6.1 Aufbau und Optimierung von Analysenmethoden zur Bestimmung der Aromakomponenten

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1 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten 6 Ergenisse 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten Vergleich von Extrktionsmethoden Für die Untersuchungen der Einflüsse einer Mykorrhizierung uf die Pflnzenqulität wr die Bestimmung der wertgeenden Inhltsstoffe der Modellpflnzen erforderlich. Für die Bestimmung der romgeenden Inhltsstoffe us Mjorn und Thymin wren zunächst der Aufu und die Optimierung einer geeigneten Anlysenmethode eine zwingende Vorrussetzung. Hierei glt es insesondere eine geeignete Methode zur Extrktion mit nschließender nlytischer Bestimmung dieser Komponenten zu finden und zu optimieren. Diese sollte schließlich eine weitgehend vollständige Extrktion relevnter Inhltsstoffe gewährleisten, möglichst keine Umwndlungen genuiner Inhltsstoffe hervorrufen und sich durch eine hohe Präzision und Routinesicherheit sowie gute Automtisierrkeit uszeichnen. Folgende für die Extrktion von Aromkomponenten üliche Verfhren wurden ezüglich ihrer Eignung zur schonenden und zeitsprenden Proenvorereitung von romgeenden Verindungen in Mjorn und Thymin vergleichend gegenüergestellt: Wsserdmpfdestilltion (WDD) Lösungsmittelextrktion mit n-hexn (LME) Beschleunigte Lösungsmittelextrktion (Accelerted Solvent Extrction, ASE) Extrktion mit üerkritischem Kohlendioxid (Supercriticl Fluid Extrction, SFE) Festphsenmikroextrktion (Solid Phse Microextrction, SPME) Diese fünf Extrktionsmethoden wurden n llen eiden Kulturen nhnd von je vier Proen frisch tiefgefrorenen Mterils und je drei Proen gefriergetrockneten Mterils durchgeführt. Die erhltenen Extrkte wurden nschließend gschromtogrphisch getrennt, mittels Pekflächen-Prozent-Methode usgewertet und die Ergenisse ller Methoden gegenüergestellt. D die Inhltsstoffe des Mjorns im Vergleich zu denen us Thymin deutlich empfindlicher gegenüer thermo- und hydrolyseedingten Veränderungen sind, werden die mit verschiedenen Extrktionsverfhren erhltenen Ergenisse nhnd dieser Kultur im Folgenden eispielhft erläutert. A. 9 zeigt dzu zunächst eine vergleichende Drstellung der Zusmmensetzung der extrhierten Verindungen us jeweils gefriergetrocknetem zw. frischem Mjorn nch WDD zw. nch LME. Verluste leicht flüchtiger Verindungen infolge der Gefriertrocknung wurden, wie die A. 9 zeigt, grundsätzlich nicht festgestellt, d sich die Inhltsstoffzusmmensetzung weder nch WDD noch nch LME ei gefriergetrocknetem Pflnzenmteril zugunsten der schwer flüchtigen Komponenten verschoen htte (A. 9). Die ph- und temperturempfindlichen Sustnzen Sinenhydrtcett und cis- Sinenhydrt wurden in den Wsserdmpfdestillten zu deutlich geringeren Anteilen gefunden ls in den Lösungsmittelextrkten. Dfür wren in den Wsserdmpfdestillten die Gehlte n Terpinen-4-ol, α- und γ-terpinen deutlich erhöht. - Seite 36 von 128 -

2 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten Pekflächen % WDD gefriergetrocknet WDD frisch LME gefriergetrocknet LME frisch A. 9 * Sinen -Terpinen g-terpinen trns- Sinenhydrt cis- Sinenhydrt Terpinen-4- ol Sinenhydrtcett RI > 2 nicht ätherische Öle Pekflächen-Prozente der wichtigsten mittels WDD zw. LME us gefriergetrocknetem zw. frischem Mjorn extrhierten Aromkomponenten (MW±SD, n=4) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): * edeutet signifiknten Unterschied zwischen gefriergetrocknet und frisch gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied zwischen WDD und LME keine signifiknte Interktion eider Einflussfktoren Vergleicht mn die LME, die SFE und die ASE (A. 1), so sind kum Unterschiede zu erkennen. Gegenüer der WDD enthlten dmit lle drei Verfhren deutlich größere Anteile der ntürlichen empfindlichen Inhltsstoffe Sinenhydrtcett und cis-sinenhydrt (vgl. A. 9). Ein weiterer Unterschied lässt sich eim Vergleich der ASE- und SFE-Extrkte von gefriergetrocknetem und frischem Mteril feststellen (A. 1). Die Extrkte us frischem Mjorn enthlten deutlich weniger Sinenhydrtcett, dfür er erhöhte Anteile n cis- und trns- Sinenhydrt sowie n Terpinen-4-ol. Umwndlungsprozesse während der Tiefkühllgerung des frischen Pflnzenmterils is zur Anlyse sind ls Ursche für diese Effekte uszuschließen, d diese Unterschiede zwischen frischem und gefriergetrocknetem Pflnzenmteril nicht ei gleicher Behndlung nch der WDD und uch nicht nch der LME uftrten (vgl. A. 9). Sustnzen mit einem Retentionsindex (RI) üer 2 (je letzte Blkengruppe uf der Aszisse in A. 9 und A. 1) wurden hier nicht weiter ufgegliedert. Hierei hndelte es sich v.. um Wchse, Fettsäuren und höhere Terpene, die für den Geruch und Geschmck nur von untergeordneter Bedeutung sind. Sustnzen mit einem Retentionsindex > 2 sind ufgrund ihrer geringen Flüchtigkeit in den Wsserdmpfdestillten nicht enthlten (A. 9) und werden deshl im Folgenden uch ls nicht ätherische Ölverindungen ezeichnet. Solche nicht wsserdmpfflüchtigen Komponenten wren nur in den Extrkten der Lösungsmittelextrktionen (LME, ASE) zw. der Extrktion mit üerkritischem Kohlendioxid (SFE) zu finden (A. 1). Der Anteil von nicht wsserdmpfflüchtigen Verindungen ist ei der SFE im Vergleich dieser drei Extrktionsverfhren m geringsten. - Seite 37 von 128 -

3 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten LME gefriergetr. LME frisch SFE gefriergetr. SFE frisch ASE gefriergetr. ASE frisch Pekflächen % c 2 1 A. 1 * * * * * c Sinen -Terpinen g-terpinen trns- Sinenhydrt cis- Sinenhydrt Terpinen-4- ol Sinenhydrtcett I* I* I* I* I* RI > 2 nicht ätherische Öle Pekflächen-Prozente der wichtigsten mittels LME, SFE zw. ASE us gefriergetrocknetem zw. frischem Mjorn extrhierten Aromkomponenten (MW±SD, n=4) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): * edeutet signifiknten Unterschied zwischen gefriergetrocknet und frisch gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied zwischen LME, SFE und ASE I* = signifiknte Interktion eider Einflussfktoren In der A. 11 sind zur esseren Vernschulichung der isher getroffenen Aussgen die Gschromtogrmme nch WDD, SFE und ASE von einer gefriergetrockneten Mjornproe üereinnder gelegt drgestellt. WDD SFE ASE A. 11 Gegenüerstellung der Chromtogrmme einer gefriergetrockneten Mjornproe nch WDD, SFE und ASE - Seite 38 von 128 -

4 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten Auch im Chromtogrmm ist deutlich zu erkennen, dss im Wsserdmpfdestillt kum noch cis-sinenhydrtcett und deutlich weniger cis-sinenhydrt nchzuweisen wren. Die Gehlte n α- und γ-terpinen sowie Terpinen-4-ol wren dgegen nch WDD im Vergleich zu SFE und ASE deutlich erhöht. Die zunächst gut geeignete SFE-Methode erwies sich während der durchgeführten Routinenlytik mit der vorhndenen SFE-Anlge jedoch ls unzureichend stil. So km es häufig zum Verstopfen der Restriktorgänge, owohl Seesnd zum Schutz eingesetzt wurde und weniger feines frisches Pflnzenmteril zur Anwendung km. Dies führte schließlich uch zu nicht kzeptlen hohen Stndrdweichungen ei der gschromtogrphischen Anlyse. Als deutlich stilere Extrktionsmethode mit sogr noch geringerem Zeit- und Areitsufwnd stellte sich die SPME mit einer Reihe von Vorteilen für die Extrktion romgeender Inhltsstoffe der Gewürzpflnzen herus. Wie die Wsserdmpfdestillte wren uch die mittels HS-SPME gewonnenen flüchtigen Extrkte frei von nicht flüchtigen und für ds Arom kum oder nicht relevnten Verindungen mit RI > 2 (A. 12). Weiterhin wurden die genuinen Verindungen cis-sinenhydrt und Sinenhydrtcett in den SPME-Extrkten in ähnlichen zw. gleichen Konzentrtionen gefunden wie im Lösungsmittelextrkt (A. 12). Der größte Vorteil der SPME liegt jedoch in der Automtisierrkeit. Im esten Fll wird die mnuelle Proenvorereitung uf ds Mhlen und Einwiegen der Pflnzenmterilien reduziert. Pekflächen % WDD gefriergetr. WDD frisch LME gefriergetr. LME frisch SPME gefriergetr. SPME frisch 4 c 3 c 2 1 c c A. 12 * * * * * * I* Sinen -Terpinen g-terpinen trns- Sinenhydrt cis- Sinenhydrt Terpinen- 4-ol Sinenhydrtcett I* I* RI > 2 nicht ätherische Öle Pekflächen-Prozente der wichtigsten mittels WDD, LME zw. SPME us gefriergetrocknetem zw. frischem Mjorn extrhierten Aromkomponenten (MW±SD, n=4) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): * edeutet signifiknten Unterschied zwischen gefriergetrocknet und frisch gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied zwischen WDD, LME und SPME I* = signifiknte Interktion eider Einflussfktoren Für Thymin wurden in Ahängigkeit vom Extrktionsverfhren nicht so deutliche Unterschiede in der Zusmmensetzung der Aromkomponenten wie ei Mjorn detektiert (A. - Seite 39 von 128 -

5 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten 13). Ds liegt v.. drin egründet, dss diese Kultur weniger empfindliche Aromkomponenten enthält. Auch m Beispiel von Thymin wr er wie ei Mjorn der Anteil nicht ätherischer Ölverindungen (RI > 2) nch SFE m geringsten und keine dieser nicht flüchtigen Verindungen wurden uch hier nur nch WDD und SPME detektiert (A. 13). Pekflächen % WDD g LME g SFE g ASE g SPME g WDD f LME f SFE f ASE f SPME f g = gefriergetrocknetes Pflnzenmteril c d c f = frisches Pflnzenmteril d 2 c d c 1 A. 13 * * p-cymen g-terpinen Thymol RI > 2 nicht ätherische Öle Pekflächen-Prozente der wichtigsten mittels verschiedener Extrktionsverfhren us gefriergetrocknetem (g) zw. frischem (f) Thymin extrhierten Aromkomponenten (MW±SD, n=4) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): * edeutet signifiknten Unterschied zwischen gefriergetrocknet und frisch gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied zwischen den Extrktionsverfhren keine signifiknte Interktion eider Einflussfktoren D die SPME ls die vorteilhfteste Methode zur Extrktion romktiver Verindungen us Mjorn und Thymin efunden wurde, sollte sie schließlich für die hohe Proennzhl der Inhltsstoffuntersuchungen für die eiden Kulturen im Rhmen der Untersuchungen der vorliegenden Areit optimiert und etliert werden. - Seite 4 von 128 -

6 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten Optimierung der SPME-Methode Aufgrund der in der Litertur eschrieenen Anwendungen der SPME-GC zur Bestimmung von Aromkomponenten erfolgte die Optimierung - usgehend von den nchfolgend ufgeführten Methodenprmetern - vollutomtisiert mit Hilfe des ComiPAL Proengeers (CTC Anlytics, Zwingen, Schweiz). Vorinkution: 5 min Tempertur: 4 C Schütteln: 5 U/min Extrktionszeit: 1 min Desorption: GC-Injektor, SSL, splitlos Injektortempertur: 2 C Desorptionszeit: 1 min Fserkonditionierung: 15 min Bei romktiven Sustnzen hndelt es sich in den meisten Fällen um flüchtige Verindungen. Die SPME sollte dher im Hed Spce (HS)-Modus etrieen werden. Aufgrund von Literturempfehlungen wurde die PDMS 1 µm Fser für die HS-SPME der Aromkomponenten verwendet. [BICCHI et l., 2; COLEMAN und LAWRENCE, 2; CORNU et l., 21; CZERWINSKY et l., 1996; JORGENSEN, 2; LIGOR et l., 2; MINDRUP, 2; NAMIESNIK und GÓRECKI, 2; ROHLOFF, 1999; ROHLOFF et l., 2; SCHÄ- FER et l., 1995] Die HS-SPME mit den oen ufgeführten Methodenprmetern wurde mit 5 mg einer gefriergetrockneten Mjornproe durchgeführt und errchte im Vergleich zu den nderen ngewndten Extrktionsmethoden schon mit dieser Ausgngsmethode gut vergleichre Ergenisse. Die folgende Aildung zeigt dzu gegenüergestellt die Gschromtogrmme nch HS-SPME und nch SFE (A. 14). HS-SPME/GC SFE/GC A. 14 Vergleich der Gschromtogrmme nch HS-SPME zw. SFE einer gefriergetrockneten Mjornproe - Seite 41 von 128 -

7 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten Ds Gschromtogrmm enthielt zunächst die gleichen Sustnzpeks wie ds nch nderen Extrktionsverfhren erhltene Chromtogrmm. Ds heißt, es konnten lle mit den nderen Extrktionsverfhren gewonnenen Verindungen uch nch HS-SPME nchgewiesen werden. Insesondere die Auflösung und die Pekschärfen des Chromtogrmms wren jedoch noch nicht zufriedenstellend. Die HS-SPME-Methode wurde dher diesezüglich nhnd der folgenden Methodenprmeter weiter optimiert: Verwendung gefriergetrockneten zw. frischen Pflnzenmterils Prüfung verschiedener Extrktionstemperturen Prüfung verschiedener Extrktionszeiten Prüfung verschiedener Desorptionstemperturen (Injektortempertur) Prüfung der splitlosen zw. Splitinjektion Prüfung verschiedener Linergrößen Prüfung verschiedener Konditionierungszeiten Mhlungsgrd des Pflnzenmterils Die für jeden Optimierungsschritt erhltenen Ergenisse werden im Folgenden diskutiert Verwendung gefriergetrockneten zw. frischen Pflnzenmterils Die SPME von 2 mg frischem Pflnzenmteril errchte ähnliche Ergenisse wie die Extrktion von 5 mg gefriergetrocknetem Pflnzenmteril (ei c. 2 % Trockensustnzgehlt) (A. 15). in Mio Sinen -Terpinen g-terpinen trns-sinenhydrt Linlool cis-sinenhydrt Terpinen-4-ol g-terpineol trns- Sinenhydrtcett cis- Sinenhydrtcett Totl Pekfläche gefriergetrocknet frisch * * * * * * A. 15 Vergleich der ermittelten Pekflächen ei Verwendung von gefriergetrocknetem zw. frischem Mjorn ei der SPME (MW±SD, n=4) * edeutet signifiknten Unterschied zwischen gefriergetrocknet und frisch (ANOVA, p <,5) Die A. 15 zeigt er, dss gerde ei der SPME von frischem Pflnzenmteril geringere Anteile der empfindlichen Inhltsstoffe cis- und trns-sinenhydrtcett und dfür leicht erhöhte Gehlte n Terpinen-4-ol zu finden wren. Ähnliche Ergenisse wren uch schon mit den Verfhren ASE und SFE, jedoch nicht mit der klten LME zu eochten (A. 16), weshl hier von Umwndlungsprozessen thermoliler Verindungen im Zusmmenhng mit dem Eigenwssergehlt frischen Pflnzenmterils uszugehen ist. - Seite 42 von 128 -

8 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten Pekflächen % Terpinen-4-ol Sinenhydrtcett * * * * * * * 1 A. 16 * * WDD gefriergetrocknegetrocknegetrocknegetrocknet WDD frisch LME gefrier- LME frisch SFE gefrier- SFE frisch ASE gefrier- ASE frisch SPME gefriergetrocknet SPME frisch Vergleich der Pekflächen-Prozente von Terpinen-4-ol und Sinenhydrtcett nch verschiedenen Extrktionsmethoden ei Verwendung von gefriergetrocknetem zw. frischem Mjorn ei der SPME (MW±SD, n=4) * edeutet signifiknten Unterschied zwischen gefriergetrocknet und frisch (ANOVA, p <,5) Die Verwendung von gefriergetrocknetem Pflnzenmteril wr dmit für die weiteren Untersuchungen esser geeignet ls frisches Pflnzenmteril Prüfung verschiedener Extrktionstemperturen Die Extrktion ei höheren Temperturen führte, wie erwrtet, zu höheren Gesmtpekflächen und dmit zu höheren Auseuten ei der Extrktion (A. 17). Pekflächen in Mio. 1,,5, 3 C 4 C 5 C A. 17 Vergleich der ermittelten Gesmtpekflächen ei verschiedenen Extrktionstemperturen ei der SPME (MW±SD, n=4) gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied (ANOVA, p <,5) Betrchtet mn llerdings die ermittelten Pekflächen-Prozente der extrhierten Aromkomponenten (A. 18), so lässt sich feststellen, dss die leichter flüchtigen Verindungen cisund trns-sinenhydrt ei höheren Extrktionstemperturen diskriminiert wurden. Der Anteil der höherflüchtigen Komponente cis-sinenhydrtcett dgegen stieg mit erhöhter Extrktionstempertur. Um uch leichter flüchtige Verindungen noch nchweisen zu können, wurde dher für die folgenden Untersuchungen eine mittlere Extrktionstempertur von 4 C ngewendet. - Seite 43 von 128 -

9 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten Pekflächen % C 4 C 5 C 1 c Sinen -Terpinen g-terpinen cis-sinenhydrt Linlool trns-sinenhydrt Terpinen-4-ol g-terpineol cis- Sinenhydrtcett trns- Sinenhydrtcett A. 18 Vergleich der ermittelten Pekflächen-Prozente ei verschiedenen Extrktionstemperturen ei der SPME (MW±SD, n=4) gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied (ANOVA, p <,5) Prüfung verschiedener Extrktionszeiten Die Prüfung verschiedener Extrktionszeiten im Anschluss n eine 5-minütige Vorinkution errchte vergleichre Ergenisse. Auch mit steigender Extrktionszeit wurden, wie erwrtet, höhere Auseuten erzielt (ohne Aildung). Der Vergleich der Pekflächen-Prozente der extrhierten Aromkomponenten zeigte jedoch uch hier ei längerer Extrktionsduer vermehrt schwerer flüchtige Komponenten (trns-sinenhydrtcett) und eine Diskriminierung der leichtflüchtigen Verindungen γ-terpinen, Linlool sowie trns- und cis- Sinenhydrt (A. 19). Eine vollständige Gleichgewichtseinstellung ei der Festphsenmikroextrktion wr nicht erforderlich, d die SPME mit Hilfe des ComiPAL Proengeers voll utomtisiert und dmit sehr gut reproduzierr durchgeführt wurde. Deshl wurde eine mittlere Extrktionszeit von 1 min evorzugt. Pekflächen % min 1 min 15 min 1 c Sinen -Terpinen g-terpinen trns-sinenhydrt Linlool cis-sinenhydrt Terpinen-4-ol g-terpineol trns- Sinenhydrtcett cis- Sinenhydrtcett A. 19 Vergleich der ermittelten Pekflächen-Prozente ei verschiedenen Extrktionszeiten ei der SPME, je zuzüglich 5 min Vorinkution (MW±SD, n=4) gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied (ANOVA, p <,5) - Seite 44 von 128 -

10 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten Prüfung verschiedener Desorptionstemperturen Erhöhte Desorptionstemperturen m GC-Injektor führten nicht zu einer Steigerung der Auseute (A. 2). Bei einem Einstz höherer Injektionstemperturen estnd dgegen uch eine erhöhte Gefhr für den Au temperturempfindlicher Sustnzen. Für die Huptkomponenten cis-sinenhydrt und cis-sinenhydrtcett deuteten sich ei 24 C Injektionstempertur ereits geringere Pekflächen n. Um trotzdem eine vollständige Proenufge von der Fser uch ei eventuell uftretenden höheren Gehlten n Aromkomponenten zu grntieren, wurde eine mittlere Desorptionstempertur von 2 C eiehlten. Pekflächen in Millionen,5,4,3,2,1, 16 C 2 C 24 C Sinen -Terpinen g-terpinen trns-sinenhydrt Linlool cis-sinenhydrt Terpinen-4-ol g-terpineol trns- Sinenhydrtcett cis- Sinenhydrtcett A. 2 Vergleich der ermittelten Pekflächen (solut) ei verschiedenen Desorptionstemperturen im Injektor nch der SPME (MW±SD, n=4) gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied (ANOVA, p <,5) Prüfung der Split- zw. splitlosen Injektion und der Linergröße Der Prolemtik von reiten Peks und ungenügender Auflösung der nfngs eingesetzten SPME-Methode im Vergleich zu nderen Extrktionsmethoden (vgl. A. 14) sollte durch den Einstz einer Splitinjektion ei der Gschromtogrphie entgegengewirkt werden. HS-SPME/GC, Split 1:2 HS-SPME/GC, splitlos A. 21 Vergleich der Gschromtogrmme nch splitloser zw. Splitinjektion (1:2) ei der SPME/GC - Seite 45 von 128 -

11 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten Wie die üereinnder gelegten Chromtogrmme in A. 21 zeigen, führte die Anwendung eines Splits von 1:2 während der Injektion zu einem deutlichen Trennvorteil. Für die weiteren Untersuchungen wurde ein Splitverhältnis von 1:2 dher eiehlten. Die Verwendung eines engeren speziellen SPME-Liners führte zu keiner sichtren Veresserung der Trennergenisse, jedoch uch zu keiner Verschlechterung (ohne Aildung) Prüfung verschiedener Konditionierungszeiten Zur Sicherstellung einer vollständigen Rekonditionierung der SPME-Fser wurden nch einem Anlysenluf 5-, 1- zw. 15-minütige Konditionierzeiten der Fser geprüft. Dzu wurde im Anschluss n die Fserkonditionierung ein proenfreier Kontrollluf der GC- Methode durchgeführt. Schon nch 5-minütiger Konditionierung wurden hierei keine Aromkomponenten mehr nchgewiesen. Sicherheitshler wurden 1 min für die Konditionierung gewählt Mhlungsgrd des Pflnzenmterils Die Mhlung des gefriergetrockneten Pflnzenmterils erfolgte nfngs mit einem 1 l Lormixer 71G (Wring Commercil, Torrington, USA), woei Korngrößen von durchschnittlich etw 3 mm entstnden. Von einer feineren Vermhlung mit dieser Mühle wurde zur Vermeidung entstehender Hitze gesehen. Eine Anlysenmühle mit Kühlnschluss (A1 Yellow Line, IKA, Stufen) mit Edelsthlschläger ot die essere Lösung. Ds Proenmteril wurde mit der gennnten Mühle für 3 min unter Kühlung (12 C) gemhlen und nschließend gesiet, so dss nur Korngrößen <,5 mm ei der nschließenden SPME zum Einstz kmen. Ttsächlich wurde hierdurch nhnd je sieen ncheinnder durchgeführter Messungen eine Veresserung der erhltenen reltiven Verfhrensstndrdweichung von 7 % (Lormixer) uf 1 is 2 % (Anlysenmühle) erreicht Optimierte HS-SPME-Methode Nch Prüfung der verschiedenen Proenvorereitungsmethoden und Optimierung der SPME, wie oen eschrieen, erfolgte die gschromtogrphische Bestimmung der Aromkomponenten mittels HS-SPME/GC vollutomtisiert mit Hilfe des ComiPAL Proengeers nch Einwge von 5 mg gefriergetrocknetem, uf Korngrößen unter,5 mm gemhlenem Pflnzenmteril in ein 2 ml HS-SPME-Vil mit einer PDMS 1 µm Fser unter folgenden Bedingungen im Hed Spce Modus: Vorinkution: 5 min Tempertur: 4 C Schütteln: 5 U/min Extrktionszeit: 1 min Desorption: GC-Injektor, SSL, split 1:2 Injektortempertur: 2 C Desorptionszeit: 1 min Fserkonditionierung: 1 min Die reltiven Stndrdweichungen der gesmten HS-SPME/GC-Methode zur Bestimmung der Zusmmensetzung romgeender Inhltsstoffe m Beispiel von Mjorn vriierten ei sieen durchgeführten Wiederholungsmessungen für 15 identifizierte Inhltsstoffe zwischen 1 und 15 % (T. 4). Bezüglich der mengenmäßigen Huptkomponenten Sinenhydrt (41,5 %) und Sinenhydrtcett (39,6 %) wurden nur Stndrdweichungen zwischen 1 und 3 % ermittelt. Die reltive Stndrdweichung für die Gesmtpekfläche lg sogr ei nur 1 %. - Seite 46 von 128 -

12 6.1 Aufu und Optimierung von Anlysenmethoden zur Bestimmung der Aromkomponenten T. 4 Pekflächen-Prozente und Reltive Stndrdweichungen (VK) der romgeenden Inhltsstoffe von Mjorn us sieen Wiederholungsmessungen mittels HS-SPME/GC Inhltsstoff Pekflächen% (MW, n=7) VK (%) α-thujen (%),9 14,3 Sinen (%) 1,9 7,7 α-terpinen (%),6 15,4 γ-terpinen (%) 1,1 1,3 trns-sinenhydrt (%) 3,6 2,7 Linlool (%),3 14, cis-sinenhydrt (%) 37,9 1, cis-p-menth-2-en-1-ol (%),9 9,1 trns-p-menth-2-en-1-ol (%),6 4,8 Terpinen-4-ol (%) 5,2 3,2 γ-terpineol (%) 2, 3,8 trns-sinenhydrtcett (%) 4, 2,6 cis-sinenhydrtcett (%) 35,6 1,8 trns-sinylcett (%) 1,3 8,9 trns-β-cryophyllen (%) 4,1 9,6 Gesmtpekfläche (solut) 249.4, 1, Ein mit dieser optimierten Methode erhltenes Gschromtogrmm einer Mjornproe ist in der A. 22 drgestellt. A. 22 GC-Chromtogrmm einer Mjornproe nch der Optimierung des HS-SPME/GC-Verfhrens - Seite 47 von 128 -

13 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Screening verschiedener Mykorrhiz-Inokul im Gewächshus Verschiedene AM-Inokul wurden in Gewächshusversuchen uf ihre Eignung zur Mykorrhizierung der Heil- und Gewürzpflnzen Mjorn, Thymin und Johnniskrut geprüft. Die dzu eingesetzten Mykorrhiz-Inokul umfssten kommerzielle Misch-Inokul (AMykor - Blähton, AMykor -Perlit), verschiedene Mono-Inokul der Gttung Glomus, mehrere Misch- Inokul, die in Thilnd isoliert wurden, sowie die von Weizen zw. Thymin isolierten utochthonen Misch-Inokul. Die mit den verschiedenen Inokul n den Heil- und Gewürzpflnzen erhltenen Ergenisse ezüglich der Mykorrhizierrkeit sowie Effekten uf Biomsse- und Inhltsstoffproduktion werden im Folgenden drgestellt. Die Ergenisse der Bewertung der Mykorrhizierung von Thymin, Mjorn und Johnniskrut ei Anwendung der verschiedenen ruskulären Mykorrhiz-Inokul sind in der T. 5 ufgeführt. T. 5 Mykorrhizierrkeit von Thymin, Mjorn und Johnniskrut mit verschiedenen AM-Inokul Mykorrhiz-Inokulum Bewertung der Mykorrhizierung* komplette Bezeichnung Akürzung Thymin Mjorn Johnniskrut K AMykor -Blähton AM-B AMykor -Perlit AM-P Glomus mossee Gm Glomus clrum Gc Glomus diphnum Gd 2 1 Glomus etunictum Ge Glomus intrrdices Gi Glomus geosporum Gg Thilnd - Scutellospor spec. T-Sc Thilnd - Aculospor spec. T-Ac Thilnd - KN T-KN Thilnd - D3 T-D utochthone Mykorrhiz - Weizen M-W utochthone Mykorrhiz - Thymin M-T 1 1 * = keine Mykorrhiz-Strukturen; 1 = geringe Mykorrhizierung; 2 = gute Mykorrhizierung; 3 = sehr gute Mykorrhizierung Thymin stellte sich ei diesen Untersuchungen ls eine grundsätzlich sehr gut mykorrhizierre Kultur herus. Die Pflnzen entwickelten ei llen untersuchten Vrinten eine Mykorrhiz-Symiose, die meist gut is sehr gut usgeildet wr. Besonders hervorzuheen wren die Vrinten mit Glomus geosporum und Glomus etunictum. Gute Mykorrhizierungen wurden uch mit dem kommerziellen AMykor -Blähton ermittelt. Mjorn wies im Vergleich zu Thymin nur eine geringe Neigung zur Mykorrhizierung uf. Gute Mykorrhizierungen wurden nur nch Inokultion mit dem kommerziellen AMykor - Blähton sowie mit Glomus geosporum erreicht. Johnniskrut zeigte mit den meisten Mykorrhiz-Inokul eenflls nur eine schwch usgeprägte Mykorrhizierung. Nch Inokultion mit Glomus diphnum sowie mit dem von Thymin isolierten utochthonen Mykorrhiz-Inokulum wurden keine Mykorrhiz-Strukturen gefunden. Die esten Mykorrhizierungserfolge wurden mit Glomus geosporum erzielt. - Seite 48 von 128 -

14 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Thymin Die Einflüsse der Mykorrhizierung uf die Biomsseerträge von Thymin (ngegeen in Msse n getrocknetem Krut pro Topf) sind für die verschiedenen Mykorrhiz-Inokul in der A. 23 grphisch gegenüergestellt. Trockenmsseertg pro Topf (g) * K AM-B AM-P Gm Gc Gd Ge Gi Gg T-Sc T-Ac T-KN T-D3 M-W M-T A. 23 Trockenmsseerträge pro Topf ei Einstz verschiedener Mykorrhiz-Inokul n Thymin (MW±SD, n=3) Akürzungen der verwendeten Mykorrhiz-Inokul wie in T. 5, S. 48 * edeutet signifiknten Unterschied im Vergleich zur (p <,5) Aus der A. 23 ist zu erkennen, dss verschiedene Mykorrhiz-Inokul unterschiedliche Auswirkungen uf den Krutertrg hen. Gegenüer der Kontrollvrinte ohne Mykorrhizierung ewirkte er nur der AMykor -Blähton signifiknte Ertrgssteigerungen. Eine tendenzielle Ertrgserhöhung wurde uch mit den thiländischen Mischpopultionen (Aculospor: p <,1; KN: p <,15; D3: p <,2) erzielt. Auffällig sind uch die positiven Wirkungen des Glomus etunictum Mono-Inokulums uf den Thyminertrg. Aufgrund der deutlichen Schwnkungen der Erträge us den je drei untersuchten Töpfen hndelt es sich jedoch uch hierei nicht um signifiknte Ertrgssteigerungen. Für die Bestimmung der romgeenden Inhltsstoffe us Thymin wurden ufgrund des wenigen zur Verfügung stehenden Mterils Mischproen us den drei Töpfen für jede Inokultionsvrinte hergestellt und diese mittels WDD uf den Gesmtgehlt n ätherischem Öl und mittels SPME/GC uf die Zusmmensetzung der Aromkomponenten untersucht. Die A. 24 zeigt die n Thymin mit verschiedenen Mykorrhiz-Inokul erhltenen ätherischen Ölgehlte nch WDD. Insgesmt sind us der A. 24 deutliche Unterschiede der ätherischen Ölgehlte in Ahängigkeit von den verschiedenen eingesetzten Mykorrhiz-Inokul zu erkennen. Die esitzt einen ätherischen Ölgehlt von,21 %. Ein ähnlicher Gehlt wurde mit Glomus clrum-inokulum erzielt. Durch Inokultion mit Glomus etunictum wurden deutlich erhöhte Gehlte n ätherischem Öl gefunden. Einige AM-Inokul führten er uch zu einer Senkung der ätherischen Ölgehlte in den Pflnzen. - Seite 49 von 128 -

15 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Ätherischer Ölgehlt (ml/1 g FM),4,3,2,1, K AM-B AM-P Gm Gc Gd Ge Gi Gg T-Sc T-Ac T-KN T-D3 M-W M-T A. 24 Ätherische Ölgehlte nch WDD ei Einstz verschiedener Mykorrhiz-Inokul n Thymin (MW±SD von zwei nlytischen Wiederholungen, n=1, Mischproe) Akürzungen der verwendeten Mykorrhiz-Inokul wie in T. 5, S. 48 Nicht nur die Gesmtgehlte n ätherischem Öl stnden unter dem Einfluss der Mykorrhizierung. Auch die Anteile der verschiedenen Aromkomponenten wiesen ei unterschiedlichen Inokul große Differenzen uf. A. 25 stellt hierzu die in Ahängigkeit vom AM-Inokulum mittels HS-SPME/GC ermittelten Zusmmensetzungen der Huptromkomponenten uszugsweise für die AM-Inokul mit uffälligen Wirkungen dr. Für die uf diesen Prmeter weniger wirksmen Inokul wurde uf die Drstellung der Inhltsstoffzusmmensetzung in der Aildung verzichtet. Pekflächen % 5 4 Thymol p-cymen g-terpinen K AM-B AM-P Gd Ge Gg T-Ac T-KN T-D3 M-W M-T A. 25 Pekflächen-Prozente der Huptromkomponenten nch HS-SPME/GC ei Einstz verschiedener Mykorrhiz-Inokul n Thymin (MW±SD von zwei nlytischen Wiederholungen, n=1, Mischproe) Akürzungen der verwendeten Mykorrhiz-Inokul wie in T. 5, S Seite 5 von 128 -

16 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Die A. 25 verdeutlicht, dss die höchsten Thymolgehlte unter dem Einfluss einer Mykorrhizierung mit AMykor -Blähton, Glomus geosporum und utochthoner Mykorrhiz von Weizen erzielt wurden. Glomus etunictum dgegen erhöhte in erster Linie die Gehlte des γ-terpinens und verringerte die Gehlte der thymintypischen Inhltsstoffe Thymol und p- Cymen sogr noch. Sttistisch gesicherte Aussgen sind er nicht möglich, d ufgrund der geringen Menge n Untersuchungsmteril nur eine Mischproe us drei iologischen Wiederholungen nlysiert wurde Mjorn An Mjornpflnzen führte uch eine vergleichsweise geringfügige Mykorrhizierung noch zu Einflüssen uf die Biomsseerträge (A. 26). So km es zu tendenziellen Ertrgssteigerungen ei Einstz der thiländischen Mischpopultionen KN (p <,15) und D3 (p <,1). Auch mit dem kommerziellen AMykor -Blähton sowie mit Glomus geosporum wurden ufgrund der geringen Anzhl n Wiederholungsversuchen nur tendenzielle Ertrgssteigerungen für Mjorn eochtetet (p <,2). Trockenmsseertrg pro Topf (g) K AM-B AM-P Gm Gc Gd Ge Gi Gg T-Sc T-Ac T-KN T-D3 M-W M-T A. 26 Trockenmsseerträge pro Topf ei Einstz verschiedener Mykorrhiz-Inokul n Mjorn (MW±SD, n=3) Akürzungen der verwendeten Mykorrhiz-Inokul wie in T. 5, S. 48 keine signifiknten Unterschiede im Vergleich zur (ANOVA, p <,5) In der A. 27 sind die mit verschiedenen Mono-Inokul ei Mjorn erhltenen ätherischen Ölgehlte gegenüergestellt (Mittelwert us je 2 Bestimmungen). Hier ist zu erkennen, dss die Gesmtgehlte n ätherischem Öl der nur von dem mit Aculospor spec. (Thilnd) mykorrhizierten Mjorn erreicht wurden. Alle nderen Inokulumversuche errchten geringere oder nur gleichwertige Gehlte. Insgesmt wurden uch ei Mjorn deutliche Unterschiede der ätherischen Ölgehlte in Ahängigkeit von den verschiedenen Mykorrhiz-Inokul detektiert. - Seite 51 von 128 -

17 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe,4 Ätherischer Ölgehlt (ml/1g FM),3,2,1, K AM-B AM-P Gm Gc Gd Ge Gi T-Sc T-Ac T-KN T-D3 M-W M-T A. 27 Ätherische Ölgehlte nch WDD ei Einstz verschiedener Mykorrhiz-Inokul n Mjorn (MW±SD von zwei nlytischen Wiederholungen, n=1, Mischproe) Akürzungen der verwendeten Mykorrhiz-Inokul wie in T. 5, S. 48 Die A. 28 stellt den Einfluss der verschiedenen Inokul uf die Zusmmensetzung der Aromkomponenten der Mjornpflnzen uch hier nur m Beispiel der AM-Inokul mit uffälligen Wirkungen dr. trns-sinenhydrt cis-sinenhydrt trns-sinenhydrtcett cis-sinenhydrtcett Pekflächen % K AM-B Gm Gc Ge T-Sc T-Ac T-KN T-D3 M-W A. 28 Pekflächen-Prozente der Huptromkomponenten nch HS-SPME/GC ei Einstz verschiedener Mykorrhiz-Inokul n Mjorn (MW±SD von zwei nlytischen Wiederholungen, n=1, Mischproe) Akürzungen der verwendeten Mykorrhiz-Inokul wie in T. 5, S Seite 52 von 128 -

18 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Die A. 28 zeigt deutlich, dss uch eim Mjorn große Unterschiede in der Zusmmensetzung der Aromkomponenten in Ahängigkeit vom eingesetzten Mykorrhiz-Inokulum festgestellt wurden. Glomus etunictum wie uch die thiländischen Vrinten Scutellospor spec., Aculospor spec. und D3 sowie die von Weizen isolierte utochthone Mykorrhiz können den Anteil der mjorntypischen Komponente Sinenhydrtcett im ätherischen Öl erhöhen. Insesondere nch Inokultion mit Glomus mossee oder Glomus clrum ist diese Komponente dgegen zugunsten der nicht cetylierten Form Sinenhydrt erniedrigt. D es sich ufgrund des wenigen verfügren Pflnzenmterils jedoch uch hier nur um nlytische Wiederholungen us je einer Mischproe us je drei Töpfen hndelt, sind die Ergenisse für sttistisch sichere Aussgen nicht geeignet Johnniskrut Die uch für Johnniskrut nur wenig usgeprägte Mykorrhizierung ging einher mit geringen Auswirkungen der Inokultion mit verschiedenen Mykorrhiz-Popultionen uf die Biomsseerträge (A. 29). Trockenmsseertrg pro Topf (g) * K AM-B AM-P Gm Gc Gd Ge Gi Gg T-Sc T-Ac T-KN T-D3 M-W M-T A. 29 Trockenmsseerträge pro Topf ei Einstz verschiedener Mykorrhiz-Inokul n Johnniskrut (MW±SD, n=3) Akürzungen der verwendeten Mykorrhiz-Inokul wie in T. 5, S. 48 * edeutet signifiknten Unterschied im Vergleich zur (p <,5) Ein Erhöhung der Biomsseerträge deutete sich nch Inokultion mit AMykor -Blähton sowie mit AMykor -Perlit n. Deutlich gesteigerte Kruterträge wurden wiederum ei Einstz der thiländischen Mykorrhiz-Mischungen erhlten. Hier sind insesondere die Mischpopultionen Aculospor spec. (p <,5) und D3 (p <,1) hervorzuheen. Die Inhltsstoffuntersuchungen in Ahängigkeit vom eingesetzten Mykorrhiz-Inokulum ezogen sich ei Johnniskrut uf die Phloroglucinderivte Hypericin und Pseudohypericin. Die für Johnniskrut im Rhmen der Inokulumversuche ermittelten Gehlte dieser Verindungen sind in der A. 3 drgestellt. Hier wurden mit AMykor -Blähton und AMykor -Perlit die höchsten Hypericingehlte induziert. Auch Glomus clrum und Glomus etunictum scheinen noch eine geringfügig steigernde Wirkung uf die Hypericingehlte zu hen. Bei Verwendung von nderen Mykorrhiz- Inokul wr die Hypericinproduktion in Johnniskrut dgegen eher unterdrückt. Sttistisch sichere Aussgen konnten ezüglich der Inhltsstoffdten uch für die Gewächshusversuche mit Johnniskrut nicht getroffen werden, d es uch hier nur um nlytische Wiederholungen us je einer Mischproe us drei Töpfen hndelt. - Seite 53 von 128 -

19 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Hypericingehlte (in mg/1g FM) Pseudohypericin Hypericin K AM-B AM-P Gm Gc Gd Ge Gi Gg T-Sc T-Ac T-KN T-D3 M-W M-T A. 3 Hypericingehlte nch ASE/HPLC ei Einstz verschiedener Mykorrhiz-Inokul n Johnniskrut (MW±SD von vier nlytischen Wiederholungen, n=1, Mischproe) Akürzungen der verwendeten Mykorrhiz-Inokul wie in T. 5, S Prüfung geeigneter Mykorrhiz-Inokul in Feldversuchen Insesondere der kommerzielle AMykor -Blähton htte sich in den Gewächshusversuchen ls gut geeignet zur Mykorrhizierung der Heil- und Gewürzpflnzen Thymin, Mjorn und Johnniskrut herusgestellt. Er zeichnete sich ußerdem durch die Möglichkeit zur kostengünstigen Produktion us. Dieses Inokulum sollte nun n diesen Kulturen in prxisnhen Feldversuchen mit dem Ziel eingesetzt werden, deutliche Ertrgssteigerungen sowie eine Erhöhung zw. qulittive Veresserung der wertgeenden Inhltsstoffe zu erreichen. Die Feldversuche wurden üer die vier Versuchsjhre 22 is 25 mit den Kulturen Mjorn, Thymin und Johnniskrut durchgeführt, um jhresedingte Witterungseinflüsse in die Bewertung der Ergenisse eineziehen zu können. Die Wetteredingungen der vier Versuchsjhre gestlteten sich erwrtungsgemäß recht unterschiedlich und können in den Klimtellen in Anlge 3 vollständig nchvollzogen werden. Ds Versuchsjhr 22 prägten hohe Niederschläge, insesondere in den Monten Juli und August, die sich positiv uf die Entwicklung der Pflnzen und dmit uch deren Kruterträge uswirkten. Die Temperturen lgen zudem im August uch deutlich üer dem lngjährigen Durchschnitt, wodurch die Pflnzen im Zusmmenhng mit den feuchten Bedingungen insesondere in der letzten Entwicklungsphse vor der Ernte einen deutlichen Wchstumsschu erhielten. Im zweiten Versuchsjhr 23 fehlten dgegen im Vergleich zum lngjährigen Mittel von April is August insgesmt 62 mm Niederschlg. Die negtiven Auswirkungen uf den Pflnzenwuchs ließen sich mit den späten Niederschlägen im Septemer nicht mehr eeinflussen. Zudem wr ds Jhr 23 geprägt von sehr hohen Temperturen. Die extrem trockenen und heißen klimtischen Bedingungen im Jhr 23 führten zu einer deutlich verzögerten Entwicklung der Pflnzen und zu drstisch reduzierten Ernteerträgen. 24 wr ein vergleichsweise kühles Anujhr. Die Temperturen lgen is zum Juli durchschnittlich 1 C unter dem montlichen lngjährigen Mittelwert. Die Niederschlgsmengen wren während der Vegettionszeit von April is Juni m Stndort Bernurg zunächst mit 122 mm im Vergleich zum lngjährigen Mittel (143 mm) nur wenig verringert. Der Juli wr dnn er regenreich. Der Aufgng der Kulturen verzögerte sich durch die kühlen Temperturen und geringen Niederschläge zunächst. Aufgrund der hohen Niederschläge im Juli und - Seite 54 von 128 -

20 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe des Temperturnstiegs im August entwickelten sich die Bestände is zur Ernte dnn er norml. Auch ds Versuchsjhr 25 gestltete sich ezüglich der Witterungsedingungen nhezu optiml für den Pflnzenwuchs. Besonders hohe Niederschläge g es im Mi mit 18 % (im Vergleich zum montlichen lngjährigen Mittelwert) und im Juli mit 22 %. Diese konnten die trockenen Monte April, Juni und August gut usgleichen. Trockenschäden im August trten ußerdem durch vergleichsweise niedrige Temperturen in diesem Mont nicht ein. Insgesmt oten die Jhre 22, 24 und 25 recht gute Witterungsedingungen für die Entwicklung der Pflnzen. Ds heiße und trockene Versuchsjhr 23 stellte dgegen recht hohe Anforderungen n die Tolernz der Pflnzen Thymin Thymin wurde in den Versuchsjhren 23, 24 und 25 uf den Versuchsfeldern ngeut. Die Mykorrhizierung der Feldversuche ist für Thymin im Versuchsjhr 23 esonders erfolgreich verlufen. Eine Beproung und Wurzeluntersuchung der jeweiligen Przellen des Feldversuches erg im konventionellen Anu für lle Kontrollflächen ttsächlich keine vorhndenen Mykorrhiz-Strukturen, wohingegen uf den mit AMykor -Blähton ehndelten Flächen eine leichte is mittlere Mykorrhizierung (Bewertungsstufe 1 is 2) festgestellt wurde. Auf den ökologischen Versuchsflächen wiesen die Kontrollflächen ereits eine leichte Mykorrhizierung uf (Bewertungsstufe 1), die mit AMykor -Blähton inokulierten Flächen wren er deutlich stärker mykorrhiziert (Bewertungsstufe 2). Die Ergenisse der Mykorrhizierungsewertung sind in Anlge 4 vollständig ufgeführt. Die Ertrgsergenisse des Versuchsnujhres 23 sind in der A. 31 grphisch drgestellt. Die Aildung zeigt die jeweils unter ökologischen und konventionellen Bedingungen erzielten frischen Kruterträge, geteilt nch den Ernteerträgen eim Schnitt im ersten Stndjhr sowie dem ersten und zweiten Schnitt im zweiten Stndjhr. Die Ernteerträge für Thymin im Anujhr 23 fielen lut A. 31 vergleichsweise niedrig us. Dies wr uf die heiße und trockene Vegettionsperiode in diesem Jhr zurückzuführen. Aus diesem Grund km es im ökologischen Anu uch zu deutlich niedrigeren Erträgen ls im konventionellen Anu. Durch Behndlung der Flächen mit AMykor -Blähton zum Zeitpunkt der Ausst wurden im ökologischen Anu von Thymin im ersten Stndjhr Ertrgszuwächse von 26 % im Vergleich zu nicht mykorrhizierten n erzielt. Im konventionellen Anu etrugen die Ertrgszuwächse uf den mykorrhizierten Flächen immer noch 9 % gegenüer den n. Diese Ertrgssteigerungen konnten mit einer Irrtumswhrscheinlichkeit von < 5 % ls signifiknt ewertet werden. Die positiven Einflüsse der Mykorrhizierung uf die Erträge wurden uch im zweiten Stndjhr der Thyminflächen festgestellt und führten im konventionellen Anu ei eiden Folgeernten zu weiteren signifiknten Ertrgssteigerungen. Im ökologischen Anu wurden tendenziell eenflls höhere Erträge ei eiden Ernten im zweiten Stndjhr erzielt (p <,1). Bezogen uf den Gesmtertrg ller Kruternten der 23 ngelegten Thyminflächen wren durch den Einstz von AMykor -Blähton im ökologischen Anu schließlich Ertrgssteigerungen von 11 % erzielt worden und die Ertrgssteigerungen im konventionellen Anu wurden sogr uf 15 % erhöht. Ds Signifiknzniveu lg dei für eide Anuvrinten deutlich üer 99 %. - Seite 55 von 128 -

21 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Krutertrg frisch (dt/h) ökologisch * * 2 ml AMykor / lfd. m konventionell * * * 2 ml AMykor / lfd. m 2. Stndjhr, 2. Schnitt 2. Stndjhr, 1. Schnitt 1. Stndjhr, 1. Schnitt A. 31 Ernteerträge für den Thyminnu 23 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD der Gesmterträge, n=6) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): * edeutet signifiknten Unterschied der Einzelerträge im Vergleich zur * edeutet signifiknten Unterschied der Gesmterträge im Vergleich zur (p <,1) signifiknter Unterschied zwischen ökologisch und konventionell keine signifiknte Interktion eider Einflussfktoren Die Inhltsstoffestimmung erfolgte in Ahängigkeit von der vorgenommenen Mykorrhizierung der Anuflächen und dem Anuverfhren (ökologisch oder konventionell). Die ermittelten Pekflächen-Prozente für die Huptromkomponenten (Thymol, γ-terpinen und p- Cymen) nch HS-SPME/GC sowie die ätherischen Ölgehlte nch WDD sind in A. 32 drgestellt. Dei sind jeweils die Mittelwerte us sechs Versuchswiederholungen im Feldnu sowie dvon us je zwei nlytischen Bestimmungen für die mykorrhizierten (mit 2 ml AMykor /lfd. m) zw. nicht mykorrhizierten () Pflnzen gegenüergestellt. Die us der A. 32 erkennren höheren ätherischen Ölgehlte ei Mykorrhiz-Einstz im ökologischen Anu 23 erwiesen sich ls signifiknt. Im konventionellen Anu wiesen die mykorrhizierten Pflnzen dgegen sogr geringere ätherische Ölgehlte uf, llerdings wren diese Unterschiede nicht signifiknt. Der Vergleich der Inhltsstoffzusmmensetzung (Pekflächen-Prozente) im ökologischen Anu von Thymin (A. 32) zeigt einen signifiknt positiven Einfluss des Mykorrhiz- Einstzes uf den Anteil der thymintypischen Aromkomponente Thymol. Im konventionellen Anu von Thymin 23 ist die Wirkung der Mykorrhizierung uf den Thymolgehlt dgegen nicht signifiknt. Jedoch wurden im konventionellen Anu ei den mykorrhizierten Pflnzen signifiknt höhere Anteile der eenflls für ds Thyminrom verntwortlichen Aromkomponente p-cymen und dfür niedrigere Anteile n γ-terpinen gefunden (A. 32). Eine Beeinflussung der Inhltsstoffzusmmensetzung von Thymin durch die Mykorrhizierung findet dmit uch im feldmäßigen Anu sttt. * - Seite 56 von 128 -

22 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Thymol g-terpinen p-cymen ätherischer Ölgehlt Pekflächen% ökologisch * * 2 ml AMykor/lfd. m konventionell * * 2 ml AMykor/lfd. m,7,6,5,4,3,2,1, Ätherischer Ölgehlt (ml/1g FM) A. 32 Pekflächen-Prozente der Huptromkomponenten nch HS-SPME/GC und ätherische Ölgehlte nch WDD für den Thyminnu 23 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD, n=6) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): * edeutet signifiknten Unterschied im Vergleich zur signifiknter Unterschied zwischen ökologisch und konventionell nur für den ätherischen Ölgehlt keine signifiknte Interktion eider Einflussfktoren Im nächsten Anujhr wurden die Feldversuche uf den zur Verdrängung utochthoner Mykorrhiz mit nicht mykorrhizierendem Rps ls Vorfrucht vorereiteten Versuchsflächen durchgeführt, um deutlichere Unterschiede im Mykorrhizierungsgrd zu erhlten und deutlichere Einflüsse der Mykorrhizierung uf die Inhltsstoffdten zu detektieren. Die Versuchswiederholungen der Feldversuche (ökologisch und konventionell) für Thymin im Anujhr 24 wurden zur Erhöhung der sttistischen Sicherheit ußerdem uf 18 Kontrollprzellen und 12 Przellen mit AMykor -Blähton erhöht. Die Ergenisse der Wurzeluntersuchungen der Thyminnuflächen 24 zeigten jedoch während der Thyminvegettion uch uf nicht mit AMykor -Blähton ehndelten Flächen vorhndene Mykorrhiz-Strukturen (Anlge 4). Trotz der vorherigen Verdrängung von Mykorrhizpilzen durch den Einstz von Rps ls Vorfrucht, konnte sich die utochthone Mykorrhiz während der Vegettionsperiode von Thymin schnell wieder regenerieren. Die zum Zeitpunkt der Thyminusst mit AMykor -Blähton ehndelten Przellen wiesen zwr höhere Mykorrhizierungsgrde (Bewertungsstufen 1 is 3) uf ls die Kontrollflächen, jedoch htte sich uch uf den meisten unehndelten Przellen is zur Thyminernte wieder eine stile Mykorrhiz-Kultur etliert (Bewertungsstufe is 2). Die Biomsseerträge wurden demzufolge im Anujhr 24 uch deutlich weniger von der gezielten Mykorrhiz-Behndlung der Versuchsflächen eeinflusst (A. 33). Zwr deuteten sich im konventionellen Anuversuch 24 Ertrgssteigerungen uf den mykorrhizierten Flächen n, jedoch wurde im ökologischen Versuch der gegenteilige Effekt eochtet. - Seite 57 von 128 -

23 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Krutertrg frisch (dt/h) ökologisch * 2 ml AMykor / lfd. m konventionell ml AMykor / lfd. m 2. Stndjhr, 2. Schnitt 2. Stndjhr, 1. Schnitt 1. Stndjhr, 1. Schnitt A. 33 Ernteerträge für den Thyminnu 24 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD der Gesmterträge, n 1 =18 n, n 2 =12 AMykor 2 ml / lfd. m) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): * edeutet signifiknten Unterschied der Gesmterträge im Vergleich zur signifiknter Unterschied zwischen ökologisch und konventionell tendenzielle Interktion eider Einflussfktoren (p <,1) Die A. 34 lässt er einen Einfluss der Ausringung des AMykor -Blähtons uf den ätherischen Ölgehlt im Anujhr 24 erkennen. Thymol g-terpinen p-cymen ätherischer Ölgehlt Pekflächen% ökologisch 2 ml AMykor/lfd. m konventionell * 2 ml AMykor/lfd. m,7,6,5,4,3,2,1, Ätherischer Ölgehlt (ml/1g FM) A. 34 Pekflächen-Prozente der Huptromkomponenten nch HS-SPME/GC und ätherische Ölgehlte nch WDD für den Thyminnu 24 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD, n 1 =18 n, n 2 =12 AMykor 2 ml / lfd. m) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): * edeutet signifiknten Unterschied im Vergleich zur signifiknter Unterschied zwischen ökologisch und konventionell für Thymol, p-cymen, γ-terpinen sowie für den ätherischen Ölgehlt keine signifiknte Interktion eider Einflussfktoren - Seite 58 von 128 -

24 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Im konventionellen Anu des Thymins in Bernurg wurde eine signifiknte Steigerung der ätherischen Ölgehlte uf den mit AMykor ehndelten Flächen festgestellt. Im ökologischen Anu führte die Ausringung des AMykor -Blähtons llerdings zu keiner signifiknten Beeinflussung der ätherischen Ölgehlte. Die Zusmmensetzung der Aromkomponenten wurde durch die Ausringung der eiden Blähtonvrinten eenflls nicht signifiknt eeinflusst. Im letzten Versuchsjhr des Thyminnus 25 wurden die Feldversuche für Thymin weiter usgedehnt, so dss für den ökologischen ls uch für den konventionellen Lndu je 3 Wiederholungen der Kontrollflächen (ohne Blähton-Ausringung) vorlgen und je 15 Wiederholungen von mykorrhizierten Flächen mit 2 zw. 4 ml AMykor -Blähton / lfd. m. Die Wurzeluntersuchungen uf den vorhndenen Mykorrhizierungsgrd (Anlge 4) ergen er uch in diesem Versuchsjhr deutliche Mykorrhizierungen uf den Kontrollflächen. Der Rpsnu in der Vorfrucht konnte die utochthone Mykorrhiz zwr uch für den Anuversuch 25 zunächst verdrängen, doch htte sich die Mykorrhiz innerhl der Vegettionsperiode des Thymins uch in diesem Jhr uf den nicht inokulierten Kontrollflächen schnell wieder etliert. Mit AMykor -Blähton ehndelte Przellen wiesen zwr durchschnittlich höhere Mykorrhizierungsgrde uf, er uch die Kontrollflächen wren zum Teil mykorrhiziert (Anlge 4). Signifiknte Effekte uf die Biomsseerträge durch den Einstz des AMykor -Blähtons konnten dher in den Feldversuchen 25 ufgrund der hohen Schwnkungen der Przellenerträge erneut nicht ermittelt werden (A. 35). Krutertrg frisch (dt/h) ökologisch konventionell ml AMykor / lfd. m 4 ml AMykor / lfd. m 2 ml AMykor / lfd. m 4 ml AMykor / lfd. m A. 35 Ernteerträge für den Thyminnu 25 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD, n 1 =3 n, n 2 =15 AMykor 2 ml / lfd.m, n 3 =15 AMykor 4 ml / lfd. m) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): keine signifiknten Unterschiede im Vergleich zur signifiknter Unterschied zwischen ökologisch und konventionell signifiknte Interktion eider Einflussfktoren Auch die Auswertung der ätherischen Ölgehlte zeigte keine signifiknten Einflüsse der Mykorrhizierung (A. 36). - Seite 59 von 128 -

25 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Pekflächen% Thymol g-terpinen p-cymen ätherischer Ölgehlt ökologisch * 2 ml AMykor / lfd. m * 4 ml AMykor / lfd. m konventionell 2 ml AMykor / lfd. m 4 ml AMykor / lfd. m,7,6,5,4,3,2,1, Ätherischer Ölgehlt (ml/1g FM) A. 36 Pekflächen-Prozente der Huptromkomponenten nch HS-SPME/GC und ätherische Ölgehlte nch WDD für den Thyminnu 25 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD, n 1 =3 n, n 2 =15 AMykor 2 ml/lfd. m, n 3 =15 AMykor 4 ml/lfd. m) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): * edeutet signifiknten Unterschied im Vergleich zur signifiknter Unterschied zwischen ökologisch und konventionell für Thymol, p-cymen und γ-terpinen kein signifiknter Unterschied zwischen ökologisch und konventionell für ätherischen Ölgehlt keine signifiknte Interktion eider Einflussfktoren Betrchtet mn die Zusmmensetzung der Aromkomponenten (Pekflächen-Prozente nch HS-SPME/GC), so wurden für p-cymen und γ-terpinen weder im ökologischen noch im konventionellen Feldversuch signifiknte Einflüsse der Mykorrhizierung festgestellt. Der Gehlt n Thymol wurde llerdings im ökologischen Anu ei leichter Mykorrhizierung zunächst signifiknt gesenkt, konnte ei stärkerer Mykorrhizierung dnn er wieder gesteigert werden (A. 36). Der Einfluss der Mykorrhizierung uf Ertrgswerte und Inhltsstoffe von Thymin wurde im Rhmen der vorliegenden Areit ufgrund der guten Mykorrhizierrkeit dieser Kultur m umfssendsten etrchtet. Die Einflüsse einer Mykorrhizierung mit AMykor -Blähton uf die Erträge und die romgeenden Inhltsstoffe für Thymin wurden dher für lle durchgeführten Untersuchungen nhnd der Gewächshus- und Feldversuche in der folgenden Telle noch einml zusmmengefsst (T. 6). Die Auswertung in der Telle zeigt zunächst einen positiven Einfluss der Mykorrhizierung mit dem AMykor -Blähton uf den Krutertrg im Thyminnu. Insesondere im Gewächshusversuch sowie im Feldversuch 23 führte die Anwendung des AMykor -Blähtons zu signifiknten Steigerungen der Kruterträge. Nur im ökologischen Anu der Versuchsjhre 24 und 25 deuteten sich niedrigere Ernteerträgen nch Mykorrhizierung n. D in diesen Jhren jedoch uch uf den Kontrollflächen gut etlierte Mykorrhiz-Symiosen n den Thyminwurzeln detektiert wurden, sind diese Versuchsergenisse nicht zu verllgemeinern. Auch der Gesmtgehlt n ätherischem Öl in Thymin wurde insesondere ei leichter Mykorrhizierung (2 ml / lfd. m) meist positiv eeinflusst. Erhöhte Mengen n Inokulum htten im Vergleich zu den Kontrollflächen llerdings keinen Einfluss uf den Gesmtgehlt - Seite 6 von 128 -

26 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe oder führten sogr zu einer Senkung der Gehlte n ätherischem Öl im Vergleich zur. Bezüglich der Zusmmensetzung der Aromkomponenten km es ei Mykorrhiz- Anwendung häufig zu einer Steigerung der p-cymen-gehlte und im Gegenzug zu niedrigeren Gehlten n γ-terpinen. Die Thymolgehlte wurden ei Mykorrhizierung oft gesteigert. Dieser Effekt wurde ei höherem Mykorrhiz-Einstz eher noch unterstützt. T. 6 Zusmmensetzung der Aromkomponenten (%) Zusmmenfssende Üersicht ller ermittelten Einflüsse der Mykorrhizierung mit AMykor -Blähton uf Ertrg und Inhltsstoffe von Thymin Feldversuche Prmeter Krutertrg Ätherischer Ölgehlt p-cymen γ-terpinen Thymol Gewächshusversuche Aufwnd- mit ökologisch konventionell menge AMykor -Blähton AMykor 2 ml / lfd. m 4 ml / lfd. m 2 ml / lfd. m 4 ml / lfd. m 2 ml / lfd. m 4 ml / lfd. m 2 ml / lfd. m 4 ml / lfd. m 2 ml / lfd. m 4 ml / lfd. m - erhöht mit AM im Vergleich zur : (5-1 %), (1-2 %), (2-3 %), (> 3 %); - gesenkt mit AM im Vergleich zur : (5-1 %), (1-2 %), (2-3 %), (> 3 %); - uneeinflusst von Mykorrhizierung (Aweichung von der < 5 %); - signifiknte Änderung (p <,5) Mjorn Feldversuche mit Mjorn wurden in den Jhren 22, 23 und 24 durchgeführt. Die extrem heißen und trockenen Witterungsedingungen im Versuchsjhr 23 (siehe Kp und Anlge 3) führten jedoch zu deutlich lückenhften Beständen und dmit hohen Ernteverlusten, so dss dieser Anuversuch nicht usgewertet werden konnte. Die Wurzeluntersuchungen zum Mykorrhizierungsgrd ergen für die eiden ürigen Jhre erfolgreiche Mykorrhizierungsergenisse uf den mit AMykor -Blähton ehndelten Versuchsflächen, dgegen meist keine zw. nur gering usgeildete Mykorrhiz-Strukturen uf den Kontrollflächen (Anlge 4). Die Kruterträge von Mjorn konnten im Versuchsjhr 22 durch Einstz des AMykor - Blähtons nicht signifiknt gesteigert werden. Eine Tendenz zu höheren Ernteerträgen g es llerdings 22 im konventionellen Anu von Mjorn nch Mykorrhiz-Behndlung (p <,15, vgl. A. 37). - Seite 61 von 128 -

27 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Krutertrg frisch (dt/h) ökologisch konventionell ml AMykor / lfd. m 65 ml AMykor / lfd. m 35 ml AMykor / lfd. m 65 ml AMykor / lfd. m A. 37 Ernteerträge für den Mjornnu 22 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD, n=4) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): keine signifiknten Unterschiede im Vergleich zur keine signifiknten Unterschiede zwischen ökologisch und konventionell keine signifiknte Interktion eider Einflussfktoren Die mittels Wsserdmpfdestilltion (WDD) ermittelten Gesmtgehlte n ätherischem Öl der Mjornpflnzen us dem Feldversuch 22 sind in der A. 38 grphisch drgestellt. Ätherischer Ölgehlt (ml/1g),4,3,2,1,345, ökologisch,33 35ml Amykor / lfd. m,35 65ml Amykor / lfd. m,325 konventionell,355 35ml Amykor / lfd. m,31 65ml Amykor / lfd. m A. 38 Ätherische Ölgehlte nch WDD für den Mjornnu 22 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD, n=4) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): keine signifiknten Unterschiede Auch ezüglich der ätherischen Ölgehlte wurden tendenziell höhere Werte nur ei der mykorrhizierten Vrinte des konventionellen Anus ermittelt (p <,15). Signifiknte Unterschiede g es jedoch uch ei den ätherischen Ölgehlten weder in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung noch in Ahängigkeit vom konventionellen oder ökologischen Anu. Im Jhr 23 wurden die Versuchsflächen für 24 mit nicht mykorrhizierendem Rps ls Vorkultur vorereitet, wodurch die utochthone Mykorrhiz verdrängt werden sollte. Außer- - Seite 62 von 128 -

28 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe dem wurden die Versuchswiederholungen pro Vrinte von im Jhr 22 vier uf sechs in den Folgejhren erhöht. Schließlich erwies sich die Mykorrhizierung im ersten Versuchsjhr 22 mit Aufwndmengen von 35 zw. 65 ml / lfd. m ußerdem ls zu hoch und wurde für die nächsten Versuchsjhre uf 2 ml / lfd. m festgelegt. Signifiknte Unterschiede der Kruterträge oder uch der Gehlte n ätherischem Öl und der Zusmmensetzungen der Aromkomponenten wurden ei Mjorn zwischen Kontrollflächen und mit Blähton ehndelten Flächen er uch im Versuchsjhr 24 nicht detektiert (ohne A.). Die für Mjorn in den Gewächshus- und Feldversuchen ermittelten Dten zum Einfluss der Mykorrhizierung mit AMykor -Blähton uf die Erträge und Aromstoffgehlte werden in der T. 7 nochmls zusmmengefsst drgestellt. T. 7 Zusmmensetzung der Aromkomponenten (%) Zusmmenfssende Üersicht ller ermittelten Einflüsse der Mykorrhizierung mit AMykor -Blähton uf Ertrg und Inhltsstoffe von Mjorn Feldversuche Prmeter Krutertrg Ätherischer Ölgehlt Gewächshusversuche mit ökologisch konventionell AMykor -Blähton Aufwndmenge AMykor 2 ml / lfd. m 35 ml / lfd. m 65 ml / lfd. m 2 ml / lfd. m 35 ml / lfd. m 65 ml / lfd. m Sinen 2 ml / lfd. m trns-sinenhydrt 2 ml / lfd. m cis-sinenhydrt 2 ml / lfd. m trns-sinenhydrtcett 2 ml / lfd. m cis-sinenhydrtcett 2 ml / lfd. m - erhöht mit AM im Vergleich zur : (5-1 %), (1-2 %), (2-3 %), (> 3 %); - gesenkt mit AM im Vergleich zur : (5-1 %), (1-2 %), (2-3 %), (> 3 %); - uneeinflusst von Mykorrhizierung (Aweichung von der < 5 %); - signifiknte Änderung (p <,5) Die zusmmenfssende Drstellung in der Telle mcht deutlich, dss die Wirkungen der gezielten Inokultion von Mjornpflnzen mit dem AMykor -Blähton deutlich geringer usfielen ls die für Thymin eochteten Effekte. Eine tendenzielle Steigerung der Kruterträge ei Inokultion mit dem AMykor -Blähton wurde zwr im Rhmen der Gewächshusversuche festgestellt werden, doch konnte diese Beochtung nur im konventionellen Feldversuch 22 estätigt werden (p <,15). Signifiknte Ertrgssteigerungen wurden in keinem Versuch ermittelt. Auch ezüglich der Gehlte und Zusmmensetzungen der Inhltsstoffe wren keine reproduzierren Effekte im Zusmmenhng mit der Blähtonnwendung detektiert worden. Eine Tendenz zur Steigerung des ätherischen Ölgehltes lässt sich nur im konventionellen Lndu erkennen (p <,15). - Seite 63 von 128 -

29 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Johnniskrut Mit Johnniskrut wurden Feldversuche in den Jhren 22 und 23 durchgeführt. Bei den Wurzeluntersuchungen zum Mykorrhizierungsgrd der Versuchsprzellen wurden meist deutliche Unterschiede zwischen den gezielt inokulierten Flächen und den Kontrollflächen ermittelt. Nicht mit AMykor -Blähton ehndelte Kontrollflächen wren zwr meist uch leicht mykorrhiziert, uf den gezielt inokulierten Versuchsflächen wurden er deutlich stärker usgeildete Mykorrhiz-Strukturen gefunden. Keine höhere Mykorrhiz-Ausildung ls uf den Kontrollflächen wr n den mit AMykor -Blähton inokulierten Pflnzen er im ökologischen Feldversuch des Anujhres 22 festgestellt worden. (Anlge 4) Die für Johnniskrut im Feldversuch 22 ermittelten Erträge werden in der folgenden Aildung drgestellt. Signifiknte Unterschiede wurden hier weder in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung noch in Ahängigkeit vom ökologischen zw. konventionellen Anu ermittelt (A. 39). Krutertrg frisch (dt/h) Stndjhr, 1. Schnitt 1. Stndjhr, 2. Schnitt 2. Stndjhr, 1. Schnitt ökologisch konventionell ml AMykor /lfd. m 65 ml AMykor / lfd. m 35 ml AMykor /lfd. m 65 ml AMykor / lfd. m A. 39 Ernteerträge für den Johnniskrutnu 22 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD, n=4) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): keine signifiknten Unterschiede im Vergleich zur signifiknter Unterschied zwischen ökologisch und konventionell keine signifiknte Interktion eider Einflussfktoren Die Ergenisse der Bestimmung der Hypericinverindungen für ds Johnniskrut us dem Anujhr 22 wiesen dgegen deutlichere Veränderungen in Ahängigkeit vom Mykorrhiz-Einstz uf. Die A. 4 zeigt dzu die ermittelten Hypericingehlte des ersten und zweiten Schnittes im Versuchsjhr 22 jeweils für die ökologische und konventionelle Anuvrinte. Im konventionellen Anu wurden, wie hier zu sehen, signifiknt höhere Gehlte der eiden Hypericinverindungen Hypericin und Pseudohypericin in den mykorrhizierten Johnniskrutpflnzen gefunden. Bei den Johnniskrutpflnzen us ökologischem Anu wren die Hypericingehlte ereits uf den nicht mit AMykor -Blähtons mykorrhizierten Flächen sehr hoch. Wie oen eschrieen, htte die zusätzliche Ausringung des AMykor -Blähtons ußerdem zu keiner esseren Mykorrhiz-Ausildung ls uf den Kontrollflächen geführt (vgl. Anlge 4). Demzufolge wurde uch keine weitere Steigerung der Hypericingehlte uf den AMykor -Flächen erzielt. - Seite 64 von 128 -

30 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Die Hypericingehlte des Johnniskruts us der zweiten Ernte wren in eiden Anuvrinten gegenüer den Gehlten us der ersten Ernte deutlich gesenkt. Auch hier wr wieder ein positiver Einfluss der Mykorrhiz-Anwendung uf den Hypericingehlt in der konventionellen Vrinte festzustellen. Weiterhin wr zu eochten, dss eine niedrigere Dosierung des AMykor -Blähtons zu stärkeren Effekten führte ls die höhere Dosierung. Hypericingehlt (mg/1g) Pseudohypericin Hypericin ökologisch konventionell 1. Schnitt 2. Schnitt 1. Schnitt 2. Schnitt * 21 * * * * 9 * * ml AMykor / lfd. m 65 ml AMykor / lfd. m 35 ml AMykor / lfd. m 65 ml AMykor / lfd. m 35 ml AMykor / lfd. m 65 ml AMykor / lfd. m 35 ml AMykor / lfd. m 65 ml AMykor / lfd. m A. 4 Hypericingehlte nch ASE/HPLC für den Johnniskrutnu 22 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD der Gesmtgehlte, n=4) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): * edeutet signifiknten Unterschied im Vergleich zur kein signifiknter Unterschied zwischen ökologisch und konventionell signifiknte Interktion eider Einflussfktoren Wie schon für Mjorn eschrieen, htte uch ds Johnniskrut im Anujhr 23 deutlich unter den heißen Temperturen und den fehlenden Niederschlägen zu leiden. Die Pflnzen wren unvollständig ufgegngen, ws zu großen Bestndslücken, geringem Pflnzenwuchs und insgesmt hohen Ernteusfällen führte. Auch die Auswertung der Ernteerträge (A. 41) führte deshl zu deutlichen Schwnkungen der einzelnen Przellen, so dss keine Unterschiede der Kruterträge in Ahängigkeit von der Anwendung des AMykor - Blähtons ermittelt wurden. Bei der Folgeernte im zweiten Stndjhr wurden zwr wieder höhere Ernteerträge erhlten, signifiknte Ertrgsunterschiede in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung trten er uch hier nicht uf. - Seite 65 von 128 -

31 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe Krutertrg frisch (dt/h) ökologisch ml AMykor / lfd. m konventionell 2 ml AMykor / lfd. m 2. Stndjhr, 1. Schnitt 1. Stndjhr, 1. Schnitt A. 41 Ernteerträge für den Johnniskrutnu 23 in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und ökologischem zw. konventionellem Anuverfhren (MW±SD, n=6) Zweifktorielle ANOVA (p <,5): keine signifiknten Unterschiede im Vergleich zur signifiknter Unterschied zwischen ökologisch und konventionell keine signifiknte Interktion eider Einflussfktoren Die Hypericingehlte wurden ufgrund des sehr ungleichmäßigen und sehr lückenhften Bestndes der ökologischen Flächen eim ersten Schnitt im Anujhr 23 nur für den konventionellen Feldversuch ermittelt und sind in der A. 42 drgestellt. Hypericingehlt (mg/1g) konventionell * 2 ml AMykor/lfd. m Hypericin Pseudohypericin A. 42 Hypericingehlte nch ASE/HPLC für den Johnniskrutnu 23 in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung ei konventionellem Anuverfhren (MW±SD der Gesmtgehlte, n=6) * edeutet signifiknten Unterschied im Vergleich zur (t-test, p <,5) Die A. 42 zeigt, dss zumindest für den konventionellen Anu uch im Anujhr 23 signifiknte Steigerungen der Hypericingehlte ei den mykorrhizierten Pflnzen festgestellt wurden. Eine Zusmmenfssung ller für Johnniskrut ermittelten Einflüsse einer Mykorrhizierung mit AMykor -Blähton uf die Erträge und Hypericingehlte in den durchgeführten Gewächshus- und Feldversuchen wird in der T. 8 drgestellt. - Seite 66 von 128 -

32 6.2 Einflüsse der Mykorrhizierung uf Biomsse und Inhltsstoffe T. 8 Zusmmenfssende Üersicht ller ermittelten Einflüsse der Mykorrhizierung mit AMykor - Blähton uf Ertrg und Inhltsstoffe von Johnniskrut Feldversuche Prmeter Krutertrg Hypericin Pseudohypericin Gewächshusversuche mit ökologisch konventionell AMykor -Blähton Aufwndmenge AMykor 2 ml / lfd. m 35 ml / lfd. m 65 ml / lfd. m n.. 2 ml / lfd. m 35 ml / lfd. m 65 ml / lfd. m n.. 2 ml / lfd. m 35 ml / lfd. m 65 ml / lfd. m - erhöht mit AM im Vergleich zur : (5-1 %), (1-2 %), (2-3 %), (> 3 %); - gesenkt mit AM im Vergleich zur : (5-1 %), (1-2 %), (2-3 %), (> 3 %); - uneeinflusst von Mykorrhizierung (Aweichung von der < 5 %); - signifiknte Änderung (p <,5); n.. - nicht nlysiert (zu geringe Proenmengen); - Mykorrhizierung durch AMykor -Blähton nicht erfolgreich Im Gewächshusversuch wurden für die Mykorrhizierung mit AMykor -Blähton tendenziell steigernde Effekte uf den Ertrg und die Inhltsstoffe Hypericin und Pseudohypericin festgestellt. Aufgrund der geringen Anzhl n Versuchswiederholungen wren diese Ergenisse jedoch nicht signifiknt. Eine ertrgsteigernde Wirkung der Mykorrhizierung ließ sich in den Feldversuchen er nicht estätigen. Dgegen wren uch in den Feldversuchen deutliche Änderungen der Inhltsstoffgehlte (Hypericine) nch der Anwendung des AMykor -Blähtons zu eochten. Dei fnd im Anujhr 22 im ökologischen Anu ei niedriger Anwendungskonzentrtion des Mykorrhiz-Inokulums eine Reduzierung der Gehlte der Hypericinverindungen in Johnniskrut sttt. Aufgrund der fehlenden Unterschiede im Mykorrhizierungsgrd von inokulierten Versuchsflächen und Kontrollflächen ist für diesen Effekt er nicht der Einstz des AMykor - Blähtons verntwortlich. Die ökologischen Feldversuche des nächsten Anujhres konnten nicht nlysiert werden, so dss die Effekte im ökologischen Anu insgesmt nicht uswertr sind. Im konventionellen Anu wurden er in eiden Anujhren für lle Anwendungskonzentrtionen des Inokulums signifiknte Steigerungen der Inhltsstoffe Hypericin und Pseudohypericin ermittelt. Dei führte eine niedrigere Dosierung des AMykor -Blähtons zu stärkeren Effekten uf die Hypericingehlte ls eine höhere Dosierung. Zusmmenfssend wurde uch für Johnniskrut ein deutlicher Einfluss der Mykorrhiz- Behndlung uf die Entwicklung der wertgeenden Inhltsstoffe der Pflnze festgestellt. - Seite 67 von 128 -

33 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides Phänotypische Beurteilung der Schädigungen Nch Mykorrhiz-Inokultion wr ei gesunden, nicht mit dem Erreger eimpften Johnniskrutpflnzen im Gewächshus äußerlich kein Unterschied zwischen mykorrhizierten und nicht mykorrhizierten Pflnzen zu eochten. Die A. 43 zeigt ds Ergenis der Beimpfung mit dem Erreger m Beispiel nicht mykorrhizierter und mykorrhizierter Pflnzen der nfälligen Stndrdsorte. (ohne AM) erregerfrei (ohne AM) C. cf. gloeosporioides mit AMykor -Blähton erregerfrei mit AMykor -Blähton C. cf. gloeosporioides A. 43 Vergleich nicht mykorrhizierter Pflnzen (Bild links) und mykorrhizierter Pflnzen (Bild rechts) jeweils ohne (linke Pflnze) zw. mit (rechte Pflnze) Erregereimpfung Johnniskrutsorte: nfälliger Stndrd Mykorrhizierung: nicht mykorrhizierte (linkes Bild), AMykor -Blähton (rechtes Bild) Erreger: ohne Erreger (je linke Pflnze), C. cf. gloeosporioides 1³ Konidien/ml (je rechte Pflnze) Zeitpunkt: 1 DAT Bereits 1 Tge nch der Inokultion mit 25 ml einer Konidiensuspension von Colletotrichum cf. gloeosporioides einer Konidiendichte von 1³/ml wren in der nicht mykorrhizierten Pflnze deutliche Welkesymptome ei der ehndelten Vrinte (rechte Pflnze im linken Bild) zu erkennen. Die Ausringung von 25 ml Erregersuspension einer Konidiendichte von 1³/ml führte demnch ei der nicht mykorrhizierten der nfälligen Stndrdsorte schon nch 1 Tgen zu den eknnten Krnkheitssymptomen, die schließlich uch ds Asteren der Pflnzen nch sich zogen. Betrchtet mn dgegen die zuvor mit dem AMykor -Blähton mykorrhizierten Johnniskrutpflnzen der nfälligen Stndrdsorte, so führte der Befll mit dem Erreger längst nicht zu den een eschrieenen Ergenissen (A. 43, rechtes Bild). Im Vergleich zur nicht mykorrhizierten Vrinte (A. 43, linkes Bild) hielt die mykorrhizierte Pflnze (A. 43, rechtes Bild) dem Befll mit dem Erreger deutlich esser stnd und wies uch nch der Beimpfung nhezu keine Welkesymptome uf. Die drgestellten Ergenisse ließen sich mit den weiteren durchgeführten Versuchen regelmäßig reproduzieren. Auch ei der Sorte Topz wurden in nicht zuvor mykorrhizierten Pflnzen Welkesymptome eochtet, die llerdings erst zu einem späteren Zeitpunkt die entsprechende Ausprägung erlngten. Bei vorheriger Mykorrhizierung lieen die Welkesymptome uch ei dieser Johnniskrutsorte us oder wren deutlich schwächer usgeprägt (ohne Aildung). Phänotypisch wurde dmit ein positiver Einfluss der Mykorrhizierung uf die Tolernz der Johnniskrutpflnzen gegenüer dem Welkeerreger Colletotrichum cf. gloeosporioides ermittelt. - Seite 68 von 128 -

34 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides Biomsseuseuten in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Pthogenefll Die Bestimmung der Biomsse in mykorrhizierten und nicht mykorrhizierten Töpfen jeweils 3 Tge nch der Inokultion mit dem Erreger Colletotrichum cf. gloeosporioides führte zu den in A. 44 drgestellten Ergenissen. Spross-FM (g/topf) c - ohne Erreger "nfälliger Stndrd" d c Cfg 1E3 Cfg 1E5 Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml Spross-FM (g/topf) c - ohne Erreger 'Topz' Cfg 1E3 Cfg 1E5 Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml - ohne AM AMykor - ohne AM AMykor A. 44 Biomsse (frisches Sprossgewicht in g/topf) in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Erregereimpfung (Cfg) 3 DAT (MW±SD, n=6) Johnniskrutsorte: nfälliger Stndrd (Bild links), Topz (Bild rechts) Mykorrhizierung: nicht mykorrhizierte zw. AMykor -Blähton Erreger: Colletotrichum cf. gloeosporioides ( / 1³ / 1 5 Konidien/ml) Zeitpunkt: 3 DAT * edeutet signifiknten Unterschied im Vergleich zur nicht mykorrhizierten (t-test, p <,5) Bei der nfälligen Stndrdsorte (Bild links) htte die Mykorrhizierung ereits nhnd der gesunden Kontrollvrinte (ohne Erreger) zu leicht erhöhten Biomsseerträgen geführt. Die durch den Erregerefll im Wchstum eeinträchtigten Töpfe wiesen in den mykorrhizierten Vrinten eenflls deutlich höhere Erträge uf. Auch ei der tolernten Johnniskrutsorte Topz (Bild rechts) wr schon nhnd der gesunden Pflnzen ei Mykorrhizierung ein esseres Wchstum, gemessen n der Biomsse, zu erkennen. In den nicht mykorrhizierten Pflnzen dieser Sorte führte eine Beimpfung mit der geringeren Erregerkonzentrtion von 1³ Konidien pro ml noch nicht zu Ertrgsverlusten. Bei höherer Erregerkonzentrtion von 1 5 Konidien pro ml dgegen wiesen uch die nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen der Sorte Topz ein eeinträchtigtes Wchstum uf. Die Mykorrhizierung htte er uch ei der Sorte Topz die Wchstumshemmung unterdrückt. Die Behndlung mit AMykor -Blähton ht dmit m Beispiel des Johnniskruts im Gewächshusversuch einen positiven Effekt uf die Biomsseerträge gesunder Pflnzen, v.. er uch uf die mit Colletotrichum cf. gloeosporioides efllenen krnken Pflnzen gezeigt. - Seite 69 von 128 -

35 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides Ergenisse der Bestimmung von Enzymktivitäten Ktlse-Aktivität Die A. 45 zeigt die Rektion der nfälligen Stndrdsorte m Beispiel der Ktlse (CAT)-Aktivität uf die Beimpfung der Johnniskrutpflnzen mit dem Erreger Colletotrichum cf. gloeosporioides. Ktlse-Aktivität (µmol H2O2 g FM -1 min -1 ) DAT - ohne AM AMykor - ohne Erreger Cfg 1³ Cfg 15 2 DAT c Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml - ohne Erreger Cfg 1³ Cfg 15 3 DAT Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml d c cd - ohne Erreger Cfg 1E3 Cfg 1E5 Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml A. 45 Ktlse-Aktivität in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Erregereimpfung (Cfg) jeweils 6, 2 und 3 DAT (MW±SD, n=4) Johnniskrutsorte: nfälliger Stndrd Mykorrhizierung: nicht mykorrhizierte zw. AMykor -Blähton Erregersuspension: Colletotrichum cf. gloeosporioides ( / 1³ / 1 5 Konidien/ml) ANOVA (p <,5): gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied Die Mykorrhizierung htte keinen Einfluss uf die CAT-Aktivität in den erregerfreien Pflnzen. Die Beimpfung mit Colletotrichum cf. gloeosporioides führte in der niedrigeren Erregerkonzentrtion kum zu Veränderungen der Aktivität der CAT in den nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen. In den mit höheren Erregerkonzentrtionen eimpften nicht mykorrhizierten Pflnzen erg sich nch 3 Tgen jedoch ein deutlicher Afll der CAT-Aktivität. In den zuvor mit AMykor -Blähton inokulierten Pflnzen km es zu weichenden Effekten insesondere ei der höheren Erregerkonzentrtion. Bei den mit 1 5 Konidien/ml des Erregers eimpften Pflnzen zeigte sich ereits nch 2 Tgen eine Steigerung der CAT-Aktivität und nch 3 Tgen wr die CAT-Aktivität gegenüer nicht mykorrhizierten Pflnzen mit gleichem Infektionsgrd wie uch gegenüer der uneimpften deutlich erhöht. Vergleichre Ergenisse wurden uch mit der Sorte Topz erhlten (ohne A.). - Seite 7 von 128 -

36 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides Ascort-Peroxidse-Aktivität Die Aktivität der eenflls H 2 O 2 uenden Ascort-Peroxidse (APX) wurde von der Mykorrhizierung ei zusätzlichem Pthogenefll noch deutlicher eeinflusst. Die A. 46 zeigt dies m Beispiel einer Versuchsreihe mit der nfälligen Stndrdsorte. Ascort-Peroxidse-Aktivität (µmol Ascort g FM -1 min -1 ) DAT - ohne AM AMykor - ohne Erreger 2 Cfg DAT 1³ Cfg 15 Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml c - ohne Erreger Cfg 1³ Cfg 15 3 DAT Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml e de cd - ohne Erreger Cfg 1E3 Cfg 1E5 Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml A. 46 Ascort-Peroxidse-Aktivität in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Erregereimpfung (Cfg) jeweils 6, 2 und 3 DAT (MW±SD, n=4) Johnniskrutsorte: nfälliger Stndrd Mykorrhizierung: nicht mykorrhizierte zw. AMykor -Blähton Erregersuspension: Colletotrichum cf. gloeosporioides ( / 1³ / 1 5 Konidien/ml) ANOVA (p <,5): gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied c Auch uf die Aktivität der APX htte die Mykorrhizierung keinen Einfluss in den erregerfreien Pflnzen. Die niedrige Erregerkonzentrtion zeigte in den nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen zunächst noch keine nennenswerten Wirkungen uf die APX-Aktivität der Pflnzen. Nch 3 Tgen km es jedoch in den mit 1 3 Konidien/ml des Erregers eimpften Pflnzen zu einer Senkung der APX-Aktivität. Hohe Erregerkonzentrtionen wirkten sich ereits nch 6 Tgen nhltend negtiv uf die APX-Aktivität us. Bei den geringen Effekten der niedrigen Erregerkonzentrtion zeigten mykorrhizierte Pflnzen noch keinen Unterschied der APX-Aktivität zu nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen. Die vorherige Mykorrhizierung wies er insesondere ei der durch strken Erregerefll eeinträchtigten Aktivität der APX deutliche Wirkungen uf. Bei Beimpfung mit 1 5 Konidien/ml konnte schon 6 Tge nch der Erregereimpfung im Vergleich zur nicht mykorrhizierten die Aktivität der APX ufrecht gehlten werden. Nch 2 Tgen zeigte sie sich sogr erhöht gegenüer der nicht efllenen. Auch 3 Tge nch Pthogenefll wr die APX-Aktivität der mykorrhizierten Pflnzen gegenüer der nicht mykorrhizierten noch stilisiert worden. Vergleichre Ergenisse wurden uch n der Sorte Topz erhlten (ohne A.). - Seite 71 von 128 -

37 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides Monodehydroscort- und Dehydroscort-Reduktse-Aktivität Auch die Aktivität der Monodehydroscort-Reduktse (MDHAR) wurde, wie in der folgenden Aildung m Beispiel der nfälligen Stndrdsorte drgestellt, im Flle des Pthogeneflls von der Mykorrhizierung positiv eeinflusst (A. 47). Monodehydroscort-Reduktse-Aktivität (µmol NADH g FM -1 min -1 ) DAT c - ohne AM AMykor - ohne Erreger Cfg 1³ Cfg 15 2 DAT Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml - ohne Erreger Cfg 1³ Cfg 15 3 DAT Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml c c - ohne Erreger Cfg 1E3 Cfg 1E5 Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml A. 47 Monodehydroscort-Reduktse-Aktivität in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Erregereimpfung (Cfg) jeweils 6, 2 und 3 DAT (MW±SD, n=4) Johnniskrutsorte: nfälliger Stndrd Mykorrhizierung: nicht mykorrhizierte zw. AMykor -Blähton Erregersuspension: Colletotrichum cf. gloeosporioides ( / 1³ / 1 5 Konidien/ml) ANOVA (p <,5): gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied d c c Die Mykorrhizierung zeigte uch uf die MDHAR keinen Einfluss in den erregerfreien Pflnzen. Die Beimpfung mit der niedrigen Erregerkonzentrtion führte ußerdem zu keinen Unterschieden der MDHAR-Aktivität in den nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen. Erst ei hohem Erregerefll wurde die Aktivität der MDHAR in den Kontrollpflnzen zu llen Messzeitpunkten deutlich gesenkt. Bei vorheriger Mykorrhizierung wr ereits ei niedriger Erregerkonzentrtion, und esonders ei hoher Erregerkonzentrtion, eine Steigerung der MDHAR-Aktivität nch 6, 2 und 3 Tgen zu eochten. Insesondere ei strkem Befll mit dem Erreger Colletotrichum cf. gloeosporioides wurde die Aktivität des Enzyms in den zuvor mykorrhizierten Pflnzen zu llen Messzeitpunkten stilisiert. Die durchgeführten Prllelversuche zeigten vergleichre Ergenisse. d d c - Seite 72 von 128 -

38 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides Die Dehydroscort-Reduktse zeigte ei llen durchgeführten Versuchen deutlich schwnkende Werte. Dei wurden keine eindeutigen Effekte des Erregereflls zw. der Mykorrhizierung uf die Aktivität dieses Enzyms ermittelt (ohne A.) Glutthion-Reduktse-Aktivität Die Beeinflussung der Aktivität der Glutthion-Reduktse (GR) durch Pthogenefll und Mykorrhizierung wird in der folgenden A. 48 m Beispiel einer Versuchsreihe mit der Johnniskrutsorte Topz drgestellt. Glutthion-Reduktse-Aktivität (µmol NADPH g FM -1 min -1 ) 1,8,6,4,2 1,8,6,4,2 1,8,6,4,2 1 DAT - ohne AM AMykor - ohne Erreger Cfg 1³ Cfg 15 2 DAT Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml cd - ohne Erreger Cfg 1³ Cfg 15 3 DAT Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml c c c - ohne Erreger Cfg 1E3 Cfg 1E5 Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml A. 48 Glutthion-Reduktse-Aktivität in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Erregereimpfung (Cfg) jeweils 1, 2 und 3 DAT (MW±SD, n=4) Johnniskrutsorte: Topz Mykorrhizierung: nicht mykorrhizierte zw. AMykor -Blähton Erregersuspension: Colletotrichum cf. gloeosporioides ( / 1³ / 1 5 Konidien/ml) ANOVA (p <,5): gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied c In den erregerfreien Pflnzen htte die Mykorrhizierung keinen edeutenden Einfluss uf die Aktivität der GR. 1 Tge nch Erregereimpfung zeigte sich eenflls noch kein Effekt uf die Enzymktivität. Dgegen wr die GR-Aktivität nch Pthogenefll mit eiden Erregerkonzentrtionen in der nicht mykorrhizierten nch 2 und 3 Tgen deutlich hergesetzt. Mykorrhizierte Pflnzen dgegen konnten die Aktivität der GR 2 und 3 Tge nch Erregereimpfung uf zumindest Ausgngsniveu, teilweise sogr uf erhöhtem Niveu, stilisieren und dmit den fortschreitenden Au der durch den Welkeerreger vermehrt uftretenden Rdikle sicherstellen. Vergleichre Ergenisse wurden uch in den Prllelversuchen mit eiden Johnniskrutsorten erhlten. d c - Seite 73 von 128 -

39 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides Glutthion-S-Trnsferse-Aktivität Die A. 49 zeigt die Ergenisse der Aktivitätsestimmungen der Glutthion-S-Trnsferse (GST) in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Pthogenefll ei einem Versuchsdurchluf mit der nfälligen Stndrdsorte. Glutthion-S-Trnsferse-Aktivität (µmol NADPH g FM -1 min -1 ) 1,8,6,4,2 1,8,6,4,2 1,8,6,4,2 6 DAT - ohne AM AMykor - ohne Erreger Cfg 1³ Cfg 15 2 DAT Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml - ohne Erreger Cfg 1³ Cfg 15 3 DAT Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml c c - ohne Erreger Cfg 1E3 Cfg 1E5 Coll. cf. gloeosp., Konidien/ml c c c c c A. 49 Glutthion-S-Trnsferse-Aktivität in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Erregereimpfung (Cfg) jeweils 6, 2 und 3 DAT (MW±SD, n=4) Johnniskrutsorte: nfälliger Stndrd Mykorrhizierung: nicht mykorrhizierte zw. AMykor -Blähton Erregersuspension: Colletotrichum cf. gloeosporioides ( / 1³ / 1 5 Konidien/ml) ANOVA (p <,5): gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied Auch uf die Aktivität der GST htte die Mykorrhizierung keinen edeutenden Einfluss in den erregerfreien Pflnzen. Die Erregereimpfung mit 1 3 Konidien/ml zeigte eenflls noch keinen Effekt uf die Enzymktivität in den nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen. Jedoch km es in den nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen ei hoher Erregerkonzentrtion nch 2 und 3 Tgen zu einem deutlichen Aktivitätsfll der GST. In mykorrhizierten Pflnzen wurde schon ei niedrigerer Erregerkonzentrtion eine Aktivitätssteigerung gegenüer der hervorgerufen und uch ei strkem Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides lieen die Enzymktivitäten erhöht oder er zumindest stil im Vergleich zu den gesunden Kontrollpflnzen. Die drgestellten Ergenisse wurden in den Prllelversuchen estätigt. - Seite 74 von 128 -

40 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides Ergenisse der Bestimmung von Antioxidntien Ascorinsäure Die m Beispiel der nfälligen Stndrdsorte jeweils 1, 2 zw. 3 Tge nch Pthogen- Inokultion ermittelten Ergenisse sind der folgenden A. 5 zu entnehmen. Ascort reduziert / oxidiert (µmol/g FM) A. 5,6,5,4,3,2,1,,6,5,4,3,2,1,,6,5,4,3,2,1, Reduziertes Ascort AsA c cd 1 DAT - Cfg 1E3 Cfg 1E5 - Cfg 1E3 Cfg 1E5 ohne Erreger 2 DAT ohne Erreger Reduziertes Ascort AsA Coll. Oxidiertes cf. gloeosporioides Ascort (Konidien/ml) DAsA c de e cd - Cfg 1³ Cfg 15 - Cfg 1³ Cfg 15 ohne 3 DAT ohne Erreger Reduziertes Ascort AsA Coll. Erreger Oxidiertes cf. gloeosporioides Ascort (Konidien/ml) DAsA c c c c - ohne Erreger e d Cfg 1E3 Cfg 1E5 - ohne Erreger Oxidiertes Ascort DAsA Cfg 1E3 Cfg 1E5 Coll. cf. gloeosporioides (Konidien/ml) Gehlte reduzierten (links) und oxidierten (rechts) Ascorts in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Erregereimpfung (Cfg) jeweils 1, 2 und 3 DAT (MW±SD, n=4) Johnniskrutsorte: nfälliger Stndrd Mykorrhizierung: nicht mykorrhizierte zw. AMykor -Blähton Erregersuspension: Colletotrichum cf. gloeosporioides ( / 1³ / 1 5 Konidien/ml) ANOVA (p <,5): gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied (AsA zw. DAsA) Die Mykorrhizierung führte in den erregerfreien Pflnzen zu keinen nennenswerten Effekten uf die Gehlte n reduziertem und oxidiertem Ascort. Die Messwerte des reduzierten Ascorts (AsA) wren in den nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen zu llen Messzeitpunkten nch Erregerefll deutlich gesunken. Dei wr ei der hohen Erregerkonzentrtion eine noch stärkere Reduktion der AsA-Konzentrtion zu verzeichnen ls ei der niedrigeren Erregerkonzentrtion. In den mykorrhizierten Johnniskrutpflnzen lieen die AsA-Gehlte dgegen uch ei Erregerefll nch 1 und 2 Tgen noch stil. Nch 3 Tgen htten die Gehlte n AsA in den mit hoher Erregerkonzentrtion eimpften Pflnzen eenflls genommen, lgen er immer noch deutlich höher ls in den nicht mykorrhizierten Pflnzen. Die Messwerte für oxidiertes Ascort (DAsA) wiesen sowohl ei den nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen ls uch ei den zuvor mykorrhizierten Pflnzen insesondere nch 1 und - Seite 75 von 128 -

41 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides 2 Tgen noch deutliche Schwnkungen der Einzelmessungen uf. Nch 3 Tgen htte sich dnn er ei der nicht mykorrhizierten esonders ei der hohen Erregerkonzentrtion ds Gleichgewicht deutlich zugunsten des DAsA verschoen. In den mykorrhizierten Pflnzen dgegen konnte ds Gleichgewicht AsA/DAsA, wie us der Aildung zuschätzen ist, zumindest ei der niedrigeren Erregerkonzentrtion noch sehr gut ufrecht erhlten werden und uch ei der hohen Erregerkonzentrtion wr es nur leicht zugunsten des DAsA verschoen Glutthion Die A. 51 zeigt die ermittelten Ergenisse der Glutthion-Bestimmung für die nfällige Stndrdsorte des Johnniskruts. Glutthion reduziert / oxidiert (µmol/g FM) A. 51,12,1,8,6,4,2,,12,1,8,6,4,2,,12,1,8,6,4,2, Reduziertes Glutthion GSH c c c 1 DAT - ohne AM AMykor Oxidiertes Glutthion GSSG - Cfg 1E3 Cfg 1E5 none Cfg 1³ Cfg 15 ohne 2 DAT Erreger Reduziertes Glutthion GSH Coll. Oxidiertes cf. gloeosporioides Glutthion (Konidien/ml) GSSG cd d - Cfg 1³ Cfg 15 - Cfg 1³ Cfg 15 3 DAT ohne ohne Erreger Reduziertes Glutthion GSH Coll. Erreger Oxidiertes cf. gloeosporioides Glutthion (Konidien/ml) GSSG - ohne Erreger c c Cfg 1E3 Cfg 1E5 - ohne Erreger Cfg 1E3 Cfg 1E5 Coll. cf. gloeosporioides (Konidien/ml) Gehlte reduzierten (links) und oxidierten (rechts) Glutthions in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Erregereimpfung (Cfg) jeweils 1, 2 und 3 DAT (MW±SD, n=4) Johnniskrutsorte: nfälliger Stndrd Mykorrhizierung: nicht mykorrhizierte zw. AMykor -Blähton Erregersuspension: Colletotrichum cf. gloeosporioides ( / 1³ / 1 5 Konidien/ml) ANOVA (p <,5): gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied (GSH zw. GSSG) Durch die Mykorrhizierung km es zu keinen nennenswerten Wirkungen uf die Gehlte des reduzierten zw. oxidierten Glutthions in den erregerfreien Pflnzen. Die Inokultion mit dem Erreger führte in den nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen zwr zu einer Asenkung der Gehlte der reduzierten Form des Glutthions (GSH), llerdings km es nicht zu einem uffälligen Anstieg der Gehlte n oxidiertem Glutthion (GSSG). Eine - Seite 76 von 128 -

42 6.3 Einflüsse der Mykorrhizierung uf ds Antioxidtive System von Johnniskrut ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides Verschieung zugunsten des GSSG wr deutlich zu erkennen, zeigte er nicht ds für den Ascort-Kreisluf eochtete edrohliche Ausmß (vgl. Kp ). In den mykorrhizierten Pflnzen wurde jedoch uch ezüglich des Glutthions eine Neigung zu höheren Gehlten n GSH festgestellt. Ds Verhältnis n GSH zu GSSG pegelte sich dmit in diesen Pflnzen eenflls uf einem höheren Niveu ein Ergenisse der Bestimmung von Mlondildehyd ls Prmeter für die Lipidperoxidtion Die Ergenisse der Messungen der Mlondildehyd (MDA)-Konzentrtion ls Endprodukt der Lipidperoxidtion in den Wurzeln der Johnniskrutsorte nfälliger Stndrd ei Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides und in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung sind in der A. 52 drgestellt. nmol Mlondildehyd (MDA) / g Wurzel A DAT - ohne AM AMykor - ohne Erreger Cfg 1E3 Cfg 1E5 2 DAT Coll. cf. gloeosporioides, Konidien/ml - ohne Erreger Cfg 1³ Cfg 15 3 DAT Coll. cf. gloeosporioides, Konidien/ml c - ohne Erreger Cfg 1E3 Cfg 1E5 Coll. cf. gloeosporioides, Konidien/ml Mlondildehyd-Gehlte in Ahängigkeit von Mykorrhizierung und Erregereimpfung (Cfg) jeweils 1, 2 und 3 DAT (MW±SD, n=4) Johnniskrutsorte: nfälliger Stndrd Mykorrhizierung: nicht mykorrhizierte zw. AMykor -Blähton Erregersuspension: Colletotrichum cf. gloeosporioides ( / 1³ / 1 5 Konidien/ml) ANOVA (p <,5): gleiche Buchsten edeuten keinen signifiknten Unterschied c d c Die Mykorrhizierung htte keinen Einfluss uf die Lipidperoxidtion in den gesunden Pflnzen. In den nicht mykorrhizierten n wr ei der geringen Erregerkonzentrtion nch 2 und 3 Tgen ein Anstieg der MDA-Konzentrtion messr. Bei der hohen Erregerkonzentrtion von 1 5 Konidien pro ml wr schon nch 1 Tgen ein strker Fortschritt der Lipidperoxidtion in den Wurzelzellen zu eochten. In den mykorrhizierten Pflnzen dgegen wr nch 1 und 2 Tgen uch ei strkem Befll mit Colletotrichum cf. gloeosporioides kein Anstieg des MDA zu eochten und uch nch 3 Tgen nhm die Lipidperoxidtion noch lngsmer zu ls in den nicht mykorrhizierten Kontrollpflnzen. Eine Zunhme des MDA und dmit der Lipidperoxidtion ließ sich jedoch uch ei den mykorrhizierten Pflnzen nicht vollständig vermeiden. - Seite 77 von 128 -

43 6.4 Aufu und Optimierung einer 2-D-Elektrophorese-Methode 6.4 Aufu und Optimierung einer 2-D-Elektrophorese-Methode Aufreitung von Pflnzenmteril für die 2-D-Elektrophorese Für die Entwicklung der 2-D-Elektrophorese-Methode zur Trennung von Mjorn- und Johnniskrutproteinen wurde ls Ausgngsmethode die zuerst von DAMERVAL und seinen Mitreitern (1986) eschrieene und von GÖRG et l. (1988) veresserte Methode zur Pflnzenufreitung eingesetzt, zunächst entsprechend für Mjorn ngepsst und optimiert und später uf Johnniskrut üertrgen. Als Ausgngsmethode zur Proenvorereitung wurde dzu 1 g des von den Stängeln efreiten Mjornkruts mit flüssigem Stickstoff gemörsert, um die Zellwände ufzurechen. Die fein zerkleinerte Proe wurde dnn mit 1 ml einer 1 %-igen TCA-Aceton-Lösung mit,7 % 2-Mercptoethnol versetzt und in ein 15 ml Proenröhrchen üerführt. Nch schneller Akühlung der Gefäße in flüssigem Stickstoff fnd die Fällung der Proteine dnn ei -2 C für etw 2 h sttt. Dei wurden die Proen nch je 5, 1 und 15 min nochmls mit dem Vortexer gemischt und nch Zentrifugtion die Üerstände vorsichtig gesugt. Die Proteinpellets wurden nschließend zweiml in 1,5 ml Aceton mit,7 % 2-Mercptoethnol für 5 min im Ultrschlld gewschen, um störendes TCA (ph) wieder us der Proe zu entfernen, und die Proteine nschließend erneut für 3 min ei -8 C usgefällt. Die Üerstände nch der Zentrifugtion wurden dnn erneut gesugt. Nch dem letzten Wschschritt erfolgte die Trocknung des Proteinpellets in der Vkuumzentrifuge. Insesondere us den im Gewächshus herngezogenen Pflnzen wren die mit der von DAMERVAL et l. (1986) eschrieenen Ausgngsmethode erhltenen Proteinuseuten viel zu gering für eine spätere Detektion getrennter Proteine uf dem 2-D-Gel. Dher wurde eine Erhöhung des eingesetzten Pflnzenmterils von ursprünglich 1 g uf 3 g erforderlich. Eine weitere Veresserung der Proteinuseute wurde durch die Verteilung der Proensuspension in TCA/Aceton-Lösung uf mehrere Gefäße erzielt. Die Proenmischung wurde dzu m Vortexer gut suspendiert und gleichmäßig uf sechs 2,2 ml Sfe-Sel-Tues verteilt. Die drus resultierende stärkere mechnische Benspruchung der Proen führte ußerdem zu weißeren, reineren Proteinpellets. Die Anzhl der Wschschritte musste von 2 uf 3 oder sogr mehr erhöht werden, worus eenflls reinere Proteinpellets resultierten und dmit eine störungsärmere Durchführung der Isoelektrischen Fokussierung (IEF) gegeen wr Lösen des gefällten Proteins Als Ausgngsmethode zur Lösung des gefällten Proteins wurde ds Proteinpellet nfngs in einem 8 M Hrnstoffpuffer ufgenommen [BERKELMAN und STENSTEDT, 1998]: 8 M Hrnstoff, 2 % CHAPS, 2 mm DTT,,5 % Ampholyte ph 3-1,,2 % Bromphenollu. Ds getrocknete Proteinpellet wurde im Verhältnis 5 µl Puffer pro mg Proe in dem Puffer resuspendiert und durch Vortexen, Ultrschllehndlung und nschließende Inkution unter Schütteln für 1 Stunde ei 37 C estmöglich gelöst. Anschließend wurden nicht lösliche Bestndteile nochmls durch Zentrifugtion getrennt. Die Ermittlung der Proteinkonzentrtionen der gelösten Proe erfolgte mit Hilfe des 2-D- Qunt Kits (GE Helthcre Europe GmH, München) üer eine indirekte Klirtion. Anfängliche Proleme eim Spnnungsufu während der IEF ließen zunächst uf Unreinheiten der Proteinproe schließen. Versuche, die gelöste Proteinproe dgegen nochmls zu filtrieren (Micro Spin Tue, Crl Roth GmH + Co. KG, Krlsruhe) führten jedoch nicht zu den erwrteten Veresserungen. Ein Teil der Proteine ging hierei sogr wieder verloren. Die Proteinestimmungen der filtrierten Proteinlösungen ergen niedrigere Werte (mximl 1 mg/ml) ls die unfiltrierten Proen. Bei Versuchen ohne diesen Filtrtionsschritt wurden die gelösten Proteinmengen mit reinem Hrnstoff-Lösungspuffer um etw ein Drittel erhöht. - Seite 78 von 128 -

44 6.4 Aufu und Optimierung einer 2-D-Elektrophorese-Methode Die Wiederholung der physiklischen Areitsschritte Vortexen, Ultrschllehndlung und Inkution unter Schütteln ei 37 C (1 Stunde) führte eenflls zu einer veresserten Aufnhme der Proteine in den Lösungspuffer. Die Verwendung des Hrnstoff-Lösungspuffers (8 M Hrnstoff, 2 % CHAPS, 2 mm DTT,,5 % Ampholyte 3-1,,2 % Bromphenollu) führte uch mit den oen ufgeführten mechnischen Veränderungen noch nicht zu zufriedenstellenden Ergenissen. Mit dieser Pufferzusmmensetzung wurden eim Lösen von 2 mg ufgereinigter Proe in 1 ml Lösungspuffer nur Proteinkonzentrtionen von 5 is 9 µg/ml erreicht. Eine Erhöhung der Konzentrtionen n DTT und Ampholyte im Puffer is uf 5 mm DTT und 1 % Ampholyte führte zu etws höheren Proteinkonzentrtionen in der Lösung is etw 1 mg/ml und einem sichtr geringeren Anteil nicht löslicher Bestndteile nch der Zentrifugtion. Die gelöste Proteinmenge konnte weiterhin erhöht werden, indem ein Puffer mit Thiohrnstoff verwendet wurde. Dei wurde die Proteinkonzentrtion mehr ls verdoppelt, so dss im Ergenis deutlich mehr Proteinspots im 2-D-Gel drgestellt werden konnten. Eine deutliche Veresserung der Trennergenisse v.. in der ersten Dimension rchte schließlich noch die Verwendung eines nderen Detergenzes im Lösungspuffer. Der Austusch von CHAPS im Lösungspuffer gegen 1 % C7BzO führte zu einer weiteren Verdopplung der Proteinkonzentrtion in der Lösung sowie uch zu esseren Trennerfolgen in der IEF, worus uch schärfere 2-D-Bilder resultierten. Der optimierte Lösungspuffer estnd somit us 7 M Hrnstoff, 2 M Thiohrnstoff, 1 % C7BzO, 5 mm DTT, 1 % Ampholyte und,5 % Bromphenollu. Die A. 53 und A. 54 zeigen zum Nchweis der Optimierung des Lösungspuffers gegenüergestellt zwei 2-D-Bilder von Mjornprotein nch Aufnhme des Proteinpellets mit dem ursprünglichen Lösungspuffer zw. dem optimierten Puffer. Bei Verwendung des optimierten Lösungspuffers wurden deutlich mehr Proteinspots uf dem 2-D-Gel sichtr. Der optimierte Puffer wr demnch für die Drstellung möglichst vieler Proteine des Pflnzenkrutes esser geeignet. A D-Gel von 8 µg Mjornprotein mit dem Ausgngspuffer zur Extrktion Puffer: 8 M Hrnstoff, 2 % CHAPS, 2 mm DTT,,5 % Ampholytlösung 2 x 2 cm; SDS-PAGE 8-16 % T; IPG 3-1; Coomssiefärung A D-Gel von 8 µg Mjornprotein mit dem optimierten Puffer zur Extrktion Puffer: 7 M Hrnstoff, 2 M Thiohrnstoff, 1 % C7BzO, 5 mm DTT, 1 % Ampholytlösung 2 x 2 cm; SDS-PAGE 8-16 % T; IPG 3-1; Coomssiefärung - Seite 79 von 128 -

45 6.4 Aufu und Optimierung einer 2-D-Elektrophorese-Methode Im Resultt ller durchgeführten Optimierungsschritte konnten die Proteinkonzentrtionen im Lösungspuffer ei gleichem Einstzverhältnis der Proe schließlich vervierfcht werden und Proteinkonzentrtionen von üer 4 mg/ml erreicht werden. Diese Konzentrtionen wren erforderlich, um die Proenuftrgung ei der IEF mit einer In-Gel-Rehydrtisierung in usreichender Nchweisempfindlichkeit durchführen zu können. Die gelöste Proteinproe stnd dmit für die IEF ereit Rehydrtisierung der IPG-Streifen Um ein möglichst komplexes Bild von der Proteinzusmmensetzung der Pflnzenproen zu erhlten, wurden für die Entwicklung einer Methode zur Trennung von Mjorn- und Johnniskrutprotein im Rhmen der Untersuchungen 17 cm IPG-Streifen üer einen weiten ph- Bereich von 3 is 1 eingesetzt. Der Rehydrtisierungspuffer entsprch dei dem Lösungspuffer für die Proteine (siehe Kp ). Der Schwerpunkt der Veresserung der Rehydrtisierung eruhte druf, ds Volumen sowie die Aufnhme der Rehydrtisierungslösung zu optimieren und dmit die Vorussetzungen für ein optimles Ergenis der nschließenden Fokussierung zu schffen. Die Rehydrtisierung der IPG-Streifen wurde dzu nfngs mit pssiver In-Gel- Rehydrtisierung durchgeführt und die Rehydrtisierungszeit zunächst uf 12 h egrenzt. Die von den Herstellern ngegeenen Volumin der Rehydrtisierungsflüssigkeiten (c. 34 µl für 17 cm IPG-Streifen) sind dei nicht komplett ufgenommen worden. Die Erhöhung der Rehydrtisierungsduer uf 16 h führte schließlich zu einer veresserten Aufnhme der Proelösung in den IPG-Streifen und dmit uch zu einer esseren Fokussierung. Die Proteine konnten durch die längere Rehydrtisierungsduer esser in die Gelmtrix eintreten. Es verlie keine Restpufferlösung ußerhl des IPG-Streifens und der Spnnungsufu während der IEF erfolgte schneller. Als optimles Rehydrtisierungsvolumen für einen 17 cm lngen IPG-Streifen wurde mit 33 µl schließlich ein etws niedrigeres Volumen ls vom Hersteller ngegeen ermittelt. Versuche mit ktiver Rehydrtisierung zeigten im Vergleich zur pssiven Rehydrtisierung keine Veresserung für den Erfolg der Fokussierung. Auch ds Cup Loding nch der Rehydrtisierung wurde ls Proenuftrgung versuchsweise eingesetzt. So konnten zunächst erfolgreiche Isoelektrische Fokussierungen durchgeführt werden. Allerdings gestltete sich die lterntiv durchführre In-Gel-Rehydrtisierung weniger ufwendig und prktikler. D mit In-Gel-Rehydrtisierung uch größere Proenmengen uf den IPG-Streifen ufgercht werden können, wurde diese Vrinte für die weitere Optimierung vorgezogen. Bei optimlem Proeneintritt während der In-Gel-Rehydrtisierung in die Gelmtrix der IPG- Streifen knn die druf folgende IEF direkt n die Rehydrtisierung ngeschlossen werden. Dies ist nicht immer gegeen. Auch hier führte diese Vorgehensweise ei der druf folgenden Fokussierung zu Prolemen eim Spnnungsufu. Dgegen wurden die IPG-Streifen nch der Rehydrtisierung zunächst zwischen feuchtem Filterppier gelottet, woei nhftende, nicht in ds Gel eingetretene Proteine und Rehydrtisierungspuffer sowie ndere Störkomponenten (z.b. Reste n Minerlöl oder uskristllisiertem Hrnstoff) nochmls entfernt wurden. Auch die für die Rehydrtisierung zu lösende Proteinmenge musste optimiert werden. Dzu wurde die Proteinlösung im Rehydrtisierungspuffer verdünnt, um Üerldungseffekten in der IEF vorzueugen. Zu hohe Proteinkonzentrtionen führten zu einem strk verzögerten Spnnungsufu und verschlechterten dmit den Verluf der IEF und so uch ds Ergenis der 2-D-Elektrophorese. Für einen cm lngen IPG-Streifen ph 3-1 stellte sich für eine spätere Coomssiefärung eine gelöste Proteinmenge von 8 µg ls optiml herus. Bei nschließender Silerfärung genügte die Auftrgung von c. 15 µg Protein pro Gel. Diese niedrigere Konzentrtion ei der Proenuftrgung egünstigte uch den Verluf der IEF. - Seite 8 von 128 -

46 6.4 Aufu und Optimierung einer 2-D-Elektrophorese-Methode Die optimierte Rehydrtisierung erfolgte schließlich n 17 cm IPG-Streifen ph 3-1 in Form einer pssiven In-Gel-Rehydrtisierung ei 2 C für 16 h (üer Ncht) mit 33 µl Rehydrtisierungspuffer, der die Proteinproe gelöst enthält. Für Coomssiefärung wurden 8 µg Protein pro Gel, für Silerfärung 15 µg pro Gel ufgetrgen. Zur Rehydrtisierung wurden die Streifen mit Minerlöl üerschichtet, um ein Austrocknen zu vermeiden Isoelektrische Fokussierung (IEF) Auf der Grundlge von Literturdten [BERKELMANN und STENSTEDT, 1998; GARFIN und HEERDT, 24; POSCH, 1994] wr ein erstes Fokussierungsprogrmm für die 1. Dimension entsprechend T. 9 ufgestellt worden. T. 9 Ausgngs-Fokussierungsprogrmm zur Optimierung der IEF Aluf Voltzhl Zeit Spnnungsnstieg Stufe 1 2 V 1 h Liner Stufe 2 5 V 1 h Liner Stufe 3 1. V 1 h Liner Stufe 4 1. V 3. Vh Rpid Die drin ngegeenen Gesmtvoltstunden für die 17 cm IPG-Streifen, ph 3-1 wurden nfngs nicht erreicht. Zu hohe Stromflüsse während der Fokussierung stellten dei den limitierenden Fktor dr. Mögliche Urschen hierfür können zu hohe Slzkonzentrtionen in der Proe, ds Vorhndensein nderer störender Bestndteile und Unreinheiten, wie z.b. unlösliche Feststoffe, Phenole oder Lipide, sowie unvollständig gelöste oder wieder usgefllene Proteine uf dem Gel gewesen sein. Neen Optimierungen der Proenvorereitung, des Lösungspuffers (vgl. Kp ) und der Rehydrtisierung (vgl. Kp ) wren schließlich uch Veränderungen ei der IEF erforderlich, um eine zufriedenstellende Fokussierung der Pflnzenproteine zu erzielen. Um eventuell noch vorhndene Verunreinigungen, Slze oder üerschüssiges DTT während der Fokussierung ufzunehmen, wurden hierei zunächst feuchte Filterppierstreifen zwischen IPG-Gel und Elektroden gelegt. Dies führte schon zu einer leichten Verkürzung der Fokussierduer. Ein mehrfcher Wechsel dieser Filterppierstreifen ller 2 h konnte den Spnnungsufu er nicht weiter eschleunigen. D hierfür nch jedem Wechsel die Spnnungen neu ufgeut werden mussten, erg sich uch ein inkzeptler Zeitufwnd für die Fokussierung (mindestens 12 h). Der Spnnungsufu im Fokussierungsprogrmm wurde in einem nächsten Optimierungsschritt in den ersten eiden Stufen etws verzögert, um einen lngsmeren Proeneintritt zu gewährleisten. Dmit wurden die Spnnungen dieser eiden Stufen zunächst in der vorgegeenen Zeit erreicht. Schließlich wurden uch die Endstufen im Spnnungsufu heruntergesetzt, um mit niedrigeren Voltzhlen, dfür llerdings höherem Zeitufwnd, den Fokussierungseffekt zu erzielen. Eine schließend durchgeführte Fokussierungskinetik (Üerprüfung der Trennergenisse der Fokussierung nch 9., 15., 21. und 24. Vh) zeigte, dss eine optimle Auftrennung der Mjornproteine ei einer Voltstundenzhl von 24. erreicht wurde. Ds in T. 1 drgestellte Fokussierungsprogrmm führte schließlich zu dem gewünschten Fokussierungserfolg für die Proteine des Mjorns zw. des Johnniskruts. T. 1 Optimiertes Fokussierungsprogrmm für Proteine von Mjorn und Johnniskrut Aluf Voltzhl Zeit Spnnungsnstieg Stufe 1 15 V 1 h Liner Stufe 2 3 V 1 h Liner Stufe 3 6 V 1 h Liner Stufe 4 8. V 24. Vh Rpid - Seite 81 von 128 -

47 6.4 Aufu und Optimierung einer 2-D-Elektrophorese-Methode Die optimierte Methode zur IEF der Pflnzenproteine wurde schließlich mit diesem Fokussierungsprogrmm durchgeführt. Befeuchtete Filterppierstreifen zur Aufnhme störender Sustnzen wurden zwischen Elektroden und IPG-Gelstreifen positioniert. Die rehydrtisierten IPG-Streifen wurden mit Minerlöl üerschichtet fokussiert, um ein Austrocknen der Streifen zu verhindern. Nch erfolgreicher Fokussierung wurden die IPG-Streifen entnommen, nochmls zwischen feuchtem Filterppier gelottet und eventuell is zur Weiterverreitung ei -8 C gefroren gelgert Äquilirierung der IPG-Streifen Für die Äquilirierung der IPG-Streifen wurden verschiedene Zeiten getestet, in denen die Streifen in den einzelnen Lösungen verweilen. 15 min in eiden Lösungen wurden dei ls geeignete Äquilirierzeiten ermittelt. Die Äquilirierung erfolgte dei in 5 mm TRIS-HCl Puffer ph 8,8, 6 M Hrnstoff, 3 % Glycerol, 2 % SDS,,2 % Bromphenollu mit der ersten Lösung (enthält 1 % DTT) und der zweiten Lösung (enthält 2,5 % IAA) für je 15 min unter Schütteln. Nch dem Äquilirieren wurden die Streifen nochmls gelottet, um restliche Lösung zu entfernen SDS-Elektrophorese Nch der Äquilirierung erfolgte die vertikle SDS-PAGE-Elektrophorese der uf den IPG- Streifen fokussierten Proteine in den selst gegossenen 2 x 2,5 cm Grdientengelen (T = 8-16 %). Die äquilirierten IPG-Streifen wurden dzu uf die seitliche Oerfläche eines Grdientengeles gelegt und mit heißer Agrose fixiert. Die elektrophoretische Trennung erfolgte mit TRIS-HCl-Puffer in der Dodec Cell (Bio-Rd Lortories GmH, München), der Elektrophoresekmmer, in einem Zeitrum von 5 is 16 h. Nchdem der Proeneintritt der Proteine vom IPG-Streifen uf ds Grdientengel in den ersten 9 min lngsm ei niedriger Stromspnnung von mximl 5 V stttfnd, konnte die Spnnung gesteigert werden und die Trennung der Proteine nch Molekulrgewicht erfolgen, is die durch Bromphenollu mrkierte Luffront ds Gelende n der Anode erreicht htte. Je höher die ngelegte Stromspnnung wr, umso schneller erfolgte der Durchluf. Mximl wurden 2 V ngelegt, woei sich die Versuchsduer dnn uf 5 h elief. Es wurden verschiedene Spnnungen und Zeiten geprüft, dei wurden keine Unterschiede der Trennqulität festgestellt. Die Stromspnnung konnte demzufolge nch dem Proeneintritt im Bereich zwischen 5 und 2 V elieig den gewünschten Zeitverhältnissen ngepsst werden. Der Stromfluss wurde gegen eine Üerhitzung der Gele uf 2 ma pro Gel limitiert und die Gele während der Trennung ei 2 C temperiert Färung, Dokumenttion und Auswertung der 2-D-Gele Um sowohl eine zur Quntifizierung geeignete ls uch eine für die nschließende mssenspektrometrische Untersuchung relevnter Proteinspots direkt komptile Färemethode zu nutzen [PATTON, 22], wurde für die Methodenentwicklung im Rhmen der Untersuchungen der vorliegenden Areit der Einstz einer Coomssiefärung ngestret. Zum Erreichen einer höheren Nchweisempfindlichkeit ist zu Vergleichszwecken uch eine Silerfärung nch BLUM et l. (1987) nchvollzogen worden. Die A. 55 und A. 56 zeigen eine Gegenüerstellung der 2-D-Gele der jeweils gleichen Proe mit verschiedenen Proteinkonzentrtionen nch Coomssie- und Silerfärung. Ds Siler gefärte 2-D-Gel zeigt viele der Spots deutlicher und stärker ls ds Coomssie gefärte Gel. Die Sensiilität der Silerfärung lg nchweislich deutlich höher. Die erhöhte Nchweisempfindlichkeit der Silerfärung erforderte eine entsprechend verringerte Proteinuftrgemenge ei der In-Gel-Rehydrtisierung. Die geringe Proenkonzentrtion ließ ei gleicher oder sogr erhöhter Spotnzhl in den 2-D-Gelen v.. uch die IEF in kürzerer Zeit lufen, d die Spnnungen schneller erreicht wurden. - Seite 82 von 128 -

48 6.4 Aufu und Optimierung einer 2-D-Elektrophorese-Methode A. 55 Coomssie gefärtes 2-D-Gel ei 8 µg Proteinuftrgung (Mjorn) 2 x 2 cm; SDS-PAGE 8-16 % T; IPG 3-1 A. 56 Siler gefärtes 2-D-Gel ei 15 µg Proteinuftrgung (Mjorn) 2 x 2 cm; SDS-PAGE 8-16 % T; IPG 3-1 Nch der erfolgreichen Optimierung der 2-D-Methode und dmit höherer möglicher Proteinuftrgemengen stellte sich uch die Coomssiefärung ls usreichend empfindliche Färemethode herus. Grundsätzlich wren eide Färemethoden unter Berücksichtigung der ufzutrgenden Proteinmenge ls einsetzr zu eurteilen. Allerdings km es esonders ei silergefärten Gelen vermehrt zur Streifenildung. Ein weiteres Prolem stellt die Prktikilität der Silerfärung von gleichzeitig zwölf Gelen dr. Die Zeiten für die einzelnen Färe- und Entwicklungsschritte ei der Silerfärung müssen präzise eingehlten werden, um reproduzierr und gleichmäßig gefärte Gele zu erhlten. D dies ei vielen prllel zu färenden Gelen nicht immer einfch zu relisieren wr, wren Schwierigkeiten ei der späteren Gegenüerstellung und quntittiven Auswertung der Gele gerdezu vorprogrmmiert. D die Coomssiefärung deutlich unsensiler uf geringere Aweichungen von den vorgeschrieenen Einwirkzeiten regierte, wr diese für eine spätere quntittive Gegenüerstellung verschiedener 2-D-Gele vorzuziehen und wurde im Rhmen der durchgeführten Untersuchungen dnn uch erfolgreich eingesetzt. Die gefärten Gele wren in destilliertem Wsser ei Rumtempertur einige Tge lgerfähig. Coomssiegefärte Gele erwiesen sich dei ls länger hltr, während silergefärte Gele schnell ufquollen Optimierte 2-D-Elektrophorese-Methode Die A. 57 zeigt ein Flussschem üer den optimierten Aluf der im Rhmen der Untersuchungen der vorliegenden Areit entwickelten 2-D-Elektrophorese-Methode zur Trennung der Proteine us Mjorn und us Johnniskrut. Ein mit der optimierten Methode erstelltes 2-D-Gel einer Mjornproe ist in der A. 58 drgestellt. Die optimierte 2-D-Elektrophorese-Methode wr in dieser Form gut für eine softwreunterstützte semi-quntittive Auswertung der Proteinmuster von Mjorn wie uch von Johnniskrut geeignet. - Seite 83 von 128 -

49 6.4 Aufu und Optimierung einer 2-D-Elektrophorese-Methode Mjorn + Johnniskrut sofort in flüssigen Stickstoff üerführen je 3 g ei -8 C lgern Pflnzenufreitung 3 g mörsern in flüssigem Stickstoff mit 1 ml TCA-Aceton-Lösung Proteine usfällen, 3 min tiefkühlen 3-ml mit je 1,5 ml Acetonlösung wschen, 3 min tiefkühlen Vkuumtrocknung zu weißem Pulver Proteine lösen c. 2 mg mit 1 ml Lösungspuffer, 1 h ei 37 C schütteln Rehydrtisierung n 17 cm IPG-Streifen, ph 3-1 In-Gel-Rehydrtisierung c. 16 h, ei 2 C üer Ncht Proenvolumen 33 µl mit 8 µg Protein 1. Dimension: IEF Fokussierung is 24. Vh, c. 8 h, 2 C Äquilirierung Lösung 1 mit DTT + SDS 15 min, schütteln Lösung 2 mit IAA + SDS 15 min, schütteln Portionen von c. 2 mg ei -8 C lgern Proteinestimmung fokussierten IPG-Streifen lgern, -8 C 2. Dimension : SDS-PAGE IPG-Streifen uf TRIS-HCl-Grdientengel 8-16 % T 9 min ei 5 V Proeneintritt üer Ncht 7 V oder 5-6 h ei 2 V Färung Coomssiefärung A. 57 computerunterstützte Auswertung Flussschem der optimierten 2-D-Elektrophorese-Methode Gel trocknen A D-Gel von 8 µg Mjornprotein mit der optimierten 2-D-E-Methode 2 x 2 cm; IPG ph 3-1; SDS-PAGE Grdient 8-16 % T; Coomssiefärung - Seite 84 von 128 -

50 6.5 Systemische Einflüsse der Mykorrhizierung uf die Proteine 6.5 Systemische Einflüsse der Mykorrhizierung uf die Proteine Mjorn Jeweils zwei Pflnzen mykorrhizierten und drei Pflnzen nicht mykorrhizierten Mjorns wurden für die 2-D-Elektrophorese der Proteine des oerirdischen Pflnzenmterils (Krut) herngezogen. Pro Pflnze wurden cht 2-D-Gele ngefertigt. Mit Hilfe der 2-D-Elektrophorese und nschließender computerunterstützter Auswertung wurden 487 Proteine im oerirdischen Blttmteril von Mjorn detektiert. Nch dem Mtching-Prozess ller Gelwiederholungen von mykorrhiziertem und nicht mykorrhiziertem Mjorn konnten schließlich noch 173 dieser Proteine llen Gelen zugeordnet werden. Die nschließende computerunterstützte semi-quntittive Auswertung der 2-D-Gele von mykorrhiziertem und nicht mykorrhiziertem Mjorn erg insgesmt 15 Proteinspots, die durch die Mykorrhizierung eine mindestens 2-fch veränderte Expression erfhren htten. Anhnd des so gennnten Mstergels sind in der A. 59 die 15 in mykorrhizierten Pflnzenproen quntittiv eeinflussten Spots mit den von der Softwre vergeenen Nummern (SSP) ezeichnet und ihre Loklistion im 2-D-Gel durch rote Kreuze mrkiert. Ds Mstergel entspricht dei einem softwreerstellten Gel, ds lle Spots, die in irgendeinem der nlysierten Gelvrinten uftreten in einem Gel enthält A. 59 Loklistion (rotes Kreuz) im 2-D-Mstergel und SSP-Nrn. der in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung in Mjorn hoch- zw. herunterregulierten Proteinspots Mstergel: softwreerstelltes Gel, ds lle Spots ller nlysierten Gelvrinten in einem Bild enthält - Seite 85 von 128 -

51 6.5 Systemische Einflüsse der Mykorrhizierung uf die Proteine Die Identifizierung dieser insgesmt 15 hoch- zw. herunterregulierten Proteine mittels MALDI-TOF/TOF MS wr im Flle von Mjorn für 13 Proteine erfolgreich verlufen. Die identifizierten Proteine sind in der T. 11 unter Ange der SSP-Nummern, der Score- Werte der Dtennksuche und der in den Gelen der mykorrhizierten Pflnzen und der Kontrollpflnzen detektierten Proteinmengen ufgeführt. SSP 1 Proteinnme / vermeintliche Funktion Score 2 T. 11 Identifizierung und detektierte Mengen der durch AMykor -Blähton-Einstz in Mjorn heruf- zw. herunterregulierten Proteine Proteinmenge (ng/gel) 3 Verhältnis 4 (n=16) mit AMykor (n=24) 518 Cytochrom 6 f Komplex - Eisen-Schwefel , Untereinheit (E.C ) 766 RuBisCo große Untereinheit (E.C ) , RuBisCo große Untereinheit (E.C ) ,15 43 RuBisCo große Untereinheit (E.C ) , RuBisCo große Untereinheit (E.C ) , Chperonin 6 lph-untereinheit , Chperonin 6 lph-untereinheit ,4 345 Photosystem II Suerstoff freisetzender ,72 Komplex Protein 1 (C 2+ -Bindung) 622 Cronhydrse (Isoform) (E.C ) , Cronhydrse (E.C ) , Aktin , Fruktose-1,6-isphospht-Aldolse (E.C , ) Vorstufe, Chloroplst 563 Glutmin-Synthetse (E.C ) , nicht identifiziert ,93 34 nicht identifiziert , SSP-Nummer entsprechend der Bezeichnung in A. 59 Trefferquote in Mscot zw. CDS Plnt Mittelwerte der ngegeen Wiederholungen, gleiche Buchsten in den Zeilen edeuten keinen signifiknten Unterschied geprtes Verhältnis uf der Bsis der ngegeen Wiederholungen; AMykor / ei hochregulierten Proteinen; / AMykor ei herunterregulierten Proteinen; negtives Vorzeichen git eine gesenkte Proteinexpression in mykorrhizierten Vrinten n durch Mykorrhizierung herufreguliert durch Mykorrhizierung herunterreguliert Protein-Frgment, Hinweis uf degrdierte Proteine Die Telle zeigt nur ei zwei der quntittiv veränderten Proteine eine Steigerung der Expression in mykorrhiziertem Mjorn (in T. 11 hellgrün hinterlegt; SSP 518 und 766). Die Expression der weiteren ufgeführten Proteine wurde in der Folge der Mykorrhizierung in den Mjornpflnzen mindestens 2-fch herunterreguliert (in T. 11 ornge hinterlegt). Grundsätzlich lässt sich nhnd dieser Ergenisse zunächst feststellen, dss die Mykorrhizierung einen Einfluss uf den Proteinstoffwechsel der Mjornpflnzen usüt. Insesondere n der Photosynthese eteiligte Proteine wurden durch die Mykorrhizierung verstärkt exprimiert. Sie wurden ls eine große Riulose-1,5-isphospht-Croxylse/Oxygense (RuBisCo)-Untereinheit (SSP 766) und ls Cytochrom 6 f Komplex in Form der Eisen- Schwefel-Untereinheit (SSP 518) identifiziert. Mehrere herunterregulierte Proteinspots wurden eenflls ls große RuBisCo Untereinheit identifiziert (SSP 744, 43, 515). D es sich hierei er um Frgmente (in T. 11 ornge gestreift) der großen RuBisCo- Untereinheit hndelte, deren Molekulrgewichte im 2-D-Gel (15, 3 und 32 kd) deutlich - Seite 86 von 128 -

52 6.5 Systemische Einflüsse der Mykorrhizierung uf die Proteine unter dem theoretischen Molekulrgewicht (51,5 kd) lgen, wren dies Produkte einer Proteinspltung. D die Frgmente in mykorrhizierten und nicht mykorrhizierten Pflnzen reproduzierr detektiert wurden, htte der Proteinu schon in der leenden Pflnzenzelle stttgefunden und wr nicht uf die Proenufreitung zurückzuführen. Die niedrigeren Gehlte dieser Spltprodukte in mykorrhizierten Pflnzen elegen dmit einen geringeren Au dieses photosyntheserelevnten Proteins in mykorrhizierten Pflnzen. Eenflls n der Photosynthese eteiligte Enzyme, wie Chperonin 6 (SSP 388, 283) und der Suerstoff freisetzende Komplex des Photosystems II (SSP 345) wurden dgegen nch Mykorrhizierung ttsächlich in reduzierten Mengen gefunden. Zu weiteren nch Mykorrhizierung in ihrer Expression gesenkten Proteinen zählten in Mjorn ußerdem nur indirekt üer ds Kohlendioxid-Gleichgewicht n der Photosynthese eteiligte Enzyme (Cronhydrsen in verschiedenen Isoformen, SSP 622, 535), der Zellwndstrukturustein Aktin (SSP 464) sowie m Kohlenhydrtstoffwechsel (Fruktose-1,6-isphospht-Aldolse, SSP 446) und m Proteinstoffwechsel (Glutmin-Synthetse, SSP 563) eteiligte Enzyme Johnniskrut Die Proteinuntersuchungen für Johnniskrut wurden n den zwei Johnniskrutsorten Topz und der gegenüer dem Welkeerreger Colletotrichum cf. gloeosporioides nfälligen Stndrdsorte durchgeführt. Von eiden Sorten wurden jeweils zwei mykorrhizierte Pflnzen und je zwei nicht mykorrhizierte Pflnzen für die 2-D-Elektrophorese der Proteine des oerirdischen Pflnzenmterils herngezogen. Die 2-D-Elektrophorese wurde in jeweils sieen is zehn Wiederholungen durchgeführt, dmit eine usreichende Anzhl n Gelen für eine gesicherte Aussge üer die durch die Mykorrhizierung zw. durch die Johnniskrutsorte unterschiedlich regulierten Proteine zur Verfügung stnd. Mit Hilfe der Softwre PDQuest (Bio-Rd Lortories GmH, München) wurden uch für Johnniskrut lle Gele usgewertet, um sttistisch gesichert lle die Proteinspots zu detektieren, die ei Behndlung mit dem Mykorrhiz-Inokulum zw. in Ahängigkeit von der untersuchten Johnniskrutsorte in ihrer Expression erhöht oder verringert wren. Nch 2-D-Elektrophorese und nschließender computerunterstützter Auswertung wurden im oerirdischen Krutmteril von Johnniskrut 463 Proteine detektiert. Nchdem lle Gelwiederholungen von mykorrhiziertem und nicht mykorrhiziertem Johnniskrut der Sorte Topz und der nfälligen Stndrdsorte gemtcht wren, konnten schließlich noch 237 dieser Proteine von der Softwre in llen Gelen zugeordnet werden. Mit Hilfe der computerunterstützten semi-quntittiven Auswertung der 2-D-Gele wurden für die Johnniskrut-2-D-Gele lle die Proteine detektiert, die ) in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung mindestens 2-fch hoch- zw. herunterreguliert worden wren (in eiden Johnniskrutsorten), ) in Ahängigkeit von der Johnniskrutsorte mindestens 2-fch differenziert reguliert worden wren zw. c) einer Schnittmenge us ) und ) entsprchen. Hierunter fielen lle Proteine, die zwr in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung unterschiedlich exprimiert wurden, er nur in einer Johnniskrutsorte. Diese Auswertung erg insgesmt 29 Proteine, die in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung und/oder von der eingesetzten Johnniskrutsorte mindestens 2-fch quntittiv verändert exprimiert wren. Diese 29 Proteinspots und ihre Loklistion im 2-D-Gel sind nhnd des Mstergels in der A. 6 durch rote Kreuze mrkiert und mit der SSP-Nummer ezeichnet. - Seite 87 von 128 -

53 6.5 Systemische Einflüsse der Mykorrhizierung uf die Proteine A. 6 Loklistion (rotes Kreuz) im 2-D-Mstergel und SSP-Nrn. der in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung und/oder die Sorte in Johnniskrut hoch- zw. herunterregulierten Proteinspots Mstergel: softwreerstelltes Gel, ds lle Spots ller nlysierten Gelvrinten in einem Bild enthält Von den quntittiv mindestens 2-fch veränderten Proteinen wren ) 5 Proteinspots in Ahängigkeit von der Mykorrhizierung in eiden Sorten, ) 8 Proteinspots nur in Ahängigkeit von der untersuchten Johnniskrutsorte und c) 16 Proteinspots ufgrund der Mykorrhizierung in nur einer Johnniskrutsorte mindestens 2-fch hoch- oder herunterreguliert worden. Auch für Johnniskrut wurden von diesen 29 Proteinen is uf zwei Proteine lle mittels MALDI-TOF/TOF MS und nschließender Dtennksuche identifiziert. ) Durch die Mykorrhizierung in ihrer Expression eeinflusste Proteine (in eiden Sorten) Die fünf unhängig von der Johnniskrutsorte durch die Mykorrhizierung in Johnniskrut herunterregulierten Proteinspots und ihre Bezeichnung sind unter Ange der SSP- Nummern und der Proteinmengen in llen Untersuchungsvrinten in T. 12 ufgelistet. - Seite 88 von 128 -