Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades
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- Eugen Auttenberg
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1 Isolierung und Charakterisierung bioaktiver Polysaccharide und Extrakte aus Okra (Abelmoschi esculenti fructus) und deren Einsatz in physiologischen Testsystemen mit Relevanz für den Gastrointestinaltrakt Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Christian Lengsfeld aus Augsburg 2004
2 II. Inhaltsverzeichnis I. Verwendete Abkürzungen 4 II. Inhaltsverzeichnis 7 III. Zusammenfassung Einleitung Die Pflanze Abelmoschus esculentus Der menschliche Verdauungsapparat Die Gliederung des Verdauungstrakts Histologie der Darmwand Aufbau des Magens Gastrischer Mucus Funktion des Magens Typische pathogene Erscheinungen des Magens 22 A.Gastritis 22 B. Ulcus ventriculi und Ulcus duodeni 23 C. Magenkarzinom 23 D. Refluxösophagitis DasBakterimn Helicobacter pytori Allgemeine Angaben Charakterisierung und Lebensweise von H. pylori Genetische Besonderheiten von H. pylori Epidemologische Daten zu H. pylori Virulenzfaktoren \onh. pylori Weitere Entwicklungsaspekte zu H. pylori Das Bakterium Campylobacterjejuni Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeit Material und Methoden Geräte und Chemikalien Chemikalien, Zusätze Verbrauchsmaterialien Geräte Allgemeines, Lösungsmittel Pflanzliches Ausgangsmaterial von Okra Herstellung eines Frischextraktes aus Okrafrüchten 37
3 2.5. Extraktion und Aufreinigung von Polysacchariden aus Okraihichten Proteinausfällung mit TCA Enzymatischer Abbau des Proteinanteils von Rohpolysacchariden mit Pronase E Fluoreszenzmarkierung von Polysacchariden mit FITC Analytische Methoden Bestimmung des Gesamt-Kohlenhydratgehalts Vergleichsstandard für die Kohlenhydratbestimmung in Okra-Fraktionen Bestimmung des Gesamt-Uronsäuregehalts Reduktion uronsäurehaltiger Polysaccharide Hydrolyse von Polysacchariden Derivatisierung von Polysacchariden zu Alditolacetaten Derivatisierung von Polysacchariden zu teilmethylierten Alditolacetaten (PMAA) Bestimmung des Gesamt-Proteingehalts Stärkenachweis in Polysacchariden Nachweis von Standard-Enzymaktivitäten : Dünnschichtchromatographie (DC) Anionenaustausch-Chromatographie (AEX) an DEAE-Sephacel Gelpermeationschromatographie (GPC) von Polysacchariden Gelpermeationschromatographie (GPC) von Proteinen Gelpermeations-Hochdruck-Flüssigkeitschromatografie (GPC-HPLC) Ionenaustausch-HPLC Gaschromatografie / Massenspektrometrie Qualitative Bestimmung des Veresterungsgrades von Polysacchariden Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Silberfärbung Ex v/vo-adhäsionsstudien an gastrointestinalen Epithelien In i/yw-adhäsionsstudien an Dünnschnitten humaner Magenschleimhaut In vrtro-adhäsionsstudien mit Okra-RPS und Helicobacter pylori In v/fr-o-toxizitätsstudien mit Bakterien (Proliferationsexperimente) Untersuchungen zur ph-stabilisierung durch polysaccharidhaltige Lösungen Mikrobiologische Methoden Eingesetzte Bakterienstämme Kultivierung und Konservierung von Bakterien Molekularbiologische Methoden Isolierung bakterieller Gesamt-DNA 52
4 Polymerase chain reaction (PCR) Viskositätsbestimmungen Kinematische Viskosität Rotationsviskosimetrie Medien, Puffer und Reagenzien PBS-Puffer Resuspendierungslösung (FITC-Markierung von Bakterien) Blockpuffer, 0,2 % BSA (in s/fw-adhäsionsassay) Pferdeblutagar (Kultivierung mikroaerophiler Bakterien) Einfriermedium für Bakterien-Dauerkulturen LB-Medium (Kultivierung von E. coli) Modifiziertes Waymouth-Medium (ex v/vo-bioadhäsionsassay) ,0 M Natriumphosphatpuffer, ph 6,0 (AEX, Methode 1) ,5 M Kaliumphosphat-Puffer, ph 7,5 (AEX, Methode 2) ,05 M Kaliumphosphat-Puffer, ph 6,0 (HPLC-Eluent) x TAE-Puffer (Stammlösung für DNA-Elektrophorese) Bradford-Reagens (Protein-Detektion) Thymol-Schwefelsäure-Sprühreagens(DC-Detektion) Dimsyl-Kalium-Reagens (Methylierung von Polysacchariden) Lösungen und Puffer für SDS-PAGE Lösungen für die Silberfärbung von Proteingelen Ergebnisse Teil A: Analytische Untersuchungen Untersuchung des Kohlenhydratanteils in Okrafrüchten Herstellungeines Frischextraktes aus Okrafrüchten Extraktion wasserlöslicher Polysaccharide aus Okrafrüchten Lösungsverhalten des Rohpolysaccharids (45 % EtOH-Fällung) Rheologische Eigenschaften von Frischextrakt und Rohpolysaccharid Fraktionierung des Rohpolysaccharids über AEX Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung von Kohlenhydraten über GPC Qualitative Monosaccharid-Bestimmung in den Fraktionen über DC Quantitative Bestimmung der Uronsäuren über lonenaustausch-pad-hplc Quantitative Untersuchung der Zucker-Zusammensetzung über GC/MS Bindungsanalytik von Polysacchariden über GC/MS Infrarot-(IR-)Spektroskopie vom Okra-Rohpolysaccharid 85
5 3.2. Untersuchung des Proteinanteils in Okrafrüchten Nachweis von Standard-Enzymaktivitäten im Okra-Frischextrakt SDS-PAGE von Proteinen aus Okra-Frischextrakt und -Rohpolysaccharid Enzymatischer Abbau des Proteinanteils am Okra-Rohpolysaccharid Irreversible Ausfällung von Proteinen aus Okra-Frischextrakt Isolierung wasserlöslicher, nativer Proteine aus Okra-Frischextrakt Bestimmung der Molekulargewichtsverteilung extrahierter Proteine über GPC SDS-PAGE der proteinhaltigen AEX- und GPC-Fraktionen aus Okra-FE Ergebnisse Teil B: Funktionale Untersuchungen ph-stabilisierende Eigenschaften von Okra-Frischextrakt und -Rohpolysaccharid Fluoreszenzmarkierung des Rohpolysaccharids zur Detektion über HPLC Ex v/vo-adhäsionsstudien mit Polysacchariden an gastrointestinalen Epithelien Vorversuche zu in srta-adhäsionsstudien mit Helicobacter pylori In.wto-Adhäsionsstudien (H. pylori) mit biogenen Testsubstanzen In s/ta-adhäsionsstudien (H. pylori) mit Okra-RPS In Mta-Adhäsionsstudien (H. pylori) mit AEX-Fraktionen von Okra-RPS In s/ft/-adhäsionsstudien (H. pylori) mit Okra-FE In sfft/-adhäsionsstudien (H. pylori) mit Proteinfraktionen aus Okra-FE In v;/ro-toxizitätsstudien mit Okra-Fraktionen gegen H. pylori In v/fro-adhäsionsstudien mit H. pylori In i/yw-adhäsionsstudien (H. pylori) mit anderen Testsubstanzen In j/(m-adhäsionsstudien mit Campylobacterjejuni Diskussion Diskussion zur Untersuchung des Kohlenhydratanteils in Okrafrüchten Diskussion zur Untersuchung des des Proteinanteils in Okrafrüchten Diskussion zu den funktionalen Untersuchungen 151 IV. Literaturverzeichnis 162 V. Danksagung 174 VI. Veröffentlichungen 176 VII. Lebenslauf
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