Antibiotika-Resistenz und. mikrobiologische Diagnostik.

Transkript

1 Antibiotika-Resistenz und mikrobiologische Diagnostik

2 Agenda Was bedeutet Resistenz Wie messen wir Empfindlichkeit Was hat sich mit EUCAST verändert Wichtige Resistenzmechanismen Resistenzentstehung / -übertragung Phänotypische Resistenzprüfung DNA-basierte Methoden Was können wir heute schon tun

3 Patient S.M Jetziges Leiden: Sommerferien 2009 Zypern Husten, Fieber, Atemnot Maskenbeatmung Nachweis Influenza A H1N Intubation mechanische Beatmung Antimykotika, Breitspektrumantibiotika, Repatriierung bei ARDS

4 Patient S.M. 1961

5 Patient S.M. 1961

6 Patient S.M Antimikrobielle Eintrittsmedikamente: Colistin iv. Meropenem iv. Linezolid iv. Caspofungin iv. 3 x 3 Mio IE 3 x 2g 2 x 600mg 1 x 50 mg (ca. Fr / d)

7 Bakteriologie Trachealsekret 1

8 Bakteriologie Trachealsekret 2

9 Patient S.M Massnahmen und Verlauf: Hygienemassnahmen (Isolierung) ab Eintritt Stopp aller antimikrobiellen Substanzen Verlegung in stabilem Zustand

10 Patientin W.E., Kollaps bei Mobilisation Verlegung Intensivstation bei Sepsis

11 Bakteriologie Trachealsekret => nosokomiale Übertragung

12 Bakteriologie Urin

13 Patientin W.E.1942 Verlauf: Langzeitbeatmung Dauerausscheidung von Carbapenem-resistenter K. pneumoniae (KPC) über 1 Jahr Dauerisolierungsmassnahmen

14 Antibiotika und Resistenz Was heisst Resistenz? Was bedeutet Empfindlichkeit?

15 Empfindlichkeitsprüfung 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Verdünnung Antibiotikum Inokkulum 10 5 Bakterien 24h Bebrütung

16 Empfindlichkeitsprüfung MHK 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Verdünnung Antibiotikum Inokkulum 10 5 Bakterien 24h Bebrütung MHK = minimale Hemmkonzentration (99%)

17 Empfindlichkeitsprüfung MBK MHK 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 Verdünnung Antibiotikum Inokkulum 10 5 Bakterien 24h Bebrütung MHK = minimale Hemmkonzentration (99%) MBK = minimale Bakterizidiekonzentration (100%)

18 Resistenz- bzw. Empfindlichkeit Empfindlichkeit = Wachstumshemmung des Mikroorganismus (visuell 99%) bei einer Konzentration der Testsubstanz innerhalb der therapeutischen Breite

19 Definition Empfindlichkeit: Breakpoint Bestimmung traditionell: Erreger unabhängige Grössen: - pharmakologische Parameter der Wirkstoffkonzentrationen in vivo - Toxizität - (klinische Wirksamkeitsdaten)

20 Definition Empfindlichkeit: Breakpoint Bestimmung traditionell: Erreger abhängige Grössen - in vitro Wachstumshemmung => MHK - pharmakokinetisch / phamakodynamische Berechnungen (Monacomodell) - (klinische Wirksamkeitsdaten)

21 Definition Empfindlichkeit: Breakpoint Bestimmung traditionell: Erreger unabhängige Grössen + Erreger abhängige Grössen Festlegung eines Schwellenwertes ( Breakpoint ) durch nationale Kommittees (zb Clinical Laboratory Standards Institute CLSI) Breakpoint: - ca 1/8 bis 1/4 der maximalen Plasmakonzentration

22 Definition Empfindlichkeit: Breakpoint ab 2011 EUCAST: European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing CH: Antibiotikakommittee der Schweizerischen Gesellschaft für Mikrobiologie

23 EUCAST Kahlmeter G. ECCMID 2010

24 Epidemiologischer cut-off: ECOFF Begrenzt die Wildtyp Population nach oben (keine Resistenz) ECOFF N Anzahl Isolate Wildtyp Nicht-Wild-typ(en) MHK

25 Epidemiologischer cut-off: ECOFF Benzylpenicillin bei Pneumokokken Brown D. ECCMID 2011

26 Epidemiologischer cut-off: ECOFF Penicillin bei Pneumokokken Kahlmeter G. ECCMID 2010

27 EUCAST-Definition Empfindlichkeit Susceptible = high likelihood of therapeutic success Intermediate = antimicrobial agent activity with uncertain therapeutic effect.... appropriately treated in body sites where the drugs are concentrated or high dosage of drug can be used; also indicates a buffer zone. preventing technical factors from causing major errors. Resistant = high likelihood of therapeutic failure

28 EUCAST Hat die intermediäre Kategorie also für viele Spezies/Antibiotika-Kombinationen abgeschafft. Begründungen: Pharmakokinetische/pharmakodynamische Daten Vermeiden einer Aufteilung des Wildtyps Eindeutige Therapieempfehlungen an die Kliniker

29 Resistenzmechanismen Generell gibt es nur 3 Grundmechanismen 1. Enzymatische Inaktivierung 2. Modifizierung der Zielstruktur 3. Influx / Efflux

30 Bakterielle Achillesfersen

31 Resistenzmechanismen bei Gram+ Spezies Genotyp Phänotyp Typ Mechanismus Staphylokokken meca MRSA (PBP2a) Modifizierte Zielstruktur Pneumokokken pbp Penicillin-Resistenz (Mosaiktyp) Modifizierte Zielstruktur Staphylokokken Pneumokokken Streptokokken erm MLS (Makrolid-Lincosamid- Streptogramin) induzierbar / konstitutiv Enzymatische Inaktivierung Staphylokokken aac, ant, aph Aminoglycosidresistenz Enzymatische Inaktivierung Staphylokokken Pneumokokken Streptokokken gyra Chinolonresistenz Modifizierte Zielstruktur Staphylokokken bla(x) Betalaktamase Penicillinresistenz Enterokokken pbp Penicillinresistenz (PBP5 bei E. faecium) Enterokokken vanabc Vancomycinresistenz (VRE) Enzymatische Inaktivierung Modifizierte Zielstruktur Modifizierte Zielstruktur

32 Resistenzmechanismen bei Gram+ Spezies Genotyp Phänotyp Typ Mechanismus Staphylokokken meca MRSA (PBP2a) Modifizierte Zielstruktur Pneumokokken pbp Penicillin-Resistenz (Mosaiktyp) Modifizierte Zielstruktur Staphylokokken Pneumokokken Streptokokken erm MLS (Makrolid-Lincosamid- Streptogramin) induzierbar / konstitutiv Enzymatische Inaktivierung Staphylokokken aac, ant, aph Aminoglycosidresistenz Enzymatische Inaktivierung Staphylokokken Pneumokokken Streptokokken gyra Chinolonresistenz Modifizierte Zielstruktur Staphylokokken bla(x) Betalaktamase Penicillinresistenz Enterokokken pbp Penicillinresistenz (PBP5 bei E. faecium) Enterokokken vanabc Vancomycinresistenz (VRE) Enzymatische Inaktivierung Modifizierte Zielstruktur Modifizierte Zielstruktur

33 Resistenzmechanismen bei Gram- Spezies Genotyp Phänotyp Typ Mechanismus Enterobacteriaceae Nonfermenter tem, shv Einfachere Betalaktamasen Enzymatische Inaktivierung Enterobacteriaceae Nonfermenter tem, shv, ctx, oxa, per, u.a. Extended Spectrum Betalaktamasen (ESBL) Enzymatische Inaktivierung Enterobacteriaceae Nonfermenter vim, ger u.a. Metallo-Betalaktamasen (MBL) Enzymatische Inaktivierung Enterobacteriaceae Nonfermenter dha, cit, fox, ampc, u.a. AmpC-Typ Betalaktamasen Enzymatische Inaktivierung Enterobacteriaceae Nonfermenter Enterobacteriaceae Nonfermenter Enterobacteriaceae Nonfermenter oprd, omp(x), u.a. Membranimpermeabilität Influx / Efflux gyra, parc Chinolonresistenz Modifizierte Zielstruktur aac, ant, aph Aminoglycosidresistenz Enzymatische Inaktivierung

34 Resistenzmechanismen bei Gram- Spezies Genotyp Phänotyp Typ Mechanismus Enterobacteriaceae Nonfermenter tem, shv Einfachere Betalaktamasen Enzymatische Inaktivierung Enterobacteriaceae Nonfermenter tem, shv, ctx, oxa, per, u.a. Extended Spectrum Betalaktamasen (ESBL) Enzymatische Inaktivierung Enterobacteriaceae Nonfermenter vim, ger u.a. Metallo-Betalaktamasen (MBL) Enzymatische Inaktivierung Enterobacteriaceae Nonfermenter dha, cit, fox, ampc, u.a. AmpC-Typ Betalaktamasen Enzymatische Inaktivierung Enterobacteriaceae Nonfermenter Enterobacteriaceae Nonfermenter Enterobacteriaceae Nonfermenter oprd, omp(x), u.a. Membranimpermeabilität Influx / Efflux gyra, parc Chinolonresistenz Modifizierte Zielstruktur aac, ant, aph Aminoglycosidresistenz Enzymatische Inaktivierung

35 Natürlich oder Erworben Resistenzen kommen als natürliche (intrinsische) vor Oder können erworben werden (übertragbare Resistenzen)

36 Natürliche Resistenzen Können durch spezifische Gene bedingt sein: ampc bei Enterobacter, Citrobacter etc. vanc bei Enterococcus gallinarum Können durch die Struktur der Bakterien bedingt sein: z.b. Penicillinresistenz der Gram-negativen Colistinresistenz der Gram-positiven

37 Natürlich oder Erworben Natürliche Resistenzen sind vorhersehbar durch Identifizierung Natürliche Resistenzen sind diagnostisch wertvoll (Colistin, Vancomycin) => typische Resistenzmuster Die meisten medizinisch relevanten Resistenzen sind übertragbar Übertragbare Resistenzen müssen gesucht werden

38 Übertragbarkeit von Resistenzen Transformation Pneumokokken Konjugation ESBL Transduktion S. aureus

39 Bakterien im Sammelfieber Bakterien sammeln Resistenz(gene) Resistenz ist ein unausweichlicher Evolutionsprozess durch Mutation und Selektion Je höher der Selektionsdruck (i.d.r. Antibiotika) desto mehr Resistenzmechanismen erwirbt ein Keim

40 Gentransfer: vertikal X Mutation (vermittelt Resistenz Gegen Antibiotikum) Antibiotikagabe = Selektionsdruck V E R T I K A L

41 Gentransfer: horizontal Plasmid (vermittelt Resistenz Gegen Antibiotikum) HORIZONTAL Antibiotikagabe = Selektionsdruck X

42 Selektionsdruck: Resistenz korreliert mit Antibiotikagebrauch

43 Beta-Laktam Ping-Pong einfache Beta- Laktamase = BL S. aureus BL Penicilline er Breitspekrumpenicilline, 1. Gen. Cephalosporine Breitspektrum- Betalaktamasen = BSBL TEM-1/2 SHV-1 Penicilline 1. Gen. Cephalosporine er 2. Gen Cephalosporine erste mutierte Breitspektrum- Betalaktamasen (BSBL) TEM-26 Penicilline 1. Gen. Cephalosporine 2. Gen. Cephalosporine er 3. Gen. Cephalosporine Inhibitorkombinationen Extendend Spectrum Betalaktamasen (ESBL) mutiert aus BSBL Breitspektrum- Betalaktamasen (BSBL) Inhibitorresistent (IRT) TEM-3 SHV-5 TEM-1/2 IRT Penicilline 1. Gen. Cephalosporine 2. Gen. Cephalosporine 3./4. Gen Cephalosporine Penicilline 1. Gen. Cephalosporine 2. Gen. Cephalosporine Inhibitorkombinationen (z.b. Augmentin) er er Carbapeneme 4. Gen. Cephalosporine Carbapenemasen NDM-1 KPC OXA-48 Penicilline Cephalosporine Inhibitorkombinationen (z.b. Augmentin) Carbapeneme 1990er-??? 2000er

44 Erkennung von Resistenzen Erregeridentifikation (natürliche Resistenzen) Phänotypische Resistenzprüfung: - Plättchendiffusionstest - Mikrodilutionsautomat (Vitek, Phönix) - E-test / MHK-Messung - Synergien / Antagonismus - selektive Medien / Platten Massenspektrometrie (MALDI-TOF) Genotypisch: - RT-PCR von Resistenzgenen - GeneXpert - Next-Generation Sequencing (NGS)

45 Erreger-Identifikation

46 Erregeridentifikation MALDI-TOF Massenspektrometrie (Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight) Methode zur Massen- Analyse von Makromolekülen Massensignale von ribosomalen und zytoplasmatischen Proteinen zur Speziesidentifikation (molekularer Fingerprint)

48 Minimale Hemmkonzentration (MHK) Mikrodilution E-test Mikrodilution / E-test: => Je kleiner die MHK, desto empfindlicher ist der Erreger

49 Plättchendiffusion: Kirby-Bauer Konzentrationsgradient Antibiotika- Plättchen Bakterien- Wachstum Hemmhof Plättchendiffusionstest: => Je grösser der Hemmhof, desto empfindlicher ist der Erreger

50 Erkennung von Resistenzen Synergie Antagonismus CAZ AMC Clavulansäure hemmt ESBL des Bakteriums => sichtbare Synergie zwischen Amoxy/Clav und Cefotaxim / Ceftazidim ESBL-Verdacht Clavulansäure induziert AmpC des Bakteriums => sichtbarer Antagonismus zwischen Amoxy/Clav und Ceftazidim AmpC-Verdacht

51 E-test vs Plättchendiffusion E-test Plättchendiffusion Berichterstattung quantitativ (MHK) qualitativ (S/I/R) Eichung / Referenz mit Breakpoint ohne Breakpoint Abschätzung Wirksamkeit ja bedingt Arbeitsaufwand sehr hoch niedriger Zeitaufwand 48 72h 48h Kosten hoch niedrig Einsatz Spezialfälle Routine

52 Beziehung MHK - Hemmhof MHK (mg/l) > >38 Hemmhof mm

53 Epidemiologischer cut-off: ECOFF Begrenzt die Wildtyp Population nach unten (keine Resistenz) N Anzahl Isolate Nicht-Wild-typ(en) Wildtyp Hemmhofdurchmesser

54 Verteilungskurve und Fehlerrate Penicillin bei S. aureus Nicht-Wildtyp Wildtyp Resistent Sensibel Sind Wildtyp und Nicht-Wildtyp klar getrennt, kann der ECOFF zum S/R Grenzwert werden, ohne dass Fehlklassifikationen resultieren

55 Verteilungskurve und Fehlerrate ECOFF = Form der Verteilungskurve und EUCAST R/S 17 /<17 Fehlerrate Messgenauigkeit E. coli

56 Verteilungskurve und Fehlerrate ECOFF = EUCAST R/S 17 /<17 Resistent? Messgenauigkeit Sensibel E. coli Überlappende Populationen verhindern eine klare Einteilung in Wildtyp und Nicht-Wildtyp durch einen ECOFF. Wird der ECOFF wie hier zum S/R Grenzwert spaltet er den Nicht-Wildtyp und es resultieren Fehlklassifikationen.

57 Plättchendiffusionstest: kalter Kaffee? Plättchendiffusionstest war jahrzehntelang der am meisten verbreitete Resistenztest Ablösung durch automatisierte Mikrodilution seit Jahren - Vitek, Phönix - Messung von 3-5 Verdünnungsstufen - extrapolierte MHK (Gerätealgorythmen) Beide Verfahren haben jedoch Vor- und Nachteile:

58 Plättchendiffusion / Mikrodilution Plättchendiffusion Mikrodilutionsautomaten Vorteile Nachteile Vorteile Nachteile Geringe Materialkosten Viel «Handarbeit» Wenig «Handarbeit» Höhere Materialkosten Kontaminationen und resistente Subpopulationen sofort erkennbar Flexible Antibiotikazusammenstellung Antagonismen/Synergien leicht erkennbar Kontaminationen und resistente Subpopulationen kaum erkennbar Vorgegebene Antibiotikazusammenstellung Relativ langsam Schnell Antagonismen/Synergien schwer zu detektieren Hohe Auflösung / Unterscheidung von Populationen Schwierige Standardisierung (Viel «Handarbeit») Hohe Standardisierung (Hersteller) Niedrigere Auflösung / Unterscheidung von Populationen

60 DNA-basierte Erreger-/Resistenzdiagnostik PCR-Vollautomat Keimidentifikation Molekulare Resistenzmarker ctxm OXA-48 NDM KPC VIM IMP Probe: pos. Blutkultur Nanosphere Verigene System Zeitbedarf: ca 3h 12 24h

61 Detektion ab Direktmaterial

62 GeneXpert : erhältliche Tests GeneXpert für Resistenz GeneXpert Test Xpert MRSA/SA Xpert EV Xpert Flu Xpert CT/NG Xpert vana/vanb Xpert BA 4-Plex Xpert HemosIL FII&FV Xpert BCR-ABL Xpert GBS Xpert MTB/RIF Xpert C. difficile Nachweis von MRSA/S. a ureus Enteroviren (Meningitis) Influenza A, Influenza B, pandemic strain 2009 H1N1 C. tra ch o m a tis /N. g o n orrho ea e va n A/van B Resistenzgen bei Enterokokken B. a nth racis Factor II und Factor V Alleles BCR-ABL Oncogene (CML, ALL) Gruppe-B-Streptokokken M. tuberculo sis -Komplex/Rifampicin Resistenzmutationen C. d ifficile

63 phänotypisch - genotypisch phänotypisch genotypisch Zeitaufwand langsam (>48h) sehr schnell (<2h)* Informationsgehalt breit gezielt Interpretation direkt via Datenbank Einsatz Routine / Screening Bestätigung hoher Verdacht Arbeitsaufwand hoch niedriger Materialkosten niedriger hoch * falls ab Direktmaterial möglich

64 Next Generation Sequencing (NGS) Parallele Durchführung von Millionen Sequenzierungsreaktionen ( Mio Sequenzen / Analyse Zusammenstellung der sequenzierten DNA-Stücke und Abgleich mit Datenbanken Whole Genome Sequencing bakterieller Genome schnell und billig Sensitivität sollte genügen, um ab Direktmaterial zu arbeiten (ohne vorgängige )

65 NGS in der Mikrobiologie Identifikation von Mikroorganismen (whole Genome, 16s rrna Gen, andere) Genetische Resistenzprüfung inkl. Mechanismen Virulenzfaktoren Typisierung

66 Resistenzdruck: Was tun? schmal breit

67 Resistenzdruck: Was tun? Schnellere Identifikation Schnellere Empfindlichkeitsprüfung (Semi)quantitative Empfindlichkeitsprüfung Kluge Kommunikation mit Klinikern => Raschere Therapieoptimierung (Spektrum) => Genauere Therapieanpassung (Substanz, Dosis) => Rasche Anpassung der Hygienemassnahmen

68 Herzlichen Dank Jacques Gubler Michael Hombach Peter Keller Reinhard Zbinden Vladimira Hinic