Enantiomerenanalytik und CE

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1 Quelle: www. quarks. de Enantiomerentrennung von Arzneistoffen Geschichte omenklatur Eigenschaften von chiralen Arzneistoffen enantiomeric excess Beispiele von chiralen Arzneistoffen Anforderung an die Enantiomerenanalytik Trennung durch Kristallisation als Diastereomerensalze hromatographische Trennung (Bsp.: PL) Kapillarelektrophoretische Trennung 1

2 1815 J.B. Libout Rotation von polarisiertem Licht in αquarz 1848 L. Pasteur Trennung von atriumammoniumtartrat 1874 Van`t off / Le Bel Asymmetrisches Atom, Tetraedermodell 1938 E. Fischer Konfiguration der ()Glucose 1966 R.S. ahn,. Ingold, V. Prelog R/S omenklatur GilAviv Geschichte Gaschromatographische Trennung omenklatur von Isomeren Isomere Stereoisomere Strukturisomere (optisch inaktiv) Enantiomere (optisch aktiv) Diastereomere Atropisomere MesoVerbindungen (optisch inaktiv) Epimere (optisch aktiv) Anomere (optisch aktiv) 2

3 Eigenschaften von Enantiomeren Gleiche chemische und physikalische Eigenschaften (gegenüber achiralen Medien) Schmelzpunkt spektroskopische Eigenschaften (UV, IR, Fluoreszenz, MS) pk a /pk b Werte, Redoxpotential, ucleophilie... Unterschiedliche Eigenschaften gegenüber chiralen Medien linear polarisiertes Licht ( Drehwertbestimmung im Polarimeter) chemische Umsetzungen mit chiralen Reagenzien Wichtig für Arzneistoffe: Wechselwirkungen mit Proteinen hirale Arzneistoffe Pharmakodynamische Unterschiede (Wechselwirkungen mit Enzymen, Rezeptoren, Ionenkanälen...) Pharmakokinetische Unterschiede (Proteinbindung, Metabolisierung und Verteilung) ca. 80 % der synthetischen chiralen Arzneistoffe sind als Racemat im andel 98% der semisynthetischen oder natürlich vorkommenden AS sind enantiomerenrein im andel 3

4 hirale Arzneistoffe Wirkstoff Asparagin Adrenalin hloramphenicol Thalidomid Ethambutol Dopa Ibuprofen Tranylcypromin (R)Enantiomer süß 30x aktiver als (S) (R,R) antibakteriell nicht (?) teratogen (R,R) Erblindung passive Diffusion (S)Enantiomer bitter (S,S) inaktiv teratogen (S,S) tuberkulostatisch aktive Diffusion (R) inaktiv, aber Inversion zu (S) () MAemmer, () AReuptakehemmer (antidepressiv) Enantiomerenüberschuß ( enantiomeric excess, ee ) ( E 1 E 2 ) ee (%) = x 100 ( E 1 E 2 ) E 1 = Konzentration des Enantiomers 1 E 2 = Konzentration des Enantiomers 2 Was sagt mir eine ee Angabe? ee = 0% bedeutet Es liegt ein Racemat (50:50) vor! ee = 100% bedeutet Die Substanz ist enantiomerenrein! ee = 90% bedeutet Es liegt ein 95:5 Gemisch zweier Enantiomere vor! 4

5 Arten von hiralen Zentren neben vierbindigem Kohlenstoff G. Subramanian (ed.): A Practical Approach to hiral Separations by Liquid hromatography, V Weinheim (1994) p2 hirale Arzneistoffe mit einem chiralen Zentrum Als Racemat werden eingesetzt: Als reines Enantiomer werden eingesetzt: Ibuprofen Pyrantel Methadon Propranolol Thiopental etirizin hloroquin Warfarin Promethazin xazepam Metoprolol Verapamil Phenprocoumon Salbutamol floxacin meprazol (chiraler Schwefel) yclophosphamid (chiraler Phosphor) Ifosfamid (chiraler Phosphor) Acetylcystein (R) etirizin (R) Levodopa (S) Pramipexol (S) Folsäure (S) Ibuprofen (S) Methotrexat (S) Levomethadon (R) Levofloxacin (S) Adrenalin (R) meprazol (S) 2 l S 2 5

6 hirale Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (I) Ascorbinsäure (4R,5S) Diltiazem (2S,3S) hloramphenicol (1R,2R) S aptopril (S,S) Pilocarpin (3S,4R) 3 S l l hirale Arzneistoffe mit zwei chiralen Zentren (II) Ephedrin (1R,2S) R,2S L()Ephedrin 1S,2R D()Ephedrin 1R,2R L()Pseudoephedrin 1S,2S D()Pseudoephedrin erythroreihe threoreihe Tramadol (1S,2S 1R,2R; trans bzw. ZRacemat)

7 Anforderungen an die Enantiomerenanalytik hohe Empfindlichkeit (achweisgrenze << 1%) gute Reproduzierbarkeit kostengünstig (Geräte, Durchführung der Messung) geringer Substanzbedarf geringer Zeitaufwand Messung ohne aufwändige Probenvorbereitung keine Artefaktbildung (v.a. keine Racemisierung) Anwendungen von Enantiomerentrennungen in Industrie und Forschung Präparativ: Isolierung des enantiomerenreinen Arzneistoffes nach der Synthese Analytisch: Bestimmung der Enantiomerenreinheit während der Produktion Untersuchungen zur Pharmakokinetik und zum Metabolismus invitro und invivo 7

8 Trennung durch Kristallisation als Diastereomerensalze Prinzip: für Basen: für Säuren: achteile: Zum Racemat (RS) wird ein enantiomerenreines (R oder S) Fällungsreagenz gegeben Äpfelsäure, Mandelsäure, Weinsäure und derivate, amphersulfonsäure Base (R,S) Säure (R) diastereomere Salze ( Kation (R), Anion (R) und Kation (S), Anion (R) ) Ephedrin, Brucin, hinin, Phenylethylamin zeitaufwändig, nicht für analytische Anwendungen geeignet hromatographische Trennung von Enantiomeren (I) 1. Trennung nach Derivatisierung zu Diastereomeren z.b. (S)1Phenylethylisocyanat (PEI) für Aminosäuren S 2 3 S S S SPhenylalanin R 2 3 S R 3 S }Diastereomere RPhenylalanin Trennung an RP18 möglich achteile: quantitative Umsetzung notwendig Reagenz muss sehr rein sein zeitaufwändig, nur für analytische Anwendungen 3 8

9 hromatographische Trennung von Enantiomeren (II) 2. Direkte Trennung an chiralen (pseudo)stationären Phasen Methoden: Prinzip: Vorteil: PL, G, E Unterschiedlich starke Wechselwirkungen (WW) der Enantiomere in einer chiralen Umgebung (π π, ionisch, Wasserstoffbrücken, DipolWW) analytisch und präparativ nutzbar hirale stationäre Phasen (SP`s) für die PL Typ Autor Jahr hiraler Selektor Interaktion Fließmittel Substrate Bemerkungen I Pirkle ,5dinitrobenzoyl)phenyglycin Wasserstoffbrücken rganisch elektronenreiche enges Einsatzgebiet und andere ASDerivate π π Wechselwirkungen Aromaten II kamoto 1986 PolysaccharidDerivate Wasserstoffbrücken, rganisch oder viele Substrate auch chemische Selektivität Inklusionskomplexe wässrig mit Ionenzusatz hohe Probenkapazität III Armstrong u.a yclodextrine Inklusionskomplexe wässrig einige A`s, AS Blaschke 1974 Polacryl und metacrylamide Inklusionskomplexe rganisch einige A`s hohe Probenkapazität ram 1975 Kronenether Inklusionskomplexe rganisch wenige IV Davankow u.a Prolin Ligandenaustausch wässrig mit u 2 Aminosäuren mit Metallkomplexen V Allenmark u.a Protein hydrophobe und wässrige Puffer viele Substrate geringe Probenkapazität (αagp, BSA, vomuceid) Wasserstoffbrücken geringe Stabilität 9

10 Beispiele für direkte Enantiomerentrennungen: PirkleSäulen (Typ I) hiraler Selektor: R(()(3,5 dinitrobenzoyl) phenylglycine) (DBPG) Mobile Phase: nexan / 2Propanol 80/20 (V/V) Flussrate: 1 ml/min Detection: UV 254 nm Probe:xazepam (0.5mg/ml) Beispiele für direkte Enantiomerentrennungen: PolysaccharidDerivate (Typ II) hiralpak AD: Amylosederivat Warfarin Verapamil Mobile Phase: nexan/2propanol/ Diethylamin = 90:10:0.1 (V:V:V) Flussrate: 1.0 ml/min Mobile Phase: nexan/ethanol/ Diethylamin = 50:50:0.1 (V:V:V) Flussrate: 0.7 ml/min 10

11 Beispiele für direkte Enantiomerentrennungen: PolysaccharidDerivate (Typ II) hiracel D: ellulosetrisphenylcarbamat Ibuprofen Propranolol nexan/2propanol/f 3 =100:1:0.1(V:V:V) Flussrate: 1 ml/min nexan/2propanol/diethylamin=80:20:0.1(v:v:v) Flussrate: 1 ml/min Beispiele für direkte Enantiomerentrennungen: Polyacrylamide (Typ III) hiraspher T: poly(acryloylsphenylalanine ethyl ester) xazepam Mobile Phase: neptan/tetrahydrofuran 50/50 (V/V) Flussrate: 1.0 ml/min 11

12 Enantiomerentrennung an Proteinphasen (Typ IV): α1glycoprotein (AGP) Kapillarelektrophorese 12

13 Instrumenteller Aufbau ochspannungsquelle Instrumenteller Aufbau ochspannungsquelle 13

14 Die Elektrophoretische Mobilität AAME: Die Kapillarwand hat keinen Einfluß Wanderungsrichtung und Wanderungsgeschwindigkeit der Analyten sind nur von der Ladung und der elektrophoretischen Mobilität abhängig z. e v eff = E 6πη πηr z. e E η r eff. Ladung Feldstärke Viskosität Ionenradius Der Elektroosmotische Fluss Si Si pabhängigkeit des EF Deprotonierung der Silanolgruppen v EF = ε ζ 4πη E E ζ η ε Quarz Feldstärke ZetaPotential Viskosität Dielektrizitätskonstante LM a b a starre Grenzschicht b diffuse Grenzschicht 14

15 Der Elektroosmotische Fluss Definition: Durch Dissoziation der Silanolgruppen der inneren berfläche der Quarzkapillare wird die Kapillarwand negativ aufgeladen, und die Pufferlösung im Inneren der Kapillare erhält einen Überschuß an positiven Ladungsträgern (Kationen). Durch elektrostatische Anziehung lagern sich die Kationen der Pufferlösung an die Kapillarwand an, und zwar zum einen in Form einer starren (unbeweglichen) Grenzschicht direkt an der Kapillaroberfläche und zum anderen in einer diffusen (beweglichen) Grenzschicht in weiterem Abstand zur Kapillarwand. Bei Anlegen einer Spannung beginnen sich die Kationen der diffusen Grenzschicht in Richtung Kathode zu bewegen. Infolge eines osmotischen Effektes bewegt sich auch das sie umgebende Lösungsmittel mit, und es kommt zu einem ettostrom der Pufferlösung in Richtung der Kathode. Diesen Effekt bezeichnet man als elektroosmotischen Fluss (EF). Elektrophoretische und Elektroosmotische Mobilität t M Stempelförmiges Flussprofil Zeit [min] pabhängigkeit von u EF und u EFF Deprotonierung der Silanolgruppen Protonierungsgrad der Analyten v = v EF v EFF 15

16 Möglichkeiten zur Beeinflussung des EF Veränderung des Trennsystems Auswirkungen auf den EF pwert des Puffers EF wenn p Pufferkonzentration EF wenn Pufferkonz. Temperatur rg. Lösungsmittel (A, Me...) Viskositätsveränderung, evtl. auch Selektivitätsänderung Komplexe Veränderungen, meist Änderung der Selektivität hem. Veränderung der Reduzierung / Umkehr des EF Kapillarwand (lin. Polyacrylamid, Methylcellulose) hirale Selektoren in der E yclodextrine native (α, β, γd) substituierte D nichtionische (Methyl, ydroxypropyl, ydroxyethyl...) anionische (arboxymethyl, Sulfobutyl, Sulfoethyl...) kationische (Trimethylammoniumhydroxypropyl...) hirale Kronenether 18Krone6Tetracarbonsäure hirale Mizellbildner (SDSDigitonin, Gallensäuren,...) Glykopeptide (Vancomycin, Rifamycin) Proteine (SA, BSA, AGP) 16

17 ative yclodextrine als chirale Selektoren 62% aller Enantiomerentrennungen in der E mit yclodextrinen als chirale Selektoren α yclodextrin => 6 αdglucoseeinheiten β yclodextrin => 7 αdglucoseeinheiten γ yclodextrin => 8 αdglucoseeinheiten b a c Durch die chirale Information in der Struktur der Zucker wird im yclodextrin eine chirale Umgebung erzeugt! D α β γ Dimension a b c Kavitätsvolumen Å floxacin Formel: F F 3 * 3 3 * 3 hemische Eigenschaften: Betainstruktur, besser: Zwitterion (saure arboxylfunktion, basischer Stickstoff am Piperazinring); IEP = 7,4 ein hiralitätszentrum (*) (Das S()Enantiomer ist je nach Keimart 8128 mal stärker wirksam als das R()Enantiomer) andelsnamen: Tarivid : R,S(±)floxacin (1984) Tavanic : S()floxacin (Levofloxacin, 1998) 17

18 Formel: F 3 floxacin F 3 Trimethylammoniumacetat = * Betain 3 3 * 3 hemische Eigenschaften: Betainstruktur, besser: Zwitterion (saure arboxylfunktion, basischer Stickstoff am Piperazinring); IEP = 7,4 ein hiralitätszentrum (*) (Das S()Enantiomer ist je nach Keimart 8128 mal stärker wirksam als das R()Enantiomer) andelsnamen: Tarivid : R,S(±)floxacin (1984) Tavanic : S()floxacin (Levofloxacin, 1998) Praktikumsaufgabe Qualitative Bestimmung von floxacinenantiomeren in umanurin mit ilfe der Kapillarelektrophorese Elektrophoretische Bedingungen: Laufpuffer: 100mM 3 P 4 mit Triethylamin auf p 2,0 eingestellt hiraler Selektor: 45mM ydroxypropylβyclodextrin (D.S.=0,8) Kapillare: fused silica; 20/27 cm 50 µm I.D. x 375 µm.d. Spannung: 20kV Injektion: hydrodynamisch; 5 sec (Urinproben) bzw. 10 sec (wässrige Standardlösung) bei 0,5 psi Detektion: UVDetektion, 280 nm λ max =294 nm 18

19 Literaturhinweise E Grundlagen: F. Tagliaro, G. Manetto, F. rivellente, F.P. Smith: A brief introduction to capillary electrophoresis, Forensic Science International, 92 (1998), Wätzig: Grundlagen der Kapillarelektrophorese, PZ Prisma, 3 (1996), hirale Trennungen: S. Fanali, Z. Aturki,. Desiderio: ew strategies for chiral analysis of drugs by capillary electrophoresis, Forensic Science International, 92 (1998),