Biochemische und physiologische Untersuchungen zum Einsatz von Mikroalgen zur Entfernung des Antiepileptikums Carbamazepin aus Abwässern Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Hannover zur Erlangung des Grades Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Sandra Mareike Haase, M.Sc. geboren am 21.06.1985 in Göttingen 2017
42 10 21 28 4 8 9 40 4 6 8 Abstract Kurzfassung Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis VIII IX XVI XVIII XXII 1 Einleitung 1 2 Stand des Wissens 2.1 Pharmazeutische Wirkstoffe 2.1.1 Begriffsbestimmung 2.1.2 Eintrag in die aquatische Umwelt 2.1. Gefährdung der aquatischen Umwelt 2.1.4 Gesetzesgrundlage 2.2 Carbamazepin (CBZ) 10 2.2.1 Vorstellung von CBZ 10 2.2.2 CBZMetabolismus 2.2. Therapeutische Wirkung von CBZ 16 2.2.4 CBZKonzentration in der Umwelt 17 2.2.4.1 Gesetzesrahmen für CBZ in der aquatischen Umwelt 19 2.2.4.2 CBZHumantoxikologie 19 2.2.5 Methoden zur Entfernung von CBZ aus Abwasser 2. Mikroalgen 26 2..1 Überblick 26 2..2 CBZÖkotoxikologie 2..2.1 CBZGefahrenabschätzung 28 2..2.2 CBZinduzierter oxidativer Stress 1 2..2. Schutzmechanismen gegen oxidativen Stress 2.. CBZWirkung auf Mikroalgen 2.4 Untersuchungsgebiet 2.4.1 Fluss Leine 9 2.4.2 Pharmazeutische Belastung der Leine Zielsetzung XI
45 46 49 51 51 51 5 5 54 54 55 55 55 57 57 58 60 6 6 6 6 4 Material & Methoden 44 4.1 Grundlegende Messungen 4.1.1 Anzuchtbedingungen 4.1.2 Wachstumsmessung 44_ 4.1. Zellaufschluss "45" 4.2 Mikroalgen aus der Leine 46 4.2.1 Untersuchungsgebiet 4.2.2 Isolierung der Mikroalgen 44 46 4.2. Typisierung isolierter Mikroalgen 47 4.2.4 Saisonale Häufigkeitsverteilung isolierter Mikroalgen 4. Messparameter 4..1 Pigmentbestimmung 4..2 Protein 51 4.. Aminosäuren 4..4 Zucker 52 4..5 Chlorophyllfluoreszenz 4..6 Photosynthetische Aktivität 4..7 Lichtkompensationspunkt 4..8 Phasenverteilung 52 4..9 Glutathion 54 4..9.1 Reduziertes Glutathion 4..9.2 Oxidiertes Glutathion 4..10 GlutathionReduktase 4..11 SuperoxidDismutase 4..12 Katalase 56 4..1 Lipidperoxidation 4..14 Cytochrom P450Komplex 4..15 Glutathion STransferase 4.4 Analytische Messverfahren 4.4.1 Antikörperbasiertes Nachweisverfahren (ELISA) 4.4.2 Chromatographisches Nachweisverfahren (HPLCESIMS/MS) 4.5 Datenauswertung 56 58 4.5.1 Vergleichbarkeit der Ergebnisse 4.5.2 Wachstumsraten 4.5. Statistische Auswertung XII
64 64 68 70 72 74 76 76 78 8 8 89 90 90 90 92 9 95 95 5 Ergebnisse 64 5.1 Mikroalgen aus der Leine 5.1.1 Typisierung isolierter Mikroalgen 5.1.2 Saisonale Häufigkeitsverteilung isolierter Mikroalgen 68 5.1. Klimatische Effekte auf die Zellteilung und die Photosynthese 68 5.1..1 Wachstum unter saisonalen Bedingungen 5.1..2 Pigmente der Photosynthese 5.1..1 Energieverwertung während der Photosynthese 5.1..2 Produkte der Photosynthese 69 5.1.4 Algenauswahl Part I 7 5.2 CBZKonzentration in der Leine 5. CBZEinfluss auf den Photosyntheseapparat 5..1 Wachstum unter CBZEinfluss 5..2 Pigmente der Photosynthese 5..2.1 Chlorophyll a 78 5..2.2 Chlorophyll b 80 5..2. Carotinoide 81 5.. Messparameter zur Energieverwertung 5...1 Nichtphotochemisches Quenching (NPQ) 5...2 Apparente Elektronentransportrate (ETR) 84 5..4 Produkte der Photosynthese 86 5..4.1 Protein 86 5..4.2 Aminosäuren 88 5..4. Zucker 88 5..5 Phasenverteilung 5.4 Schutzmechanismen gegen CBZinduzierte ROSBildung 5.4.1 GlutathionSchutzsystem 5.4.1.1 Reduziertes Glutathion 5.4.1.2 Oxidiertes Glutathion 5.4.1. GlutathionReduktase 5.4.2 Enzymatisches Schutzsystem 5.4.2.1 SuperoxidDismutase 5.4.2.2 Katalase 97 5.4.1 Lipidperoxidation 98 5.5 Enzymatische CBZEntgiftungssysteme 100 XIII
6.4 Schutzmechanismen gegen CBZinduzierte ROSBildung 144 6.4.1 Antioxidatives Schutzsystem (Glutathion, Carotinoide) 144 6.4.2 Enzymatisches Schutzsystem 146 102 5.5.1 Cytochrom P450Komplex 100 5.5.2 Glutathion STransferase 101 5.5. Algenauswahl Part II 5.6 Stressantwort ausgewählter Mikroalgen 10 5.7 CBZMetabolisierungskapazität ausgewählter Mikroalgen 105 5.7.1 CBZMetabolisierung unter simulierten Sommerbedingungen 105 5.7.1.1 Antikörperbasiertes CBZNachweisverfahren 105 5.7.1.2 Chromatographisches CBZNachweisverfahren 107 5.7.2 CBZMetabolisierung unter simulierten Winterbedingungen 112 6 Diskussion 115 6.1 Mikroalgen aus der Leine 115 6.1.1 Typisierung isolierter Mikroalgen 115 6.1.2 Saisonale Häufigkeitsverteilung der isolierten Mikroalgen 116 6.1. Klimatische Effekte auf die Zellteilung und die Photosynthese 116 6.1..1 Wachstum unter saisonalen Bedingungen 118 6.1..2 Pigmente der Photosynthese 118 6.1..4 Produkte der Photosynthese 120 6.1.4 Zwischenfazit zum Abschnitt Mikroalgen aus der Leine" 122 6.2 CBZKonzentrationen in der Leine 124 6. CBZEinfluss auf den Photosyntheseapparat 128 6..1 Wachstum unter CBZEinfluss 128 6..2 Pigmente der Photosynthese 10 6..2.1 Chlorophyll a und b 10 6..2.2 Carotinoide 6.. Messparameter zur Energieverwertung 1 6..4 Produkte der Photosynthese 17 6..4.1 Protein 17 6..4.2 Aminosäuren 6..4. Zucker 19 6.1.. Energieverwertung während der Photosynthese 119 1 140 6..5 Phasenverteilung 141 6..6 Zwischenfazit zum Abschnitt CBZEinfluss auf den Photosynthese apparat" 14 XIV
200 227 6.4.2.1 SuperoxidDismutase 147 6.4.2.2 Katalase 148 6.4. Lipidperoxidation 149 6.4.4 Zwischenfazit zum Abschnitt Schutzmechanismen gegen CBZinduzierte ROSBildung" 151 6.5 Enzymatische CBZEntgiftungssysteme 15 6.5.1 Cytochrom P450Komplex 154 6.5.2 Glutathion STransferase 155 6.5. Zwischenfazit zum Abschnitt Enzymatische CBZEntgiftungs systeme" 156 6.6 CBZStress, Schutzmechanismen und Metabolisierungsstrategien 158 6.7 Stressantwort ausgewählter Mikroalgen 17 6.8 CBZMetabolisierungskapazität ausgewählter Mikroalgen 177 6.8.1 CBZMetabolisierung unter simulierten Sommerbedingungen 178 6.8.1.1 Antikörperbasiertes CBZNachweisverfahren 178 6.8.1.2 Chromatographisches CBZNachweisverfahren 179 6.8.2 CBZMetabolisierung unter simulierten Winterbedingungen 187 6.8. MikroalgenBakterien CoKultivierungen 190 6.8.4 Zwischenfazit zum Abschnitt CBZMetabolisierungskapazität ausgewählter Mikroalgen" 192 7 Zusammenfassung 195 8 Schlussfolgerung 199 9 Ausblick Literaturverzeichnis Anhang 204 XV