Methylierungsmarker und andere neue Triageverfahren. Gerd Böhmer Hannover
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- Maximilian Lang
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1 Methylierungsmarker und andere neue Triageverfahren Gerd Böhmer Hannover 1
2 Entwicklung des Zervixkarzinoms & initialer Einsatz von Triage-Methoden Infektion Persistierender HPV Transformation HPV negativ HPV positiv LSIL early HSIL late HSIL cancer Heilung Regression Regression Progression 90% 30-60% HPV Tests: z.b.: Roche cobas L1 Kapsidprotein: Cytoimmun Cytoactiv p16/ki-67 Zytologie: Roche CINtec PLUS Epigenetischer Biomarker: GynTect Therapie Integrations Biomarker : HPV-INT-CX LSIL correlates with cervical intraepithelial neoplasia grade 1 (CIN1), HSIL (High-grade SIL) with CIN3 and most cases of CIN2 Source: M. Schiffmann, D. Solomon, N. Engl. J. Med. 369:24, Dec 12, 2013; Roche CINtec PLUS Cytology document: D _00001]; expert discussions oncgnostics 2
3 L1-Kapsid-Protein (Cytoactiv Test)
4 Cytoactiv - Test immunzytochemischer Nachweis des L1-Virusproteins Indikation: persistierender PAP III D-2 Voraussetzung: positiver HPV-Test (! )
5 Cytoactiv Test Interpretation Positives Ergebnis L1-Kapsid (Virushülle) nachweisbar: Günstige Prognose weil das immunogene Korrelat noch nachweisbar und eine Spontanremission noch möglich Negatives Ergebnis L1-Kapsid nicht mehr nachweisbar: Ungünstige Prognose, weil eine Integration der Virus-DNA wahrscheinlich und das immunogene Korrelat fehlt
6 L1-Kapsidprotein bei PAP IIID 2
7 L1 Risk profils remission or progression to CIN3 for early dysplastic lesions % 93% Remission Stable Progression % 37% 0 L1 + LSIL L1 + HSIL L1 - LSIL L1 - HSIL
8 CINtec plus (p16ink4a + Ki 67) DUAL STAIN
9 p16 im natürlichen Zellzyklus antiproliferativer Effekt p16-expression führt zu irreversiblem Zellzyklus-Arrest in der Zelle 7
10 Histologie Konisat p16 (Normalgewebe) Seite 1
11 Histologie p16 (Zervix-Ca) Seite 1
12 Einfluss von HPV E7 auf Zellzyklus und p16 Expression Bergeron et al., Int J Cancer (2014)
13 p16 im Zellzyklus bei HPV-Infekt Zellen mit onkogener E7-Wirkung nach HPV- Integration: p16 verliert seine Funktion, wird aber paradox überexprimiert 7
14 Ki-67 im natürlichen Zellzyklus Ki-67 wird im Zellkern gesunder proliferierender Zellen (z.b. in Basalzellen) überexprimiert Somit ist der Nachweis von KI-67 ein Indikator für die Proliferation 14
15 Histologie Konisat Ki 67 (Normalgewebe) Seite 1
16 Histologie Ki67 (Zervix-Ca) Seite 1
17 17 Der Nachweis einer KI-67 UND einer p16- Überexpression in ein und der selben gesunden Zelle schließen sich aus!!
18 CINtec PLUS p16/ki-67 Biomarker Kombination Braune zytoplasmatische Färbung p16 Überexpression Rote nukleäre Färbung - Ki-67 Expression 18
19 p16/ki67 dual stain (CINtec PLUS) Bergeron et al., Int J Cancer (2014)
20 CINtec PLUS p16/ki-67 Biomarker Kombination simultaner immunzytochemischer Nachweis von p16 und Ki-67 in einer Zelle Indikator für zervikale Dysplasie Unabhängig von der morphologischen Beurteilung Indikation: PAP III p,g,(e), PAP IIID-1 20
21 Anwendung von Biomarkern Im zytologischen Screening zur Abklärung von Frauen mit unklarem zytologischen Befund (PapIII) als alternative zum HPV-Test p16/ki67 hat eine höhere Spezifität (63.2% vs 37.8%) bei ähnlicher Sensitivität für die Erkennung von CIN2+ im Vergleich zum HPV-Test Bergeron et al., Int J Cancer (2015) Bei der Verwendung von HPV als primärer Sceening-Test zur Abklärung von hrhpv-positiven Frauen p16/ki67 hat eine höhere Spezifität (58.9% vs 49.6%) bei gleicher Sensitivität für die Erkennung von CIN2+ im Vergleich zur konventionellen Zytologie Wentzensen et al., JNCI (2014)
22 Epigenetischer Biomarker: Methylierungsmarker GynTect
23 Wissenschaftliche Basis- epigenetische Änderungen inder DNA Wissenschaftliches Prinzip zur Detektion von Tumorzellen mit Karzinomspezifischen epigenetischen Modifikationen, genannt DNA- Methylierung. 2 3
24 Marker Identification & Validation Tumorproben Marker Identifikation Marker Validation Klinische Validation Ganzes Genom Epigenetische Marker Regionen: etwa * mögliche Markerregionen 12* Markerregionen 6* GynTect Marker *numbers for GynTect 24
25 Biology of GynTect markers 20 Gewebeproben wurden microdissektiert: Tumor und Stroma getrennt und mittels NGS (Next Generation Sequenzing) analysiert 2
26 Ergebnisse: Gewebebasierte Analyse Zervixgewebe: 99.4% (155 von 156) der Zervix-Ca s wurden durch GynTect erkannt, eine falschpositive Probe Hohe Sensitivität uns Spezifität, 13 HPV hr-typen wurden berücksichtigt 99.4% 97.9% number of positive markers per sample all 6 marker 6 marker 5 marker 4 marker 3 marker 2 marker Sensitivity (N= 156) Specificity (N = 49) Tissue Trial 26
27 % methylated scrapes Ergebnisse der Validierung aus Zervixabstrichen 95 CIN 3 bzw. Karzinome und 166 PAP 1 (HPV-pos. oder neg.) Sensitivität CIN3+: 92%; geringe falschpositiv-rate DLX1 ITGA4 RXFP3 SOX17 ZNF671 GynTect positiv marker regions HPV- (n=76) HPV+ (n=91) CIN3 (n=45) CxCa (n=50) 2
28 % detection rate Ergebnisse: Jena (STM samples) 306 Patienten hrhpv positiv Dünnschichtabstriche Sensitivität (all ages) for CIN3+: 67.6%, Spezificität CIN3+: 82.6% Sensitivität ( 30y) for CIN3+: 75.0%, Specificität CIN3+: 79.1% Trial for CE IVD mark 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% < 30y 30y total 2 no CIN CIN 1-2 CIN 3 CxCa
29 Ergebnisse: Vergleich cobas HPV & CINtec Plus Ergebnisse HPV CINtec Plus GynTect Sensitivity CIN % 100.0% 59.7% CIN % 100.0% 64.8% Specificity CIN % 90.2% 98.0% CIN % 69.6% 94,6% invalid test results 0.36% 3.62% 1.43%
30 Integrierte HPV- DNA: HPV-INT-CX
31 Biomarker in der personalisierten Medizin Integrierte HPV-DNA als individualisierter Biomarker für den Nachweis rezidivierender Präkanzerosen bei der post-operativen Nachsorge BMBF: 16GW0130K HPV-INT-CX
32 Post-operative Nachsorge bei CIN3-10,2 %ige Wahrscheinlichkeit eines Rezidivs innerhalb von 2 Jahren (Arbyn et al Vaccine 24: S3, 78-89; Kocken et al Gyn Oncology 125: ) Persistierende bzw. rezidivierende CIN3 oder Neuentstehung Risikofaktoren: Größe der Läsion Endozervikaler (Mit-) Befall Alter der Patientin Befallene Schnittränder Nachsorge: Zytologie hrhpv-test Zytologie und hrhpv-test (co-testing) Sensitivität 95%; Spezifität 67% Weiterer Spielraum für Verbesserung?
33 HPV-DNA Integration ist ein charakteristischer Schritt in der Zervixkarzinogenese Woodmann et al., (2007) Nature Reviews Cancer 7(1):11-22 geeigneter molekularer Marker für die
34 Neue effiziente Technologien für den Nachweis von HPV-DNA Integraten 80% Virus-Zell-Übergangssequenzen sind für jede Patientin einzigartig!!!!
35 Xu et al., 2013 PLoS ONE 8(6):e66693 TEN-Plattform für die Identifizierung und Sequenzierung von Virus-Zell-Übergängen TEN = Tagging, Enrichment and Next-Generation Sequencing
36 Aussage zur intratumoralen Heterogenität 1) Identifizierung von HPV16-positiven Arealen p16-färbung 2) Mikrodissektion von Tumorarealen verschiedener Regionen vcj-pcr T1 S T2 T4 T3 Integrat nachweisbar Integrat nicht nachweisbar Keine intratumorale Heterogenität in Zervixkarzinomen! HPV-Integration ist ein individueller molekularer Marker repräsentativ für sämtliche Zellen eines Tumors
37 HPV-INT-CX Klinische Fragestellung: Proof of Concept der Überlegenheit des individuellen vcj-pcr Tests bezüglich Spezifität im Vergleich zur Routine (co-testing) bei gleicher Sensitivität in der Nachsorge nach Konisation Studiendesign: Prospektive, multizentrische Kohortenstudie (Beobachtungsstudie) zur Evaluierung der diagnostischen Güte Patientenzahl: n=670; Rekrutierung 15 Monate Nachsorge Intervalle: 6, 12 und 24 Monate Laufzeit Studie: insgesamt 4 Jahre
38 Zusammenfassung - Biomarker können das Zugrundeliegen einer klinisch relevanten Dysplasie erhöhen. - Methylierungsmarker und Integrationsmarker könnten für die klinische Routine vielversprechend sein. - Biomarker können die klinisch / kolposkopische Diagnosefindung nicht ersetzen.
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