NFATc2 ist ein Schalter der T-Zell-Rezeptor-abhängigen Aktivierung in humanen CD4 + Th-Zellen Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades des Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat) eingereicht am Fachbereich Biologie, Chemie und Pharmazie der Freien Universität Berlin vorgelegt von Miriam Ricarda Podtschaske aus Berlin Berlin, Dezember 2006
1. Gutachter: Prof. Dr. Rupert Mutzel 2. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Radbruch Disputation am: 12. Februar 2007
Inhaltsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis... VII 1 Einleitung... 1 1.1 Allgemeine Grundlagen... 1 1.1.1 Naive und Antigen-erfahrene CD4 + Th-Zellen in der Peripherie... 2 1.2 Die Bedeutung der Signalweiterleitung in Th-Zellen... 4 1.3 Aktivierung und Signalweiterleitung in T-Lymphozyten... 5 1.3.1 Signalweiterleitung über den T-Zell-Rezeptor... 5 1.3.2 Die Bedeutung und Erzeugung von Ca 2+ Signalen in Th-Zellen... 8 1.3.3 Beeinflussung der zellulären Transkription durch Ca 2+ Signale... 9 1.3.4 Sensoren und Effektoren Ca 2+ -sensitiver Prozesse... 10 1.4 Die Phosphatase Calcineurin... 11 1.4.1 Struktur und Regulation von CaN... 11 1.4.2 Inhibitoren der CaN Aktivität... 12 1.5 CaN als Regulator der T-Zellaktivierung... 14 1.6 Die Regulation der IL-2 Transkription... 15 1.6.1 Die Bedeutung von IL-2 für das Immunsystem... 15 1.6.2 Regulatorische Sequenzelemente des IL-2 Gens... 16 1.6.3 Aktivierungsabhängige Transkriptionsfaktoren am IL-2 Promotor... 18 1.6.3.1 NFAT... 18 1.6.3.2 NF- B... 21 1.6.3.3 AP-1... 22 1.7 Binäre oder graduelle Geninduktion als Folge der zellulären Signaltransduktion... 23 1.7.1 Prinzip der binären und graduellen Geninduktion... 23 1.7.2 Potentielle Kontrollebenen einer binären IL-2 Genexpression... 25 1.8 Ziele dieser Arbeit... 27 2 Material... 28 2.1 Chemikalien... 28 2.1.1 Puffer und Medien... 29 2.1.2 Reaktionskits... 32 2.1.3 Enzyme... 32 2.1.4 Oligonukleotid-Primer... 33 2.1.5 Plasmide... 33 2.1.6 Antikörper... 33 3 Methoden... 35 3.1 Zellbiologische Methoden... 35 3.1.1 Isolierung humaner mononukleärer Zellen aus peripherem Blut... 35 3.1.2 Bestimmung der Zellzahl... 35 3.1.3 Kultivierung und Stimulation von CD4 + Th-Zellen... 35 3.1.4 Kultivierung der Jurkat Zellinie... 36
Inhaltsverzeichnis IV 3.1.5 Transfektion von Jurkat Zellen... 36 3.1.6 Fixierung von Zellen mit Formaldehyd oder DSP... 36 3.1.7 Intrazelluläre Färbung von Zytokinen und Oberflächenmolekülen... 37 3.1.8 Färbung von Zelloberflächenmarkern... 37 3.1.9 Beladung mit dem Calciumindikator Indo-1 für Ca 2+ -Messung... 38 3.1.10 Intrazelluläre Färbung von Transkriptionsfaktoren... 38 3.1.11 Der IL-2 Sekretionsassay... 39 3.1.12Isolation von Zellkernen aus humanen CD4 + Th-Zellen... 40 3.2 Durchflusszytometrie und Methoden der Zelltrennung... 40 3.2.1 Durchflusszytometrie... 40 3.2.2 Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)... 41 3.2.3 Magnetische Zellsortierung zur Isolierung von CD4 + Th-Zellen... 42 3.2.4 Analyse von isolierten Zellkernen mittels Durchflusszytometrie... 42 3.2.5 Calciummessung mit dem Indo-1 Ca 2+ Indikator in CD4 + Th-Zellen... 43 3.3 Proteinbiochemische Methoden... 44 3.3.1 Präparation von Proteinproben für die Gelelektrophoretische Analyse... 44 3.3.2 Isolierung von Proteinen aus fixierten Zellen... 44 3.3.3 Fraktionierung von Zellextrakten aus CD4 + Th-Zellen... 44 3.3.4 Fällung von Proteinen... 45 3.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)... 45 3.3.6 Western Blot... 45 3.3.7 Strippen und Rehybridisieren von Western Blots... 46 3.4 Molekularbiologische Methoden... 46 3.4.1 Extraktion von Gesamt-RNA und mrna... 46 3.4.2 Reverse Transkription von mrna... 46 3.4.3 PCR Amplifikation von cdna... 47 3.4.4 Amplifikation von cdna im Light Cycler... 47 3.4.5 Quantitative PCR zur Amplifikation genomischer DNA... 49 3.4.6 CHART-PCR Assay... 49 4 Ergebnisse... 50 4.1 Die bimodale Verteilung von IL-2 exprimierenden CD4 + Th-Zellen... 50 4.1.1 Charakterisierung der Aktivierung von CD4 + Th-Zellen nach PMA und Ionomycin Stimulation... 50 4.1.2 Modulation der IL-2 Expression mit PMA und Ionomycin... 51 4.1.3 Der CaN Inhibitor CsA induziert eine binäre IL-2 Expression nach Stimulation mit PMA/Ionomycin oder CD3/ CD28... 53 4.1.4 CsA hat keinen Einfluss auf die Herstellung intrazellulärer Ca 2+ Signale... 54
Inhaltsverzeichnis V 4.1.5 Aktivierung von NFAT, NF- B und AP-1 nach differentieller Stimulation... 56 4.1.6 NFAT- und NF- B-vermittelte Reportergenaktivität in Jurkat Zellen... 58 4.2 Separation von IL-2 Produzenten und IL-2 Nichtproduzenten... 60 4.2.1 Etablierung des IL-2 Sekretionsassays... 60 4.3 Die binäre IL-2 Expression wird oberhalb der IL-2 mrna Induktion reguliert... 63 4.3.1 IL-2 mrna wird in IL-2 Nichtproduzenten nicht effektiv induziert... 63 4.4 Die IL-2 Promotor Regulation ist nicht der Schalter der binären IL-2 Expression... 64 4.4.1 Regulation des proximalen IL-2 Promotors durch Chromatinumlagerung... 64 4.4.2 Verwendung von DraI zur Untersuchung der IL-2 Promotorzugänglichkeit... 65 4.4.3 Analyse der DraI Spezifität mittels PCR und Light Cycler... 66 4.4.4 Die IL-2 Promotorzugänglichkeit wird nur in IL-2 Produzenten effektiv induziert... 67 4.5 Detektion aktivierter Transkriptionsfaktoren in Zellkernen auf Einzelzellebene... 68 4.5.1 Verwendung isolierter Zellkerne zur Messung von NFAT und NF- B im FACS... 68 4.5.2 Spezifischer Nachweis von NFATc2 und NF- B in isolierten Zellkernen... 70 4.6 Die binäre IL-2 Expression ist abhängig von der NFATc2 Translokation... 72 4.6.1 IL-2 Produzenten und IL-2 Nichtproduzenten unterscheiden sich in der Menge des translozierten NFATc2... 72 4.6.2 CsA beeinflusst die Frequenz der NFATc2 enthaltenden Zellkerne aber nicht die Fluoreszenzintensität von NFATc2 in Zellkernen aus CD4 + Th-Zellen... 74 4.7 Die Aktivierung und nukleäre Translokation von NFATc2 wird durch CaN in einer Alles-oder-Nichts-Reaktion reguliert... 75 4.7.1 Die maximale CaN-Aktivität führt zur vollständigen Translokation von NFATc2... 75 4.7.2 CaN reguliert die NFATc2 Aktivierung in einer Alles-oder Nichts-Reaktion... 77 4.7.3 Die Gesamtmenge an NFATc2 ist in IL-2 Produzenten größer als in IL-2 Nichtproduzenten... 78 4.8 NFATc2 ist ein zellulärer Schalter der IL-2 Expression... 79 4.8.1 Die NFATc2 Menge ist in CD4 + Gedächtniszellen höher als in naiven CD4 + Th- Zellen... 79 4.8.2 Die binäre NFATc2 Aktivierung ist in CD4 + Gedächtniszellen der molekulare Schalter der binären IL-2 Expression... 82 4.9 Modellierung der NFATc2-abhängigen binären IL-2 Expression... 84 4.9.1 Die IL-2 Produzenten lassen sich durch eine höhere mittlere NFATc2 Menge charakterisieren... 84 4.9.2 Mathematische Modellierung der binären IL-2 Expression durch kooperative Aktivierung von NFATc2... 85 5 Diskussion... 87 5.1 Binäre IL-2 Proteinexpression in CD4 + Th-Zellen... 87 5.1.1 Stimulationsabhängige Modulation der binären IL-2 Expression... 87 5.1.2 Varianz der detektierten IL-2 Expression in humanen CD4 + Th-Zellen... 88
Inhaltsverzeichnis VI 5.2 Analyse von Schwellenwerten und binären Expressionsmustern bei der Zytokinproduktion in individuellen CD4 + Th-Zellen... 90 5.2.1 Die Bedeutung von Aktivierungsschwellenwerten in individuellen T-Lymphozyten bei der Zytokinproduktion... 90 5.2.2 Mechanismen der binären Proteinexpression bei der IL-2 Expression... 92 5.3 Analyse der Kontrollebenen der aktivierungsabhängigen IL-2 Expression... 94 5.3.1 Reportergenanalysen zur Untersuchung der binären Proteinexpression... 94 5.3.2 NFATc2-abhängige Induktion der IL-2 mrna... 96 5.3.3 NFATc2-abhängige Chromatinumlagerungen am IL-2 Promotor... 98 5.3.3.1 Chromatinumlagerungen zur Regulation der Zytokininduktion... 98 5.3.3.2 Einfluss der allelen Exklusion auf die IL-2 Expression in IL-2 Produzenten... 100 5.3.3.3 Struktur des IL-2 Promotors als Ursache einer stochastischen binären IL-2 Geninduktion... 101 5.4 NFATc2 als zellulärer Schalter der IL-2 Expression... 103 5.4.1 Die Identifikation von NFATc2 als binärem Schalter der TCR Aktivierung... 103 5.4.2 Die Bedeutung von NFATc2 in CD4 + Th-Zellen... 104 5.4.3 Regulation der CaN Aktivität als Vorraussetzung der NFATc2 Aktivierung... 106 5.5 Modell des NFATc2 Schalters... 107 5.6 Die Bedeutung des NFATc2 Schalters für das Immunsystem... 109 Zusammenfassung... 111 Summary... 112 6 Literaturverzeichnis... 113
Abkürzungsverzeichnis VII Abkürzungsverzeichnis AICD Aktivierungsinduzierter Zelltod (Activation-Induced Cell Death) (griech.) anti Ak Antikörper AP-1 Activator Protein 1 APC Antigenpräsentierende Zelle BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise [Ca 2+ ] i Freie zytosolische und nukleäre Calciumionenkonzentration CaM Calmodulin CaN Calcineurin CD Cluster of Differentiation cdna komplementäre DNA CRAC durch Ca 2+ Freisetzung aktivierter Ca 2+ -Kanal CsA Cyclosporin A Cyp Cyclophilin DAG 1,2-Diacylglycerol d.h. dass heißt DMSO Dimethysulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuklease dntp Desoxyribonukleotidtriphosphat EDTA Ethylendiamin-tetraessigsäure EGTA Ethylenglykol-bis-(2-aminoethyl)-tetraessigsäure ER Endoplasmatisches Retikulum FACS Durchflusszytometer (Fluochrome Activated Cell Sorting) FCS Fötales Kälberserum FK506 Tacrolimus FKBP FK506-bindendes Protein FL-1 Fluoreszenzkanal 1 FSC Vorwärtsstreulicht (Forward scatter) g Erdbeschleunigung h Stunde IC 50 IFN IgG Inhibitorkonzentration, die zu einer halbmaximalen Hemmung führt Interferon Immunglobulin G
Abkürzungsverzeichnis VIII I B IL IP 3 JNK kda l M MAPK MFI MHC min NFAT NF- B P/I PJ PKC PMA RPMI RT sek SSC TCR Th NF- B -Inhibitor Interleukin Inositol-1,4,5-triphosphat c-jun-n-terminale-kinase Kilodalton Liter Molar Mitogen-aktivierte-Proteinkinase gemittelte Fluoreszenzintensität (Mean fluorescence intensity) Haupthistokompatibilitätskomplex Minute Nuclear Factor of Activated T-cells Nuclear Factor B PMA/Ionomycin Propidiumjodid Proteinkinase C Phorbol-12-Myristate-13-Acetat Rosewell Park Memorial Institute (Zellkulturmedium) Raumtemperatur Sekunde Seitwärtsstreulicht (Sideward scatter) T-Zell-Rezeptor (T-cell receptor) T-Helferzelle