INK4a HPV-Proofer Hybrid Capture II Linear Array APTIMA Genomica Amplicor Specificity Szarewski et al., Epidemiol Biomarkers Prev 2008; 17(11): ) 20

21 Klärung der Test Performance/Qualität Analytische Sensitivität: Wie viele HPV Genome nötig? Spezifität: Kreuzreaktionen zwischen HPV Typen? Nachweis jeglicher HPV Infektion, wichtig für Epidemiologie Klinische Sensitivität: Wie viele CIN2+ werden detektiert? Spezifität: Wie viele falsch positive HPV+/CIN- gefunden? Nachweis nur klinisch relevanter Infektionen Wichtig für Primäres HPV Screening Gute Gewichtung nötig: hohe Sensitivität für CIN2+ um Erkrankung zu finden UND minimale Detektion von HR-HPV Infektionen ohne Erkrankung Daher HPV Tests wählen mit ausreichender KLINISCHER VALIDIERUNG z.b. FDA approval

22 Anforderungen an HPV Testformate 14 HR-HPV Typen werden detektiert Klinisch validiert gegen Hybrid Capture 2 (HC2) Und/oder GP5+/GP6+ PCR-(EIA) (Diassay) HC2 und Diassay validiert in grossen prospektiven klin. Studien (Frauen >30 Jahre) Besitzt klin. Sensitivität für CIN2+ von 95% Besitzt klin. Spezificität für CIN2+ von 90.7 bis 94.1% Neue Testformate sollen zumindest erreichen 90% der HC2 Sensitivität 98% der HC2 Spezificität AMK Meijer et al., J Clin Virol. 2009

23 Qualitätskontrolle Abstrichqualität (Abnahme unter kolposkop. Sicht?) Lab Infrastruktur (Kontaminationsrisiko, PCR Problem) validierter Test Interne Kontrolle für zelluläre DNA! Monitoring der Abläufe Intra/inter Lab Reproduzierbarkeit Proficiency Testung von Standardproben eines Referenzlabors AMK

24 Athena Studie: Addressing the need for advanced screening Frauen, US multi-center Studie, doppel-verblindet Cobas HPV Test (Roche) 12 hrhpv und HPV16/18 Genotypisierung 93,5% Sensitivität, 69,3% Spezifität für CIN3, 0,3% falsch negativ Identifizierung der Frauen mit höchstem absoluten/relativen Risiko einer CIN3+ 10% HPV16 und/oder 18 positive bei unauffälliger Zytologie hatten eine CIN3+ 16% HPV16 und/oder 18 positive mit ASC-US Zytologie hatten eine CIN3+ Wright TC et al., Am J Clin Pathol Oct;136(4):

25 CIN 3 Risiko bei HPV16/18+ Cobas Roche HPV-Test

26 Paradigmenwechsel! FDA panel recommends HPV DNA test as first-line cervical cancer screening. Contemporary Ob/Gyn, Publish date: MAR 20, 2014 The researchers found considerable differences among the laboratories in overall cytological abnormal rates (3.8% to 9.9%) and in sensitivity of cytology to detect cervical intraepithelial neoplasia (CIN) grade 2 or worse (42.0% to 73.0%). In contrast, the positivity rate for high-risk HPV DNA subtypes varied only from 10.9% to 13.4%, and the sensitivity of the HPV DNA testing from 88.2% to 90.1%. These observations suggested that HPV DNA testing without cytology should be considered as the initial method for cervical cancer screening. The assay received FDA approval and is the first and only HPV DNA test indicated for first-line primary screening of cervical cancer in the United States. April 24 th, 2014 AMK

27 Beispiele für Einführung eines primären HPV Screenings Niederlande: höhere Sensitivität in Studien gezeigt, starke Wissenschaftslobby, Kosteneffizienz bei Intervallanpassung Mexiko: kein Screening etabliert bisher, neues Screeningsystem soll modern und effizient sein. England: gut funktionierendes organisiertes zytologisches Screening System, dennoch Umstellung auf primäres HPV Screening, keine ausreichende Kapazität an Zytologieassistentinnen Entwicklungsländer zb Ghana: Studie ACCESSING (ESTHER/GIZ finanziert) Bisher kein Screening, technisch einfache, billige, spezifische Methode nötig AMK

28 Fallbeispiel Aufnahme Kolposkopie bei Z.n. Konisation Courtsey Dr. G. Cichon

29 Fallbeispiel Patientin 29 Jahre, HPV16 positive Dysplasie Prätherapeutisch : Abstrich in Dysplasiesprechstunde, PAP IVa, CIN III HPV16 stark (1347 MFI), HPV 59 grenzwertig positiv (9 MFI) bei Konisation : Abstrich gezielt von Läsion HPV16 stark positiv (1131 MFI), HPV 59 nicht nachweisbar bei Kontrolle PAP IIID HPV 59 stark positiv (560 MFI), klinischer Aspekt atyp. Condylome HPV 16 nicht nachweisbar! Bei ausschliesslichem HR-Nachweis wäre ein HR-HPV Positiv mit einem Therapieversagen für den ursächlichen Typ der Dysplasie interpretiert worden. Tatsächlich eine florierende Infektion mit einem anderen HPV Typ. Das ist weiter zu verfolgen, hat aber einen anderes Risiko.

30 Neue Testentwicklungen Vollständige Genotypisierung für grosse epidemiologische Studien => NGS: HPV Testung durch Sequenzierung, Illumina Plattform mrna Quantifizierung zur Prognose der Dysplasie => QG2.0-HPV, Panomics Onkoproteintest E6/E7 zur Erhöhung der Spezifität, z.b. Einsatz in Entwicklungsländern => PIPAVIR (FP7 Projekt); Arbor Vita E6 Oncoprotein assay PCR-rapidStripe zum preiswerten und schnellen Screening z.b. in Entwicklungsländern => AJ Innuscreen/Analytik Jena AMK

31 Next Generation Sequencing Machbarkeitsstudie Amplifikation mit barcoded primern, pooling Sequenzierung von 1200 Proben in einer Lane Vergleich zu GP5+/6+ PCR, Luminex MPG => Sehr preiswerter Hochdurchsatz z.b. für Epidemiologie AMK

32 HPV Onkoproteintests für höhere Spezifität E7 Onkoproteine von 12 HR-HPV Typen (FP7 EU Projekt PIPAVIR) detektiert durch RabMabs, in klin. Validierung PIPAVIR Partner E7 Antigen positiv negativ Mikrogen: E7 ELISA Biosynex: E7 rapid Test + DIMA

33 ELISA: HPV differentiation well Detection in clinical samples Koch et al., pers. comm.

34 Ein brennendes Problem: weltweite Zervixkarzinominzidenzen 2008 altersstandardisierte Rate/ Frauen pro Jahr Ghana: 80 Zervixkarzinome/ IARC Globocan 2008

35 Catholic Hospital Battor / Ghana CHB/Charité ESTHER clinical partnership

36 Adequate Screening in Ghana HPV16/18 E6 Protein Test Women in trial district North Tongu, Ghana will be screened for cervical cancer and receive treatment. 1) A simple screening method for HPV will be scientifically validated for the given context. 2) A model for community-based CxCa screening will be developed. 3) Nurses, midwifes physicians and lab technicians will be educated. 4) Epidemiological data for HPV prevalence will be collected. Aufwand durch PCR-basiertes pre-screening reduzierbar!

37 rapidstripe HPV Test (HPV16, 18, 45) In Entwicklung und klin. Validierung DNA Extraktion (crude) Multiplex PCR Low tech read-out Auf lateral flow Streifen Self-sampling (ohne Arzt) HPV Screening DNA Test HPV Triage Onkoprotein Test Kolposkopie, LEEP PCR product AMK Patel, Graser, Hillebrand, AJ Innuscreen

38 Fazit Trotz grosser Erfolge hat das CxCa Screening Verbesserungspotential HPV Test hat eine höhere Sensitivität als Zytologie (>30 Jahre!) Unterschiedliches karzinogenes Potential von HR-HPV Typen ist gegeben Genotypisierung liefert in mehrfacher Hinsicht wertvolle Informationen, v.a. CIN Risiko, Verlaufskontrolle HPV Screening Tests sollen klinisch validiert sein Weitere Entwicklung von HPV Tests für high through-put, höhere Spezifität und Einsatz in Entwicklungsländern

39 Rwanda impft alle Mädchen gegen HPV! AMK

40 Thank you! And please. screen the mothers AND VACCINATE THE DAUGHTERS AMK

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