INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV 1. EINLEITUNG 1 2. MATERIAL UND METHODEN

I Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV 1. EINLEITUNG 1 2. MATERIAL UND METHODEN 5 2.1. Organismen und Vektoren 5 2.2. Kultivierung und Lagerung von Escherichia coli 7 2.2.1. Vollmedium für die Anzucht von E. coli-stämmen 7 2.2.2. Zellanzucht 7 2.2.3. Messung des Bakterienwachstums 8 2.3. Arbeiten mit Nukleinsäuren 8 2.3.1. Isolierung von Nukleinsäuren 8 2.4. Standardtechniken für das Arbeiten mit Nukleinsäuren 9 2.4.1. Auftrennung und Dokumentation von Nukleinsäuren 9 2.4.2. Größenbestimmung von Nukleinsäuren 9 2.4.3. Konzentrationsbestimmung von DNA 9 2.4.4. Gewinnung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 9 2.4.5. Reinigung von PCR-Produkten 10 2.4.6. Spaltung, Dephosphorylierung und Ligation von DNA 10 2.4.7. Phenolextraktion und Fällung von Nukleinsäuren 10 2.4.8. Übertragung von DNA in Escherichia coli 10 2.5. Hybridisierung von Nukleinsäuren 11 2.5.1. Herstellung von Digoxigenin markierten DNA-Sonden 11 2.5.2. Southern-Blot (Southern, 1975) 12 2.5.3. Dot-Blot 13 2.5.4. Koloniehybridisierung 13 2.5.5. Detektion von Hybridsierungssignalen 13 2.5.6. Wiederverwendung von Nylonmembranen 14 2.6. DNA-Sequenzierung 14 2.6.1. DNA-Sequenzierung am A.L.F. -Sequencer 14 2.6.2. DNA-Sequenzierung am ABI-Sequencer 377 15 2.7. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 15 2.7.1. Standardmäßig eingesetzte PCR 15 2.7.2. Overlap extension-pcr 15 2.8. Proteinchemische Methoden 17 2.8.1. Proteinbestimmung (Bradford, 1976) 17 2.8.2. Bestimmung der Enzymaktvität 17 2.8.3. Denaturierende Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE ) 19 2.8.4. Anfärben von Proteinen 19 2.8.5. Trocknen von Polyacrylamid-Gelen 20 2.8.6. Umpuffern und Einengen von Proteinlösungen 20 2.8.7. Chemische Modifikation von GrdD 20 2.8.8. Massenspektrometrie 21 2.9. Spektroskopische Methoden 22

II 2.10. Zink-Analytik 22 2.11. Heterologe Protein-Expression 22 2.11.1. Zellanzucht, Induktion der Genexpression und Zellernte 22 2.11.2. Native Reinigung von Strep-tag-Fusiosprotein 22 2.12. Geräte und Chemikalien sowie Firmen 22 3. EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 25 3.1. Klonierung von grdd1 aus Eubacterium acidaminophilum 25 3.2. Auswertung der Sequenzdaten 27 3.2.1. Genanordnung 27 3.2.2. Transkriptions- und Translationssignale 28 3.3. Versuche zur Klonierung von grdd2 29 3.4. Vergleich der Sequenzen von GrdC und GrdD aus Eubacterium acidaminophilum 33 3.4.1. Sequenzen von GrdC und GrdD anderer Organismen 33 3.4.2. Vergleich der Sequenzen von GrdC 34 3.4.3. Vergleich der Aminosäuresequenzen von GrdD 37 3.4.4. Vergleich der Aminosäuresequenz der großen Untereinheit GrdC von Protein C mit Sequenzen der Datenbanken 38 3.4.5. Vergleich der Sequenz von GrdD mit Datenbanken 41 3.4.6. Sequenzverleich von OrfU 41 3.5. Heterologe Hybridisierung von chromosomaler DNA aus Clostridium litorale 45 3.6. Klonierung von grdc und grdd in Vektoren zur heterologen Proteinexpression 46 3.6.1. Klonierung von grdd in pqe30 in Escherichia coli M15 (prep4) 47 3.6.2. Klonierung von grdd und grdc zur Expression als Strep-tag-Fusionsproteine 47 3.7. In vitro-mutagenese von grdd1 48 3.8. Heterologe Expression der rekombinanten Untereinheiten von Protein C in Escherichia coli 50 3.8.1. Reinigung von GrdD als N-terminales 6xHis-tag -Fusionsprotein 50 3.8.2. Heterologe Expression von GrdD als Strep-tag-Fusionsprotein 53 3.8.3. Reinigung von GrdC als Strep-tag-Fusionsprotein 56 3.8.4. Enzymaktivität der Untereinheiten GrdD in Gegenwart von GrdC 58 3.8.5. Enzymaktivität von GrdD-Mutanten 58 3.9. Analyse des Zink-Gehalts in GrdC 60 3.10. Untersuchungen zur Markierung des katalytisch aktiven Cysteins in GrdD 61 3.10.1. Untersuchungen zum Substratschutz durch Acetylphosphat und zur Inaktivierung von GrdD durch Jodacetat 61 3.10.2. Weiterführung der Ansätze durch Markierung von GrdD mit 4-Vinylpyridin und Analyse der proteolytischen Spaltungsprodukte 63 3.10.3. Untersuchung der modifizierten Proteine und der Mutante GrdD C359 A durch CD-Spektroskopie 66 4. DISKUSSION 69 4.1. Protein C der Glycin-Reduktase 69 4.2. Klonierung von grdd aus Eubacterium acidaminophilum 69 4.3. Vergleich der funktionellen Genorganisation der Glycin-Reduktase und Proteine aus verschiedenen Organismen 71

III 4.4. Der Sequenzvergleich der Untereinheit GrdD 74 4.5. Sequenzvergleich der Untereinheit GrdC 77 4.6. Reinigung und Charakterisierung der rekombinanten Untereinheiten von Protein C nach heterologer Expression in Escherichia coli 81 4.7. Die Rolle von Zink im Katalysemechanismus von Protein C 84 4.8. Nachweis der katalytisch aktiven Thiol-Gruppe an GrdD 88 4.9. Hypothetischer Mechanismus für die Katalyse von Protein C 91 4.10. orfu aus Eubacterium acidaminophilum und Clostridium difficile 93 5. ZUSAMMENFASSUNG 96 6. LITERATURVERZEICHNIS 97

IV Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung AcP Acetylphosphat Amp r Ampicillinressistenz Ähnl. Ähnlichkeit AP- alkalische Phosphatase APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosin-5 -triphosphat B. Bacillus Bet Betain (N,N,N-Trimethylglycin) bp Basenpaar(e) bzw. beziehungsweise C Grad Celsius C. Clostridium Ct. Carboxydothermus ca. circa CD Cirkulardichronismus CoA Coenzym A d Schichtdicke Da Dalton deg x cm2 x dmol Einheit der molaren Eliptizität dest. destilliert DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuclease dntp Desoxynucleosid-5 -triphosphat DTT Dithiothreitol DIG Digoxigenin dutp Desoxyuridin-5 -triphosphat ε molarer Extinktionskoeffizient E. Eubacterium, Escherichia EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EB Elutionspuffer Endkonz. Endkonzentration Fa. Firma F Farad FAD Flavinadenindinucleotid g Gramm h Stunden HABA 4-Hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid HPLC High-performance liquid chromatography Ident. Identität IPTG Isopropyl-β-thiogalactopyranosid J Joule k- kilo- (10 3 ) kb kilobasen K M Michelis-Konstante l Liter λ Lambda (Wellenlänge) M Molar M- mega- (10 6 )

V -m -meter m- milli (10-3 ) µ- micro- (10-6 ) min Minute(n) mrna messenger-ribonukleinsäure m/z Massenzahl N normal n- nano-(10-9 ) NAD(P) + Nicotinamidadenindinucleotid-(phosphat) NAD(P)H Nicotinamidadenindinucleotid-(phosphat) reduziert OD Optische Dichte orf open reading frame (offener Leserahmen) PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese P i anorganisches Phosphat ph negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration PCR Polymerase-Ketten-Reaktion PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuclease rdna ribosomale Desoxyribonukleinsäure s Sekunde(n) s. siehe Sar Sarkosin (N-Methyl-Glycin) SDS Natriumdodecylsulfat s. o. siehe oben Tab. Tabelle TEMED N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin TFA Trifluoressigsäure theoret. theoretisch Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan T. Tissierella, Treponema u. a. unter anderem U Units (Einheit für die Enzymaktivität) upm Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett V Volt Vol. Volumen v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen X-Gal 5-Brom-4-chlor-indoyl-β-D-galactosid z. B. zum Beispiel