VETERINÄRMEDIZIN Kälteanpassung \bi\ Listeria monocytogenes: Klonierung, D^Ä-Sequenzanalyse und Funktionsstudien der Gene CS/JL, CS/JLB und flar aus dem Wildtypstamm Listeria monocytogenes EGD Eva-Maria Busch Fachverlag Köhler Giessen
INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG l 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 Taxonomie von Listeria spp. 3 2.2 Kälteanpassung von L. monocytogenes 4 2.3 Extrazelluläre Beweglichkeit 9 2.4 Listeriose bei Mensch und Tier 11 2.5 Infektionsverlauf und beteiligte Virulenzfaktoren 13 2.5.1 L.monocytogenes im Mausinfektionsmodell 19 2.6 Epidemiologie der Listeriose 21 2.7 Diagnostik von L.monocytogenes 22 3 MATERIAL 24 3.1 Bakterienstämme 24 3.2 Plasmide 25 3.3 Oligonukleotide 27 3.4 Vorgefertigte Reagenzien 29 3.5 Anzuchtmedien 30 3.6 Antimikrobielle Wirkstoffe 30 3.7 Standardpuffer 31 3.8 Chemikalien, Enzyme und Antikörper 31 3.9 Molekulargewichtsmarker 32 3.10 Peptide 32 3.11 Geräte 32 4 METHODEN 35 4.1 Isolierung von Nukleinsäuren 35 4.1.1 Isolierung chromosomaler DNA aus Listerien 35 4.1.2 Isolierung von episomaler DNA 36
4.1.3 Isolierung von RNA 38 4.1.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 40 4.2 Nukleinsäure-Analytik 40 4.2.1 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 40 4.2.2 Restriktion von DNA mittels Restriktionsendonukleasen 43 4.2.3 Aufreinigung von Ligations-und Restriktionsansätzen 44 4.2.4 Elektrophoretische Analyse von Nukleinsäuren 44 4.2.5 Transfer von Nukleinsäuren auf eine Membran 46 4.2.6 Hybridisierung 47 4.2.7 Klonierung von DNA-Fragmenten 51 4.2.8 Transformation von episomaler DNA in Bakterien 53 4.2.9 Herstellung chromosomaler Deletionsmutanten 56 4.2.10 DNA-Sequenzanalyse 57 4.2.11 Primer Extension 62 4.3 Isolierung von bakteriellen Proteinen 64 4.3.1 Präparation von Überstandsproteinen 64 4.3.2 Präparation von Membranproteinen mittels Harnstoffextraktion 64 4.3.3 Präparation von Zellwand-Proteinen mittels SDS-Extraktion 65 4.3.4 Herstellung von Zytoplasmaextrakten 65 4.4 Protein-Analytik 65 4.4.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-PAGE) 65 4.4.2 Transfer von Proteinen auf eine Membran (Western Blot) 66 4.4.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen 67 4.4.4 Naßblot zur N-terminalen Proteinsequenzanalyse 68 4.4.5 Herstellung polyklonaler Antikörper 69 4.4.6 Immunfluoreszenz 69 4.4.7 Fluoreszenzbestimmung 70 4.5 Mausinfektionsmodell 70 4.6 Anlegen von Glyzerinkulturen 70 4.7 Wachstumstests mit L.monocytogenes 71 4.8 Motilitätstest von Listerien im Hitchens-Agar 71 4.9 Vergleichende Datenbankanalysen 71
III 5 ERGEBNISSE 72 5.1 Charakterisierung des flar-gens 72 5.1.1 Klonierung des flar-gens 72 5.1.2 DNA-Sequenzanalyse desy?aä-gens 73 5.1.3 Untersuchung zur Spezifität desyzaä-gens bei Listeria spp. 73 5.2 Funktionsanalysen des flar-gens durch Konstruktion einer EGDv.AflaR- Deletionsmutante 75 5.2.1 Herstellung der EGD::A/7a7?-Deletionsmutante 75 5.2.2 Vergleich der exprimierten Proteine des Wildtyps und der Mutante 79 5.2.3 Motilitätstests 80 5.3 Untersuchung der Expression kälteinduzierter Proteine 82 5.3.1 N-terminale Sequenzanalyse von kälteinduzierten Proteinen 82 5.4 Charakterisierung des cspl-gens und seiner flankierenden Bereiche 85 5.4.1 Klonierung und DNA-Sequenzanalyse 86 5.5 Funktionsanalysen des «pl-gens durch Konstruktion einer EGD::AaypL- Deletionsmutante 91 5.5.1 Konstruktion der EGD::AcipL-Deletionsmutante 91 5.5.2 Charakterisierung der EGD::Ao?pL-Deletionsmutante 95 5.5.3 Herstellung CspL-spezifischer polyklonaler Antikörper 107 5.5.4 Immunbiochemische Untersuchungen mit polyklonalen CspLspezifischen Antikörpern 108 5.6 Transkriptionsstudien 109 5.6.1 Transkription des cspl-gens 110 5.6.2 Transkription des./7a4-gens 111 5.6.3 Kartierung des Transkriptionsstartpunktes von cspl durch Primer Extension 113 5.6.4 Promotorsequenz des orpl-gens 114 5.6.5 Ribosomenbindungsstelle 115 5.7 Untersuchung der EGD::AcspL-Mutante im Mausinfektionsmodell 116 5.8 Funktionsstudien des cspl-gens mit dem Grün fluoreszierenden Protein" 117 5.8.1 Herstellung eines CspL-GfP-Fusionsproteins 118
IV Inhaltsverzeichnis 5.8.2 Transformation 119 5.8.3 Wachstumsversuche bei unterschiedlichen Temperaturen 119 5.8.4 Immunbiochemische Untersuchungen 120 5.9 Analytische und funktionelle Charakterisierung des asplb-gens 124 5.9.1 Nachweis des CspLB-Proteins durch N-terminale Sequenzanalyse 124 5.9.2 Klonierung und DNA-Sequenzanalyse der flankierenden Bereiche des asplb-gens 125 5.9.3 Klonierung und DNA-Sequenzanalyse des asplb-gens 125 5.9.4 Vergleichende Sequenzanalysen der Proteine CspL und CspLB 126 5.10 Funktionsanalysen des orplb-gens durch Konstruktion einer EGD::AaspLB- Deletionsmutante 127 5.10.1 Konstruktion der EGD::A«pLB-Deletionsmutante 127 5.10.2 Charakterisierung der EGD::AaspLB-Deletionsmutante 131 5.11 Transkriptionsstudien 135 5.11.1 Transkriptionsanalyse des csplb-gens 13 5 5.11.2 Transkriptionsanalyse desy7a/4-gens 137 5.11.3 Kartierung der Transkriptionsstartpunkte des cyplb-gens durch Primer Extension 139 5.11.4 Promotorsequenz des cyplb-gens 140 5.11.5 Ribosomenbindungsstelle 141 6 DISKUSSION 142 6.1 Bedeutung desy?a/?-gens für die Regulation des Flagellins 143 6.2 Charakterisierung des aspl-gens 147 6.3 Charakterisierung des csplb-gens 163 7 ZUSAMMENFASSUNG 168 8 SUMMARY 170 9 LITERATURVERZEICHNIS 172
10 ANHANG 190 10.1 DNA-Sequenzen 190 10.1.1 yfaä-genlokus 190 10.1.2 cspl-genlokus 194 10.1.3 csplb-genlokus 202 10.2 Vergleichende Datenbankanalysen 208 10.2.1 Ähnlichkeitsstudien zu den Proteinsequenzen der N-terminalen Proteinsequenzanalysen 208 10.2.2 Offene Leserahmen der cspl- und ayplb-genloki 217