Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der Abkürzungen... 6 1. Einleitung... 9 1.1 Probiotika...9 1.1.1 Definition und Historisches...9 1.1.2 Klinische Bedeutung probiotisch wirksamer Bakterienstämme...9 1.1.3 Eigenschaften probiotisch wirksamer Bakterienstämme...11 1.2 Das Probiotikum E. coli Nissle 1917...13 1.2.1 Besonderheiten des Stammes E. coli Nissle 1917...14 1.3 Lipopolysaccharid (LPS)...17 1.3.1 Allgemeine Merkmale des bakteriellen LPS...17 1.3.2 Wirkung des LPS...17 1.3.3 Molekulare Struktur des LPS am Beispiel von E. coli Nissle 1917...19 1.4 Mikroarrays...23 1.4.1 Methodisches Prinzip der Mikroarray- Hybridisierung...25 2. Methodik... 27 2.1 Material...27 1
2.1.1 Verwendete Chemikalien...27 2.1.2 Verwendete Kits und Enzyme...29 2.1.3 Verwendete Bakterienstämme...30 2.1.4 Verwendete Lipopolysaccharide (LPS)...30 2.1.5 Verwendetes Spenderblut...30 2.1.6 Verwendete Fluoreszenzfarbstoffe zur cdns- Markierung...31 2.1.7 Verwendete Mikroarrays...31 2.1.8 Medien und Lösungen...32 2.2 Methoden...37 2.2.1 Herstellung der Bakterienrohlysate...37 2.2.1.1 Vergleichende Wachstumskurvenanalyse der Bakterienstämme E. coli Nissle 1917 und E. coli W536...37 2.2.1.2 Herstellung von Bakterienlysaten durch Ultraschallbehandlung...38 2.2.1.3 Bestimmung der Proteinkonzentration im Bakterienlysat nach Bradford...38 2.2.2 Zellpräparation...39 2.2.2.1 Gewinnung von venösem Vollblut und autologem Plasma...39 2.2.2.2 Isolation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMZ)...39 2.2.2.3 Zellzahlbestimmung der PBMZ...40 2.2.3 Inkulturnahme und Stimulation der PBMZ...40 2.2.3.1 PBMZ- Kulturen...40 2.2.3.2 PBMZ- Kulturen für die Zytokin- Konzentrationsbestimmung mittels ELISA...41 2.2.3.3 Vitalitätsprüfung der PBMZ...42 2.2.4 RNS- Präparation...42 2.2.4.1 Isolation von Gesamt- RNS aus kultivierten PBMZ...42 2.2.4.2 Denaturierende RNS- Gelelektrophorese...43 2.2.4.3 mrns- Isolierung aus Gesamt- RNS...44 2.2.4.4 Bestimmung der Konzentration und Reinheit der mrns...44 2
2.2.5.1 Synthese und Markierung von cdns...45 2.2.5.2 Quantifizierung der in cdns integrierten Menge an Cy-3 bzw. Cy-5...46 2.2.6 Hybridisierung der Mikroarrays...47 2.2.6.1 Kompetetive Hybridisierung von Cy-3- und Cy-5- markierter cdns auf Mikroarrays...47 2.2.6.2 Auslesen der hybridisierten Mikroarrays...47 2.2.7 Auswertung der Mikroarray- Daten...48 2.2.7.1 Normalisierung der im Mikroarray gemessenen Daten...49 2.2.8 Quantitative real- time PCR...52 2.2.8.1 Reverse Transkription von mrns in cdns...52 2.2.8.2 Amplifikation und relative Quantifizierung genspezifischer cdns durch real- time PCR...53 2.2.9 Quantitative Zytokinbestimmung mittels ELISA...57 2.2.9.1 IL-6- ELISA...57 2.2.9.2 IL- 10- ELISA...58 2.2.9.3 IL-12p40- ELISA...59 3. Ergebnisse... 60 3.1 Vergleichende Analyse des Wachstumsverhaltens der Bakterienstämme E. coli Nissle 1917 und E. coli W536...60 3.2 Etablierungsschritte der Mikroarraymethodik zur Analyse von Genexpressionsprofilen humaner PBMZ nach Stimulation mit bakteriellen Komponenten...61 3.2.1 Ermittlung der benötigten PBMZ- und daraus gewonnener Gesamtbzw. mrns- Menge...62 3.2.2 Bestimmung und Ausgleich unterschiedlicher Markierungsraten von Cy-3 und Cy-5 in cdns für die Mikroarray- Hybridisierung...62 3.2.3 Überprüfung der Angleichung der unterschiedlichen Markierungsraten 3
von Cy-3 und Cy-5 durch Mikroarray- Hybridisierung...63 3.2.4 Kontrolle der Spezifität der Mikroarray- Hybridisierung durch den Nachweis stimulus- spezifischer Genexpressionsmuster in PBMZ...66 3.3 Genexpressionsanalysen mittels 10K- Mikroarrays...68 3.3.1 Vergleichende Analyse der Genexpressionsmuster in PBMZ induziert durch LPS Nissle, LPS W536 oder LPS S. min....69 3.3.1.1 Analyse des in PBMZ durch LPS Nissle induzierten Genexpressionsmusters...69 3.3.1.2 Analyse des Genexpressionsmusters nach Stimulation mit LPS Nissle im Vergleich zu LPS W536...73 3.3.1.3 Vergleich der Genexpressionsmuster von PBMZ nach Stimulation mit LPS S.min. und LPS Nissle...75 3.3.2 Vergleichende Analyse der Genexpressionsmuster von Nissleund W536- Lysat...77 3.3.2.1 Analyse des in PBMZ durch Nissle- Lysat induzierten Genexpressionsmusters...77 3.3.2.2 Vergleich der Genexpressionsmuster von PBMZ nach Stimulation mit LPS Nissle im Gegensatz zur Stimulation mit Nissle- Lysat...81 3.3.2.3 Analyse des durch Nissle- Lysat induzierten Genexpressionsmusters im direkten Vergleich zu W536- Lysat...84 3.4 real- time PCR ausgewählter Gene zur genaueren Bestimmung der Genexpression von IL-10, IL-12p40 und CCL24...86 3.5 Quantifizierungen der Zytokinproduktion nach Stimulation der PBMZ aus Zellkulturüberständen mittels ELISA...89 3.5.1 IL-6- Freisetzung aus PBMZ nach Stimulation mit LPS oder Lysat...90 3.5.2 IL-10- Freisetzung nach Stimulation mit LPS oder Lysat...91 4
3.5.3 IL-12p40- Freisetzung nach Stimulation mit LPS oder Bakterienlysat...93 3.5.4 Quotient aus den Konzentrationen für IL-12p40 und IL-10...95 3.5.5 Einfluss einer Hitzebehandlung von LPS und Bakterienlysat auf die Freisetzung von IL-12p40 und IL-10 aus PBMZ...97 3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse...99 4. Diskussion... 101 4.1 Genexpressionsanalyse mittels Mikroarray...101 4.2.1 Einfluss der verkürzten O- spezifischen Kette von LPS Nissle auf die Genexpression von PBMZ...106 4.2.2 Vergleichende Analyse der Rohlysate von E. coli Nissle 1917 und E. coli W536...109 4.3 Quantitative Analyse der CCL24-, und IL-12p40- Expression...112 4.4 Quantitative Analyse der IL-10- Freisetzung...115 Literatur...120 Anhang...136 5