Biochemisches Grundpraktikum. Einführung in Methoden der Molekularbiologie

Transkript

1 Biochemisches Grundpraktikum Einführung in Methoden der Molekularbiologie Isolierung chromosomaler DNA aus Sojabohnen Nachweis der gentechnischen Veränderung glyphosattoleranter Sojabohnen mittels PCR Isolierung und Analyse von Plasmiden aus E. coli K12-Stämmen Inhaltsverzeichnis: Seite 1. Zusammenfassung des Praktikumversuchs 2 2. Zeitplan 2 3. Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen 3 4. Versuch 1 Isolierung chromosomaler DNA aus Sojabohnen Theoretischer Teil Die Roundup Ready Sojabohne Experimenteller Teil: 5 A: Isolierung chromosomaler DNA aus Sojabohnen 5 B: Agarosegelelektrophorese zur Analyse der isolierten chromosomalen DNA 6 5. Versuch 2 Nachweis der gentechnisch veränderten Roundup Ready Sojabohne mittels PCR Theoretischer Teil Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und ihre Anwendungsgebiete Experimenteller Teil: 14 C: PCR-Analyse 15 D: Agarosegelelektrophorese zur Analyse der PCR-Produkte Versuch 3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli K12-Stämmen Theoretischer Teil Grundlagen von Plasmidvektoren 16 Funktion der Restriktionsendonukleasen 20 E. coli K12-Stämme 23 Transformation von E. coli Experimenteller Teil: 26 E: Isolierung von Plasmid-DNA (Minipräparation) 27 F: Sequenzspezifische Hydrolyse der isolierten Plasmid-DNA 28 G: Agarosegelelektrophorese zur Analyse der hydrolysierten Plasmid-DNA Literatur 29 Stand: April 2005

2 2 1. Zusammenfassung des Praktikumversuchs Versuch 1: Isolierung von chromosomaler DNA aus Sojabohnen Die chromosomale DNA aus rohen konventionellen und aus gentechnisch veränderten Sojabohnen (Roundup Ready Sojabohne, Monsanto Co.) der Spezies Glycine max wird isoliert und mittels Agarosegelelektrophorese die DNA-Qualität und Ausbeute bestimmt. Versuch 2: Nachweis der gentechnischen Veränderung in herbizidtoleranten Sojabohnen (Roundup Ready ) mittels PCR Der Nachweis für die gentechnische Veränderung erfolgt mit dem für Sequenzen der Roundup Ready Sojabohne spezifischen Primerpaar B1/B2. Die Amplifizierbarkeit der extrahierten DNA wird in einem Parallelansatz mit einem Primerpaar GM03/GM04 kontrolliert, das aus dem Bereich des Lektin-Gens stammt und welches speziesspezifisch für Glycine max ist. Die PCR-Produkte werden elektrophoretisch auf die zu erwartenden Produktgrößen überprüft. Versuch 3: Isolierung der Plasmid-DNA pgfpuv aus E.coli (Plasmid-Minipräparation) Die Plasmid-DNA pgfpuv wird aus E. coli Zellen durch alkalische Lyse der Bakterien und Ethanol-Präzipitation der Plasmid-DNA isoliert und gereinigt. Das Plasmid enthält das Gen für das Grüne Fluoreszierende Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria. Die isolierte Plasmid-DNA wird mit Restriktionsendonukleasen hydrolysiert und die entstandenen DNA- Fragmente durch Agarosegelelektrophorese überprüft. 2. Zeitplan 1. Tag - Isolierung der chromosomalen DNA aus Sojabohnen - Gelelektrophoretische Analyse der chromosomalen DNA 2. Tag - Durchführung der Polymerasekettenreaktion - Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Produkte - Animpfen der Reagenzglaskulturen für die Plasmid-Minipräparation 3. Tag - Durchführung der Plasmid-Minipräparation - Restriktionshydrolyse der Plasmid-DNA - Gelelektrophoretische Analyse der hydrolysierten Plasmid-DNA

3 3 3. Arbeiten mit gentechnisch veränderten Organismen Für die im Praktikum verwendeten gentechnisch veränderten Organismen (GVO) gilt das Gesetz zur Regelung von Fragen der Gentechnik (Gentechnik-Gesetz, GenTG) und seine Verordnungen. Die benutzten GVO sind in die Sicherheitsstufe 1 klassifiziert worden und dürfen nur in zugelassenen und gekennzeichneten Genlabors gehandhabt werden. Durchgeführte Arbeiten sind in Formblättern aufzuzeichnen, was im Praktikum Aufgabe der Betreuer ist. Jeder mit biologischem Material der Risikogruppe 1 kontaminierte Abfall ist vor der Entsorgung durch Autoklavieren bei 121 C und 2 bar für 20 min zu inaktivieren. Spitzes oder scharfkantiges Material muss in Kunststoffbehältern so gesammelt werden, dass eine Verletzung von Mitarbeitern ausgeschlossen ist. Verschüttetes biologisches Material muss sofort mit Desinfektionsmitteln (z.b. 70 %igem Isopropanol) behandelt und mit Papiertüchern aufgewischt werden. Steriles Arbeiten Lösungen und Geräte, die mit Nukleinsäuren direkt in Kontakt kommen, müssen Nukleasefrei sein. Es werden grundsätzlich analysenreine für die Molekularbiologie geeignete Chemikalien verwendet, mit denen steril gearbeitet werden muss. Das verwendete Wasser ist bidestilliert und autoklaviert. Thermostabile Lösungen und Kulturmedien sowie Geräte aus Kunststoff (Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße usw.) werden 20 min bei 121 C und 2 bar autoklaviert, während man hitzeempfindlichen Lösungen zur Entfernung von Mikroorganismen (häufig Quellen enzymatischer Kontaminationen) durch 0,2 µm Filter sterilfiltriert. Glasgeräte lassen sich durch Backen bei 150 C über Nacht sterilisieren.

4 4 4. Versuch 1 Isolierung chromosomaler DNA aus Sojabohnen 4.1 Theoretischer Teil Die Roundup Ready Sojabohne Die Sojabohne Roundup Ready der amerikanischen Firma Monsanto wurde derart gentechnisch verändert, dass sie tolerant gegenüber dem Breitbandherbizid Glyphosat (Handelsname Roundup ) ist. Glyphosat (HOOC-CH 2 -NH-CH 2 -PO(OH) 2 ) ist ein nichtselektiver Wirkstoff, der über Blätter und oberirdische Sprossen aufgenommen und mit dem Assimilatstrom über die gesamte Pflanze verteilt wird. Die toxische Wirkung von Glyphosat beruht auf der Inhibition des Enzyms 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSP-Synthase). Durch den Ausfall dieses Enzyms, ist der Shikimisäureweg blockiert, so daß die Biosynthese der essentiellen aromatischen Aminosäuren Tryptophan und Phenylalanin nicht stattfinden kann, was zu einem Absterben der Pflanze führt. Für Tiere und Menschen ist dieses Herbizid nicht toxisch. Die Glyphosat-Toleranz der transgenen Sojabohnen wurde dadurch erzielt, dass sie mit einem Gen für eine bakterielle EPSP-Synthase aus dem Agrobacterium-Stamm CP4 (CP4- EPSP-Synthase) transformiert wurde. Die agrobakterielle CP4-EPSP-Synthase wird durch Glyphosat nicht inhibiert und verleiht somit der transgenen Sojapflanze die Herbizidtoleranz. Das CP4-EPSP-Synthase Gen wurde unter die Kontrolle des starken Pflanzenpromotors Cauliflower Mosaic Virus (CaMV-35-S-Promotor) und dem Terminator des Nopalin- Synthase-Gen (NOS-Terminator) aus Agrobacterium tumefaciens gestellt. Zusätzlich enthält das Genkonstrukt Sequenzen des Chloroplasten-Transferpeptids (CTP) zur Einschleusung der EPSP-Synthase in die Chloroplasten aus Petunia hybrida (Abb. 1). Dieses Genkonstrukt wurde vektorlos über Mikroprojektilbeschuss ( gene gun oder Partikelkanone) in die Sojabohnen transferiert. Insertion in die Zelllinie GTS Glycine max Terminator Insertion bp Herbizid-Resistenz Gen Transitpeptid Promotor Gen Pflanzen- DNA NOS3` CP4-EPSPS CTP P-E35S Abb. 1: Integriertes Genkonstrukt in die Roundup Ready Sojabohne NOS3` = Terminator der Nopalin-Synthase; CP4-EPSPS = 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase; CTP = Chloroplasten-Transit-Peptid; P-E35S = Promotor des Cauliflower Mosaic Virus.

5 5 Im Gegensatz zu den bisher auf dem Markt befindlichen transgenen Pflanzen enthält die Roundup Ready Sojabohne keine Markergene, insbesondere keine Antibiotika- Resistenzgene. 4.2 Experimenteller Teil In diesem Versuch wird die Gesamt-DNA aus konventionellen und Roundup Ready Sojabohnen der Spezies Glycine max isoliert. Die chromosomale DNA dient im Versuch 2 als DNA-Ausgangsmaterial für die PCR-Analyse der Sojabohnen. Eine für die PCR geeignete DNA sollte einen hohen Reinheitsgrad aufweisen, denn die Anwesenheit von Hemmstoffen beeinflusst die Sensitivität negativ bis hin zur völligen Inhibierung der enzymatischen Reaktion. Beispielsweise inhibieren Proteine und Peptide in sehr geringen Konzentrationen die PCR. Des weiteren sollte vermieden werden, dass die DNA durch mechanische Scherkräfte zu stark fragmentiert wird, ein Nachweis mit Hilfe der PCR wäre dann nicht mehr möglich. Für die Isolierung von Gesamt-DNA stehen eine Vielzahl von Methoden zur Wahl. Die gewählte Methode ist abhängig von dem Probenausgangsmaterial und dem späteren Verwendungszweck der isolierten DNA. In diesem Versuch wird für die Isolierung der chromosomalen DNA die CTAB-Methode verwendet. Diese Methode basiert auf der Lyse der Pflanzenzelle durch CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid), einem ionischen Detergenz, und der Reinigung der DNA mittels Chloroform und anschließender Isopropanol- Präzipitation. Die DNA-Qualität und Ausbeute der isolierten chromosomalen DNA wird dann mittels Agarosegelelektrophorese bestimmt. A: Isolierung chromosomaler DNA aus Sojabohnen Materialien: CTAB-Extraktionslösung ph 8,0 20 g/l CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) 1,4 M NaCl 0,1 M Tris (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) 0,02 M EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) mit HCl ph 8,0 einstellen, autoklavieren. CTAB-Präzipitationslösung 5 g/l CTAB 0,04 M NaCl autoklavieren. 1,2 M NaCl-Lösung, autoklavieren. Chloroform p.a. 70 % (v/v) Ethanol p.a. Isopropanol p.a. Salzsäure p.a. Durchführung: Pro Gruppe wird sowohl chromosomale DNA aus konventionellen Sojabohnen als auch aus gentechnisch veränderten Sojabohnen (Roundup Ready, Monsanto Co.) isoliert. Sojabohnen in H 2 O bidest über Nacht bei RT oder 1 h bei 65 C quellen lassen. 100 mg (entspricht einer halben Sojabohne) der gequollenen Sojabohnen in ein Eppendorfgefäß überführen und mit einer sterilen zugeschmolzenen gelben Pipettenspitze zerkleinern. 500 µl CTAB-Extraktionslösung hinzugeben und gründlich mischen. 30 min bei 65 C im Wasserbad inkubieren, jeweils nach 10 min Zerkleinern wiederholen.

6 6 10 min in der Tischzentrifuge zentrifugieren. Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführen. Mit 200 µl Chloroform versetzen und 1 min kräftig mischen. 10 min zur Phasentrennung zentrifugieren. Wässrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführen. 2 Volumenteile CTAB-Präzipitationslösung hinzugeben und mischen. 60 min bei Raumtemperatur inkubieren und anschließend 5 min zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Präzipitat in 350 µl 1,2 M NaCl lösen. Mit 350 µl Chloroform versetzen und 1 min kräftig mischen. 10 min zur Phasentrennung zentrifugieren. Die wässrige Phase in ein neues Eppendorfgefäß überführen. Mit 0,6 Volumenteilen Isopropanol versetzen. 10 min zentrifugieren, den Überstand verwerfen, das Sediment mit 500 µl eiskaltem 70 %igen Ethanol versetzen und kräftig mischen. 10 min zentrifugieren und den Überstand vorsichtig mit einer Gilson-Pipette abziehen. Das DNA-Sediment 5 min in der Vakuumzentrifuge trocknen und in 100 µl H 2 O bidest lösen. Lagerung der DNA bei 20 C. B: Agarosegelelektrophorese zur Analyse der isolierten chromosomalen DNA Nukleinsäuren und ihre Hydrolyseprodukte lassen sich in nichtdenaturierenden, horizontalen Agarosegelen elektrophoretisch trennen und sichtbar machen. Die Elektrophoresen erfolgen in Flachbettkammern, deren Auswahl sich nach den Kriterien Trennqualität (steigt mit zunehmender Trennstrecke) und Anzahl der Proben richtet: - Minigelapparatur: Gelgröße 6 x 8 cm, Kämme mit 5 bzw. 8 Taschen - Maxigelapparatur: Gelgröße 19 x 21 cm, Kämme mit 25 bzw. 33 Taschen - Auswahl der Agarosekonzentration des Gels richtet sich nach der Länge der zu trennenden DNA-Fragmente: Agarosekonzentration [% (w/v)] 0,6 0,8 1,0 1,5 Kettenlänge [kb] ,8 10 0,5 8 0,3 6 DNA-Größenstandards Die Größe gelelektrophoretisch getrennter DNA-Moleküle wird durch Referenzspuren mit DNA-Molekülen bekannter Größe, die durch Restriktionen von Plasmiden oder Bakteriophagen bekannter Sequenz hergestellt werden, bestimmt. Die Signalintensität der DNA-Größenstandards kann auch zur Ermittlung der DNA-Menge in den aufgetragenen Proben durch einen Intensitätsvergleich herangezogen werden.

7 7 Verwendete DNA-Größenstandards 100 bp DNA Leiter Fragmentgrößen [bp] λdna/ecor I/Hind III Fragmentgrößen [bp] / Materialien: 50 x TAE-Puffer 242 g Tris 57,1 ml Eisessig 100 ml 0,5 M EDTA, ph 8,0 mit H 2 O bidest. auf 1 L auffüllen Agarosegel-Probenauftragspuffer 0,05 % (w/v) Bromphenolblau 0,2 % (w/v) SDS 50 % (v/v) Glycerin in 1 x TAE-Puffer 1 x TAE-Puffer 50 x TAE-Puffer 1:50 (v/v) mit H 2 O bidest. verdünnen Durchführung: Die isolierte chromosomale DNA wird in horizontalen Flachbett-Minigelapparaturen elektrophoretisch getrennt. Verwendet wird eine 0,8 %ige Agaroselösung. Die für den Trennbereich und die Geldimension notwendige Agarosemenge wird in 1x TAE-Puffer suspendiert und im Mikrowellenherd durch Kochen vollständig gelöst. Die heiße Agaroselösung auf ca. 60 C abkühlen lassen und in die mit Textilband abgedichtete Gelkammer luftblasenfrei gießen. Probenkamm einsetzen und das Agarosegel min erstarren lassen. Das Gel mit 1 x TAE Elektrophoresepuffer 1-2 mm überschichten und den Probenkamm entfernen. Jeweils 10 µl DNA-Lösung werden in einem Eppendorfgefäß mit 3 µl Probenauftragspuffer versetzt und gemischt. Zur Bestimmung der DNA-Größe wird ein geeigneter DNA-Größenstandard (λdna/ecor I/Hind III) analog zu den zu untersuchenden DNA-Proben mit Proben-Auftragspuffer versetzt. Zur Konzentrationsabschätzung wird eine Standard-DNA-Probe (λdna) mit einem DNA- Gehalt von 0,5 µg mit 3 µl Probenauftragspuffer versetzt. Die Proben, der Größenstandard und die Standard-DNA-Probe werden in jeweils eine Tasche des Agarosegels mit Hilfe einer Gilson-Pipette aufgetragen. Die Gelelektrophorese wird bei einer konstanten Spannung von 5 V/cm Elektrodenabstand durchgeführt. Die Elektrophorese ist beendet, wenn die Bromphenolblaufront 1-2 cm vom unteren Gelrand entfernt ist.

8 8 Nach Beendigung der Elektrophorese das Gel 1-3 min in einer wässrigen Ethidiumbromidlösung (1 µg/ml) färben (wird von den Betreuern durchgeführt) und zur Reduktion der Hintergrundfärbung weitere 10 min elektrophoretisch trennen. Die im Gel aufgetrennten Nukleinsäuren werden im UV-Durchlicht bei 302 nm visualisiert und photographiert. 5. Versuch 2 Nachweis der gentechnisch veränderten Roundup Ready Sojabohne mittels PCR 5.1 Theoretischer Teil Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Methode der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) wurde 1987 von Kary B. Mullis entwickelt. Mit diesem die Gentechnik revolutionierenden Verfahren ist es möglich, in vitro von bestimmten Nukleotidsequenzen millionenfach Kopien enzymatisch herzustellen. Dieser als Amplifikation bezeichnete Vorgang erlaubt es, auch sehr geringe Mengen von DNA einer Analyse schnell zugänglich zu machen. Für diese Leistung ist Kary B. Mullis 1993 der Nobelpreis verliehen worden. Aus der Grundidee der Polymerase- Kettenreaktion hat sich ein breites Repertoire an speziellen PCR-Techniken entwickelt, die in den verschiedensten Bereichen Anwendung gefunden haben (Gentechnik, medizinische Diagnostik, Paläontologie und Kriminalistik). Der Mechanismus der Polymerase-Kettenreaktion Die Vorgänge bei der Vervielfältigung einer Nukleinsäure mittels der PCR ist dem Reaktionsablauf bei der natürlichen Replikation ähnlich (Abb. 2). Eine DNA-Polymerase synthetisiert einen neuen DNA-Strang an einer einzelsträngigen Nukleinsäurematrize. Dazu werden Startermoleküle (Primer) benötigt, die an die Matrizen- DNA binden (hybridisieren). Von deren 3`-Ende aus synthetisiert die Polymerase den neuen DNA-Strang. Bei der natürlichen Replikation hybridisiert ein RNA-Primer an die Matrizen- DNA. Bei der Polymerase-Kettenreaktion werden synthetische Oligonukleotide aus etwa 15 bis 30 Desoxynukleotiden verwendet. Durch die Wahl eines gegenläufig orientierten Oligonukleotid-Primerpaares kann die DNA-Sequenz zwischen den Primern gezielt vervielfältigt werden. Das entscheidende Prinzip der PCR ist die zyklische Wiederholung der einzelnen Reaktionsschritte, wodurch die Ausgangsmenge an DNA bis zu einem Faktor von etwa 10 7 amplifiziert werden kann. Nach den Reaktionszyklen liegt das gewünschte Reaktionsprodukt in großen Mengen vor und daher ist eine Isolierung der Produkt-DNA sehr einfach.

9 9 Denaturierung zum Einzelstrang Hybridisierung der Oligonukleotidprimer (Annealing) Bereich der vervielfältigt werden soll Polymerase-Reaktion (Extension) 2. Zyklus Denaturierung und Primer- Hybridisierung Zweiter Synthesezyklus Produkte des ersten Zyklus ursprüngliche Matrize Sichtbarmachen des Produkts weitere Zyklen exponentielle Vermehrung der vervielfältigten Fragmente nach 30 Zyklen: 2 28 = Fragmente Abb. 2: Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion

10 10 Die einzelnen Reaktionsschritte eines Zyklus sind: 1. Denaturierung des zu amplifizierenden DNA-Doppelstranges: Bei etwa C wird die Matrizen-DNA aufgeschmolzen. Es entstehen einzelsträngige DNA-Moleküle. 2. Primer-Hybridisierung (Annealing) an die einzelsträngige DNA: Die synthetischen Oligonukleotide binden bei Temperaturen von etwa C an die komplementären Zielsequenzen der Matrizen-DNA und leiten auf diesem Weg die Amplifikation des dazwischen gelegenen Sequenzabschnittes ein. 3. Synthese des Gegenstranges (Extension): Vom 3`-Ende der Primer ausgehend wird der Gegenstrang der Matrizen-DNA durch eine DNA-Polymerase synthetisiert (Extension). Die hier gewählte Temperatur entspricht in der Regel dem Temperaturoptimum der verwendeten Polymerase. Ursprünglich verwendete man als Polymerase das Klenow-Fragment der E. coli DNA- Polymerase I. Sie besitzt jedoch zwei entscheidende Nachteile: Nach jedem Denaturierungsschritt muss neues Enzym zugegeben werden, da es hitzelabil ist. Eine Automatisierung des Prozesses ist somit weitgehend unmöglich. Die Hybridisierungs- und Extensionstemperatur ist durch die Temperaturempfindlichkeit des Enzyms auf 37 C festgelegt. Primer können so eher unspezifisch binden und falsche Produkte entstehen. Der eigentliche Durchbruch der Methode wurde durch die Verwendung der hitzestabilen DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, der Taq-Polymerase, erreicht (Tab. 1). Ihr ungewöhnliches Temperaturoptimum von 72 C führt zur deutlichen Reduktion unspezifischer Reaktionen, vor allem durch die Verminderung von Sekundärstrukturen der einzelsträngigen Matrizen-DNA bei dieser Temperatur. Ihre Fehlerquote ist bei optimalen Reaktionsbedingungen mit 1/ sehr gering. Allerdings ist diese abhängig von der Konzentration der Desoxynukleotidyltriphosphate und Mg 2+ -Ionen, der Enzymkonzentration und der Zykluszahl. Häufig wird an das 3`-Ende des neusynthetisierten Stranges vom Enzym ein Desoxyadenosin angehängt. Durch die Temperaturunempfindlichkeit der Taq-Polymerase ist der PCR-Prozess erst automatisierbar geworden. Durchgeführt werden die PCR-Experimente in Thermocyclern. Dieser besteht aus einem temperierbaren Reaktionsraum, in den die PCR-Probengefäße gegeben werden. Eine automatische Steuerung regelt ein zyklisches Temperaturprogramm, wobei die jeweilige Temperatur, Zeit pro Reaktionsschritt und Zyklenzahl individuell programmierbar sind. Moderne Thermocycler erreichen Zykluszeiten von < 1 min, so dass eine PCR mit 30 Zyklen in weniger als 1 h beendet ist. Mit der Möglichkeit viele Proben parallel zu bearbeiten, hat sich die PCR als Routinemethode etabliert. Tab. 1: Standardparameter für die Polymerase-Kettenreaktion mit der Taq-Polymerase Parameter Enzymkonzentration Desoxynukleotide Magnesiumkonzentration Ionenkonzentration ph-wert DNA-Konformation Denaturierung Primer-Konzentration Annealing-Temperatur Polymerisation Zyklenzahl Standard-PCR-Bedingungen 1,0-2,0 Units je µm 1,2-2,5 mm 40 mm NaCl/ 50 mm KCl 8,8 linear s bei C 0,025-0,2 µm 5 C unter T m des Primers s bei C 25-35

11 11 Die PCR wird meist zur Amplifikation von DNA-Sequenzen von ca. 200 bis Basenpaaren Länge benutzt. Bei längeren Sequenzen wird die Gefahr, dass die Taq- Polymerase ein falsches Nukleotid einbaut, groß. Durch Verwendung verschiedener DNA- Polymerasen, meist einer Variante der Taq-Polymerase und einer thermostabilen DNA- Polymerase mit einer 3` 5`- Exonuklease (proofreading) -Aktivität, wie z.b. der Pwo- Polymerase, können sogar DNA Sequenzen von Basenpaare Länge und mehr amplifiziert werden. Sie arbeiten mit 5-15mal größerer Kopiergenauigkeit als die Taq- Polymerase Als Primer werden Oligodesoxynukleotide von 15 bis 30 Basenpaaren Länge und nicht zu geringem GC-Gehalt eingesetzt, um zu gewährleisten, dass die Hybridisierung spezifisch ist und die hybridisierten Primer bei der optimalen Polymerisationstemperatur von 72 C nicht von der Matrizen-DNA dissoziieren. Für die Anlagerung der strangspezifischen Primer an die einzelsträngigen DNA-Moleküle muss eine geeignete Temperatur (Annealing-Temperatur) gewählt werden, die nur die Hybridisierung der Primer an die komplementäre Zielsequenz zulässt. Bei den meisten PCR- Experimenten wird eine Annealing-Temperatur von 5 C unter der berechneten Schmelztemperatur gewählt. Bei dieser Temperatur bindet ein Primer in der Regel nur an seine vollständig komplementäre Sequenz, bei Basenfehlpaarungen ist keine effiziente DNA- Doppelstrangbildung möglich. Bei zu niedrigen Temperaturen kann es jedoch zu unspezifischen Hybridisierungen mit anderen ähnlichen Sequenzbereichen der Matrizen- DNA kommen. Andererseits ist die Hybridisierung mit den Zielsequenzen bei Temperaturen deutlich höher als T m nicht effizient genug, und die Ausbeute der PCR wird sehr gering. Als Schmelztemperatur T m wird diejenige Temperatur bezeichnet, bei der die betrachteten DNA-Moleküle zu 50 % denaturiert, also einzelsträngig vorliegen. Die Schmelztemperatur eines PCR-Primers lässt sich mit einer Vielzahl verschiedener Formeln berechnen. Bis zu einer Größe von etwa 25 bp kann die Schmelztemperatur annäherungsweise anhand der Zusammensetzung aus G C und A = T-Paaren berechnet werden. Der Beitrag eines G C-Paares zur Schmelztemperatur beträgt etwa 4 C, der eines A = T-Paares 2 C. Die zu wählende Zyklenzahl hängt von der Menge der Matrizen-DNA ab, die in das PCR- Experiment eingesetzt wird. Man geht davon aus, dass bei etwa Matrizen-Molekülen 25 bis 30 Zyklen optimal sind. Bei 50 oder weniger Matrizenmolekülen in einem PCR-Ansatz kann es sinnvoll sein, die Zyklenzahl auf 40 bis 45 zu erhöhen. In der Anfangsphase einer PCR erhöht sich die Produktmenge exponentiell. Die für die ersten Zyklen geltende Abhängigkeit zwischen Amplifikation und Zyklenzahl lässt sich wie folgt beschreiben: Y n = (1 + R) n Y = Amplifikationsfaktor n = Anzahl der Zyklen R = Effizienz der Amplifikation (0 R 1) Erfahrungsgemäß beträgt R etwa 0,7 bis 0,8 bei Reaktionen bis zu 30 Zyklen. Abhängig ist R von der Menge an Ausgangsmolekülen und der Sequenz der Matrizen-DNA. Die Zyklenzahl, bis zu der diese exponentielle Abhängigkeit gilt, ist für jede PCR individuell verschieden. In der Regel kann man davon ausgehen, dass etwa bis zum 20. Zyklus die obige Gleichung gültig ist. Bei höheren Zyklenzahlen wird die Amplifikationsrate zunehmend geringer (Abb. 3). Das liegt zum einen daran, dass dann die in höherer Konzentration vorliegende Produkt- DNA in verstärktem Maße mit sich selbst (re)hybridisieren kann und damit in Konkurrenz zu den Primern tritt. Zudem ist die Konzentration der Taq-Polymerase bei hoher Zyklenzahl limitierend, da die Menge an Matrizen-DNA die der Taq-Polymerase übersteigt. Es sollte vermieden werden, die PCR-Parameter so zu wählen, dass dieser Zustand erreicht wird. Zum einen kann die Ausbeute nicht mehr wesentlich gesteigert werden, zum anderen treten

12 12 unerwünschte Effekte auf, wie beispielsweise eine Zunahme von unspezifischen Nebenprodukten und eine Steigerung der Polymerisationsfehler der Taq-Polymerase. log (Produktmenge) Amplifikationseffizienz Plateau-Phase exponentielle Phase Zykluszahl Zykluszahl Abb. 3: Zusammenhang zwischen Zykluszahl und Produktmenge bei der Polymerasekettenreaktion. Nur unter optimalen Bedingungen, die annähernd während der ersten Zyklen gegeben sind, folgt die Produktbildung einem exponentiellen Gesetz. Mit der Akkumulation des Reaktionsproduktes Pyrophosphat, der zunehmenden Konkurrenz zwischen Primer und komplementärem DNA-Strang um die Matrize, sowie der Konkurrenz der Matrizen-Moleküle um die Polymerase und deren Denaturierung kommt es zu einer Reaktionsverlangsamung bis in der Plateauphase kaum noch eine Amplifikation stattfindet. Entsprechend nimmt die Amplifikationseffizienz von 2 auf 1 ab. Zu beachten ist, dass die Halbwertszeit der Taq-Polymerase bei 92,5 C etwa 2 h beträgt, bei 97,5 C jedoch drastisch auf 5 min sinkt. Der Denaturierungsschritt bei einer PCR wird daher in den meisten Fällen jeweils s lang bei C durchgeführt, so dass die Taq-Polymeraseaktivität bis zum letzten Zyklus erhalten bleibt. Die große Leistungsfähigkeit der PCR beruht auf folgenden Besonderheiten des Verfahrens: 1. der exponentiellen Amplifikation. 2. der hohen Empfindlichkeit (Sensitivität), die es im Prinzip erlaubt, sogar noch ein Molekül spezifischer DNA im hohen Überschuss unspezifischer DNA nachzuweisen. 3. der hohen Spezifität, die durch die genaue Hybridisierung der Primer mit den komplementären Sequenzen der DNA-Matrize gegeben ist und die man durch die Annealing-Temperatur beeinflussen kann. 4. der beträchtlichen Robustheit des Verfahrens, die es möglich macht, DNA reproduzierbar auch in komplexer Matrix spezifisch nachzuweisen. 5. des apparativ geringen Aufwands für die Durchführung der PCR durch mikroprozessorgesteuerte Thermocycler und für die Analyse der PCR-Produkte mit Hilfe konventioneller Gelelektrophoresegeräte. Die verschiedenen Anwendungsgebiete der PCR Mittels PCR kann man DNA- und RNA-Sequenzen anreichern, die nun direkt für molekularbiologischen Untersuchungen, einschließlich Klonierung, Sequenzierung und Restriktionsanalyse, eingesetzt werden. Aufgrund der Einfachheit und Schnelligkeit des Verfahrens hat die Polymerase-Kettenreaktion eine so schnelle Verbreitung gefunden, wie kaum eine andere Technik zuvor. Durch spezielle Anpassungen und Verknüpfungen mit anderen Methoden ist die PCR in vielen Forschungsbereichen ein unentbehrliches Hilfsmittel geworden.

13 13 Anwendung in der Evolutionsforschung Ein Beispiel für die Vielseitigkeit der Polymerase-Kettenreaktion ist die Anwendung in der paläontologischen Genetik bzw. molekularen Paläontologie. Fossile DNA ausgestorbener Spezies war bislang für genetische Untersuchungen kaum zugänglich, da die geringen Mengen an konservierter DNA eine weitreichende Analyse nicht zuließen. Erst mit Hilfe der PCR Technik konnte fossile DNA amplifiziert und im Anschluss daran molekularbiologisch näher charakterisiert werden. Die aus solchen Untersuchungen gewonnenen Daten führten zu einer teilweisen Neuordnung von systematischen Verwandtschaftsverhältnissen und ermöglichten darüber hinaus die phylogenetische Einordnung von unbekannten Spezies. Anwendung in der medizinischen Diagnostik Von herausragender Bedeutung ist die medizinische Anwendung der PCR-Technik. Mit zunehmendem Wissen über spezifische humane Gene und deren Mutationen, die oft die molekulare Ursache einer genetisch bedingten Krankheit sind, ist die Analyse solcher Genveränderungen für die medizinische Diagnostik von hochrangiger Bedeutung. Neben der Charakterisierung von Erbkrankheiten wie Thalassämien, Cystische Fibrose oder Tay- Sachs-Syndrom sind mit Hilfe der PCR auch verschiedene Krebserkrankungen auf der Ebene von Genmutationen untersucht worden. Eine andere medizinische Anwendung der PCR ist der Nachweis von viralen oder bakteriellen Infektionen. Statt eines konventionellen Nachweises durch Kutlivierung der Erreger oder mit Hilfe von immunologischen Tests können PCR-Analysen vor allem schneller, sensitiver und auch schon vor Krankheitsausbruch eine Infektion nachweisen. Erregerspezifische Oligonukleotid-Primer werden verwendet, um bestimmte Genabschnitte von pathogenen Bakterien oder Viren zu amplifizieren. Bedeutende Anwendungsbeispiele sind die klinische PCR-Diagnose von Aidsund Tuberkulose-Infektionen, die durch konventionelle Methoden erst viel später nachzuweisen sind. Gezielte Sequenzveränderungen durch PCR Ein elementarer Arbeitsschritt in der modernen DNA-Technologie ist die gezielte Veränderung von DNA-Sequenzen. Dieser Vorgang wird als gerichtete Mutagenese bezeichnet. Er wird angewendet, um beispielsweise die Funktionen bestimmter DNA- Abschnitte oder die Bedeutung einzelner Aminosäuren für die biologische Aktivität von Proteinen zu untersuchen. Eine solche gezielte Veränderung auf der DNA-Ebene, z.b. eine Punktmutation, lässt sich unter Zuhilfenahme der PCR-Technik einfach durchführen. Mutationen innerhalb von PCR-Fragmenten können durch die Verwendung von Primern mit Sequenzabweichungen an ihrem 5`-Ende im Vergleich zur Matrizen-DNA erzeugt werden, da für die Polymerisationsreaktion bei der PCR nur am 3`-Ende eine vollständige Basenkomplementarität zwischen Primer und Matrizen-DNA erforderlich ist. Auf diesem Weg können peripher in PCR-Produkte Mutationen eingeführt werden, beispielsweise zusätzliche Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme, die für die Konstruktion von rekombinanten DNA- Sequenzen sehr nützlich sind. PCR in der Kriminaldiagnostik Geringste Mengen von DNA beispielsweise in Blut- oder Haarfunden an einem Tatort können mittels PCR amplifiziert werden, um anschließend eine genetische Analyse damit durchzuführen. Der genetische Fingerabdruck ist solch ein Analyseverfahren, mit dem individuelle genetische Merkmale sichtbar werden. PCR zum Nachweis von gentechnisch veränderten Lebensmitteln Seit der am 15. Mai 1997 in Kraft getretenen Verordnung über neuartige Lebensmittel und Lebensmittelzutaten ( Novel Food -Verordnung) müssen gentechnisch veränderte Lebensmittel gekennzeichnet werden. Sie schreibt für Erzeugnisse, die vermehrungsfähige gentechnisch veränderte Organismen enthalten oder aus solchen bestehen und für Erzeugnisse, die sich gegenüber vergleichbaren konventionellen Lebensmitteln wissenschaftlich nachweisbar unterscheiden, eine Kennzeichnung vor. Zur Kontrolle dieser

14 14 Kennzeichnungsvorschrift durch die zuständigen Überwachungsbehörden sind geeignete standardisierte Nachweisverfahren erforderlich. Durch die gentechnische Modifikation unterscheidet sich der gentechnisch veränderte Organismus (GVO) in mindestens einer Eigenschaft vom entsprechend nicht gentechnisch veränderten Organismus. Dieser Unterschied bzw. die durch den gentechnischen Eingriff verursachte Änderung auf DNA-Ebene kann prinzipiell zur Identifikation von Lebensmittelrohstoffen, Lebensmitteln und Lebensmittelzutaten herangezogen werden. Alle entwickelten Nachweisverfahren bauen direkt auf den Nukleotidsequenzen der neueingeführten genetischen Information auf. Voraussetzungen hierfür sind, dass im Rohstoff oder Lebensmittel noch hinreichend intakte rekombinierte DNA vorhanden ist und die Kenntnis der gentechnischen Veränderung. Aufgrund ihrer hohen Sensitivität, ihrer Spezifität und Schnelligkeit ist die Polymerasekettenreaktion die Methode der Wahl, um die neueingeführten Erbinformationen auch in äußerst geringen Konzentrationen spezifisch nachzuweisen. Standardisierte Nachweismethoden existieren beispielsweise für transgene Kartoffeln, transgene Mikroorganismen in Rohwurst und Joghurt, sowie für die von der Firma Monsanto in den Verkehr gebrachten herbizidtoleranten Sojabohnen, die in die amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren gemäß 35 des Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes (LMBG) aufgenommen wurden. Für die Ableitung der Primer werden Sequenzen aus dem Zielgen, den Marker- oder Selektionsgenen und Regulatorgenen verwendet. Für einfache Screening-Zwecke eignen sich Sequenzen aus dem Promotor- und dem Terminatorbereich, da diese bei sehr vielen transgenen Pflanzen identisch sind. Für den spezifischen Nachweis der gentechnischen Veränderung werden Sequenzen aus dem Zielgen oder Sequenz-Kombinationen auf Regulator- und Zielgen verwendet. Schwierigkeiten beim Einsatz der PCR ergeben sich bei verarbeiteten Lebensmitteln und isolierten Produkten (z.b. Brot, Stärke, Käse mit Chymosin, Zucker, Tomatenketchup), wenn die DNA durch mechanische Kräfte, chemische Hydrolyse oder enzymatische Prozesse stark fragmentiert wurde. Außerdem kann die Verarbeitung zu einem vollständigen Abbau oder zur Entfernung der DNA führen. Des weiteren können eine Reihe von Lebensmittelbegleit- und inhaltsstoffe die PCR schon in sehr geringen Konzentrationen inhibieren. 5.2 Experimenteller Teil In diesem Versuch soll die genetische Veränderung in glyphosattoleranten Sojabohnen (Roundup Ready ) mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion nachgewiesen werden. Der Nachweis der gentechnischen Veränderung erfolgt mit dem für Sequenzen der Roundup Ready Sojabohne spezifischen Primerpaar B1/B2, welches an der CaMV-35S- Promotorsequenz und an die Petunia hybrida Chloroplasten-Transit-Signal-Sequenz (CTP) bindet. Mit diesem Primerpaar wird ein PCR-Produkt einer Größe von 172 Basenpaaren erzielt. Die Amplifizierbarkeit der isolierten chromosomalen DNA aus konventionellen und Roundup Ready Sojabohnen wird in einem Parallelansatz mit einem Primerpaar GM03/GM04 kontrolliert, das aus dem Bereich des Lektin-Gens stammt. Das Lektin-Gen ist speziesspezifisch für Glycine max. Mit diesem Primerpaar wird ein PCR-Produkt einer Größe von 118 Basenpaaren erhalten. Im Anschluss an die PCR werden die PCR-Produkte elektrophoretisch im Agarosegel aufgetrennt und mittels eines DNA-Größenstandards auf die zu erwartenden Produktgrößen überprüft.

15 15 C: PCR-Analyse Materialien: Desoxynukleotid-triphosphat (dntp)-lösung, enthält jeweils 10 mm datp, dctp, dgtp, dttp. Primerpaar GM03/GM04, jeweils 10 pmol/µl GM03: 5`-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3` GM04: 5`-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3` Primerpaar B1/B2, jeweils 10 pmol/µl B1: 5`-TGA TGT GAT ATC TCC ACT GAC G-3` B2: 5`-TGT ATC CCT TGA GCC ATG TTG T-3` 10 x PCR Pufferlösung 200 mm Tris-HCl 500 mm KCl Taq DNA Polymerase 5 U/µl 50 mm MgCl 2 Durchführung: Für die PCR pro Ansatz die folgenden Lösungen in ein steriles 0,5 ml PCR-Gefäß pipettieren: Lösungen 10 x PCR Pufferlösung 10 mm dntp-lösung 50 mm MgCl 2 20 pmol Primer DNA (10-50 ng) Taq DNA Polymerase H 2 O bidest. Volumen 10 µl 2 µl 3 µl 2 µl x µl 0,5 µl ad 100 µl die Taq DNA Polymerase am Ende zugeben, mischen, kurz zentrifugieren, um die Lösung am Gefäßboden zu sammeln. Die Proben bis zur Platzierung in den Thermocycler auf Eis stellen. In den Kontrollansatz (PCR ohne DNA-Template) H 2 O bidest anstelle der DNA-Lösung pipettieren. Die Reaktionsansätze in den Thermocycler überführen und das Temperatur-Zeit- Programm starten: 1. Denaturierung der DNA 2. 35maliger Durchlauf des folgenden Zyklus: Denaturierung Primer-Hybridisierung Elongation 3. abschließende Elongation 3 min 45 sec 30 sec 1 min 3 min 95 C 95 C 60 C 72 C 72 C Nach Beendigung der PCR jeweils 15 µl der PCR-Proben in ein neues Eppendorfgefäß überführen und die restlichen Proben bei 20 C aufbewahren.

16 16 D: Agarosegelelektrophorese zur Analyse der PCR Produkte Jeweils 15 µl der PCR-Proben werden mit 3 µl Proben-Auftragspuffer versetzt. Parallel zu den untersuchenden PCR-Proben wird ein geeigneter DNA-Größenstandard (100 bp DNA Leiter) aufgetragen. Analysiert werden die Proben in einem 1,5 %igen Minigel. Gelelektrophorese und Färbung gemäß Abschnitt B (Seite 6). 6. Versuch 3 Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli K12-Stämmen 6.1 Theoretischer Teil Grundlagen von Plasmidvektoren - Molekularbiologie bakterieller Plasmide Eigenschaften von Plasmiden Das Darmbakterium Escherichia coli enthält den größten Teils seiner Gene, die für verschiedene Proteine kodieren, auf einem einzelnen, zirkulären Chromosom mit einer Größe von 4 x 10 6 bp. Die meisten, aus natürlichen Habitaten isolierten Bakterien besitzen zusätzlich kleine zirkuläre DNA-Moleküle von 2 bis 600 kb Länge, die als Plasmide bezeichnet werden. Das Vorkommen der Plasmide ist nicht nur auf E. coli beschränkt; ihr Nachweis gelang in den meisten Gram-positiven und Gram-negativen Organismen, in einigen Hefen, aber nicht in höheren Eukaryonten. Per Definition sind Plasmide zirkuläre, extrachromosomal lokalisierte, doppelsträngige DNA-Moleküle, die sich autonom vom Wirts-Genom replizieren und mit diesem koexistieren. Lineare Plasmide konnten als seltene Ausnahmen bislang nur bei Streptomyceten nachgewiesen werden. Plasmide kodieren für Genprodukte, die für ihre Vermehrung, ihre Stabilität und gegebenenfalls für ihre Übertragung in andere Bakterienzellen verantwortlich sind. Charakteristisch für alle Plasmide ist eine spezifische Region mit dem Ursprungspunkt der DNA-Replikation (ori), die ihre autonome Vermehrung in der Wirtszelle ermöglicht. Zusätzlich kodieren sie für Funktionen, die ihren bakteriellen Wirten ein Überleben oder zumindest einen Wachstumsvorteil unter bestimmten Umweltbedingungen sichern (Tab. 2). Tab. 2: Eigenschaften einiger natürlich vorkommender Plasmide Plasmid Herkunft Größe [bp] Kopienzahl Phänotyp ColE1 RSF1010 psc101 Escherichia coli Escherichia coli Salmonella panama Colicin-Produktion Streptomycin-Resistenz Tetracyclin-Resistenz Weit verbreitet unter natürlichen Plasmiden ist die Vermittlung von Antibiotikaresistenzen, die sich durch Konjugation, also den gezielten Transfer der Plasmide von einer Donor- in eine Rezipientenzelle in Bakterienpopulationen ausbreiten können. Das Plasmid psc101 enthält ein Resistenzgen für das bakteriostatische Antibiotikum Tetracyclin (Translationsinterferenz von Tetracyclin: hemmt die Bindung der Aminoacyl-tRNA an die 30 S-Untereinheit der Ribosomen), während ein RSF1010-Genprodukt das bakterizide Antibiotikum Streptomycin

17 17 (Translationsinterferenz von Streptomycin: inhibiert den Kettenstart und führt zu Ablesefehlern der mrna) durch Modifikation inaktiviert. Plasmid-kodiert sind auch die Bacteriocine, toxische Proteine, die von Bakterien zur Bekämpfung von artgleichen oder nahe verwandten Nahrungskonkurrenten eingesetzt werden, wie das die Cytoplasmamembran depolarisierende Colicin des Plasmids ColE1. Auf gentechnische Arbeiten mit Plasmiden haben die Mechanismen Einfluss, mit denen ihre Kopienzahl in einer Bakterienzelle reguliert wird (Abb. 4). Die Kopienzahl eines Plasmids ist definiert als das Verhältnis der Anzahl der Plasmidkopien zur Anzahl der bakteriellen Chromosomen. Bei einer stringenten Replikationskontrolle ist die Vermehrung von Plasmidund chromosomaler DNA verknüpft, so daß 1 2 Kopien pro Zelle vorliegen, während bei der relaxierten Kontrolle die Plasmidreplikation unabhängig erfolgt und Kopienzahlen > 20 auftreten. Diese sog. Multicopy-Plasmide unterliegen der Amplifikation, d.h. sie können ihre Replikation in Gegenwart des bakteriostatischen Antibiotikums Chloramphenicol (bindet an die 50 S-Untereinheit der Ribosomen und verhindert die Bildung der Peptidbindungen) fortsetzen. Die Inhibition der Translation durch Chloramphenicol stoppt nur die chromosomale DNA-Synthese, während die Zahl der Plasmide auf bis zu 3000 Moleküle pro Zelle gesteigert werden kann. Abb. 4: Kontrolle der Plasmidreplikation Plasmide in der Gentechnologie Für die Vermehrung von Fremd-DNA in E. coli ist es notwendig, die exogene DNA mit den Kontrollelementen zur Replikation im bakteriellen Wirt zu supplementieren. Diese wirtsspezifischen Sequenzabschnitte sind auf Bakteriophagen oder Plasmiden lokalisiert, die Vektoren für die Aufnahme zu klonierender DNA darstellen. Der Vorgang der DNA- Klonierung (Abb. 5) umfasst damit die Arbeitsschritte: Integration von Fremd-DNA in einen Vektor Transformation der chimären Vektoren in Empfängerzellen Selektion von Klonen mit rekombinanter DNA

18 18 einzusetzende Fremd- DNA rekombinante DNA Plasmid -Vektor Ligation Antibiotikaresistenzgen Einschleußen in Wirtszellen (Transformation) Kultivierung und Selektion von Zellen mit rekombinanter DNA antibiotikahaltiger Nährboden Abb. 5: Prinzip der DNA-Klonierung Für gentechnische Arbeiten sollten Plasmide folgende Eigenschaft besitzen: niedrige Molmasse (Effizienz der Transformation sinkt mit zunehmender Größe des Plasmids) phänotypische Marker (zur Übertragung von selektierbaren Merkmalen, wie z.b. Antibiotikaresistenzen, die den transformierten Zellen neuartige, leicht nachweisbare Eigenschaften verleihen) singuläre Schnittstellen für Restriktionsendonukleasen (für die Integration der Fremd-DNA; Schnittstellen sollten im kodierenden Bereich eines Markers liegen, um den entsprechenden Phänotyp zu inaktivieren) Die natürlichen Plasmide erfüllen diese Kriterien im allgemeinen nicht gleichzeitig, so dass rekombinante Vektoren entwickelt wurden. Der Prototyp der modernen Klonierungsvektoren (Abb. 6) ist das Plasmid pbr322 (p steht für Plasmid, B und R sind die Initialen der Konstrukteure Bolivar und Rodriquez, Seriennummer 322), dessen Tetracyclin-Resistenzgen aus psc101 und dessen ori aus ColE1 stammt.

19 19 Abb. 6: Aufbau des Vektors pbr322 Hervorzuheben sind die beiden Gene für die Resistenz gegen die Antibiotika Tetracyclin und Ampicillin (bakterizide Ampicillin-Wirkung durch Inhibition der Zellwandsynthese), die für die Restriktionsenzyme Pst I und EcoR V singuläre Erkennungssequenzen besitzen und sich zur Klonierung von Fremd-DNA anbieten. Nach erfolgter Transformation in E. coli können durch Selektion auf das intakte Resistenzgen mit einem Antibiotika-haltigen Nährboden nur Plasmid-haltige Zellen überleben. Durch Testen der Sensitivität hinsichtlich des zweiten Antibiotikums lassen sich Klone mit rekombinanten Plasmiden identifizieren (Abb. 7). Die geringe Kopienzahl, die Größe und die Verteilung der Klonierungsstellen von pbr322 haben zur Entwicklung von verbesserten Plasmidvektoren geführt. Weit verbreitet sind die Derivate der puc-vektorserie (Abb. 8) (UC: University of California), deren Polylinker eine multiple Klonierungsstelle (MCS, multiple cloning site) darstellt und auf einem kurzen Stück DNA singuläre Schnittstellen für verschiedene Restriktionsendonukleasen aneinandergereiht enthält.

20 20 Abb. 7: Selektion von pbr322-tragenden Bakterien Abb. 8: Restriktionskarte des Vektors puc19 (MCS: Polylinker) Funktion der Restriktionsendonukleasen Die gezielte Rekombination von DNA-Molekülen setzt Methoden voraus, um den DNA- Doppelstrang in definierte Fragmente mit Enden bekannter Sequenz zu zerlegen. Lösungsansätze ergaben sich aus dem Restriktions-Modifikations-System von Bakterien zur Abwehr von Infektionen durch Bakteriophagen (Abb. 9). Dieses wirtsspezifische Modifikationssystem besteht aus Methylasen, welche die bakterielle DNA durch Methylierung an der Aminogruppe von Adeninresten (Abb. 10) oder der C(5)-Position vom Cytosin vor Nukleaseabbau schützen, und aus Restriktionsendonukleasen, die eingedrungene Fremd- DNA anhand von Erkennungssequenzen spalten.

21 21 Abb. 9: Schutzfunktion des Restriktions-Modifikations-Systems von Bakterien Abb. 10: Blockierung der EcoR I-Schnittstelle durch Methylierung Man unterscheidet drei Typen von Restriktionsenzymen: Typ I: Typ II: Typ III: Schnittstellen mindestens 1000 bp von der Erkennungssequenz entfernt. sequenzspezifische Spaltung Schnittstelle max. 26 bp von der Erkennungssequenz entfernt Die DNA Hydrolyse innerhalb der Erkennungssequenz prädestiniert die Typ II- Restriktionsendonukleasen (Tab. 3) für gentechnische Arbeiten. Bereits 1983 waren 355

22 22 verschiedene Restriktionsenzyme mit 91 Spezifitäten aus über 200 verschiedenen Bakterienstämmen charakterisiert worden. Die Nukleasen werden nach dem ersten Buchstaben der Gattung sowie den beiden ersten Buchstaben der Spezies des Produzenten benannt und durch die Angabe des Serotyps sowie, bei mehreren verschiedenen Enzymen pro Wirt, durch eine römische Zahl näher klassifiziert. Tab. 3: Erkennungs- und Schnittstellen von Typ II-Restriktionsendonukleasen Die Mehrzahl der Typ II-Restriktionsenzyme erkennen und hydrolysieren DNA-Moleküle an bestimmten Tetra- oder Hexanukleotidsequenzen, die eine zweifache Rotationssymmetrie zeigen. Diese Palindrome besitzen in 5` 3`- Leserichtung auf den komplementären Strängen eine identische Sequenz. Die entstehenden Restriktionsfragmente können glatte

23 23 Enden (blunt ends) oder kohäsive Enden (sticky ends) mit 5`-überstehenden oder 5`eingezogenen Einzelsträngen aufweisen. Da für jede Base die Wahrscheinlichkeit, an einer beliebigen Nukleotidposition aufzutreten, 1 : 4 beträgt, werden bei einer Erkennungssequenz von n bp DNA-Fragmente erzeugt, die im Durchschnitt 4 n bp lang sind. E. coli K12-Stämme Für gentechnische Arbeiten haben E. coli K12-Derivate den Status von Sicherheitsstämmen erlangt und werden als Empfängerorganismen zur Herstellung rekombinanter Bakterien eingesetzt. Der ursprüngliche E. coli Stamm K12 wurde 1922 aus dem Darm eines Diphteriepatienten an der Stanford-Universität isoliert. Eine phänotypische Charakterisierung der Kultur zeigte signifikante Unterschiede zu den übrigen E. coli Wildtypstämmen, die auf spontane Mutationen während der Selektionsschritte bei der Isolierung zurückgeführt wurden und z.b. eine erneute Besiedlung des menschlichen Darms ausschlossen. Ausgehend von diesem Stamm sind durch Zufallsmutagenesen mit Röntgenstrahlen oder UV-Licht Derivate selektioniert worden, die vorteilhafte Eigenschaften für mikrobiologische oder gentechnische Arbeiten aufweisen. So besitzen die K12-Derivate E. coli DH5α, JM109 oder XL1-Blue den Genotyp enda1, der auf ein mutiertes Endonuklease-Gen hinweist und die Ausbeute sowie Qualität von Plasmidisolaten verbessert. Allen E. coli K12-Stämme ist gemeinsam, dass sie generell apathogen sind. Abb. 11 zeigt die Unterschiede zu virulenten E. coli Wildtypstämmen, die Toxine, Fimbrien-Adhäsine und O-Antigene bilden sowie ein Eisenaufnahmesystem und eine Kapsel besitzen. Abb. 11: Schematische Darstellung eines virulenten Wildtyp- (links) und eines apathogenen K12-Stammes (rechts). Zellwandaufbau von E. coli Kenntnisse über die Zellwandstruktur von Bakterien sind sowohl für die komplexen Vorgänge bei der Transformation als auch für die Isolierung von Plasmiden notwendig. E. coli gehört zur Gruppe der Gram-negativen Bakterien und enthält eine dreischichtige Zellwand (Abb. 12). Das Bakterium wird von einer äußeren Lipid-Doppelschicht umgeben, die durch Calcium-Ionen stabilisiert einen Schutz vor lytischen Enzymen, wie Lysozym, bietet. Auf diese Membran sind noch Lipopolysaccharide aufgelagert, die für die antigenen

24 24 Eigenschaften der Bakterien verantwortlich sind. Über Lipoproteine ist die äußere Bakterienhülle mit einem Peptidoglykan-Gerüst (Murein-Sacculus) verknüpft. Dieses Stützskelett der Zellwand (Abb. 13) besteht aus linearen Polysaccharidketten (aufgebaut aus alternierenden N-Acetylglucosamin- und N-Acetylmuraminsäureresten), die durch kurze Peptidbrücken quervernetzt werden. Die Mureinschicht und die nach innen folgende Cytoplasmamembran schließen den periplasmatischen Raum ein, in dem z.b. die Restriktionsendonukleasen des Bakteriums lokalisiert sind. Abb. 12: Schema des Zellwandaufbaus Gram-negativer Bakterien (CM, Cytoplasmamembran, PR, periplasmatischer Raum, M, Murein, ÄM, äußere Membran, GlcNAc, N-Acetylglucosamin, Gal, Galactose, Glc, Glucose, Glc-N, Glucosamin, Hep, Heptose, KDO, 2-Keto-3-desoxyoctonsäure)

25 25 Abb. 13: Struktur des Mureins von E. coli (die linke Seite zeigt einen Ausschnitt des Peptidoglykans, unten rechts ist das zweidimensionale Netzwerk perspektivisch gezeichnet; GlcNAc, G, N-Acetylglucosamin, MurNAc, M, N-Acetylmuraminsäure, Dpm, Diaminopimelinsäure) Transformation von E. coli Zentraler Punkt jedes Klonierungsexperiments ist die Einführung von rekombinanter Plasmid-DNA in Bakterienzellen durch den Vorgang der Transformation. Während in der Zellbiologie mit diesem Begriff die Entwicklung von normalen tierischen Zellen zu Zelltypen mit Wachstumseigenschaften von Krebszellen beschrieben wird, umfasst die Transformation in der Gentechnik die Übertragung von freier, löslicher DNA auf ein Empfänger-Bakterium. Zellen mit der Fähigkeit zur DNA-Aufnahme werden als kompetente Zellen bezeichnet. Die Möglichkeit, Plasmide ohne direkten Zell-Zell-Kontakt zu übertragen, ist zuerst bei den Bakteriengattungen Haemophilus, Neisseria und Bacillus beobachtet worden. Diese natürliche Kompetenz wird auf Veränderungen der Zelloberfläche während des Wachstumszyklus und die Adsorption von DNA in der mittleren exponentiellen Wachstumsphase zurückgeführt. E. coli besitzt keine natürliche Transformationskompetenz und muss durch chemische oder physikalische Methoden künstlich kompetent gemacht werden.

26 26 Abb. 14: Transformation von kompetenten Zellen nach dem Hanahan-Verfahren Als Standardmethode hat sich das Hanahan-Verfahren (Abb. 14) eingebürgert, bei dem osmotisch stabilisierte Suspensionen von E. coli K12-Stämmen bei 0 C mit Calciumchlorid- Lösung behandelt werden und nach einem kurzen Hitzeschock bei 42 C eine Transformationseffizienz von Transformanten/µg Plasmid-DNA erreichen können. Es wird vermutet, daß Calciumchlorid die Zellwandstruktur lockert und zusätzlich die DNA als schwerlösliches Calciumsalz auf der Zelloberfläche ausfällt, um die direkte Aufnahme der Plasmide zu erleichtern. Ohne zeitaufwendige Vorbehandlung können Bakterien direkt durch physikalische Techniken kompetent gemacht werden, wobei sich die Methode der Elektroporation als schnelles und einfaches Verfahren zur Transformation von pro- als auch eukaryontischen Zellen durchgesetzt hat. Suspensionen aus Spender-DNA und Empfängerzellen werden Hochspannungsimpulsen mit Feldstärken von V/cm ausgesetzt, wodurch eine transiente Steigerung der Permeabilität von Zellmembranen auftritt und die Fremd-DNA stabil aufgenommen wird. Eine Modifikation dieser Technik nutzt die Bildung von Eiskristallen, um die Zellwandstruktur löchrig zu machen, indem DNA-haltige Zellsuspensionen in flüssigem Stickstoff kurzzeitig eingefroren werden. Diese sogenannte snap freezing -Methode hat sich nur für die Transformation von E. coli Stämmen mit zirkulärer Plasmid-DNA bewährt, da ihre Effizienz mit Werten von maximal 10 4 Transformanten/µg Plasmid-DNA hinter den anderen Verfahren zurückbleibt. 6.2 Experimenteller Teil Eine Minipräparation von Plasmid-DNA wird immer dann der Groß-Präparation vorgezogen, wenn für anschließende Verfahren geringe Mengen an DNA (< 20 µg) ausreichend sind. Beispiele hierzu sind die PCR, Sequenzierungen oder Screening-Verfahren, mit denen die für weitere Analysen interessanten Klone erst identifiziert werden sollen. Dies kann im einfachsten Fall durch eine Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA zur Überprüfung von DNA- Inserts in ihren Vektoren durchgeführt werden. In diesem Versuch wird für die Minipräparation von Plasmid-DNA eine klassische Methode, basierend auf der alkalischen Lyse der Bakterien und Ethanol-Präzipitation der isolierten Plasmid-DNA nach Birnboim und Doly, verwendet. Isoliert wird das Plasmid pgfp UV aus dem Bakterium E. coli (Abb. 15). Dieses Plasmid enthält das Gen für das Grüne