-APP-A. Serologische Diagnose der Schweine-Ple anhand eines indirekten ELISAs spezifisc Antikörper gegen das ApxIV RTX Toxin

Transkript

1 -APP-A Serologische Diagnose der Schweine-Ple anhand eines indirekten ELISAs spezifisc Antikörper gegen das ApxIV RTX Toxin

2 Übersicht Der Erreger Epidemiologie Diagnostik CHEKIT-APP-Apx-IV

3 Der Erreger Actinobacillus pleuropneumoniae Gramnegatives Bakterium 1960 erstmals in England, in Kalifornien und in Australien Früher der Gruppe Heamophilus zugeordnet: H. H. Im 1983 wird eine Verwandtschaft zwischen H. pleuropne beschrieben Variable Virulenz je nach Serotyp hoch virulen Das Schwein ist der einzige Wirt für APP Weltweite Verbreitung mit massgeblichem wirtschaftliche Schweineindustrie 15 verschiedene Serotypen

4 Der Erreger Virulenzfaktoren Exotoxine Lipopolysacharide (Fennwick and Osburn, 1986) Bakterielle Kapsel (Jnzana et al, 1993; Ward et al Adhesionsfaktoren (Dom et al. 1994) Urease (Bosse and McInnes, 1997)

5 Der Erreger Toxine Exotoxine: RTX Toxine APX: Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxine Apx-I Apx-II Apx-III Neu Apx-IV

6 Der Erreger APX RTX Toxine a b Secreted toxins Biovar Serotype ApxI ApxII ApxIII a 5b Cross reaction A.suis A.suis A.rossii - A.porcitonsillarum

7 Epidemiologie Hochansteckende Krankheit Übertragung durch infizierte Tiere Bei akuten Infektionen rasche Verbreitung im Stall (aerog Virulenz abhängig von: - Serotyp hoch virulen - Prim. /sekundäre Infektionen (PRRS, Cir - Stallmanagement Schwache Widerstandsfähigkeit in der Umwelt

8 Epidemiologie Problematik Trägertiere ohne klinische S

9 Diagnostik Diagnostische Mittel Klinik Pathologie Serologie Erregernachweis Bakteriologie/PCR

10 Diagnostik Serologie KBR Vorteil: Keine Kreuzreaktion mit H. Nachteil: Schlechte Sensitivität Schwierige Standardisieru Arbeitsaufwendige Technik

11 Diagnostik Serologie Indirekte Hämaglutination Vorteil: Keine Kreuzreaktion mit H. p Nachteil: Schlechte Sensitivität Schwierige Standardisierung Arbeitsaufwendige Technik

12 Diagnostik Serologie ELISA mit Kapselantigene oder zelluläres Lipopolys Vorteil: Schnelle Methode Einfache Standardisierung Nachteil: Leistungsmerkmale abhängig vo Nicht serotypenspezifisch (z.b. 1 Mehrere Tests notwendig um al Kreuzreaktionen mit anderen Ke

13 Diagnostik Serologie ELISA mit ApxI, ApxII und/oder ApxIII Antigen Vorteil: Schnelle Methode Einfache Standardisierung Nachteil: Leistungsmerkmale abhängig vo Mehrere Tests notwendig um al Kreuzreaktionen mit anderen Ke - E.coli - A. porcitonsilla - A. suis - A. rossi

14 Diagnostik Serologie ELISA mit ApxIV Vorteil: Schnelle Methode Einfache Standardisierung Erfassung aller 15 Serotypen APP spezifisch Differenzierung von geimpften u (Schaller et al. 2001)

15 Diagnostik Produktion und Reinigung von rekombinantem ApxIV Expression in E. coli B Stamm BL21(DE3) Affinitätschromatografische Reinigung mit Ni pjffrok7 hydrophobic domains repeated glyc ApxIV 6xHis ApxIV-N Apx 6xHis 6xHis ApxIV

16 Control + ApxIV-N ApxIV-C experimentell und natürlich APP i Schweine A. suis a 5b / / / / / Bre 1926 Bre 1930 Bre 1935 Bre 1765 Jen Experimentelle Infektion mit 12 APP Serotypen Natürliche Infektion mit APP1 Schaller et al. (1999) Natürliche Infektion mit APP2 S A S

17 Antigenetische Spezifität von vo Schaller et al. (1999) std ApxIVA serotype 1 serotype 2 ApxI ApxII ApxIII ApxI ApxIVA ApxII ApxIVA ApxIII kda anti - ApxIVA Ak anti- ApxI Ak anti- ApxII Ak anti- ApxIII Ak

18 kda ApxIV wird nur während der Infek Serotyp 1 Serotyp 5 Sero Schaller et al. (1999)

19 ApxIV Zusammenfassung a b Secreted toxins Biovar Serotype ApxI ApxII ApxIII a 5b Cross reaction A.suis A.suis A.rossii - A.porcitonsillarum

20 -APP-A

21 2 Platten Kit 2 Stück 1 x 0.6 ml 1 x 0.9 ml 1 x 0.9 ml 1 x 100 ml 1 x 100 ml 1 x 100 ml 1 x 60 ml -APP-ApxIV 10 Platten Kit "Bulk" Ware 2 x 5 Stück à 5 Stück CHEKIT-APP-ApxIV Testplatten, Antigen beschichtet. 1 x 0.6 ml à 1.2 ml CHEKIT-Anti-Schwein-IgG-PO-K markiert mit Meerrettichperoxidas 2 x 0.9 ml à 0.9 ml CHEKIT-APP-ApxIV-Kontrollseru konserviert mit 0.1 % Natriumazid 2 x 0.9 ml à 0.9 ml CHEKIT-APP-ApxIV-Kontrollseru konserviert mit 0.1 % Natriumazid 1 x 100 ml à 100 ml CHEKIT-APP-ApxIV Probenverd 3 x 100 ml à 500 ml CHEKIT-10x-Konzentrat, nicht g 2 x 100 ml à 100 ml CHEKIT-TMB-Substrat, gebrauch 1 x 60 ml à 60 ml CHEKIT-TMB-Stopplösung, gebr

22 -APP-ApxIV Testablauf Verdünnung der Proben und Kontrollen: 1:10 Verdünnung 100 µl/well Inkubation: 60 Minuten bei 37 C Waschen der Platte: 3 x 300 µl Wasch-& Verdünnerlösung Konjugat Verdünnung: 1:400, 100 µl/well Inkubation: 60 Minuten bei 37 C = ApxIV Antigen = anti-apxiv AKs Wasch 3 Wasch-&

23 ROC Kurve n = negative Proben 97 positive Proben -APP-ApxIV 100 APP Sensitivity Specificity

24 -APP-ApxIV Verteilung 900 Positive Negativ CHEKIT-APP-ApxIV (S/P in %) APP Diagnosis=1 APP Diagnosis

25 Spezfität < CHEKIT-APP-ApxIV % classes Number of samples 111 Proben von SPF Tieren und von Herden ohne APP Vorgeschichte (Western Blot negativ) -APP-ApxIV

26 Nicht pathogener Actinobaci Gottschalk et al., University of Montréal, 2003 Zwei atypische Actinobacillus Stämme (9953L55 and 0347 h Isoliert von Schweinen: - Ohne klinische Symptome e - Keine pathologischen Verän - Historisch kein APP im Bes h Ursprünglich antigenetisch und biochemisch als APP h Mit allen phänotypischen Eigenschaften von APP Experimentelle Infektion: beide Stämme sind nicht pat Phylogenetische Analyse (16S rrna) : Stämme unters Ak gegen 9953L55 kreuzreagieren mit App S s

27 Non-pathologische Actinoba Stamm 953L55 führt zu Kreuzreaktionen in konventionelle ELISA (Gottschalk et al., 2003) Gottschalk et al. (2003)

28 -APP-ApxIV Spezifität CHEKIT-APP-ApxIV (%) = APP negative Schweine, n = = APP/6 experimentell infizierte Schweine ± 30 Tage n.i., n 3 = APP/7 experimentell infizierte Schweine ± 30 Tage n.i., n 4 = APP/10 experimentell infizierte Schweine ± 30 Tage n.i., 5 = A. porcitonsillarum experimentell infizierte Schweine 5

29 -APP-ApxIV Analytische Sensitivität Experimentelle Infektion - aerosol - 10 Wochen alte SPF Tiere - APP Serotyp 6, 7 and Euthanasie nach 5 Wochen - Alle Tiere zeigten - Infektionskeim wurde aus Läsionen isoliert Figure 2a. +? - APP Seroty CHEKIT- APP- ApxIV (%) 10 dpi dpi

30 APP-ApxIV APP Serotype 6 +? - +? dpi CHEKIT- APP - ApxIV (%)

31 APP-ApxIV APP Serotype dpi CHEKIT- APP- ApxIV (%)

32 -APP-ApxIV Analytische Sensitivität 100 APP/2 KBR Referenzserum (VLDIA070, SW-APP2, AHS, Deventer, NL). Titer 1/ x höhere Sensitivität verglichen mit der KBR CHEKIT-APP-ApxIV (%) /1.25 1/5 1/20 Dilutio

33 -APP-ApxIV Differenzierung zwischen geimpften (Porcilis APP) Impfung Infektio ApxIV negativ

34 Porcilis APP trial Group 1 (Control) Titer (LOG2) Age (week)

35 Porcilis APP trial Group 2 (Lot vaccin A) Pig age (week) Group 3 Titer (LOG2) PP (%) Titer (LOG2) st vacc. 2nd vacc st vacc. P Apx I (titer) Apx II (titer) Apx III (titer) OMP (titer) Apx IV (%)

36 -APP-ApxIV Bestätigungsmethode: Western-blot Use of recombinant ApxIV in serodiagnosis of Actinoba infections; development and prevalidation of the A A. Dreyfus a, A. Schaller b, S. Nivollet b, R.P.A.M. Segers c, M. Kobisch Hüssy a, R. Miserez a, W. Zimmermann g, F. Inderbitzin h and J. F a Institute of Veterinary Bacteriology, University of Berne, Laenggass-Strasse 1 b Bommeli Diagnostics, Stationsstr. 12, CH-Liebefeld, Bern, Switzerland c Intervet International, P.O. Box 31, NL-5830 AA Boxmeer, The Netherlands. d Unité de mycoplasmologie bactériologie, AFSSA, BP 53, F Ploufragan e Laboratoire de développement et d'analyses des Côtes d'armor, BP 54, F-2244 f Danish Veterinary Institute, Bülowsvej 27, DK-1790 Copenhagen V, Denmark g Clinic for Swine Diseases University of Berne, and pig health service, Bremga h SBAG Schlachtbetrieb SG AG, CH-9015 St. Gallen, Submitted (2003)

37 -APP-ApxIV Zusammenfassung Spezifität: 99% - 100% Sensitivität: 95% % Einzige serologische Methode welche alle Serotype Keine Kreuzreaktionen mit anderen Keimen Differenzierung zwischen geimpften (Porcilis APP) a

38 -APP-ApxIV