RECK. Interne Qualitätskontrolle der extrahierten RNA RECK RK100. Interne Eignungskontrolle der RNA-Extraktion PRODUKTMERKMALE -20 C RK100 INHALT

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1 Interne Qualitätskontrolle der extrahierten RNA INHALT ANWENDUNGSGEBIET Seite 1 PRODUKTBESCHREIBUNG Seite 1 PRODUKTMERKMALE Seite 2 ANDEREN PRODUKTEN ERFORDERLICH Seite 2 IM PRODUKT ENTHALTENES MATERIAL Seite 3 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES, NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL Seite 3 HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Seite 3 VERFAHREN Seite 5 PROBLEMLÖSUNGEN Seite 9 ERKLÄRUNG DER SYMBOLE Seite 10 ANWENDUNGSGEBIET Das Produkt wird für die Eignungskontrolle von aus biologischen n extrahierter RNA bei Amplifikations- und reversen Transkriptionstests eingesetzt. Darüber hinaus vereinfacht dieses Produkt die Analyseverfahren bei den Amplifikations- und den reversen Transkriptionstest. Die Identifizierung nicht geeigneter n bei den Amplifikationstests zum Nachweis einer ZielcDNA in dem bei der RNA-Extraktion aus biologischen n erhaltenen Produkt der reversen Transkriptionsreaktion kann für die Feststellung der wirklich negativen n eingesetzt PRODUKTBESCHREIBUNG ELITechGroup S.p.A. C.so Svizzera, Torino ITALY Büro: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Internetseite: C Das Produkt enthält die für die RNA-Extraktion CPE-RNA und die Kontrollmischung, die gebrauchsfertig in Reaktionsgefäßen aliquotiert sind. Bei diesem Verfahren wird die für die RNA-Extraktion in der Extraktionsphase und die Kontrollmischung in der Amplifikationsphase eingesetzt. SCH m_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 1/10 In der ersten Phase wird die CPE-RNA, eine stabilisierte Lösung der Genom-RNA des Phagen MS2, dem Extraktionssystem nach der hinzugefügt, wodurch eine interne Eignungskontrolle ermöglicht wird. Die CPE-DNA wird zusammen mit der RNA der revers transkribiert und extrahiert. In der zweiten Phase wird das Produkt, welches zum Verdünnen der Taq DNA-Polymerase benutzt wird, der Amplifikationsreaktion für den zu analysierenden Parameter hinzugefügt. enthält die Oligonukleotid-Primer für die Koamplifikation des cdna-genomabschnitts, der das Hüllprotein des Phagen MS2 kodiert. Die Präsenz des spezifischen Produkts in der Amplifikationsreaktion der CPE-RNA zeigt an, dass die Extraktion, die reverse Transkription und die Amplifikation korrekt durchgeführt wurden. Darüber hinaus ermöglicht aufgrund seiner Färbung, die Hinzugabe des verdünnten Enzyms zum Amplifikationsansatz visuell zu überprüfen und das Produkt der Amplifikationsreaktion aufgrund seiner Dichte und Färbung direkt ins Agarosegel zu laden. PRODUKTMERKMALE Das Produkt kann sowohl mit Systemen, welche die Durchführung einer einzigen Amplifikationsreaktion (single round) vorsehen, eingesetzt werden als auch mit Systemen, bei denen zwei aufeinanderfolgende Amplifikationsreaktionen (nested) durchgeführt kann für Amplifikationsreaktionen eingesetzt werden, deren spezifisches Produkt ein DNA- Molekül unter 500 bp ist. kann für Amplifikationsreaktionen eingesetzt werden, bei denen die Hybridisierungstemperatur der Oligonukleotid-Primer (Annealing) zwischen 50 C und 60 C liegt. Das Produkt ist so kalibriert, dass die Sensitivität der Amplifikationsreaktion nicht verändert wird. Wenn mit Produkten der Serie OligoMIX eingesetzt, bleibt die analytische Sensitivität der Amplifikation etwa 10 Moleküle Ziel-cDNA in 10 µl Produkt aus der reversen Transkription. Die dem «Monotest» Reaktionsgefäß hinzugefügt Mit diesem Produkt kann die Eignungskontrolle von 50 Extraktionen und 100 Amplifikationsreaktionen (100 "single round oder 50 "nested ) einschließlich der entsprechenden Positivund Negativkontrollen durchgeführt ANDEREN PRODUKTEN ERFORDERLICH NICHT in diesem Produkt enthalten sind die Reagenzien für die RNA-Extraktion aus den zu testenden n, für die reverse RNA-Transkription, für die Amplifikation, für die positive Amplifikationskontrolle und für den Nachweis der amplifizierten DNA. Für diese Analysenschritte werden die folgenden Ergänzungsprodukte von ELITechGroup S.p.A. zur Anwendung empfohlen: «EXTRAgen» (Katalognr. EXTG01), Kit für die Nukleinsäure-Extraktion aus nicht-zellulären n. Mit dem Kit können 50 Extraktionen durchgeführt «EXTRAzol» (Katalognr. EXTR01), Kit für die RNA-Extraktion aus zellulären und nicht-zellulären n. Mit dem Kit können 50 Extraktionen durchgeführt «RT-Kit plus» (Katalognr. BRK200), Kit für die reverse RNA-Transkription mit "Random Primer. Mit dem Kit können 50 Reaktionen durchgeführt «DNA Polymerase 2U / µl» (Katalognr. ER40, ER140), thermostabile DNA-Polymerase für die Amplifikation von Nukleinsäuren. Mit dem ER40 können 25 Reaktionen durchgeführt Mit dem ER140 können 100 Reaktionen durchgeführt Serie «oligomix Alert Kit», Kit für die Amplifikation von cdna aus der reversen Transkription von RNA-Extrakten aus biologischen n. Serie «Positive Control», positive Amplifikationskontrolle der Plasmid-DNA; Serie «ELECTROPHORESIS» (Katalognr. EPH02 oder EPH04), Nachweis der amplifizierten DNA mittels Agarosegel-Elektrophorese. Mit dem Kit können 64 Extraktionen bearbeitet SCH m_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 2/10

2 IM PRODUKT ENTHALTENES MATERIAL Komponente Beschreibung Menge Zusammensetzung Etikettierung CPE-RNA der RNA-Extraktion 4 x 150 µl Kontrollmischung 4 x 200 µl ~3 fm Genom-RNA MS2, azetyliertes BSA, Guanidinthiocyanat, Natriumlaurylsarcosinat, 100 mm 2-Mercaptoethanol, Natriumcitrat, Salzsäure lineares Polyacrylamid 0,1 µm Oligonukleotide, TRIS-HCI, Saccharose, Bromphenolblau, Xylencyanolblau FF ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES, NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL Xn GESUNDHEITS- SCHÄDLICH - Laminarfluss-Werkbank (Laminarbox). - Einweghandschuhe aus Latex o.ä. - Tisch-Mikrozentrifuge ( U/min). - Mikropipetten und sterile Pipettenspitzen mit Aerosolfilter oder Direktverdrängungs- Dispensierpipetten (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl). - Steriles bidestilliertes Wasser. - Programmierbarer Thermostat (Thermocycler). HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Dieses Produkt ist ausschließlich für die In-vitro-Diagnose bestimmt. Allgemeine Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Alle biologischen n müssen so gehandhabt und entsorgt werden, als ob sie Infektionserreger übertragen könnten. Der direkte Kontakt mit den biologischen n ist zu vermeiden. Es dürfen keine Spritzer oder Aerosol erzeugt Material, das mit den biologischen n in Kontakt gekommen ist, muss vor der Entsorgung mindestens 30 Minuten lang mit 3%-igem Natriumhypochlorit behandelt oder eine Stunde lang bei 121 C autoklaviert Alle Reagenzien und im Test verwendeten Materialien müssen so gehandhabt und entsorgt werden, als ob sie Infektionserreger übertragen könnten. Der direkte Kontakt mit den Reagenzien ist zu vermeiden. Es dürfen keine Spritzer oder Aerosol erzeugt Abfälle müssen gemäß den geltenden Sicherheitsvorschriften behandelt und entsorgt Brennbares Einwegmaterial muss verbrannt Flüssige Abfälle, die Säuren oder Basen enthalten, müssen vor der Beseitigung neutralisiert Geeignete Schutzkleidung und -handschuhe tragen. Augen und Gesicht sind zu schützen. Lösungen niemals mit dem Mund pipettieren. Im Arbeitsbereich nicht essen, trinken, rauchen und keine Kosmetika auftragen. Nach der Arbeit mit n und Reagenzien gründlich die Hände waschen. Überschüssige Reagenzien und Abfälle nach den geltenden Vorschriften entsorgen. Vor dem Test alle Gebrauchsanweisungen zum Produkt lesen. Bei der Testdurchführung sind die im Produkt enthaltenen Anweisungen zu befolgen. Das Verfallsdatum des Produkts ist einzuhalten. Nur die im Produkt enthaltenen oder vom Hersteller empfohlenen Reagenzien verwenden. - Nie Reagenzien verschiedener Chargen gegeneinander austauschen. Keine Reagenzien aus Testbestecken anderer Hersteller verwenden. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen für die Molekularbiologie Die Verfahren der Molekularbiologie wie Extraktion, reverse Transkription, Amplifikation und Nachweis von Nukleinsäuren erfordern geschultes Personal, um falsche Ergebnisse bedingt durch den Abbau von Nukleinsäuren in den n oder Kontamination der n durch Amplifikationsprodukte zu vermeiden. Die DNA-Extraktion aus den n und die Vorbereitung der Amplifikationsreaktionen müssen räumlich separat von der Amplifikation und dem Nachweis der Amplifikationsprodukte durchgeführt Ein Amplifikationsprodukt darf nie in den Arbeitsbereich Extraktion/Vorbereitung der Amplifikationsreaktionen gelangen. Für die Extraktion/Vorbereitung der Amplifikationsreaktionen einerseits und für die Amplifikation/Nachweis der Amplifikationsprodukte andererseits müssen jeweils gesondert Kittel, Handschuhe und Instrumente zur Verfügung stehen. Die Kittel, Handschuhe und Instrumente aus dem Bereich Amplifikation/Nachweis der Amplifikationsprodukte dürfen nie in den Bereich Extraktion/Vorbereitung der Amplifikationsreaktionen gelangen. Die n dürfen ausschließlich für diese Art von Analyse verwendet Die n müssen an einer Laminarfluss-Werkbank gehandhabt Reaktionsgefäße mit verschiedenen n dürfen nie gleichzeitig geöffnet Die Pipetten zum pipettieren der n dürfen ausschließlich dafür verwendet Die Pipetten müssen Direktverdrängungs-Dispensierpipetten sein, andernfalls müssen Pipettenspitzen mit Aerosolfilter verwendet Die verwendeten Spitzen müssen steril, DNAse/RNAsefrei sowie DNA/RNA-frei sein. Die Reagenzien müssen an einer Laminarfluss-Werkbank gehandhabt Die für die Amplifikation erforderlichen Reagenzien müssen so vorbereitet werden, dass sie in einer Sitzung aufgebraucht Die Pipetten zum pipettieren der Reagenzien dürfen ausschließlich dafür verwendet Die Pipetten müssen Direktverdrängungs-Dispensierpipetten sein, andernfalls müssen Pipettenspitzen mit Aerosolfilter verwendet Die verwendeten Spitzen müssen steril, DNAse/RNAsefrei sowie DNA/RNA-frei sein. Die Amplifikationsprodukte müssen so gehandhabt werden, dass ihre Verbreitung in die Umgebung weitestgehend begrenzt wird, um Kontaminationen zu vermeiden. Die Pipetten zum pipettieren der Amplifikationsprodukte dürfen ausschließlich dafür benutzt Spezielle Hinweise und Vorsichtsmaβnahmen für die Komponenten Für das Reagenz CPE-RNA gelten folgende Gefahrenhinweise (R-Sätze) und Sicherheitsratschläge (S-Sätze): Xn - GESUNDHEITSSCHÄDLICH R 20/21/ Gesundheitsschädlich beim Einatmen, Verschlucken und bei Berührung mit der Haut. Entwickelt bei Berührung mit der Haut hochgiftige Gase. S Bei der Anwendung nicht essen und trinken. Gas/Rauch/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Geeignete Handschuhe verwenden. Nicht mit Säuren mischen. Für das Reagenz gelten folgende Sicherheitsempfehlungen (S-Sätze): S Gas/Rauch/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Berührung mit den Augen vermeiden. SCH m_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 3/10 SCH m_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 4/10

3 Programmierung des Temperaturzyklus VERFAHREN - Kontrollieren, ob die Parameter des Temperaturzyklus der Haupt-Amplifikationsreaktion eine Hybridisierungstemperatur der Oligonukleotid-Primer (Annealing) zwischen 50 C und 60 C vorsehen; - die Parameter des Temperaturzyklus der Haupt-Amplifikationsreaktion am Thermocycler einstellen. Hinweis: Es ist nicht notwendig, die Parameter des Temperaturzyklus der Amplifikationsreaktion abzuändern. n Dieser Kit muss mit dem Reaktionsprodukt der reversen Transkription (cdna) von RNA-Extrakten aus biologischen n verwendet Das System der reversen RNA-Transkription muss "Random Primer" als Primer für die Polymerisationsreaktion verwenden. Wenn biologische Zellproben verwendet werden, zum Beispiel Vollblut, sollte die Gesamtmenge der extrahierten RNA bestimmt werden, die in die reverse Transkriptionsreaktion gegeben wird, um zu vermeiden, dass unspezifische Produkte oder mögliche Inhibitionsphänomene in der anschließenden Amplifikationsreaktion auftreten. Die Endkonzentration der Gesamt-RNA in der reversen Transkriptionsreaktion sollte maximal ca. 40 ng/µl betragen. Die Höchstmenge der Gesamt-RNA, die in der reversen Transkriptionsreaktion mit 25 µl Endvolumen eingesetzt werden kann, beträgt ca. 1 µg. Die RNA-Extraktion aus der Ausgangsprobe muss für die reverse Transkription und die Amplifikationsreaktionen geeignete RNA erbringen. Es wird empfohlen, mehrere Aliquots von den n vorzubereiten, die eingefroren aufbewahrt werden, um wiederholtes Frieren/Tauen zu vermeiden. Kontrollen bei der Extraktion, der reversen Transkription und der Amplifikation Es ist absolut notwendig, jeden Extraktions- und Amplifikationslauf zu validieren, indem auch eine negative und eine positive Kontrolle mitgeführt Für die Negativkontrolle verwendet man steriles bidestilliertes Wasser (nicht im Produkt enthalten), das anstelle der biologischen extrahiert wird, ohne CPE-RNA hinzuzufügen. Das Extraktionsprodukt wird dann in der reversen Transkription und in der Amplifikationsreaktion eingesetzt. Für die verwendet man steriles bidestilliertes Wasser (nicht im Produkt enthalten), das unter Hinzugabe von CPE-RNA anstelle der biologischen extrahiert wird. Das Extraktionsprodukt wird dann in der reversen Transkription und in der Amplifikationsreaktion eingesetzt. Vorbereitung der Extraktion - Ein Reaktionsgefäß mit CPE-RNA auftauen, durch Umdrehen mischen, 5 Sekunden lang zentrifugieren, um den gesamten Inhalt auf dem Grund zu konzentrieren, und in Eis stellen. Hinweis: Die CPE-RNA muss in der ersten Phase des Extraktionsverfahrens verwendet Nach Zugabe der zu der Lyse-Lösung 10 µl CPE-RNA zu jedem Extraktionsgefäß hinzufügen und durch Umdrehen mischen. Hinweis: Andere Änderungen am Extraktionsprotokoll sind nicht erforderlich. Vorbereitung der reversen Transkription Beim System der reversen Transkription müssen Oligonukleotide mit Zufallssequenz ("Random Primer ) als Primer für die Polymerisationsreaktion der cdna verwendet Hinweis: Es sind keine Änderungen im Protokoll der reversen Transkription erforderlich. Vorbereitung der Amplifikation - Ein Reaktionsgefäß mit auftauen, durch Umdrehen mischen, 5 Sekunden lang zentrifugieren, um den gesamten Inhalt auf dem Grund zu konzentrieren, und in Eis stellen. - Das thermostabile Enzym DNA-Polymerase (nicht im Kit enthalten) mit auf die gewünschte Konzentration verdünnen. Man stellt ein verdünntes Enzymvolumen her (Gesamtvolumen), das für alle vorgesehenen Reaktionen (einschließlich Kontrollen) plus eine ausreicht, um eine Sicherheitsspanne zu haben. Das verdünnte Enzym kann nicht aufbewahrt Hinweis: Das der Amplifikationsreaktion mit dem verdünnten Enzym hinzugefügte -Volumen muss ein Zehntel des Endvolumens der Amplifikationsreaktion selbst betragen. In jedes Amplifikationsgefäß 5 µl mit verdünnte thermostabile DNA-Polymerase hinzugeben (wenn das Endvolumen der Reaktion 50 µl beträgt). Hinweis: Die Zugabe des verdünnten Enzyms zur Amplifikationsmischung kann aufgrund der blauen - Färbung visuell überprüft Hinweis: Es sind keine Änderungen im Protokoll der reversen Transkription erforderlich. Hinweis: Wenn das Produkt mit Systemen eingesetzt wird, die das Durchführen von zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationsreaktionen (nested) vorsehen, muss es bei der Vorbereitung sowohl der ersten als auch der zweiten Amplifikation zum Verdünnen der thermostabilen DNA-Polymerase benutzt Vorbereitung der elektrophoretischen Nachweisphase im Agarosegel Das spezifische Produkt der Amplifikationsreaktion kann durch elektrophoretische Trennung unter den folgenden Bedingungen nachgewiesen und identifiziert werden: - Verwendung eines 2%igen Agarosegels mit 1 µg/ml Ethidiumbromid in 1x TBE-Puffer (89 mm TRIS, 89 mm Borsäure, 2 mm Dinatrium-EDTA); - Verwendung eines 4%igen Agarosegels mit 1 µg/ml Ethidiumbromid in 1x TAE-Puffer (40 mm TRIS, 20 mm Essigsäure, 1 mm Dinatrium-EDTA), analog zu den Produkten der Reihe «ELECTROPHORESIS». Hinweis: Dank seiner Dichte und Färbung macht die Vorbereitung des Produktes der Amplifikationsreaktion mittels Zugabe eines Auftragepuffers überflüssig. 15 µl des Produktes der Amplifikationsreaktion entnehmen und direkt in eine Agarosegel-Tasche geben. Das spezifische Produkt der CPE-RNA-Amplifikation hat eine Größe von 610 bp. Hinweis: Der Elektrophoreselauf muss so durchgeführt werden, dass das spezifische Produkt der Amplifikationsreaktion des Analyseparameters vom spezifischen Produkt der CPE-RNA getrennt wird. Hinweis: Es sind keine weiteren Änderungen am Nachweisprotokoll erforderlich. Hinweis: Das Produkt der Amplifikationsreaktion kann die nachfolgenden Tests kontaminieren. Überschüssige Produkte aus der Amplifikationsreaktion und der beim Nachweis erzeugte Abfall müssen entfernt SCH m_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 5/10 SCH m_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 6/10

4 Im folgenden Beispiel wird das Ergebnis der elektrophoretischen Auftrennung eines Extraktions-, Amplifikations- und reversen Transkriptionslaufs schematisch aufgezeigt, in dem vier n analysiert wurden. Die Amplifikationsreaktion für den zu analysierenden Parameter weist ein spezifisches Produkt von 235 bp auf. Taschen Molekulargewichtsmarker zu analysieren der Parameter Allgemeine Negativkontrolle Positive Geeignete negative Positive ungeeignete Bewertung der Ergebnisse Bevor ein Ergebnis cdna-des zu analysierenden Analyseparameters NICHT VORHANDEN für eine endgültig bestätigt wird, muss das mit für diese erhaltene Ergebnis analysiert Die Reaktionsergebnisse der Analysenproben werden, wie in der folgenden Tabelle beschrieben, verwendet, um die Präsenz der cdna der CPE-RNA nachzuweisen. Testergebnis cdna der CPE-RNA Eignung der Spezifisches Produkt NICHT VORHANDEN negativ NICHT VORHANDEN nicht geeignet* 1380 bp Spezifisches Produkt VORHANDEN positiv VORHANDEN geeignet, (wahr negativ) 517 bp 459 bp 610 bp 610 bp 610 bp 387 bp 247 bp 75 bp 65 bp 46 bp 235 bp 235 bp 235 bp * Es ist möglich, dass die für den zu analysierenden Parameter positiven n kein Produkt der Amplifikationsreaktion der CPE-RNA aufweisen, obwohl sie geeignet sind. Die Amplifikationsreaktion der CPE-RNA mit kann von der Amplifikationsreaktion des zu analysierenden Parameters behindert Es ist unbedingt notwendig, die Spezifität des Amplifikationsprodukts zu validieren. Dazu vergleicht man seine Wanderungsstrecke im Gel mit der eines Markers mit bekanntem Molekulargewicht sowie mit der Wanderung des Produktes der Amplifikationsreaktion der. Das eventuelle Vorhandensein von unspezifischen Produkten der Amplifikationsreaktion hat für den Nachweis der cdna der CPE-RNA in der keinerlei Bedeutung. Wenn das spezifische Amplifikationsprodukt bei der Reaktion einer analysierten fehlt, so sind Probleme in der Amplifikationsphase (unwirksame bzw. fehlende Amplifikation), in der Phase der reversen Transkription (unwirksame bzw. fehlende reverse Transkription) bzw. in der Extraktionsphase (keine RNA vorhanden bzw. Präsenz von Inhibitoren) aufgetreten, die zu falsch-negativen Ergebnissen führen können. Die ist NICHT GEEIGNET und die Analyse muss von der Extraktion einer neuen an wiederholt *Hinweis: Auch wenn das spezifische Produkt für den analysierten Parameter nach der Amplifikationsreaktion vorhanden ist, kann das spezifische Produkt der CPE-RNA fehlen. Da die Amplifikationsreaktion der CPE-RNA mit so kalibriert ist, um nicht zu interferieren, kann sie von der Amplifikationsreaktion des zu analysierenden Parameters. In diesem Fall ist die dennoch brauchbar und das positive Ergebnis der Analyse gültig. Allgemeine Validierung des Amplifikationslaufs Die Ergebnisse der Reaktionen der negativen und der positiven Kontrollen werden verwendet, um den Extraktions-, reversen Transkriptions- und Amplifikationslauf gemäß der folgenden Tabelle zu validieren: Amplifikation der Negativkontrolle Spezifisches Produkt NICHT VORHANDEN Amplifikation der Spezifisches Produkt VORHANDEN Extraktion, reverse Transkription und Amplifikation Korrekt Extraktion, reverse Transkription und Amplifikation Korrekt Wenn das spezifische Amplifikationsprodukt in der negativen Kontrollreaktion vorhanden ist, sind Kontaminationsprobleme in der Phase Extraktion, der Amplifikation bzw. der reversen Transkription aufgetreten, die zu falsch-positiven Ergebnissen führen können. Der Test muss ab der Extraktion wiederholt Wenn bei der Reaktion der kein spezifisches Amplifikationsprodukt vorhanden ist, so sind Probleme in der Phase der Extraktion (keine RNA vorhanden bzw. Präsenz von Inhibitoren), der reversen Transkription (unwirksame bzw. keine reverse Transkription) oder der Amplifikation (unwirksame bzw. keine Amplifikation) aufgetreten, die zu falsch-negativen Ergebnissen führen können. Der Test muss ab der Extraktionsphase wiederholt SCH m_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 7/10 SCH m_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 8/10

5 PROBLEMLÖSUNGEN ERKLÄRUNG DER SYMBOLE Das spezifische Amplifikationsprodukt ist in der negativen Kontrollreaktion vorhanden Mögliche Ursachen Fehler bei der Dispensierung der CPE-RNA Fehler bei der Dispensierung der extrahierten RNA Fehler bei der Dispensierung der cdna. Fehler bei der Dispensierung des Produkts aus der ersten Amplifikation Kontamination der für die Sitzung vorbereiteten Reagenzien Kontamination des sterilen Wassers bzw. des für die Enzymverdünnung Kontamination des Enzymvorrats Kontamination des Bereichs für die Extraktion/Vorbereitung der PCR Lösungen Bei der Rekonstitution, Verdünnung und Dispensierung der Reagenzien vorsichtig sein und immer die Pipettenspitze wechseln. Ein neues Aliquot von sterilem Wasser oder verwenden. Verwenden Sie neue Enzymaliquots. Reinigen Sie Oberflächen und Instrumente mit wasserlöslichen Detergenzien, waschen Sie die Kittel, ersetzen Sie die verwendeten Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen. Das spezifische Amplifikationsprodukt ist in der Positive Control reaktion nicht vorhanden Mögliche Ursachen Fehler bei der Dispensierung der CPE-RNA Fehler bei der Dispensierung der extrahierten RNA Lösungen Führen Sie die Dispensierung der CPE-RNA sorgfältig durch. Führen Sie die Dispensierung der RNA sorgfältig durch Katalognummer. Temperaturgrenzwerte. Chargencode. Zu verwenden bis (letzter Tag des Monats). In-vitro-Diagnostikum. Entspricht den Anforderungen der Europäischen Richtlinie 98\79\EG über In-vitro- Diagnostika. Inhalt ausreichend für "N" Tests. Achtung, lesen Sie die Gebrauchsanleitung. Hersteller. Fehler bei der Dispensierung der cdna. Führen Sie die Dispensierung der cdna sorgfältig durch. Fehler bei der Dispensierung des Produkts aus der ersten Amplifikation Fehler bei der Dispensierung des Produkts der Amplifikationsreaktion ins Gel Entnehmen und dispensieren Sie das Produkt der ersten Amplifikation sorgfältig in die zweite Amplifikation. Laden Sie das Produkt der Amplifikationsreaktion sorgfältig ins Gel. Fehler bei der Dispensierung der RNA Halten Sie die Anweisungen zur RNA-Extraktion sorgfältig ein. System der reversen Transkription Ein System mit Random Primer verwenden ungeeignet. Enzyme zu stark verdünnt oder Fehler bei der Die Verdünnungsberechnungen überprüfen, aufmerksam Dispensierung der Enzyme die Dispensierung des Enzyms beobachten und gut mischen Abbau der Verwenden Sie ein neues Aliquot der CPE-RNA. Fehler bei der Programmierung der Zeit- Temperatur-Folgen. Kontrollieren Sie die Zeit-Temperatur-Folgen, die am Thermocycler eingestellt ist. Annealing-Temperatur über 60 C SCH m_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 9/10 SCH m_de 28/05/13 Revisionsstand 02 Seite 10/10