00G Regulation der Expression, Funktion und Internalisierung von muscarinischen Acetylcholinrezeptoren INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung der Doktorwürde im Fachbereich Pharmazie der Freien Universität Berlin vorgelegt von * WOLFGANG LENZ aus Traben-Trarbach Berlin 1995
i 1. Verwendete Abkürzungen 1 2. Zusammenfassung 4 3. Einleitung 9 3.1 Signalübertragung 9 3.2 G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 10 3.3 Signaltransduktion durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren 14 3.4 Familie und Struktur heterotrimerer G-Proteine 15 3.5 Funktionsweise der G-Proteine 18 3.6 Acetylcholinrezeptoren 20 3.7 Muscarinische Acetylcholinrezeptoren 21 3.7.1 Bedeutung der machr für den Organismus.-. 21 3.7.2 Reinigung und Klonierung der Muscarinrezeptoren 21 3.7.3 Funktion und Verteilung der Muscarinrezeptor-Subtypen 22 3.7.4 Strukturvergleich der Muscarinrezeptor-Subtypen 24 3.8. Desensibüisierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren 27 3.9 Fragestellung 31 4. Material und Methoden 33 4.1 Material 33 4.1.1 Chemikalien 33 4.1.2 Radioaktive Chemikalien 37 4.1.3 Enzyme 38 4.2 Methoden 39 4.2.1 machr-ligandbindungsversuche 39
4.2.1.1 [ 3 H]-QNB-Bindungsassay an Membranhomogenaten 39 4.2.1.2 [ 3 H]-QNB-Sättigungsversuche zur Bestimmung der Rezeptoraffinität für[ 3 H]-QNB 41 4.2.1.3 [ 3 H]-QNB-Carbachol-Kompetitionsversuche 42 4.2.1.4 [ 3 H]-NMS-Bindungsassay an intakten Zellen 43 4.2.1.5 Bestimmung der subzellulären Verteilung der machr 44 4.2.2 Proteinbestimmung von Membranproteinen 44 4.2.3 Zellkultur 45 4.2.4 Messung der machr-mrna durch Lösungshybridisierung 46 4.2.4.1 Isolation von RNA aus Zellkulturen 47 4.2.4.2 Bestimmung der RNA-Konzentration 49 4.2.4.3 Synthese der RNA-Sonden 49 4.2.4.4 Reinigung der RNA-Sonden 51 4.2.4.5 RNA/RNA-Lösungshybridisierungsassay 51 4.2.5 RNase-Protektionsanalyse auf Harnstoff/Polyacrylamidgelen 53 4.2.6 Untersuchung der machr-mrna durch Northern-Analyse 54 4.2.6.1 Isolation von Poly(A) + RNA.-. 54 4.2.6.2 Formaldehyd-Agarosegelelektrophorese 55 4.2.6.3 Northern Blot 56 4.2.6.4 Synthese der DNA-Sonde durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 57 4.2.6.5 Northern-Hybridisierung 58 4.2.7 Autoradiographie 59 4.2.8 Messung der [ 3 H]-Uridin- und [ 3 H]-Leucin-Inkorporierung 59 4.2.9 Messung der machr-vermittelten Hemmung der durch Forskolin stimulierten camp-akkumulation in intakten Zellen 60 4.2.10 Bestimmung der Rezeptor-stimulierten GTP-Hydrolyse 62 4.2.10.1 Membranpräparation für GTPase-Assay 62 4.2.10.2 Bestimmung der GTPase-Aktivität 64 4.2.11 Bestimmung der machr-vermittelten Phospholipase C-Stimulation 65 4.2.12 Bestimmung der Aktivität der Proteinkinase A (PKA) 66 4.2.13 Präparation von DNA 67 4.2.13.1 Bakterienkultur 67
4.2.13.2 Reinigung und Präzipitation von DNA 67 4.2.13.3 Reinigung von synthetischen Oligonucleotiden 68 4.2.13.4 Bestimmung der DNA-Konzentration 69 4.2.13.5 Präparation von Plasmid-DNA aus 1-2 ml Bakterienkulturen 69 4.2.13.6 Präparation von Plasmid-DNA aus 25-50 ml Bakterienkulturen 70 4.2.13.7 Präparation von Plasmid-DNA aus 500 ml Bakterienkulturen 71 4.2.13.8 Präparation der einzelsträngigen Form der M13-Bakteriophagen-DNA 72 4.2.14 Manipulation von DNA 73 4.2.14.1 Restriktionsenzymbehandlung von DNA 73 4.2.14.2 AufiüllreaktionvonDNA-5-Überhangenden 73 4.2.14.3 Phosphorylierung von synthetischen DNA-Linkern 73 4.2.14.4 DephosphorylierungvonDNA-5-Phosphatenden 74 4.2.14.5 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 74 4.2.14.6 Ligation, 75 4.2.15 Analyse von DNA und RNA 76 4.2.15.1 Agarosegelelektrophorese 76 4.2.15.2 Polyacrylamidgelektrophorese 76 4.2.15.3 Sequenzierung von DNA 78 4.2.16 Einfuhren von DNA in Bakterienzellen 79 4.2.16.1 Herstellung kompetenter Bakterien 79 4.2.16.2 Transformation kompetenter Bakterien 80 4.2.17 Vektor-Konstruktion und Expression des WT- und der mutierten machr in CHO-Zellen 80 4.2.17.1 Vektor-Konstruktion durch Deletionsmutagenese 80 4.2.17.2 Vektor-Konstruktion mit Hilfe gerichteter Mutagenese 81 4.2.17.3 Transfektion von DNA in eukaryotische Zellen 85 4.2.17.4 Isolation einzelner G418-resistenterZellklone 86 4.2.18 Permeabilisierung von MDCK-Zellen mit Streptolysin-0 87 4.2.19 GTP[yS]-Bindungsassay 88 4.2.20 Präparation von Cytosol aus Rattenhirn 89 III
5. Ergebnisse 90 5.1 Downregulation der m4-muscarinrezeptoren in N1E-115 und AtT-20-Zellen 90 5.2 Beteiligung der Rezeptor-Internalisierung an der Desensibilisierung von m4-muscarinrezeptoren 108 5.3 Rolle der Rezeptor-G-Protein-Interaktion für die Internalisierung von Muscarinrezeptoren 114 5.4 Internalisierung von Muscarinrezeptoren in permeabilisierten MDCK-Zellen 126 5.5 Bedeutung Membran-proximal lokalisierter Threonin-Reste für die Internalisierung von Muscarinrezeptoren 134 6. Diskussion 147 6.1 Regulation der durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren vermittelten Signaltransduktion r 147 6.2 Regulation der Muscarinrezeptor-Genexpression in N1E-115 und AtT-20-Zellen 147 6.3 Beteiligung der Rezeptor-Internalisierung an der Desensibilisierung von Muscarinrezeptoren 150 6.4 Rolle der Aktivierung heterotrimerer G-Proteine für die Internalisierung von Muscarinrezeptoren 153 6.5 Internalisierung von Muscarinrezeptoren in permeabilisierten MDCK-Zellen > 156 6.6 Bedeutung Membran-proximal lokalisierter Threonin-Reste für die Internalisierung von Muscarinrezeptoren 159 6.7 Bedeutung und Regulation der Downregulation und Internalisierung von Muscarinrezeptoren 165 IV
7. Literaturverzeichnis 167 Abstract 183 Eigene Publikationen 184 Lebenslauf 186