Biochemie II Prak.kum 2012 Andrea Kinner AG Grez

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1 Biochemie II Prak.kum 2012 Andrea Kinner AG Grez

2 Eigenscha<en von Licht des Mikroskops Lichtmikroskopie Fluoreszenzmikroskopie Konfokale Mikroskopie Mikroskopische Methoden über die Auflösungsgrenze hinaus 1

3 Eigenscha<en von Licht das Spektrum Licht ist eine elektromagne.sche Welle. Das für den Menschen sichtbare Licht umfasst nur einen sehr kleinen Teil des elektromagne.schen Spektrums. hlp:// project.eu/modules/coralreefs/images/em_spectrum.png 2

4 Die wich.gsten Eigenscha<en der Lichtwelle a b λ A A S l: AR c Wellenlänge A: Amplitude maximale Auslenkung der Welle nach oben und unten S: Schwingungsebene senkrecht zur Ausbreitungsrichtung orien.ert AR: Ausbreitungsrichtung Phase: Punkte mit gleichem Schwingungszustand (a und b) befinden sich auf der gleichen Phase der Lichtwelle. Zwischen a und c besteht eine Phasendifferenz von einer halben Wellenlänge 3

5 Die wich.gsten Eigenscha<en der Lichtwelle AR S Lichtstrahlen beschreiben die Ausbreitung des Lichts und stehen senkrecht auf den Wellenfronten. 4

6 Die Lichtbrechung gerader Lichteinfall schräger Lichteinfall Glas α λ Lu< α Die Lichtgeschwindigkeit in Glas ist geringer als in Lu<. Glas ist op.sch dichter als Lu<, die Lichtwellen werden gestaucht. Die Lichtwellen werden gestaucht und gekippt. Der Lichtstrahl ändert am Lu<- Glas- Übergang seine Richtung, man spricht von Lichtrechung. 5

7 Reflexion und Totalreflexion Lu< Glas Passiert Licht die Grenze zwischen zwei transparenten Medien wird es gebrochen und Reflek.ert, bis zu einem bes.mmten Einfallswinkel. Ab hier wird das Licht vollständig reflek.ert, man spricht von Totalreflexion. (zwischen Glas und Lu< beträgt dieser Winkel 42 ) 6

8 Die Lichtbeugung Für Wellen gilt das huygenssche Prinzip. Jeder Punkt, der von einer Welle getroffen wird, ist Ausgangspunkt neuer Wellen, der Elementarwellen. Diese Elementarwellen überlagern sich zu einer neuen Wellenfront. Wikipedia 7

9 Linsen und das Prinzip der Lupe Lichtbrechung durch Sammel- und Zerstreuungslinsen Durch die Linse sehen wir ein virtuelles vergrößertes Bild des Gegenstandes (wenn dieser sich zwischen Linse und Brennebene befindet). hlp:// an- sammellinsen 8

10 des Mikroskops Im Mikroskop wird ein reales Zwischenbild erzeugt, welches für das Auge als vergrößertes virtuelles Bild erscheint. 9

11 Aufrechtes versus inverses Mikroskop Okular Lichtquelle Tubus Okular Ojek.vrevolver Kondensor Tisch Tubus Tisch Kondensor Ojek.vrevolver Lichtquelle microsystems.com Wozu ist der komplizierte Umbau zum inversen Mikroskop notwendig? 10

12 Lichtmikroskopische Methoden I 1. Hellfeldmikroskopie hlp:// Die einfachste und grundlegendste Methode. Das Präparat wird von unten durch einen Lichtkegel beleuchtet. Kein Objekt: Lichtstrahlen werden nicht gestört und es entsteht ein gleichmäßiges helles Bild. Präparat: Lichtstrahlen bes.mmter Wellenlängen werden absorbiert. Die Amplitude der durchtretenden Lichtstrahlen wird verringert Es entsteht ein farbiges dunkleres Bild. 11

13 Amplitudenobjekte Amplitudenobjekt Amplitude Phase der Lichtwelle DurchtriL einer Lichtwelle durch ein Amplitudenobjekt: Die verminderte Amplitude der Lichtwelle wird vom Auge als reduzierte Helligkeit registriert. Chloroplasten, oder gefärbte Präparate können gut dargestellt werden. (Dicke, gefärbte Präparate) 12

14 Mikroskopische Methoden II 2. Dunkelfeldmikroskopie hlp:// Kein Präparat - Dunkelfeld Dunkelfeld Hellfeld Das Licht wird so abgelenkt, dass kein Licht in das Objek.v fällt. Ohne Präparat ist das Bild gleichmäßig dunkel. Im Präparat wird das Licht an Phasenübergängen gebrochen und gelangt ins Objek.v. (Grenzen unterschiedlich dichter Strukturen) Diese Bereiche erscheinen im Bild hell. Das Mikroskop muss mit entsprechenden Kondensoren bzw. Blenden ausgerüstet sein. 13

15 Phasenobjekte Phasenobjekt Amplitude Phase der Lichtwelle DurchtriL einer Lichtwelle durch ein Phasenobjekt: Durch die unterschiedliche Dichte im Objekt wird das Licht unterschiedlich stark abgebremst. Die Lichtwellen werden in ihrer Phase zurück geschaltet. Dies ist für das Auge nicht erkennbar. Phasenobjekte erscheinen daher transparent und kontrastarm. 14

16 Kontrastverfahren I 3. Phasenkontrastmikroskopie Ein Kontrasterhöhendes Verfahren, das kontrastreiche Bilder von transparenten, ungefärbten Präparaten liefert. Es werden Unterschiede in der Dichte von Strukturen dargestellt. Unsichtbare Phasenverschiebung wird in sichtbare Amplitudenverschiebung (Helligkeitsunterschiede) umgewandelt. Dies wird erreicht durch die Interferenz von gebeugtem Licht aus dem Präparat und dem direkten Mikroskopielicht. Dazu muss das Mikroskop mit Objek.ven mit Phasenkonstrastringen und passender Ringblende im Kondensator ausgestalet sein. 15

17 Kontrastverfahren I 3. Phasenkontrastmikroskopie Der niederländische Physiker hat 1932 das Phasenkontrastverfahren für Lichtmikroskopie erfunden hat er dafür den Nobelpreis erhalten. Frits Zernike Wikipedia 16

18 Kontrastverfahren II 4. Differen.eller Interferenzkontrast (DIC) Ein Objekt wird von zwei senkrecht aufeinander stehenden Wellenzügen durchlaufen. Es werden ähnlich wie beim Phasenkontrast, Unterschiede in der Dichte von Strukturen sichtbar gemacht. Der DIC der Kontrast kann stufenlos verstellt werden, Wodurch Farbe und Helligkeit des Untergrunds verändert werden. Vorteile gegenüber dem Phasenkontrast: bietet auch bei hoher Auflösung (offnerer Aperturblende) noch ausreichenden Kontrast. es können op.sche SchniLe gemacht werden, der DIC ist daher auch für dickere Objekte geeignet. 17

19 Kontrastverfahren II 4. Differen.eller Interferenzkontrast (DIC) Der polnische Physiker und Op.k- Theore.ker hat in den 50 Jahren den Nomarski Interference Contrast oder auch differen.al interference contrast (DIC) erfunden. Dieses Kontrastverfahren gehört weltweit zu den meist genutzten DIC Systemen. Georges Jerzy Nomarski

20 Auflösungsgrenze in der Lichtmikroskopie Ernst Abbe hat 1870 die Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops beschrieben (Veröffentlichung 1873). Sie wird daher auch Abbe- Limit genannt. Ernst Abbe Wikipedia Die Auflösungsgrenze ist der Abstand, bei dem zwei Punkte gerade noch getrennt darstellbar sind. Im Mikroskop ist die Auflösung abhängig von der Wellenlänge des Lichts. d = λ 2n sin α λ = Wellenlänge des Lichts n = Brechzahl des Mediums (zwischen Präparat und Objek.v) α = halber Öffnungswinkel des Objek.vs 19

21 Auflösung und Vergrößerung Eine höhere Vergrößerung geht nicht automa.sch mit einer höheren Auflösung einher. Stärkere Vergrößerung bei gleicher Auflösung, das Bild wirkt verschwommen und Details werden nicht aufgelöst. Nur bei einem abges.mmten Verhältnis zwischen Vergrößerung und Auflösung erhält man gute mikroskopische Bilder in denen Objektdetails dargestellt sind. Das Auflösungsvermögen wird hauptsächlich durch die numerische Apertur des Objek.vs wiedergegeben. 20

22 Auflösung numerische Apertur Die Auflösung eines Objek.vs ist abhängig von seinem Öffnungswinkel und der Brechzahl des Mediums zwischen Objekt und Objek.v. Die numerische Apertur (A oder NA) ist folgendermaßen definiert: A = n sin α NA: 0,25 d: 1µm 2α n = Brechzahl des Mediums (zwischen Präparat und Objek.v) α = halber Öffnungswinkel des Objek.vs NA: 0,5 d: 0,5µm NA: 1,4 d: 0,18µm 2α Je höher der Öffnungswinkel, desto mehr Licht fällt von einem Objektpunkt in das Objek.v und desto höher ist die numerische Apertur. 2α 21

23 Auflösung Das Rayleigh Kriterium Zwei Airy- Discs (Beugungsscheibchen) gleicher Helligkeit und Farbe lassen sich dann noch trennen, wenn sich die beiden Maxima 0. Ordnung gerade nicht mehr überschneiden. Niedrige NA Hohe NA Aperturblende 22

24 Größe von biologischen Strukturen 23

25 Fluoreszenzmikroskopie Prinzip der Fluoreszenz Strahlengang im Mikroskop Jablonski Energie Diagramm Okular Licht- quelle Objek.vlinse Objekt Differenz zwischen Abstrahlungs- und Anregunswellenlänge 1. Anregungsfilter (lässt Licht der Anregungswellenlänge(n) passieren) 2. Dichroischer Spiegel (bricht Anregungslicht, lässt Emissionslicht passieren) 3. Emissionsfilter (lässt spezifisch das Emissionslicht passieren) 24

26 Fluoreszenzmikroskopie - Farbstoffe Primärfluoreszenz oder Autofluoreszenz Eigenfluoreszenz von Molekülen (meist mit vielen konjugierten Doppelbindungen) z.b. Porphyrinring des Chlorophyll oder Lignin. Sekundärfluoreszenz Färbung von Objekten mit Farbstoffen z.b. DAPI (DNA- Färbung) oder Membran und Organellfarbstoffe. Immunfluoreszenz Färbung von Strukturen/Proteinen durch spezifische An.körper. Man unterscheidet hier die direkte und die indirekte IF. Fluoreszierende Proteine Es gibt millerweile neben GFP eine Vielzahl verschieden farbiger Proteine, die entweder für sich fluoreszieren, oder an Zielproteine fusioniert werden können. 25

27 Konfokale Mikroskopie Das Prinzip Das konfokale Pinhole (Lochblende) blockiert Licht, dass nicht aus der Fokusebene kommt. Dadurch werden die Bilder deutlich schärfer. Dies ist möglich, da mit einer punktuellen Lichtquelle, dem Laser gearbeitet wird. Vorteile: sehr gute Auflösung auch in der Z- Achse hohe Sensi.vität, verbessertes Signal zu Hintergrund Verhältnis Quan.fizierung der Fluoreszenzintensität simultane Aufnahme von unterschiedlichen Farbstoffen auf mehreren Kanälen Nachteile: sehr hohe Kosten Bedienung erfordert eine gründliche Einweisung hlp:// 26

28 des Scankopfes Prisma Detektoren AOBS Lasereinkopplung Scanner Korrektur für UV Einkopplung microsystems.com 27

29 Die Entstehung des konfokalen Bildes y Der/die Laser der Anregungswellenlänge rastern das Objekt Punkt für Punkt ab. x 28

30 Aufnahmen über 5 Dimensionen Aufnahme von Z- Stapeln (X- Y- Z) Der Strahlenteiler ist durch den AOBS ersetzt Aufnahme von Zeitserien (t) (X- Y- Z- t) Aufnahme von Bildstapel über die Wellenlänge (λ) (X- Y- Z- λ) Setup für die Aufnahme eines Z- Stapels Aufnahme von Bildstapel über die Wellenlänge und über die Zeit (X- Y- Z- λ- t) microsystems.com 29

31 Die spektrale Detek.on Das emizerte Licht wird über ein Prisma (1) oder ein GiLer in seine spektralen Bestandteile gebrochen. Die Schieber (2) erlauben die gezielte Auswahl des Wellenlängenbereichs des emizerten Lichts, der gemessen werden soll, oder das scannen über die Wellenlänge. Die Detektoren (3) wandeln das Lichtsignal in ein elektronisches Signal um. microsystems.com 30

32 Die Photomul.plier (PMTs) Die Photomul.plier wandeln die eingehenden Photonen in ein elektronisches Signal um, welches über eine Kaskade von Dynoden amplifiziert und im konfokalen Bild einem Grauwert zugeordnet wird. Weiterentwickelte, hochmoderne PMTs haben eine höhere Sensi.vität und ein reduziertes Rauschen als herkömmliche PMTs und ermöglichen das zählen von tatsächlich eingehenden Photonen. microsystems.com 31

33 FRAP Fluorescence recovery a<er photobleaching Über FRAP kann die Diffusion von Makromolekülen gemessen werden. Die gemessenen Daten ermöglichen Rückschlüsse auf die Diffusionskine.k (Bes.mmung des Diffusionskoeffizienten) sowie die Transportrate von Fluoreszenz- markierten Proteinen. microsystems.comc 32

34 FRET- Fluorescence resonance energy transfer Kein FRET FRET FRET ist eine Technik, die es ermöglicht Wechselwirkungen zwischen Molekülen jenseits der Auflösungsgrenze von Mikroskopen zu messen. Befinden sich der FRET Donor und Akzeptor in unmilelbarer Nähe, überträgt der Donor nach Anregung seine Energie auf den Akzeptor, der dann fluoresziert. microsystems.comc 33

35 FLIM Fluorescence life.me imaging Über FLIM wird gemessen wie lange ein Fluorophor durchschnillich im angeregten Zustand verbleibt. Bei Fluorophoren ähnlicher oder gleicher Farbe, aber unterschiedlicher Lebensdauer kann dies genutzt werden um die Signale zu trennen. microsystems.comc Die Lebenszeit eines Fluorophors kann sich mit seiner Umgebung ändern und so Informa.onen über die unmilelbare Umgebung des Moleküls liefern wie z.b. Salzkonzentra.on oder ph- Wert. Wikipedia 34

36 Mikrodissek.on Über die Mikrodissek.on können GewebeausschniLe oder einzelne Zellen mit Hilfe eines Lasers gezielt aus einem Präparat herausgeschnilen werden. Anschließend kann z.b. die DNA oder RNA für weitere Analysen isoliert werden. microsystems.comc 35

37 TIRF Total internal reflec.on fluorescence TIRF Mikroskopie verbessert die Aufnahmen von Oberflächenberreichen. Der Hintergrund wird deutlich reduziert und die Auflösung in Z- Richtung ist in der begrenzten Eindring.efe erhöht. Bei TIRF wird ein evaneszentes Feld für die selek.ve Beleuchtung und Anregung von Objekten in einem begrenzten Raum genutzt. Das evaneszente Feld bildet sich bei Totalreflexion von flach einfallendem Licht an der Glas- Wasser- Grenzfläche. Wikipedia microsystems.comc 36

38 Mul.- Photon- Mikroskopie Nature Reviews, Gene.cs Aug 2003 Für die Anregung des Farbstoffes ist die Absorp.on von 2 oder mehr Photonen gleichzei.g nö.g. Die Photonendichte ist nur in unmilelbarer Nähe der Focusebene dicht genug, dass zwei Photonen gleichzei.g aufeinander treffen können. Dadurch wird die Phototoxizität sowie das Ausbleichen der Farbstoffe reduziert. Zusätzlich ermöglicht die Mul.- Photon- Mikroskopie höhere Eindring.efen des Anregungslichtes, so dass auch dickere GewebeschniLe untersucht werden können. 37

39 STED s.mulated emission deple.on STED Mikroskopie erlaubt die Überwindung der Abbe schen Auflösungsgrenze, welche durch die Lichtbeugung limi.ert ist. Ein Anregungslaser wird mit einem ringförmigen Laserstrahl überlagert, der die Anregungsfläche verklei- nert, indem die Emission gezielt angeregt wird. Je höher die stärke dieses Laser- strahls ist, desto geringer wird die Anregunsfläche. Die Auflösung bei STED liegt im Bereich von nm. Es können u. A. herkömmliche Farb- stoffe oder auch fluoreszierende Proteine wie GFP verwendet werden. microsystems.comc 38

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