Molekulare Charakterisierung des IAP Survivin in Weichteilsarkomen - Bedeutung für Prognose und Etablierung neuer Therapiestrategien.
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- Norbert Krüger
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1 Molekulare Charakterisierung des IAP Survivin in Weichteilsarkomen - Bedeutung für Prognose und Etablierung neuer Therapiestrategien Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) Martin Luther Universität Halle Wittenberg von Herrn Matthias Kappler geboren am 06. Januar 1975 in Staßfurt (Sachsen-Anhalt) Gutachter: 1. Herr Prof. Dr. rer. nat. G. Moritz 2. Herr PD Dr. rer. nat. H. Taubert 3. Frau Prof. Dr. rer. nat. A. Wobus Halle (Saale), 9. März 2005 urn:nbn:de:gbv: [
2 Abkürzungen Abkürzungen Abb. Abbildung Ak Antikörper Ampr Ampicillinresistenz amol attomol Apaf-1 apoptotic protease-activating factor-1 APC adenomatous polyposis coli"-gen APS Ammoniumperoxodisulfat As Aminosäure AS antisense ATCC American Type Culture Collection, Amerikanische Zell- und Stammsammlung Bcl-2 b cell lymphoma/leukemia-2 bfgf basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor bidest bidestilliertes Wasser BIR baculovirus IAP repeats bp Basenpaar BSA bovine serum albumine, Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise CARD caspase recruitment domaine CDE cell-cycle-dependent element CDK cycline-dependent kinase cdna komplementäre DNA CHR cell-cycle gene homology region CMV early cytomegalie virus, Cytomegalivirus datp 2'-Desoxyadenosine 5'-Triphosphat DAPI 4,6-Diamidino-2-Phenylindole DEPC Diethylpyrocarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DTE Dithioerythritol DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGFP enhanced green fluorescent protein, künstlich verstärkte GFP-Protein-Variante ELISA enzyme-linked immunoadsorbent assay, Enzymimmuntest EPR-1 effector cell protease receptor-1 EtBr Ethidiumbromid FACS fluorescence activated cell sorting Fadd Fas-associated death domaine protein Fas fibroblast-associated antigene FKS fötales Kälberserum g Gramm GAPDH Glyzerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase GFP green fluorescent protein, grünfluoreszierendes Protein HBXIP hepatitis B X-interacting protein HE Haematoxylin-Eosin (-Färbung) htert humane Telomerase Reverse Transkriptase IAP inhibitor of apoptosis, Inhibitor(en) der Apoptose IgG Immunglobulin G kanr Kanamycinresistenz Kap. Kapitel kda Kilodalton LB Luria Broth - Bakteriennährmedium
3 Abkürzungen LMS Leiomyosarkom LS Liposarkom M Mol mdm2 murine double minute gene 2 MFH malignes fibröses Histiozytom mrna messenger RNA, Boten-Ribonukleinsäure MPNST maligner peripherer Nervenscheidentumor m milli mt Mutanten- oder mutiert n nano NF Neurofibromatose-Gen n.b. nicht bestimmt Nb Neuroblastom nt Nukleotid OD optische Dichte ODN Oligodesoxyribonukleinsäurefragmente OS Osteosarkom PAA Polyacrylamid PBGH Porphobilinogen Deaminase PBS phospate buffered saline, Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion PI Propidiumjodid PT Primärtumor PVDF Polyvinyldifluorid RB-1 Retinoblastom-1-Gen Rez Rezidiv RMS Rhabdomyosarkom RNA Ribonukleinsäure rpm rotations per minute, Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur oder reverse Transkription sirna small interfering RNA SDS sodium dodecyl sulfate, Natriumdodecylsulfat SE sense Tab. Tabelle TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TEMED N,N,N,N,-Tetramethylethyldiamin TNF Tumornekrosefaktor Tris Tris-hydroxymethylaminomethan TSG Tumorsuppressor-Gen U Unit(s) US undifferenziertes Sarkom UV ultraviolett V Volt VEGF vaskuläer-endothelialer Wachstumsfaktor w Gewicht WB western blot wt Wild-Typ WTS Weichteilsarkom zmol zeptomol
4 Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung Tumorentstehung und Zelltodkontrolle Weichteilsarkome - eine Charakterisierung Die Apoptose - ein essentieller Mechanismus Beschreibung der IAP Der IAP Survivin Genomische Struktur und Expression von Survivin Survivin - ein Bindeglied zwischen Zellzyklus und Apoptose Survivinexpression von normalen und transformierten Geweben Zielstellung 16 2 Material Tumormaterial Zelllinien Patientengut Geräte und Verbrauchsmittel Chemikalien Molekularbiologische Kits Antikörper und Enzyme DNA-Konstrukte, Oligodesoxynukleotide und sirnas Plasmide Bakterienstämme Puffer und Lösungen 23 3 Methoden Isolierung und Vermessung von Nukleinsäuren Isolation von Gesamt-RNA Isolation von Plasmid-DNA Photometrische Bestimmung der Nukleinsäurekonzentration Reverse Transkription, Polymerasekettenreaktion, Reinigung und Sequenzierung von PCR-Produkten Reverse Transkription (RT) Polymerasekettenreaktion (PCR) 25
5 3.2.3 Aufreinigung und Isolierung von PCR-Produkten DNA-Sequenzierung und Reinigung der Produkte Klonierung, Verdau und Ligation von DNA-Fragmenten Verdau von cdna mit Endonukleasen Ligation von DNA-Konstrukten Transformation von E.coli-Bakterien und Kulturansätze Hybridisierung der sirna Western-Hybridisierung Proteinisolierung aus Patientenmaterial Proteinisolierung aus humanen Zelllinien Westernblot-Analyse Waschen von PVDF-Membranen Survivin-ELISA Immunhistochemie Zellkultivierungstechniken Nichtvirale DNA-Transfektion Plasmid-Transfektion Transfektionsprotokoll für DNAzyme und sirna s in vitro Anreicherung mittels Vitalzellsortierung (FACSVANTAGE) Zellkoloniebildungstest Zellzyklus-Analysen Bestrahlung Apoptose-Nachweismethoden Kaspase-Assay Apoptose-Nachweismethode (DAPI-Färbung) Statistik 36 4 Ergebnisse Survivin-mRNA-Expressionsanalyse an humanen WTS-Geweben Qualitative mrna-expressionsstudien Quantitative mrna-expressionsstudien Korrelation der Survivin-mRNA-Expression mit klinischen Daten von WTS-Patienten mrna-expressionsanalyse der humanen Telomerase (htert) an Tumoren von WTS-Patienten Korrelation der htert-expression mit klinischen Daten 42
6 4.3 Kombination der Expression der Survivin- und htert-mrna und Korrelation mit den klinischen Daten von WTS-Patienten Survivin-Protein-Expressionsstudien an WTS Korrelation der Survivin-Proteinexpression mit klinischen Daten von WTS-Patienten Transfektion von Survivin-GFP-Plasmide in humane Sarkomzelllinien Inhibierung der Survivinexpression Austestung unterschiedlicher Nukleinsäureoligomere (DNAzyme, sirna) zur Inhibierung der Survivinexpression an Sarkomzelllinien Effektivität der sirna- Konstrukte in Abhängigkeit von der Konzentration Inhibierung von Survivin durch sirna-applikation in fünf Sarkom-Zelllinien mit unterschiedlichem p53-genstatus Analyse der Survivin-Expression und des klonogenen Zellüberlebens nach Applikation von sirnas gegen Survivin Analyse der Apoptose und des Zellzyklus nach sirna-applikation gegen Survivin Zell- und Strahlenbiologische Effekte der Inhibierung von Survivin in Kombination mit Röntgenbestrahlung an zwei Sarkomzelllinien mit unterschiedlichem p53-genstatus 58 5 Diskussion Einführung zu den Untersuchungen von Survivin in WTS mrna-expression von Survivin und seiner Transkripte in Tumor- und Normalgewebe Qualitative Analyse der Survivin-mRNA mittels RT-PCR Quantitative Analyse der Survivin-mRNA an WTS htert und Survivin - zwei embryonale Gene aktiv in WTS Prognostische Bedeutung der Expression von Survivinprotein für WTS Funktionelle Untersuchung von Survivin für WTS-Zelllinien Induktion der Survivinexpression durch den Einsatz von Survivin-GFP-Konstrukten sirna-spezifische Inhibierung von Survivin in WTS-Zelllinien Inhibierung von Survivin in Kombination mit Bestrahlung Therapeutische Optionen in Bezug auf Survivin Ausblick 82
7 6 Zusammenfassung 84 7 Literatur 87 8 Anhang 102
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