D-Serintransport und Tetracyclinresistenz in Staphylococcus saprophyticus sowie Fibrinogen- und Fibronektinbindung in Staphylococcus lugdunensis

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1 D-Serintransport und Tetracyclinresistenz in Staphylococcus saprophyticus sowie Fibrinogen- und Fibronektinbindung in Staphylococcus lugdunensis Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum angefertigt am Institut für Hygiene und Mikrobiologie in der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie der Medizinischen Fakultät vorgelegt von Jan Lennart Marlinghaus aus Bochum Bochum Oktober 2011

2 Transport of D-serine and tetracycline resistance in Staphylococcus saprophyticus as well as binding of fibrinogen and fibronectin in Staphylococcus lugdunensis Dissertation to obtain the degree Doctor Rerum Naturalium (Dr.rer.nat.) at the Faculty of Biology and Biotechnology Ruhr-University Bochum International Graduate School of Biosciences Ruhr-University Bochum Institute for Hygiene and Microbiology Department of Medical Microbiology Faculty of Medicine submitted by Jan Lennart Marlinghaus from Bochum, Germany Bochum October 2011 II

3 All that is, ever, ever was, will be, ever, twisting, turning, through the never Through The Never Metallica III

4 Erstgutachter: Prof. Dr. Sören G. Gatermann Zweitgutachter: Prof. Dr. Franz Narberhaus IV

5 Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät eingereicht habe und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur originale Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde. Bochum, den Jan Lennart Marlinghaus V

6 Inhaltsverzeichnis: Inhaltsverzeichnis:... I Abkürzungsverzeichnis... IV 1 Einleitung Harnwegspathogen Staphylococcus saprophyticus Die Rolle der Aminosäure D-Serin Staphylococcus lugdunensis Fibrinogen-bindendes Protein (Fbl) von S. lugdunensis Zielsetzung Material und Methoden Materialien Bakterienstämme Plasmide Oligonukleotide Enzyme Chemikalien Nährmedien Puffer und Lösungen Verbrauchsmaterialien Kits Geräte Computerprogramme Methoden Anzucht von Bakterien Erstellung von Kryokulturen Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Isolierung von Plasmid-DNA aus Staphylokokken Isolierung von chromosomaler DNA aus Staphylokokken Staphylokokkenlyse für PCR nach Reischl Polymerasekettenreaktion (PCR) Präzipitation von DNA Restriktion von DNA Agarose-Gelelektrophorese I

7 Southern Blot Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Ligation von DNA-Fragmenten Herstellung transformationskompetenter E. coli Zellen Transformation von E. coli Protoplastentransformation von S. saprophyticus und S. lugdunensis Protoplastentransformation von S. carnosus TM Homologe Rekombination und Plasmid-Curing von pbt Gramfärbung Resistenzbestimmung mit Antibiotikaplättchen und E-Test-Streifen Pulsfeldgelelektrophorese Wachstum auf PY-Agarplatten mit D-Serin D-Serin-Aufnahmetest Pyruvat-Assay (McFall, 1975) Wachstumstest im chemisch definierten Medium (CDM) Clumpingfaktortest Adhärenztest DNA-Sequenzierung Ergebnisse Identifizierung von D-Serintransportern und Tetracyclin-resistenz in S. saprophyticus Bioinformatische Ergebnisse der putativen D-Serintransporter Erstellung und Verifizierung von Allelaustausch-Mutanten putativer D-Serintransporter Ermittlung der D-Serin Transportleistung der Transporter-mutanten mittels 1H- NMR und Pyruvat-Assay Einfluss von D-Serin auf das Wachstum von Mutanten putativer D-Serintransporter Etablierung eines Tetracyclin-Resistenzmarkers für Doppel-knockout-Stämme in S. saprophyticus Isolierung und Identifizierung des Resistenzgens Verteilung von pmb2200-ähnlichen Plasmiden in S. saprophyticus Stämmen Doppelknockout mit tetk Fibrinogen- und Fibronektinbindung von S. lugdunensis Fibrinogen-Bindung von S. lugdunensis II

8 3.2.2 Fibronektin-Bindung von S. lugdunensis Erstellung von fbl-knockout-mutanten von S. lugdunensis Charakterisierung von fbl-knockout-mutanten von S. lugdunensis Diskussion SSP1070 von S. saprophyticus 7108 ist ein D-Serintransporter Bedeutung des D-Serintransports auf das Wachstum von S. saprophyticus 7108 und Transportermutanten Tetracyclin-Resistenz in S. saprophyticus Fibrinogen und Fibronektinbindung von S. lugdunensis Erstbeschreibung einer genetischen Manipulation von S. lugdunensis und Charakterisierung der erstellten fbl-allelaustauschmutanten Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Anhang Publikationen Manuskripte Posterbeiträge curriculum vitae III

9 Abkürzungsverzeichnis AB Abb. A.dest. abs. Amp As ATP bp BPB C CDM CF Cm CNS DMSO DNPH DNS dntp EDTA RG EPS Ery EtBr EtOH et al. Fg Fn g Antibiotikum Abbildung(en) Destilliertes Wasser (lat. aqua destillata) absolut Ampicillin Aminosäure/n Adenosin-5`-triphosphat Basenpaare Bromphenolblau Celsius chemisch definiertes Medium Clumping Faktor Chloramphenicol Koagulase-negative Staphylokokken Dimethylsulfoxid 2,4-Dinitrophenylhydrazin Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonukleosid-5`-Phosphat Ethylendinitrilotetraacetat Reaktionsgefäß extrazelluläre polymere Substanzen Erythromycin Ethidiumbromid Ethanol lat.: et alii (und andere) Fibrinogen Fibronektin Gramm IV

10 gdna h kb Km l LB M max. mcs MHK min MTP MU n od x PCR PFGE PPT RNA RT s SDS Tc TE T m Tris TSP U ü.n. ÜK genomische DNA Stunde(n) Kilobasenpaare Kanamycin Liter Lysogenic Broth Molar maximal multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site) minimale Hemmkonzentration Minute(n) Mikrotiterplatte(n) Miller-Units nano optische Dichte bei x nm Polymerase-Kettenreaktion Pulsefeldgelelektrophorese Protoplastentransformation Ribonukleinsäure Raumtemperatur Sekunde(n) Natriumdodecylsulfat Tetracyclin Tris-EDTA Mittelpunktstemperatur (midpoint of transition temperature) Trishydroxymethylaminoethan Trimethylsilylpropionat Unit (Enzymeinheit) über Nacht Übernachtkultur/en V

11 rpm utr UV V v/v w/v Wt X-Gal λ μ Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) untranslatierte Region Ultraviolett Volt Volumen pro Volumen Gewicht pro Volumen Wildtyp 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactopyranosid Wellenlänge micro VI

12 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Harnwegspathogen Staphylococcus saprophyticus Harnwegsinfektionen (Urinary Tract Infections, UTI) stellen eine bedeutende finanzielle Last für Gesundheitssysteme dar. Im Jahr 2000 hatte dieser Anteil in den USA ein Volumen von über 2,4 Milliarden US-Dollar (Litwin et al., 2005). Die Mehrheit aller Frauen erlebt in ihrem Leben eine UTI. Jedes Jahr kommt es in den USA zu etwa 6,8 Millionen Arztbesuchen, einer viertel Million Krankenhausaufenthalten und tausenden Toten wegen Komplikationen (Sepsis) durch UTIs (Litwin et al., 2005, Czaja und Hooton, 2006, Strehlow et al., 2006, Griebling, 2005). Nach Escherichia coli gehört Staphylococcus saprophyticus zu den häufigsten Erregern von unkomplizierten Harnwegsinfektionen bei jungen Frauen. Die prozentuale Häufigkeit der durch S. saprophyticus verursachten UTIs unterliegt regionalen und saisonalen Schwankungen und liegt zwischen 42,3% und 0,5% (Wallmark et al., 1978, Schneider und Riley, 1996, Kahlmeter, 2003, Gupta und Stamm, 1999, Colodner et al., 2006). Dabei hat das Auftreten von S. saprophyticus-utis im Sommer und frühem Herbst seinen Höhepunkt (Hovelius und Mardh, 1984, Jellheden et al., 1996). Ein Risikofaktor für das Entstehen einer S. saprophyticus-uti ist, wie bei E. coli auch, Geschlechtsverkehr (Gillespie et al., 1978). Es wurde berichtet, dass das Vorkommen dieses Keims mit dem Kontakt von rohem Fleisch oder mit Schwimmen (draußen) assoziiert ist (Hedman und Ringertz, 1991). Die Wahrscheinlichkeit, dass die erste UTI einer jungen Frau durch S. saprophyticus verursacht wird, liegt in einer Studie bei 44% (Wathne et al., 1987). Häufige Symptome bei unkomplizierten Harnwegsinfektionen sind Schmerzen und Brennen beim Wasserlassen (Algurie), häufiger Drang zum Wasserlassen (Pollakisurie) und Probleme bei der Blasenentleerung (Dysurie). Bei der von S. saprophyticus verursachten UTI treten dazu noch häufiger Proteinurie (Proteine im Urin), Pyurie (Eiter im Urin) und Hämaturie (Erythrozyten im Urin) auf als bei Gram-negativen Stäbchen (Wathne et al., 1987, Hedman und Ringertz, 1991). 1

13 Einleitung Die Harnwege sind normalerweise eine sterile Umgebung. Ein Harnwegspathogen muss sich gegen verschiedene Abwehrmechanismen behaupten können, um die Harnwege zu besiedeln. Es wurden Virulenzfaktoren für S. saprophyticus beschrieben, die bei der Kolonisation der Harnwege eine Rolle spielen. Das Enzym Urease, welches Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxid spaltet, dadurch den ph-wert erhöht und zu Blasensteinen führen kann, ist ein bedeutender Faktor bei der Kolonisation der Blase von Ratten (Gatermann und Marre, 1989, Gatermann et al., 1989). Um nicht durch den Fluss des Urins ausgespült zu werden, benötigt ein Harnwegspathogen Adhärenzfaktoren. Das Oberflächenprotein SdrI, welches zu den SD-Proteinen gehört, bindet Kollagen und erhöht die Persistenz des Bakteriums in Nieren und Blase (Sakinc et al., 2006, Kline et al., 2010). Ein weiteres Oberflächenprotein aus dieser Gruppe ist das UafA, welches S. saprophyticus die Fähigkeit vermittelt, Fibronektin zu binden (Neumann, 2011). Das oberflächenassoziierte Ssp ist eine Lipase (Abbildung 1), die wie das SdrI zur Persistenz des Bakteriums in Nieren und Blase beiträgt (Kline et al., 2010, Sakinc et al., 2005). Abbildung 1 Hochauflösende rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von S. saprophyticus (A) Das Äußere der Zelle ist mit einem oberflächenassoziierten Protein bedeckt (Gatermann et al., 1992). (B) Die flaumig-fusselige Oberfläche von 7108 ist in der Ssp-Mutante (C) verschwunden, die damit glatt erscheint (Sakinc et al., 2005). Ssp ist eine oberflächenassoziierte Lipase. Weiße Balken= 100 nm. 2

14 Einleitung Ein weiteres Oberflächenprotein von S. saprophyticus, das Aas, besitzt mehrere Funktionen. Es ist ein Autolysin, agglutiniert Schafserythrozyten und bindet Fibronektin (Hell et al., 1998, Gatermann und Meyer, 1994). Ein weiterer potenzieller Virulenzfaktor ist die D-Serindeaminase (DsdA), die D-Serin zu Pyruvat und Ammonium umsetzt (Sakinc et al., 2009, McFall, 1975). Im sequenzierten Genom von S. saprophyticus ATCC15305 ist eine Vielzahl von offenen Leserahmen zu finden, die für redundante Transporter kodieren. Es wird vermutet, dass diese Ausbreitung von paralogen Genen eine Anpassung an die sich sehr schnell ändernden osmotischen Bedingungen und des Nährstoffangebots in den Harnwegen bzw. im Urin ist (Kuroda et al., 2005). 1.2 Die Rolle der Aminosäure D-Serin Eine große Rolle bei einer UTI spielt die Nährstoffversorgung des Pathogens. Anders als im Intestinaltrakt ist der Urin in den Harnwegen arm an Kohlenhydraten. Er beinhaltet jedoch eine Vielzahl an L- und D-Aminosäuren (Armstrong et al., 1993). Besonders D-Serin und D-Alanin sind zu einem relativ hohen Anteil im Urin von höheren Wirbeltieren zu finden (Patzold et al., 2005). D-Serin ist das Enantiomer der kodogenen Aminosäure L-Serin (Abbildung 2) und wird vom Menschen meist über pflanzliche Nahrung aufgenommen oder im Gehirn durch Racemasen aus L-Serin synthetisiert (Wolosker et al., 1999, Friedman, 1999). Abbildung 2 Fischer-Projektion der zwei Enantiomere von Serin. 3

15 Einleitung Es wurde gezeigt, dass sich D-Serin negativ auf das Wachstum von Mikroorganismen auswirkt. Maas und Davis berichteten von einer Hemmung des Wachstums von E. coli durch D-Serin, die kompetitiv durch β-alanin und nicht kompetitiv durch Pantothensäure aufgehoben wurde. Sie folgerten daraus, dass D-Serin die Pantothensäuresynthese aus β-alanin stört (Maas und Davis, 1950). Das Wachstum von Flavobacterium wird ebenfalls von D-Serin inhibiert. Dieser Effekt wird durch die gleichzeitige Gabe von β-alanin, Pantothensäure und L-Asparaginsäure, einem Vorläufer der β-alanin-synthese, aufgehoben (Durham und Milligan, 1961, Durham und Milligan, 1962). Hier stört D-Serin die Synthese von β-alanin aus L-Asparaginsäure und die Pantothensäuresynthese aus β-alanin. In Erwinia blockt D-Serin ebenfalls die Synthese von Pantothensäure und β-alanin. Allerdings wird hier die Pantothensäuresynthese durch die Inhibition der Hydroxymethylierung von α-keto-panthotensäure, der direkten Vorstufe von Pantothensäure, geblockt (Grula und Grula, 1962). In Erwinia wird die β-alaninsynthese durch die Inhibiton der Decarboxylierung von L-Asparaginsäure zu β-alanin verhindert (Grula und Grula, 1963). In Mycobacterium smegmatis hemmt D-Serin das Wachstum bzw. die Zellwandsynthese, indem es statt Glycin in die Zellwand eingebaut wird und die Kopplung von D-Alanin und Diaminopimelinsäure stört. Die Hemmung der Zellwandsynthese konnte später auch für das strukturverwandte D-Threonin gezeigt werden (Yabu und Huempfner, 1974, Yabu und Takahashi, 1978). D-Serin wird von D-Alanin D-Alanin-Ligasen aus verschiedenen Spezies erkannt (Sato et al., 2005), wodurch eine Störung der Zellwandsynthese bei diesen denkbar ist. Auch in Micrococcus lysodeikticus wird das Wachstum gehemmt und D-Serin in die Zellwand eingebaut (Whitney und Grula, 1964, Whitney und Grula, 1968). Die schädliche Wirkung von D-Serin auf E. coli K12 wird durch das zytoplasmatische Enzym D-Serindeaminase (DsdA) aufgehoben, indem es D-Serin zu Ammonium und Pyruvat umsetzt (McFall, 1964). Auf Stämme, die dieses Enzym nicht besitzen, wirkt D-Serin bakteriostatisch. Dies ist hier auf die inhibierende Wirkung in der Pantothensäuresynthese und im L-Serinmetabolismus zurückzuführen (Cosloy und McFall, 1973). Das im Urin vorkommende D-Serin hemmt das Wachstum verschiedener, nicht uropathogener Spezies und wirkt dabei an verschieden Orten. Es ist bekannt, 4

16 Einleitung dass uropathogene E. coli (UPEC) das Enzym D-Serindeaminase (DsdA) exprimieren, welches D-Serin zu Pyruvat abbaut (Roesch et al., 2003, Moritz und Welch, 2006) Der Abbau von D-Serin dient uropathogenen Mikroorganismen also nicht nur zur Ernährung, sondern beseitigt einen für sie potentiell schädlichen Stoff. Ein Homolog des dsda-gens aus E. coli (UPEC) findet man auch im sequenzierten Genom von S. saprophyticus. Es ist ein Charakteristikum dieser Art, da es in jedem von 251 untersuchten Stämmen nachgewiesen wurde (Kleine et al., 2010). Weder in Staphylococcus xylosus und Staphylococcus cohnii, die die nächsten phylogenetisch Verwandten von S. saprophyticus sind, noch in Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis und 13 anderen, nicht uropathogenen Staphylokokken wurde dsda nachgewiesen (Sakinc et al., 2009). Dieses Enzym scheint für Harnwegspathogene eine besondere Bedeutung zu besitzen. Damit D-Serin von DsdA abgebaut werden kann, muss es zunächst in die Zelle aufgenommen werden. Die Transporter in E. coli sind für einen UPEC-Stamm beschrieben worden (Anfora und Welch, 2006). Abbildung 3 zeigt das angenommene Arbeitsmodel des D-Serinmetabolismus in E. coli CTF073. 5

17 Einleitung (Anfora und Welch, 2006) Abbildung 3 Arbeitsmodel vom dsdcxa-operon und D-Serinmetabolismus in uropathogenem E. coli CTF073 (Anfora und Welch, 2006). D-Serin wird durch die Transporter DsdX und CycA inkorporiert und von der D-Serindeaminase (DsdA) zu Pyruvat und Ammonium umgesetzt. D-Serin aktiviert den Transkriptionsregulator DsdC, welcher darauf die Transkription von dsdx und dsda initialisiert. Das cyca-gen steht unter Regulation von σ 54, der wiederum unter Stickstoffmangelbedingungen aktiv wird. Es ist angedeutet, dass D-Serin noch andere zelluläre Effekte hat, die noch nicht näher bekannt sind. DsdX ist ein spezifischer D-Serintransporter, der, außer zu D-Serin, nur noch eine marginale Affinität zu D-Threonin besitzt. Für diesen Transporter wurde eine höhere D-Serintransportkapazität beschrieben als für CycA, der unter anderem auch D-Alanin, Glycin, und D-Cycloserin transportiert. Beide Transporter sind H + -Symporter, die auf Kosten der protonenmotorischen Kraft D-Serin in die Zelle transportieren (Schneider et al., 2004, Anfora und Welch, 2006). Die Gene dieser Transporter werden unter verschiedenen Wachstumsbedingungen exprimiert. Die Expression von CycA ist unter Stickstoffmangelbedingungen erhöht und wird durch das Nac-System reguliert (Hua et al., 2004, Reitzer und Schneider, 2001, Zimmer et al., 6

18 Einleitung 2000). Dagegen wird im dsdcxa-operon die Expression von DsdX zusammen mit DsdA von DsdC kontrolliert, welches in Anwesenheit von D-Serin die chromosomale Transkription induziert (Norregaard-Madsen et al., 1995). In S. saprophyticus ATCC15305 ist dsda nicht im Kontext eines solchen Operons zu finden, sondern liegt als einzelnes Gen im Genom. Des Weiteren existieren drei Gene im Genom, die als D-Serin/D-Alanin/Glycin- Transporter annotiert sind und hohe Ähnlichkeit zu cyca aufweisen. Zudem finden sich dort zwei Gene, die entfernte Ähnlichkeit mit dsdx haben. Es wurde für E. coli (UPEC) gezeigt, dass das Fehlen von DsdA und die damit verbundene, steigende intrazelluläre D-Serinkonzentration zu einer erhöhten Expression von Virulenzfaktoren und einer verstärkten Kolonisation der Harnwege führt (Haugen et al., 2007). Die intrazelluläre D-Serinkonzentration könnte damit ein wichtiges Signal für ein Harnwegspathogen sein, dass daraufhin seine Genexpression an den Lebensraum Harnwege anpasst. Der Transport von D-Serin aus dem Urin ins Zytoplasma ist für die intrazelluläre D-Serinkonzentration von entscheidender Bedeutung. Es ist noch nichts darüber bekannt, ob und wie S. saprophyticus D-Serin aufnimmt. 1.3 Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus lugdunensis kolonisiert diverse Nischen des menschlichen Körpers und besiedelt dabei verstärkt Regionen ab dem Beckenbereich abwärts (Bieber und Kahlmeter, 2010). Das Bakterium gehört zu den Koagulase negativen Staphylokokken (CNS) und wurde 1988 das erste Mal beschrieben (Freney et al., 1988). Schaut man sich die Literatur der letzten 20 Jahre an, so stellt sich immer mehr heraus, dass es sich bei diesem Kommensal und Hautbewohner eher um den Wolf im Schafspelz handelt (Frank et al., 2008). S. lugdunensis zeigt klinische und mikrobielle Eigenschaften, wie gesteigerte Virulenz, die dieses Bakterium eher in eine Nische mit S. aureus stellen. Es kann Infektionen verursachen, die von Hautund Weichteilentzündungen über Peritonitis, Knochen- und Gelenkentzündungen bis hin zu Blutstrominfektionen, Sepsis und toxischem- Schock-Syndrom reichen (Pareja et al., 1998, Frank et al., 2008). 7

19 Einleitung S. lugdunensis besitzt ein sehr ähnliches Infektionsspektrum wie S. aureus und ist klinisch von diesem kaum zu unterscheiden. Es wird vermutet, dass S. lugdunensis ein häufiger Verursacher von Haut- und Weichteilinfektionen ist, aber von den meisten Laboren nicht erkannt und seine Vorkommen damit unterschätzt wird (Bocher et al., 2009). Darüber hinaus kann dieser Keim beim Befallen von nativen Herzklappen, künstlichen Herzklappen und Schrittmachern eine aggressive Endokarditis hervorrufen, die zu mehr chirurgischen Eingriffen und einer deutlich höheren Letalität (50-70%) führt als eine durch S. aureus (14,5%) oder S. epidermidis (20%) verursachte Endokarditis (Anguera et al., 2005, Vandenesch et al., 1993, Frank et al., 2008). Andere Publikationen berichten, dass S. lugdunensis für etwa 18% der infektiösen Endokarditis und für 44% der durch CNS verursachten Herzklappen-Endokarditis verantwortlich ist (Patel et al., 2000). Speziell die Fibrinogen- und Fibronektin-bindenden Proteine ClfA und FnBPA wurden bei S. aureus als Schlüssel-Pathogenitätsfaktoren in einem experimentellen Endokarditismodel bei Ratten beschrieben (Moreillon et al., 1995, Piroth et al., 2008, Que et al., 2005). Das erste Genom von S. lugdunensis wurde 2010 veröffentlicht (Tse et al., 2010) und ein zweites folgte 2011 (Heilbronner et al., 2011). Auf diesen Genomen findet man ein Gen, dessen Genprodukt homolog zu Fibronektin-bindenden Proteinen aus S. aureus und anderen Staphylokokken ist. Ein Fibrinogen-bindendes Protein (Fbl) ist ebenfalls in beiden Genomen kodiert und wurde zuvor schon im Detail charakterisiert (Geoghegan et al., 2010, Mitchell et al., 2004, Nilsson et al., 2004). 1.4 Fibrinogen-bindendes Protein (Fbl) von S. lugdunensis Im Gegensatz zu S. aureus sind bei S. lugdunensis nur sehr wenige potentielle Virulenzfaktoren beschrieben worden. Die Erforschung dieses Bakteriums wurde bis jetzt durch den Umstand erschwert, dass bis zu diesem Zeitpunkt noch keine Methode zur Transformation oder gezielten genetischen Manipulation beschrieben wurde und die Genome erst vor kurzem veröffentlicht wurden. 8

20 Einleitung Die Adhäsion an menschliches Gewebe ist der erste Schritt zur Besiedlung oder Infektion, und bei anderen Staphylokokken wurden Adhäsine als Virulenzfaktoren schon im Detail beschrieben. S. lugdunensis besitzt Bindungseigenschaften für Kollagen Typ I und IV, Immunoglobulin G, Fibrinogen, Laminin, Vitronektin, Fibronektin, Thrombospondin und Plasminogen (Paulsson et al., 1993). Das Protein ClfA aus S. aureus, das Fibrinogenbindung vermittelt, besitzt große Ähnlichkeit zu Fbl aus S. lugdunensis. Es handelt sich bei ClfA und Fbl um Vertreter der Gruppe der SD-Proteine innerhalb der Gruppe der MSCRAMM-Proteine (microbial surface component recognizing adhesive matrix molecules). Diese sind, wie der Name schon vermuten lässt, Oberflächenproteine, die die Adhäsion des Bakteriums an das Gewebe des Wirtes vermitteln. Sie werden nach der Translation über eine Signalsequenz aus der Zelle sezerniert und durch das Enzym Sortase an der Peptidoglykanwand verankert. Eine schematische Darstellung der Proteine ClfA und Fbl ist in Abbildung 4 zu sehen. (Mitchell et al., 2004) Abbildung 4 Vergleich der Fibrinogen-bindenden Proteine ClfA (S. aureus) und Fbl (S. lugdunensis). Die Fibrinogen-bindenden Domänen N2 und N3 sind zu 60% identisch. Die Proteine besitzen eine Signalsequenz (S), die für die Sekretion aus dem Zytoplasma verantwortlich ist. Die A-Domäne teilt sich in die Domänen N1-3 auf und ist für die Fibrinogenbindung verantwortlich. Die Repeatregion (R) durchspannt die Petidoglykanwand und präsentiert die 9

21 Einleitung bindenden Dömänen an der Oberfläche. Das LPXTG-Motiv dient der Sortase als Erkennungssequenz für die Verankerung im Peptidoglykan. Die SLAAVA-Erkennungssequenz wird in S. aureus von einer Metalloprotease erkannt und gespalten (Mitchell et al., 2004). Die Fibrinogen-bindenden Domänen N2 und N3 von ClfA und Fbl sind zu 60% identisch. Die Repeat-Region (R) ist bei S. lugdunensis geringfügig anders aufgebaut als bei S. aureus und besteht statt aus einer repetitiven SD-Sequenz aus einer repetitiven SDSDSA-Sequenz (Mitchell et al., 2004). ClfA ist bei S. aureus ein wichtiger Virulenzfaktor. Durch ClfA und dessen Bindung von gelöstem Fibrinogen und Fibrin an der Oberfläche des Bakteriums wird die Phagozytose gehemmt und das Bakterium entgeht damit dem Immunsystem (Higgins et al., 2006). Das Protein verursacht eine Verklumpungsreaktion in Blutplasma. Diese Verklumpungsreaktion wird in kommerziell erwerblichen Schnelltests zur Identifikation von S. aureus verwendet. Das Fibrinogen-bindende ClfA und das Fibronektin-bindenden FnBPA spielen eine wichtige Rolle für die Adhäsion und Invasion von Zellen in einem experimentellen Endokarditismodel (Piroth et al., 2008, Que et al., 2005, Moreillon et al., 1995). Fbl könnte für S. lugdunensis ein ähnlich wichtiger Virulenzfaktor sein wie ClfA für S. aureus. Nicht im Organismus selbst, aber mittels heterologer Expression in Lactococcus lactis und molekularbiologischen Methoden wurde das Oberflächenprotein Fbl als Fibrinogen-bindendes Protein identifiziert und beschrieben (Geoghegan et al., 2010, Mitchell et al., 2004). Für das Charakterisieren von Virulenzfaktoren im Organismus selbst, wie z.b. mit experimentellen Infektionen, ist jedoch das Erstellen von isogenen Mutanten notwendig. 10

22 Einleitung 1.5 Zielsetzung Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von D-Serintransportern in Staphylococcus saprophyticus Zu diesem Zweck sollten Allelaustauschmutanten von putativen D-Serintransportern erzeugt und diese auf ihre D-Serintransportfähigkeit hin untersucht werden. Hierfür sollte eine Methode entwickelt werden, die es erlaubt, die Aufnahme von nicht radioaktiv markiertem D-Serin zu messen, da die Möglichkeit der Messung von Radioisotopen nicht bestand. Des Weiteren sollte die Rolle der Aminosäure D-Serin und ihres Transports mit physiologischen Experimenten untersucht werden. Durch die Redundanz der putativen D-Serintransporter in S. saprophyticus 7108 erschien es notwendig, Doppelmutanten zu erstellen, um den D-Serintransport zu charakterisieren. Da hierfür kein zweiter Selektionsmarker zu Verfügung stand, sollte ein weiteres Resistenzgen für diesen Zweck etabliert werden. Staphylococcus lugdunensis ist ein Kommensal und besiedelt die menschliche Haut, kann aber auch sehr ernste Infektionen verursachen, deren Spektrum dem von S. aureus ähnelt. Es gibt keine in der Literatur beschriebene Methode, diesen Organismus zu transformieren oder genetisch zu manipulieren, was eine Erforschung dieses wichtigen Pathogens erschwert. Für diese Spezies sollte eine Methode zur Transformation und genetischen Manipulation etabliert werden, um weitere Forschung an diesem Keim zu ermöglichen. Des Weiteren soll die Verteilung der Bindungseigenschaften von S. lugdunensis zu den menschlichen Proteinen Fibrinogen und Fibronektin innerhalb der Spezies untersucht werden. 11

23 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Materialien In den folgenden Punkten werden alle Bakterienstämme, Plasmide, Oligonukleotide, Enzyme, Chemikalien, Nährmedien, Puffer, Lösungen, Verbrauchsmaterialien, Kits, Geräte und Computerprogramme, die in dieser Arbeit verwendet wurden, aufgeführt Bakterienstämme Tabelle 1: Verwendete Bakterienstämme Alle Stämme wurden als Glycerin-Kryokulturen bei -70 C konserviert. Stamm Escherichia coli Genotyp/ Beschreibung Referenz DH5α supe44, Δlac169 (Φ80 ΔlacZM15), hsdr17, reca1, gyra96, thi-1, rela1 Hanahan, 1983 DH5α pmb1455 puc18 SSP0286 mit 301 bp 5'-utr und 466 bp 3'-utr Diese Arbeit DH5α pmb1456 DH5α pmb1457 puc18 T1-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 301 bp 5'-utr und 466 bp 3'- utr von SSP0286 pbt2 T1-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 301 bp 5'-utr und 466 bp 3'- utr von SSP0286 Diese Arbeit Diese Arbeit 12

24 Material und Methoden DH5α pmb1441 puc18 SSP1070 mit 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'-utr Diese Arbeit DH5α pmb1444 DH5α pmb1447 puc18 T2-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'- utr von SSP1070 pbt2 T2-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'- utr von SSP1070 Diese Arbeit Diese Arbeit DH5α pmb1442 puc18 SSP2171 mit 595 bp 5'-utr und 364 bp 3'-utr Diese Arbeit DH5α pmb1445 DH5α pmb1448 puc18 T3-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 595 bp 5'-utr und 364 bp 3'- utr von SSP2171 pbt2 T3-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 595 bp 5'-utr und 364 bp 3'- utr von SSP2171 Diese Arbeit Diese Arbeit DH5α pmb1458 prb473 SSP1070 mit 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'- utr Diese Arbeit DH5α pmb1449 DH5α pmb1452 puc18 T1-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 301 bp 5'-utr und 466 bp 3'- utr von SSP0286 pbt2 T1-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 301 bp 5'-utr und 466 bp 3'- utr von SSP0286 Diese Arbeit Diese Arbeit 13

25 Material und Methoden DH5α pmb1450 DH5α pmb1453 DH5α pmb1451 DH5α pmb1454 puc18 T2-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'- utr von SSP1070 pbt2 T2-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'- utr von SSP1070 puc18 T3-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 595 bp 5'-utr und 364 bp 3'- utr von SSP2171 pbt2 T3-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 595 bp 5'-utr und 364 bp 3'- utr von SSP2171 Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit DH5α pmb2201 puc bp-hindiii- Fragment aus pmb2200 Diese Arbeit DH5α pmb2202 puc bp-hindiii- Fragment aus pmb2200 Diese Arbeit DH5α pmb2203 puc bp-hindiii- Fragment aus pmb2200 Diese Arbeit DH5α pmb2501 puc fbl mit 510 bp 5'-utr +486 bp 3' utr Diese Arbeit DH5α pmb2502 puc18 fbl-mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 510 bp 5'-utr und 486 bp 3'- utr von fbl Diese Arbeit 14

26 Material und Methoden DH5α pmb2503 pbt2 fbl-mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 510 bp 5'-utr und 486 bp 3'- utr von fbl Diese Arbeit DH5α pmb2504 prb473 fbl (aus DSM4804) mit 198 bp 5'-utr und 148 bp 3'-utr Diese Arbeit DH5α pmb2505 prb473 fbl (aus STLU 76) mit 198 bp 5'-utr und 148 bp 3'-utr Diese Arbeit Staphylococcus saprophyticus 7108 SSP0286, SSP1070, SSP2171, Ery S, Cm S, Tc S Gatermann et al., 1988 ATCC15305 Sequenzierter Stamm Kuroda et al., Kapsel, nicht adhärent Gatermann et al., 1989 Bo klinische Isolate Lehrstuhlbestand 7108 pmb pmb pmb1448 pbt2 SSP0286- Mutagenese-Konstrukt: ermb flankiert von 301 bp 5'- utr und 466 bp 3'-utr von SSP0286 pbt2 T2-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'- utr von SSP1070 pbt2 T3-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 595 bp 5'-utr und 364 bp 3'- utr von SSP2171 Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit 7108 ΔSSP0286 SSP0286::ermB Diese Arbeit 15

27 Material und Methoden 7108 ΔSSP1070 SSP1070::ermB Diese Arbeit 7108 ΔSSP2171 SSP2171::ermB Diese Arbeit 7108 ΔSSP1070 pmb ΔSSP1070 pmb ΔSSP2171 pmb1453 prb473 SSP1070 mit 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'- utr SSP1070::ermB pbt2 T1-Mutagenese-Konstrukt: tetk flankiert von 301 bp 5'- utr und 466 bp 3'-utr von SSP0286 SSP2171::ermB pbt2 T2-Mutagenese-Konstrukt: tetk flankiert von 419 bp 5'- utr und 447 bp 3'-utr von SSP1070 Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit 7108 pt pt181, Tc R Diese Arbeit 7108 pt181mcs 7108 pt181mcs, Tc R Diese Arbeit 7108 pmb pmb2200, Tc R Diese Arbeit Staphylococcus lugdunensis DSM4804 / ATCC43809 fbl, bindet Fg Freney et al., 1988 STLU DSM4804 pmb2503 Klinische Isolate aus Abstrichen und Blutkulturen pbt2 fbl-mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 510 bp 5'-utr und 486 bp 3'- utr von fbl (DSM4804) Lehrstuhlbestand Diese Arbeit DSM4804 Δfbl fbl::ermb Diese Arbeit DSM4804 Δfbl pmb2504 fbl::ermb prb473 fbl (aus DSM4804) mit 198 bp 5'-utr Diese Arbeit 16

28 Material und Methoden und 148 bp 3'-utr STLU 8 pmb2503 pbt2 fbl-mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 510 bp 5'-utr und 486 bp 3'- utr von fbl (DSM4804) Diese Arbeit STLU 8 Δfbl fbl::ermb Diese Arbeit STLU 8 Δfbl pmb2505 STLU 76 pmb2503 prb473 fbl (aus STLU 76) mit 198 bp 5'-utr und 148 bp 3'-utr pbt2 fbl-mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 510 bp 5'-utr und 486 bp 3'- utr von fbl (DSM4804) Diese Arbeit Diese Arbeit STLU 76 Δfbl fbl::ermb Diese Arbeit STLU 108 pmb2503 pbt2 fbl-mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 510 bp 5'-utr und 486 bp 3'- utr von fbl (DSM4804) Diese Arbeit STLU 108 Δfbl fbl::ermb Diese Arbeit Andere Staphylokokken Staphylococcus aureus Newman Humanes Hautisolat, bindet an Fg, CF + DSM20231 ATCC25804 Staphylococcus aureus Cowan Bindung an Fg und Fn, Cf + Maxe et al., 1986 Staphylococcus carnosus TM300 Bindet Fg und Fn nicht, CF - Cm S, Tc S und Ery S Wagner et al., 1986 Staphylococcus carnosus TM300 pmb2200 Staphylococcus carnosus TM300 pt181 pmb2200, Tc R pt181, Tc R Diese Arbeit Diese Arbeit 17

29 Material und Methoden Plasmide Tabelle 2: Ursprungsplasmide und rekombinante Plasmide. Plasmidname Genotyp Referenz Ursprungsplasmide puc18 bla Pharmacia pbt2 bla, cat Brucker, 1997 pec1 ermb Brucker, 1997 prb473 bla, cat Brucker, 1993 pt181 tetk, pre, repc Khan et al., 1982 pt181mcs tetk, repc, pre, mcs Augustin et al., 1992 pmb2200 tetk, pre, repc Diese Arbeit Rekombinante Plasmide pmb1455 pmb1456 pmb1457 pmb1441 pmb1444 puc18 SSP0286 mit 301 bp 5'-utr und 466 bp 3'-utr puc18 T1-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 301 bp 5'-utr und 466 bp 3'-utr von SSP0286 pbt2 T1-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 301 bp 5'-utr und 466 bp 3'-utr von SSP0286 puc18 SSP1070 mit 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'-utr puc18 T2-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'-utr von SSP1070 Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit 18

30 Material und Methoden pmb1447 pmb1442 pmb1445 pmb1448 pmb1458 pmb1449 pmb1452 pmb1450 pmb1453 pmb1451 pbt2 T2-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'-utr von SSP1070 puc18 SSP2171 mit 595 bp 5'-utr und 364 bp 3'-utr puc18 T3-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 595 bp 5'-utr und 364 bp 3'-utr von SSP2171 pbt2 T3-Mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 595 bp 5'-utr und 364 bp 3'-utr von SSP2171 prb473 SSP1070 mit 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'-utr puc18 T1-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 301 bp 5'-utr und 466 bp 3'-utr von SSP0286 pbt2 T1-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 301 bp 5'-utr und 466 bp 3'-utr von SSP0286 puc18 T2-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'-utr von SSP1070 pbt2 T2-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 419 bp 5'-utr und 447 bp 3'-utr von SSP1070 puc18 T3-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit 19

31 Material und Methoden pmb1454 pmb2201 pmb2202 pmb bp 5'-utr und 364 bp 3'-utr von SSP2171 pbt2 T3-Mutagenese- Konstrukt: tetk flankiert von 595 bp 5'-utr und 364 bp 3'-utr von SSP2171 puc bp-hindiii- Fragment aus pmb2200 puc bp-hindiii- Fragment aus pmb2200 puc bp-hindiii- Fragment aus pmb2200 Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit Diese Arbeit pmb2501 puc fbl mit 510 bp 5'-utr +486 bp 3' utr Diese Arbeit pmb2502 pmb2503 puc18 fbl-mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 510 bp 5'-utr und 486 bp 3'-utr von fbl pbt2 fbl-mutagenese- Konstrukt: ermb flankiert von 510 bp 5'-utr und 486 bp 3'-utr von fbl Diese Arbeit Diese Arbeit pmb2504 prb473 fbl (aus DSM4804) mit Diese Arbeit 198 bp 5'-utr und 148 bp 3'-utr pmb2505 prb473 fbl (aus STLU 76) mit 198 bp 5'-utr und 148 bp 3'-utr Diese Arbeit 20

32 Material und Methoden Oligonukleotide Tabelle 3: Die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide Die unterstrichenen Sequenzbereiche markieren eingefügte Schnittstellen Bezeichnung Nukleotidsequenz ( 5 3 ) Oligonukleotide zur Erstellung und Verifizierung von D-Serintransportermutanten von S. saprophyticus T1.1 seq EcoRI CGCGAATTCCATAATGCTAGAGGTACC T1.1 rev HindIII GCGAAGCTTTGGCTAATACTTGATGCG Ssa_DsTrapo1.2seq Ssa_DsTrapo1.2rev Ssa_DsTrapo1.2.1seq Ssa_DsTrapo1.2.1rev Ssa_DsTrapo1.3rev_BamHI Ssa_DsTrapo1.3seq_SacI TCATGAGGGCAATGGGAG CCAATCATCTCAATGCCG GCGCCACCGAAGTTTCAAGCG CTCCAATATAAAAATTCACAACC CACGGATCCAACAATAATATAGGTGAG AATGAGCTCAGGAGCACAAAACAGTCC T1.5 seq EcoRI GCACATATTCATAAAATAATGGCGCGAGGAGTAG T1.5.1 seq EcoRI TTAAGAATTCGCAAAGCTAGTATGTTTGTAAATA T1.5 rev HindIII AGACAAGCTTAGCCGCTTCTGCATCAACCCAAAT T2.1 seq EcoRI CGCGAATTCTGTACGTTACCTGTAGCG T2.1 rev HindIII GCGAAGCTTAGTTGGTGATGAACTAGC Ssa_DsTrapo2.2seq Ssa_DsTrapo2.2rev Ssa_DsTrapo2.3rev_BamHI Ssa_DsTrapo2.3seq_SacI CTTTGTTACTGGCTGGAC GGTATGCCAATTAGTGCG CTGGGATCCTGCCATATATAAGACTCC TTTGAGCTCTAGCATTCGTAACCTGTC T2.5 seq EcoRI GATGGAATTCACTTTCGTTTCAGCTGCAATTACC T2.5 rev HindIII GTAACAAGCTTTGTAGATGAGACGCTTGTACCAT T3.1 seq EcoRI CGCGAATTCAAGCAATATGCTGAACGC 21

33 Material und Methoden T3.1 rev HindIII GCGAAGCTTAGATGATCCAGTTTCAGC Ssa_DsTrapo3.2seq Ssa_DsTrapo3.2rev Ssa_DsTrapo3.3rev_BamHI Ssa_DsTrapo3.3seq_SacI GTTTATGCGTGCAATGGG TCATCACCGCTAATGCAC ATTGGATCCAAATCTTGCCCCAATTCC TGTGAGCTCTAAAGATGAACAAGGTGC T3.5 seq EcoRI GCGCGAATTCCTAATGGCGGTGCACAGTACAATG T3.5 rev HindIII GCTTAAGCTTTTCCATTTGGAACTGCCAGCCTGC pec1_seq pec1_rev_saci CM seq CM rev Ssa_Ko1 Ssa_Ko2 ermb1 ermb2 GAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGA GCCAGTGCCGAGCTCGCATGCCTGCAG TATGTTACAGTAATATTGACTT GACTTAGAAAACCGACTGT TCAAAAAGTTTTCTAAAAAATTTAC ACGGGCGTCCACAAAATCAATAGGA CCGTTTACGAAATTGGAACAGGTAAAGGGT GAATCGAGACTTGAGTGTGC Oligonukleotide zur Sequenzierung von pmb2200/ Klonierung von tetk ptet1-seq-seq ptet1-seq-rev ptet1.1 seq ptet1.1 rev ptet1.2 seq ptet2.1-rev ptet2-hind-1 tet1-seq BamHI tet1.1-seq BamHI tet1-rev SstI ATAAGGGTAGCCATGGCTAC AGGGTTAGGCCCTCAATAGG ATCACTCCTAAGCACAAAGG GATAGGAACAGCAGTATATGG CGGAATGTTTTTCCCTAGTTTAGG CTATCTGCTTTCACTTTGTC TGGTCGTAATGGTAAGCCAG AAAGGATCCCAGAAATTCTAGAACAC AAAGGATCCTCGATTTTTGGCAACATG TAAGAGCTCGTTAATACGTGTGCTCTG 22

34 Material und Methoden Oligonukleotide zur Erstellung und Verifizierung von fbl-knockout Mutanten von S. lugdunensis FBL1.1 Seq-EcoRI FBL1.1 rev-hindiii FBL1.1 Inv-rev-BamHI FBL1.1 Inv-seq-SstI fbl-check seq fbl-check rev fbl-check2 seq fbl-check2 rev FBL-Komp seq FBL-Komp rev FBL-Rep-seq FBL-Rep-rev FBL-ADom-seq-BamHI FBL-ADom-rev-HindIII STLU_tanA_F STLU_tanA_R FbpA_F FbpA_R AAGGAATTCTTATGGCCGGTTATCAGTCC ACTAAGCTTAGCACTCCAAATACGATAGC CTCGGATCCGATTGATATGATTATGCCCC ATCGAGCTCACTAAGTTACTATACGGGAG CGTATTATCCCAAGTAGCAACC CTTCATCGATTGTCCCAGTAGC AGTTGCCTATGTAGGCATTGG TACGGACATAGCCACCAACTG TTTGAATTCGGCTCATTTTATGTGATAGTG ATAAAGCTTTGCAAATAAGTTAACGGGAGC ACCTGTAATACCGGATCAACCGGG CAACACTTACATTATCATTTTCTG GAAGGATCCGAAGTGGAGCGTAATTTGTCA GAAAAGCTTGGTTGATCCGGTATTACAGGT AGCATGGGCAATAACAGCAGTAA GCTGCGCCAATTTGTTCTAAATAT GAGATTACTGGACAACAAACG GTATTGTGACGTCGTTTCCTG Enzyme Alle in dieser Arbeit verwendeten Enzyme wurden, soweit nicht anders angegeben, unter Verwendung der dazugehörigen Puffer und nach den Angaben des Herstellers verwendet. Alle Enzyme außer Lysostaphin (-70 C) wurden bei -20 C gelagert. 23

35 Material und Methoden Tabelle 4: Enzyme Enzyme Restriktionsendonukleasen Pfu-DNA-Polymerase T4-DNA-Ligase Taq-DNA-Polymerase Lysostaphin (Ambicin L) RNase Proteinase K Hersteller Fermentas Fermentas Fermentas Quiagen WAK-Chemie Medical GmbH Applichem Applichem DsdA (D-Serin-Deaminase) (Korte, 2011) Chemikalien Soweit nicht anders aufgeführt, wurden Chemikalien der Firmen Merck KGaA (Darmstadt), Roche Diagnostics (Mannheim), Roth (Karlsruhe), Sigma-Aldrich Chemie (Deisenhofen), AppliChem (Darmstadt), J. T. Baker (Deventer, Niederlande), Oxoid (Cambridge, England), New England Biolabs (Schwalbach) und Difco Laboratories (Detroit, USA) verwendet. Tabelle 5: Chemikalien Substanz Agar Agar Agarose Ampicillin Biotin Bromphenolblau Hersteller Oxoid Starlab AppliChem Fluka Serva 24

36 Material und Methoden Calciumpantothenat Chloramphenicol dntps EDTA Erythromycin Ethidiumbromid Fibrinogen (human) Glukose Glycerin Hefeextrakt Kanamycin Luria Broth Base Natriumdodecylsulfat (SDS) Niacin 2,4,-Dinitrophenylhydrazin Pyruvat Rinderserumalbumin (BSA) D-Serin Thymin Trimethylsilylpropionat (TSP) X-Gal Fluka AppliChem Fermentas Merck Sigma-Aldrich AppliChem Haematologic Technologies Inc. AppliChem Riedel AppliChem AppliChem Invitrogen Biomol AppliChem Acros Organics Acros Organics AppliChem Acros Organics AppliChem Sigma-Aldrich Roth Nährmedien Die hier aufgeführten Medien außer CDM wurden 20 min bei 121 C autoklaviert. Hitze-labile Komponenten wie z.b. Antibiotika wurden sterilfiltriert und nachträglich zugesetzt. 25

37 Material und Methoden Lysogenic Broth (LB) 25 g Luria Broth Base ad 1000 ml H 2 O LB-Agar 1000 ml LB 16 g Agar Pepton-Yeast (PY) 10 g Spezialpepton 5 g Hefeextrakt 1 g Glukose 5 g NaCl 1 g Na 2 HPO 4 ad 1000 ml H 2 O PY-Agar 1000 ml PY 12 g Agar Soja-Bouilon 30 g Tryptone Soya Broth (Oxoid) ad 1000 ml A.dest, autoklaviert Blutagarplatten 31,2 g Columbiaagar ad 800 ml A.dest, autoklaviert 32 ml Schafsblut (nach Abkühlen) 26

38 Material und Methoden Chemisch definiertes Medium - CDM (Korte, 2011) Salt Solution: 7 g K 2 HPO 4 2 g KH 2 PO 4 0,4 g Natriumcitrat 0,05 g MgSO 4 1 g (NH 4 )SO 4 ad 200 ml A.dest Aminosäure-Stammlösungen: 5 mg/ml L-Arginin in A.dest 10 mg/ml L-Glutam in in A.dest 5 mg/ml L-Glycin in A.dest 2 mg/ml L-Histidin in A.dest 9 mg/ml L-Leucinin 0,1 M HCl 5 mg/ml L-Lysinin 0,1 M NaOH 0,3 mg/ml L-Methionin in A.dest 4 mg/ml L-Phenylalanin in 0,1 M NaOH 8 mg/ml L-Prolin in 0,1 M HCl 3 mg/ml L-Threonin in A.dest 1 mg/ml L-Tryptophan in 1/10 Vol 25% Ammoniaklösung und weiterverdünnen in A.dest 5 mg/ml L-Valin in A.dest Amino Mix: Alle AS wurden zu gleichen Teilen gemischt, sterilfiltriert, portioniert und eingefroren. Natriumthiosulfatlösung 10 mg/ml Natriumthiosulfat in A.dest sterilfiltriert und bei 4 C im Kühlschrank gelagert 27

39 Material und Methoden Sörensens-Phosphatpuffer (0,1 M ph 8,0) 9,4 ml K 2 HPO 4 0,6 ml KH 2 PO 4 ad 100 ml A.dest Thyminlösung 0,2 mg/ml Thymin in Sörensens-Phosphatpuffer ph 8,0 sterilfiltriert und bei 4 C im Kühlschrank gelagert Mineral-Stammlösungen 5 mg/ml Fe 2+ SO 4 10 mg/ml CaCl 2 7 mg/ml ZnCl2 13 mg/ml NiSO 4 6H 2 O 10 mg/ml MnCl 2 Mineral Mix 1 ml je Mineral-Stammlösung ad 10 ml A.dest sterilfiltriert und bei 4 C im Kühlschrank gelagert Vitamin-Stammlösungen 10 mg/ml Thiamin in 0,05 M NaOH 12 mg/ml Niacin in 0,05 M NaOH 2,5 mg/ml Calciumpantothenat in 0,05 M NaOH 2,5 mg/ml Biotin in 0,05 M NaOH Vitamin Mix 1 ml je Vitamin-Stammlösung ad 10 ml A.dest sterilfiltriert und bei -20 C im Kühlschrank gelagert 28

40 Material und Methoden CDM 2 ml Salt Solution 1 ml Amino Mix 0,5 ml Natriumthiosulfatlösung 1 ml Thyminlösung 0,1 ml Mineral Mix ad 10 ml A.dest Vor Gebrauch wurden 50 µl Vitamin Mix hinzugegeben. Je nach Versuchsaufbau wurden Kohlenstoffquellen (Pyruvat, Glukose oder D-Serin) hinzugefügt. Tabelle 6: Nährmedienzusätze Diese Substanzen wurden vor dem Beimpfen dem Flüssigmedium bzw. nach dem Autoklavieren vor dem Gießen von Agarplatten bei 50 C hinzugefügt. Substanz Stammkonzentration gelöst in Endkonzentration Ampicillin 100 mg/ml in H 2 O 100 µg/ml Chloramphenicol 20 mg/ml in EtOH 20 µg/ml Erythromycin 10 mg/ml in H 2 O 10 µg/ml Tetracyclin 10 mg/ml in H 2 O 10 µg/ml X-Gal 50 mg/ml in DMSO 40 µg/ml D-Serin 1 M (105,09 g/l) Versuchsabhängig Pyruvat 1 M (88,06 g/l) Versuchsabhängig 29

41 Material und Methoden Puffer und Lösungen 10X PBS-Puffer 80 g NaCl 2 g KCl 14,4 g Na 2 HPO 4 (2H 2 O) 2,4 g KH 2 PO 4 ad 1000 ml H 2 O, ph 7,4, autoklaviert 1X PBS-Puffer 100 ml 10XPBS-Puffer ad 1000 ml H 2 O Verbrauchsmaterialien Tabelle 7: Verbrauchsmaterialien Verbrauchsmaterialien Antibiotikaplättchen E-Teststreifen Kryo-Röhrchen Mikrotiterplatten Mikrotiterplatten Fibronektin Membranfilter Hersteller Oxoid Biomerieux Greiner Greiner BD Biocoat TM Millipore 30

42 Material und Methoden Kits Tabelle 8: Verwendete Kits Verwendungszweck Firma Produktname Plasmidisolation Macherey-Nagel Qiagen NucleoSpin Plasmid Plasmid Midi Kit PCR-Aufreinigung Macherey-Nagel NucleoSpin ExtractII Isolierung chromosomale DNA Sondenherstellung für Southern-Blot Identifikation von S. aureus (Clumpingfaktortest) Macherey-Nagel Roche OxoiD NucleoSpin Tissue Dig Probe Synthesis Kit Staphytect Plus Geräte Tabelle 9: Verwendete Geräte Die Kleingeräte, die hier nicht aufgeführt wurden, entsprechen der Laborstandardausrüstung. Geräte Modell/Spezifikationen Hersteller Varifuge 3.0RS Tragringrotor Radius 19,4 cm Zentrifugen Biofuge stratos Rotor #3332 Radius 8,7 cm, Winkel 45 Rotor #3336 Radius 9,8 cm, Winkel 23 Heraeus Instruments 31

43 Material und Methoden Biofuge pico Rotor: #3325 Radius 8,5 cm, Winkel 40 PCR-Maschinen Thermomixer Mastercycler personal Mastercycler epgradient Thermomix compact Eppendorf (Hamburg) Geldokumentationsanlage Gel Doc TM XR+ Bio-RAD UV-Tisch translumtor UVp, inc. Spektral-Photometer Utrospec 2100 pro Eppendorf Brutschrank Funktionline Heraeus Instruments Feinwaage AE 100 Mettler (Giessen) Sartorius ph-meter SevenEasy Mettler Toledo (Giessen) Gelkammer RennerGMBH Gelkammer (PFGE) Chef-DR III System Biorad Wasseraufbereitungsanlage Purelab classic Elga Schüttelbrutschränke Innova TN 4330 New Brunswick Scientific Sterilbank HeraSave Heraeus Instruments Digitale Spiegelreflex Kamera mit Objektiv Eos 350D 50 mm, 1:2,8 DG Macro Canon (Kamera) Sigma (Objektiv) Computerprogramme Das Programm MestReNova v (Mestrelab Research S.L.) wurde zur Auswertung der erhaltenen 1 NMR-Spektren verwendet. Für die bioinformatische Auswertung von DNA und Proteinsequenzen wurden die Programme BLAST( TMHMM ( 32

44 Material und Methoden und ClustalW2 ( benutzt. Zur Dokumentation und Auswertung von Agarosegelen wurde das Programm Multi-Analyst bzw. Molekular-Analyst verwendet. Die aus Sequenzierungen erhaltenen Daten wurden mit Emboss in Linux ausgewertet. 2.2 Methoden Anzucht von Bakterien Staphylokokken- und E. coli -Kulturen wurden, wenn nicht anders angegeben, für 18 h bei 37 C im Brutschrank, Schüttelbrutschrank oder Schüttelwasserbad angezogen. Um auf plasmid- oder genomkodierte Resistenzen zu selektionieren, wurden den Medien vor der Benutzung bzw. vor dem Gießen der Agarplatten die entsprechenden Antibiotika in den in Tabelle 5 angegebenen Endkonzentrationen zugesetzt Erstellung von Kryokulturen Um Bakterienstämme dauerhaft zu lagern, wurde Zellmaterial von einer ün bewachsenen Blutagarplatte mit einem Wattetupfer in ein Kryo-Röhrchen mit einem ml Einfriermedium eingerieben und bei -70 C gelagert. Einfriermedium 3,7 g BHI-Bouillon Oxoid CM ml Glycerin (86-88%) ad 100 ml A.dest, autoklaviert Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli 2 ml einer ÜK wurden in einem 2 ml Reaktionsgefäß 1 min bei g zentrifugiert, so dass sich die Zellen in einem Pellet sammelten und das Medium verworfen werden konnte. Um mehr Plasmid-DNA zu erhalten, wurde 33

45 Material und Methoden dieser Schritt einmal wiederholt, so dass das Sediment die Zellen aus 4 ml Kultur enthielt. Das Medium wurde möglichst restlos abgenommen. Die Zellen wurden in 300 µl Puffer1 resuspendiert. Danach wurde 300 µl Puffer2 hinzu gegeben, mehrfach invertiert und max. 5 min inkubiert, um die Zellen zu lysieren. 300 µl Puffer3 wurden hinzugefügt und für 10 Minuten inkubiert, um die Zelltrümmer von der Plasmid-DNA zu trennen. Dann wurde das 2 ml Reaktionsgefäß bei g 10 min zentrifugiert und der Überstand in ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und nochmals zentrifugiert, so dass sich keine Zelltrümmer oder Proteine mehr im Gefäß befanden. Dieser Schritt kann bei starker Verunreinigung wiederholt werden. Der Probe wurde nun 630 µl Isopropanol (das 0,7x Volumen des abgenommenen Überstands) hinzugegeben, um die Plasmid-DNA zu fällen. Die Lösung wurde bei g für 25 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das DNA-Pellet wurde in 1 ml 70% Ethanol gewaschen und bei 50 C in einem Thermoblock getrocknet. Als das Ethanol restlos verdampft war, wurde die DNA in µl 1/10x TE oder A. dest. aufgenommen. Puffer1 5 ml Tris-HCl (1 M, ph 8) 2 ml EDTA (0,5 M, ph 8) ad 100 ml autoklaviert 1 ml Rnase A (1 mg/ml), bei 4 C im Kühlschrank gelagert Puffer2 10 ml SDS (10%(w/v)) 1 ml NaOH (10 M) ad 100 ml H 2 O, Lagerung bei RT (niemals kalt!) Puffer3 29,03 g Kaliumacetat ad 100 ml A.dest, ph 4,8 mit Eisessig einstellen, autoklaviert und bei 4 C gelagert 34

46 Material und Methoden Isolierung von Plasmid-DNA aus Staphylokokken Für die Isolierung von Plasmid-DNA aus Staphylokokken wurde das Plasmid Midi Kit (Qiagen) benutzt. Hierfür wurden 100 ml LB mit dem entsprechenden AB versehen, mit dem plasmidtragenden Stamm beimpft und ün angezogen. Die Zellen wurden zu 50 ml in Falcontubes bei 3500 g und 4 C 10 min zentrifugiert. Die Pellets wurden in 4 ml Puffer P1 aufgenommen, 100 µl Lysostaphin (5 mg/ml) hinzugegeben und bei 37 C inkubiert, bis die Lösung deutlich klarer geworden war (ca. 30 min). Nach diesem Schritt wurde die Methode nach den Angaben des Herstellers durchgeführt Isolierung von chromosomaler DNA aus Staphylokokken Es wurden 1,5-3 ml einer ÜK bei g sedimentiert, der Überstand verworfen und die Zellen in 180 µl ATL-Staph aufgenommen. Durch die Zugabe von 20 µl Lysostaphin (5 mg/ml) wurde die Peptidoglycanschicht bei 37 C abgebaut, bis die Zellsuspension fast klar war. Danach wurde das NucleoSpin Tissue-Kit mit den dazugehörigen Puffern und nach den Angaben des Herstellers verwendet. ATL-Staph 1 ml Tris (1 M, ph 8) 0,2 ml EDTA (0,5 M) 0,6 ml Triton X-100 ad 50 ml A.dest, autoklaviert Staphylokokkenlyse für PCR nach Reischl Es wurde Zellmaterial in 200 µl Reischl Lysis-Puffer gelöst und für 10 min im Wasserbad bei 100 C gekocht. Die Lösung wurde danach für 2 min bei g zentrifugiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Von dieser Lösung wurden 4 µl für bei der PCR-Reaktion als Matrize eingesetzt. 35

47 Material und Methoden Reischl Lysis-Puffer 0,5 ml 0,5% Tween 20 1 ml Tris (1 M, ph 8) 0,2 ml EDTA (0,5 M) 1 ml Triton X-100 ad 100 ml A.dest, autoklaviert Polymerasekettenreaktion (PCR) Mit der Polymerasekettenreaktion ist es möglich, ausgewählte Bereiche aus einer Matrize, z.b. einem Genom, zu amplifizieren. Es binden Oligodesoxinukleotide, so genannte Primer, die Nukleotide lang sind, an homologe Sequenzen eines DNA-Stranges (Hybridisierung). Diese Fragmente dienen der in den Versuchen verwendeten Polymerase als Startpunkt für die Elongation. Dieser Vorgang kann je nach Art der eingesetzten Polymerase und Größe des zu amplifizierenden DNS-Bereichs einige Minuten dauern. Durch die Erhöhung der Temperatur wird die Kopie von der Matrize gelöst, und es können sich nach Abkühlung neue Primer an die Matrizen binden. Dieser Vorgang wurde bis zu 35mal wiederholt. Mit dieser Methode kann der gewünschte Bereich der Matrize vervielfältigt werden. In dieser Arbeit wurde die PCR dazu benutzt, um Bereiche von einer Matrize zu amplifizieren und in Vektoren zu klonieren. Hierfür wurde die Pfu-Polymerase (ca. 1 kb/min) verwendet. Des Weiteren wurde diese Methode dazu benutzt, um die An- oder Abwesenheit bestimmter DNS- Sequenzen nachzuweisen. Dafür wurde die Taq-Polymerase (ca. 2 kb/min) verwendet. 36

48 Material und Methoden Tabelle 10: Konzentrationen der Reaktionskomponenten der PCR Reaktions- Stamm- Menge für 25 µl Menge für komponente konzentration Ansatz 100 µl Ansatz Oligonukleotide 1 20 pmol /µl 1,5 µl 5,0 µl Oligonukleotide 1 20 pmol /µl 1,5 µl 5,0 µl Polymerasepuffer 10x Lösung 2,5 µl 10,0 µl dntp-mix 1,25 mm je dntp 4,0 µl 16,0 µl Matrizen-DNA 50 pg 0,5-4,0 µl 0,5-4,0 µl Pfu/Taq-Polymerase 5 U/µl 0,25 µl 0,5 µl A.dest (autoklaviert) 55,55 M 20 µl 20 µl Tabelle 11: PCR-Programm Schritt Temperatur in C Dauer Initiale Denaturierung min Denaturierung s Hybridisierung s abhängig vom T m der Prime x 35 (T= T m Primer 5 C) Elongation 72 0,5-5 min Letzte Elongation 72 5 min Kühlung der Probe 4-10 bis Entnahme der Probe Nach Ende der Polymerasekettenreaktion wurde mittels Gelelektrophorese ermittelt, ob Amplifikate entstanden sind und welche Größe diese aufwiesen. 37

49 Material und Methoden Präzipitation von DNA Ethanolfällung Bei der Ethanolfällung wird die Eigenschaft des Alkohols genutzt, die Hydrathülle einer in wässriger Lösung vorliegenden Nukleinsäure zu verdrängen. In Gegenwart von Kaliumacetat fällt die DNA als Kaliumsalz aus. DNA-haltige, wässrige Lösungen wurden mit 2,5 Volumen eiskaltem Ethanol (abs.) und 0,1 Volumen 3 M Kaliumacetat vermischt und für 30 min bei -80 C oder ü.n. bei -20 C gelagert. Die als Kaliumsalz präzipitierte DNA wurde durch Zentrifugation (15 min, g, EZ, RT) sedimentiert und überschüssige Salze durch Waschen mit 500 μl 70% (v/v) Ethanol entfernt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (5 min, g, EZ, RT) wurde die DNA an der Luft oder bei 50 C getrocknet und anschließend in 0,1 x TE-Puffer aufgenommen Isopropanolfällung Bei der Isopropanolfällung wurde die DNA-haltige, wässrige Lösung mit 0,7 Volumen Isopropanol (abs.) versetzt, gut durchgemischt und die präzipitierte DNA durch Zentrifugation (25 min, g, EZ, RT) sedimentiert. Anschließend wurde die DNA mit 500 μl 70% (v/v) Ethanol gewaschen, nach einem weiteren Zentrifugationsschritt (5 min, g, EZ, RT) an der Luft oder bei 50 C getrocknet und anschließend in 0,1 x TE-Puffer aufgenommen Restriktion von DNA Endonukleasen vom TypII schneiden DNA durch hydrolytische Spaltung an kurzen, definierten Nukleotidsequenzen. Sie binden an diesen enzymspezifischen Erkennungsstellen und hydrolysieren innerhalb dieser Sequenz. Der Verdau von Plasmid- und genomischer DNA mit Restriktionsenzymen wurde bei der vom Hersteller angegebenen Temperatur und unter Verwendung der dazugehörigen Puffer durchgeführt. Plasmide, PCR- Amplifikate und genomische DNA wurden in der Regel für 1-3 Stunden inkubiert. 38

50 Material und Methoden Agarose-Gelelektrophorese Bei der Agarose-Gelelektrophorese werden DNA-Stränge der Länge nach aufgetrennt. Dabei wird eine Stromquelle an ein TAE- oder TBE-Pufferbad angeschlossen, wobei zu beachten ist, dass der negative Pol auf der Seite der Geltaschen und der positive Pol auf der anderen Seite angeschlossen wird. Da DNS wegen ihres Zucker-Phosphatrückgrats negativ geladen ist, wandert sie in Richtung des positiven Pols. Die Auftrennung von DNA-Fragmenten basiert auf der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit im Agarosegel. Diese hängt von der Länge und Konformation des DNS-Fragments, der Gelstärke (Agarosekonzentration) des Gels und der Spannungshöhe des elektrischen Feldes ab. Je länger das Fragment und je höher die Agarosekonzentration, umso langsamer die Wanderungs-geschwindigkeit. Die in den Versuchen verwendeten Agarosegele waren 0,9%ig, wenn es nicht anders angegeben ist. Der DNA-Probenpuffer lässt die DNA in die Geltasche absinken und zeigt die Laufweite der 500 bp-bande an (Bromphenolblau). Die Gele wurden mindestens 15 Minuten im Ethidiumbromidbad gefärbt oder dieser Farbstoff wurde direkt vor dem Gießen des Gels in die noch flüssige Agaroselösung gegeben. Dies ist notwendig, um die DNA später sichtbar zu machen. Ethidiumbromid interkaliert an der DNA und fluoresziert nach UV- Anregung. Um die Fragmentgröße zu bestimmen, wurde der 1 kb-ladder DNA- Standard der Firma Fermentas neben den Proben aufgetragen. Tabelle 12: Puffer zur Gelelektrophorese Puffer Inhaltsstoff Menge 50x TAE Tris (2 M) Natriumacetat (500 mm) EDTA (50 mm) 243 g 68 g 18,61 g Der ph-wert wird mit Eisessig auf 7,8 eingestellt Add ml A. dest. 39

51 Material und Methoden 10x TBE Tris Borsäure EDTA 108 g 55 g 8,4 g auf ph 7,8 mit konzentrierter Essigsäure ad ml A. dest. BPB-Probenpuffer (10 ml) Lagerung bei 4 C 50x TAE oder 10x TBE Glycerin BPB A. dest 0,2 ml 1 ml 5 ml 1 ml 3,8 ml (bei TAE) 3,0 ml (bei TBE) Southern Blot Diese Methode wurde in der Arbeit dazu verwendet, um erzeugte Mutationen im Genom von Staphylokokken zu verifizieren. Bevor der eigentliche Blot durchgeführt wurde, musste chromosomale DNA der zu untersuchenden Stämme isoliert und mit einem Restriktionsenzym verdaut werden. Des Weiteren musste eine Sonde mittels PCR hergestellt werden, die komplementär zu dem Bereich des Genoms ist, den man mit dem Blot nachweisen will. Hierzu wurde das Dig Probe Synthesis Kit (Roche, Mannheim) verwendet. Die verdaute gdna wurde durch Agarose-Gelelektrophorese in einem 1%igen Gel aufgetrennt. Dieses Gel wurde auf eine Nylonmembran gelegt, so dass die DNA unter Verwendung eines Vakuum-Blotters (Biometra) aus dem Gel auf die Membran geblottet werden konnte. Dabei wurde die Oberfläche des Blotters mit einer Maske abgedichtet, so dass die im weiteren Verlauf aufgetragenen Lösungen durch das Gel und die Nylonmembran gezogen wurden. Das Vakuum wurde angelegt und das Gel mit folgenden Lösungen überschichtet min mit Depurinierungslösung - 20 min mit Denaturierungslösung 40

52 Material und Methoden - 20 min mit Neutralisierungslösung min mit 20x SSC Bei diesem Vorgang war darauf zu achten, dass der Blot nicht trocken lief. Durch diese Schritte wurde die DNA aus dem Gel auf die Membran übertragen. Danach wurde diese für 20 min bei 120 C gebacken, um die DNA darauf zu fixieren. Der Blot wurde für 1 h mit ca. 25 ml Hybridisierungs-lösung in einem 50 ml Falkon-Gefäß bei 42 C im prähybridisiert. Ü.N. wurde der Blot mit 45 µl der DIG-markierten Sonde in 20 ml Hybridisierungslösung bei 42 C inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Membran gewaschen. - 2x 5 min bei RT in 25 ml 2x SSC / 0,1% (w/v) SDS dann entweder stringent gewaschen: - 2x 15 min bei 68 C in 25 ml 0,1x SSC / 0,1% (w/v) SDS oder unstringent gewaschen: - 2x 60 min bei RT in 25 ml 2,0x SSC / 0,1% (w/v) SDS Danach wurde der Blot für die Detektion vorbereitet. Die nächsten Schritte fanden, wenn nicht anders angegeben, bei RT statt. - 5 min waschen in Waschpuffer - Inkubation für 30 min in 20 ml Block-Lösung - Inkubation für 30 min in 20 ml Antikörper-Lösung - 2x 5 min in Waschpuffer waschen min Equilibrierung in 20 ml Detektionspuffer Die Membran wurde anschließend auf eine zurechtgeschnittene Klarsicht-folie gelegt (Seite mit der DNA nach oben), die CSPD-Lösung wurde hinzugegeben und der Blot mit einer zweiten Folie bedeckt. Dabei war darauf zu achten, dass sich keine Luftblasen unter der Folie befinden. Die überschüssige Lösung wurde herausgedrückt und der Blot für 10 min bei 37 C inkubiert. Danach wurde der Blot zusammen mit einem Film inkubiert und dieser dann entwickelt. 41

53 Material und Methoden Tabelle 13: Lösungen und Puffer für den Southern Blot Puffer/Lösung Inhalt Menge Depurinierungslösung HCl (0,25 M) 5 ml konz. HCl ad 250 ml A.dest Denaturierungslösung NaCl (1,5 M) NaOH (0,5 M) 21,94 g 5 g ad 250 ml A.dest Neutralisierungslösung Tris (1 M) NaCl (3 M) 30,25 g 43,83 g ad 250 ml A.dest ph 8,0 mit HCl einstellen 20x SSC Transferpuffer NaCl (3 M) NaCitrat (0,3 M) 175,48 g 88,2 g ad 1000 ml A.dest, ph 7,0 Hybridisierungslösung Maleinsäurepuffer (10x) Maleinsäure (0,1 M) NaCl (0,15 M) 11,6 g 8,77 g ad 1000 ml, ph mit NaOH auf 7,5 einstellen Block-Stammlösung(10x) Block Reagenz 10% (w/v) in 1xMaleinsäurepuffer, autoklavieren Block-Lösung Waschpuffer Antikörper-Lösung Block Stammlösung(10x) Maleinsäurepuffer (1x) Tween 20 (0,3% [w/v]) Maleinsäurepuffer (1x) Block-Lösung Anti-Digoxigenin-AP(Roche) (1:10000 = 75 mu/ml) 100 ml 900 ml 0,6 g 200 ml 20 ml 2 µl 42

54 Material und Methoden Detektionspuffer Tris-HCl (0,1 M) NaCl (0,1 M) 1,21 g 0,58 g ad 100 ml A.dest, ph mit HCl auf 9,5 einstellen Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Die DNA-Mengen in Agarosegelen wurden mit Hilfe des DNA-Molekulargewichtsstandards der Firma Fermentas abgeschätzt oder mit dem Photometer gemessen Ligation von DNA-Fragmenten Die T4-DNA-Ligase kann unter ATP-Verbrauch sowohl kompatibel überstehende Enden ( sticky ends ) als auch glatte Enden ( blunt ends ) über Phosphodiesterbindungen miteinander verbinden. Alle Ligationen wurden in dieser Arbeit für 1-3 h in 20 µl Ansätzen bei RT oder ün im Wasserbad bei 12 C mit dem vom Hersteller mitgelieferten Puffer durchgeführt. Die Ligation eines Fragments in ein Plasmid wurde in einem molaren Verhältnis 3-5:1 durchgeführt Herstellung transformationskompetenter E. coli Zellen Zur Herstellung transformationskompetenter E. coli Zellen wurde der Stamm DH5α verwendet. Ein Kolben mit 100 ml LB-Flüssigmedium wurde mit einer ÜK auf eine od 600 = 0,05 angeimpft. Dieser wurde bei 37 C auf einem Schüttler mit 200 rpm inkubiert, bis die Kultur eine od 600 = 0,5 erreicht hatte. Danach inkubierten die Zellen für 10 min auf Eis, bevor sie für 5 min bei 3500 g und 4 C sedimentiert wurden. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 50 ml 50 mm CaCl 2 aufgenommen und 1h auf Eis inkubiert 43

55 Material und Methoden Nach erneuter Zentrifugation für 5 min bei 3500 g und 4 C wurde wiederum der Überstand verworfen und die Zellen in 5 ml 50 mm CaCl 2, 15% Glycerin aufgenommen. Diese Zellen wurden in 200 µl Aliquots bei -80 C gelagert Transformation von E. coli Zu einem 200-µl-Aliquot transformationskompetenter Zellen wurde 10 µl eines Ligationsansatzes oder ca. 100 ng Plasmid-DNA gegeben. Nach einer Inkubation von 30 min auf Eis wurden die Zellen für 90 sec bei 42 C einem Hitzeschock ausgesetzt. Anschließend wurden 800 µl LB-Medium in das Gefäß gegeben und die Zellen bei 37 C für min auf einem Brutroller oder Eppendorf Thermomixer zur Etablierung der Antibiotikaresistenz inkubiert (phänotypische Expression). Diese Kulturen wurden danach bei g für 1 min abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Zellen auf dem entsprechenden Selektionsmedium ausplattiert Protoplastentransformation von S. saprophyticus und S. lugdunensis Diese abgeänderte Methode basiert auf der Grundlage der Protoplastentransformation von S. saprophyticus nach Gatermann (S Gatermann & Marre 1989). Die zu transformierenden Stämme wurden aus Stammkultur auf Blutagarplatten ausgestrichen und ün bei 37 C bebrütet. Am nächsten Tag wurden 5 ml PY mit diesem Stamm beimpft und für 6 h bei 37 C und 90 rpm inkubiert. Aus dieser Kultur wurde die 20 ml PY Hauptkultur angeimpft, die ün bei 120 rpm und 38 C (S. saprophyticus) bzw. 44 C (S. lugdunensis) angezogen wurde. Die Zellen wurden am nächsten Tag bei 5400 g für 10 min bei RT abzentrifugiert und das Pellet in 20 ml SoMMP + 1 ml BSA (5%, sterilfiltriert) aufgenommen und in einen sterilen Erlenmeyerkolben gegeben. Es wurden 100 µl der Bakteriensuspension entnommen und in einer Küvette mit 900 µl A.dest gemischt und die od 600 gemessen. Nach Zugabe von µl Lysostaphin (5 mg/ml) wurde die Bakteriensuspension bei 30 C und 90 rpm so 44

56 Material und Methoden lange inkubiert, bis die od 600 auf die Hälfte bis ein Drittel des Ausgangswertes gefallen war. Die Protoplastensuspension wurde in sterile Glasröhrchen gefüllt und bei 5400 g für 10 min bei RT zentrifugiert. Das Pellet wurde in 7 ml SoMMP gewaschen und erneut wie zuvor abzentri-fugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen in 2 ml SoMMP aufge-nommen und zu je 300 µl auf sterile Glasröhrchen verteilt. Die Protoplasten wurden durch die Zugabe von ca. 3-6 µg des zu transformierenden Plasmides und der sofortigen Zugabe von 2 ml PEG (40%, in SoMMP) transformiert. Dem Transformationsansatz wurde 7 ml SoMMP hinzugefügt und durch Invertieren gemischt. Es folgte eine Zentrifugation mit 5400 g für 10 min bei RT. Das Pellet wurde in 2 ml SoMMP aufgenommen und auf 3 DM3-Agarplatten mit einem Glasspatel verteilt. Die Platten wurden für 4 6 h bei 30 C inkubiert. In dieser Zeit wurde der CY- Overlayagar vorbereitet. Der CY-Agar wurde im Dampftopf gelöst und je 5 ml mit 5 ml 1M Na-Succinatpuffer (52 C) gemischt. Kurz vor Gebrauch wurden 0,8 ml CY-Transformationsmix und 108 µl des Antibiotikums (Chloramphenicol oder Tetracyclin) hinzugegeben. Jede Platte wurde mit je 3 ml Overlayagar beschichtet. Nach dem Abkühlen der DM3-Agarplatten wurden diese bei 30 C für ca. 7 Tage inkubiert. Medien und Puffer für Protoplastentransformation DM3-Agar 5,0 g Bacto Agar 2,5 g Hefeextrakt 175 ml A.dest autoklaviert und bei 4 C gelagert, Zugabe von 250 ml 1M Na-Succinat 50 ml Casamino acid (5%, in A.dest, autoklaviert) 5 ml Phosphatpuffer (10x) im Dampftopf gelöst und auf 56 C abgekühlt, vor dem Gießen Zugabe von 5 ml Glucose (50%, in A.dest, sterilfiltriert) 45

57 Material und Methoden 10 ml MgCl 2 (in A.dest, sterilfiltriert) 5 ml BSA (5%, sterilfiltriert) CY-Overlayagar 10 g Caseinhydrolysat 10 g Hefeextrakt 5,9 g NaCl 4 g Agar ad 400 ml A.dest zu je 50 ml aliquotiert, autoklaviert und bei 4 C gelagert. CY-Transformationsmix 20 ml 1 M MgCl 2 10 ml 50% Glukose, sterilfiltriert 40 ml 1,5 M Glycerolphosphat 10 ml 5% BSA, sterilfiltriert SoMM 182,2 g Sorbitol 4,64 g Maleinsäure 8,13 g Magnesiumchlorid ad 1000 ml A.dest, ph 6,5 mit NaOH einstellen PAB 70 g Difco Antibiotic Medium No 3 ad 1000 ml A.dest, autoklaviert Phosphatpuffer 10x 22,85 g Di-Kaliumhydrogenphosphat x 3H 2 O 7,5 g Kaliumhydrogenphosphat 46

58 Material und Methoden ad 500 ml A.dest, autoklaviert Succinatpuffer 270,15 g Bernsteinsäure-di-Natriumsalz x6h 2 O ad 1000 ml A.dest, ph 7,5 mit Bernsteinsäure eingestellt, autoklaviert PEG 40% (in SoMM) 40 g PEG6000 ad 100 ml SoMM, autoklaviert Glucose 50% 50 g Glukose ad 100 ml A.dest, sterilfiltriert Casaminoacids 5% 12,5 g Casaminoacids ad 250 ml A.dest, autoklaviert Protoplastentransformation von S. carnosus TM300 Medien und Lösungen für die Protoplastentransformation von S. carnosus TM300 (Götz et al. 1983) sind, wenn nicht anders angegeben, identisch mit dem Protokoll für Protoplastentransformation von S. saprophyticus und S. lugdunensis. Eine Vorkultur mit 10 ml PY wurde mit S. carnosus TM300 beimpft und ün bei 37 C bei 100 rpm bebrütet. Die 300 ml PY Hauptkultur wurde mit 3 ml der Vorkultur beimpft und bei 37 C bis zu einer od 600 = 0,3-0,35 angezogen. Die Zellen wurden 10 min bei 3500 g und 18 C in 50 ml-falcontubes pelletiert und in 15 ml SMMP resuspendiert. Je 30 ml der Zellsuspension wurden in einen 100 ml-kolben gegeben und ün bei 30 C (ohne Schütteln) mit je 20 µl, 40 µl 47

59 Material und Methoden und 80 µl Lysostaphin (1 mg/ml) inkubiert. Die nun klare Suspension wurde am nächsten Tag für 30 min bei 5400 g und 18 C in Glasröhrchen zentrifugiert und das Protoplastenpellet vorsichtig in 2 ml SMMP durch Schütteln aufgenommen. Die Protoplastensuspension wurde mit einer Glaspipette zu je 300 µl portioniert und konnte nun entweder sofort für die Transformation eingesetzt oder bei - 80 C eingefroren werden, um sie zu einem anderen Zeitpunkt einzusetzen. Zu je 300 µl der Protoplastenlösung der 3 unterschiedlichen Verdauansätze wurden 30 µl des zu transformieren Plasmids oder eines Ligationsansatzes gegeben und sofort danach 2 ml 40% PEG6000 in SMM hinzu pipettiert. Nach 2 min Inkubation bei RT wurde 7 ml SMMP hinzugegeben und der Ansatz durch Invertieren gemischt. Die Zellen wurden dann bei 18 C und 702 g für 30 min sedimentiert, in 2 ml SMMP aufgenommen und in je 300 µl Portionen mit einem Drigalskispatel auf DM3-Agarplatten verteilt. Die Überschichtung mit CY- Overlayagar erfolgt, wie in Protoplastentransformation von S. saprophyticus und S. lugdunensis beschrieben, nach 4-6 h Inkubation bei 30 C. SMMP 342,3 g Saccharose 4,64 g Maleinsäure 8,13 g Magnesiumchlorid ad 1000 ml A.dest, ph 6,5 mit NaOH einstellen PEG 40% (in SMM) 40 g PEG6000 ad 100 ml SMM, autoklaviert Homologe Rekombination und Plasmid-Curing von pbt2 Der bei der Protoplastentransformation erhaltene Stamm wurde auf PY-Agar mit Erythromycin (5 µg/ml) überstrichen und bei 30 C ün bebrütet. Am Folgetag wurde eine 20 ml PY-Kultur von dieser Platte angeimpft und bei 30 C 48

60 Material und Methoden und 90 rpm ün geschüttelt. Aus dieser Kultur wurden 2,5 ml entnommen und in 500 ml, auf 44 C vorgewärmtes PY-Medium mit Erythromycin (5 µg/ml) gegeben. Diese Kultur wurde ün bei 44 C und 120 rpm inkubiert. Am nächsten Tag wurde mit dieser Kultur eine neue 500 ml PY-Kultur angeimpft und ün geschüttelt. Durch dieses Vorgehen werden die Zellen vermehrt, ohne dass sich der pbt2 Vektor replizieren kann, da er einen hitzelabilen origin of replication besitzt. Von der letzten Kultur ausgehend wird eine Verdünnungsreihe in PY-Medium angelegt und auf PY-Agar mit Erythromycin (5 µg/ml) ausplattiert. Diese Platten wurden bei 42 C ca h bebrütet und einzelne Kolonien auf 1. PY-Agar mit Erythromycin (5 µg/ml) und 2. PY-Agar mit Chloramphenicol (20 µg/ml) parallel gepickt. Diese Platten wurden ün bei 42 C bebrütet. Potentielle Kandidaten für eine erfolgreiche Allelaustaschmutante wuchsen mit Erythromycin (5 µg/ml), aber nicht mit Chloramphenicol (20 µg/ml). Diese Kandidaten wurden mit PCR bzw. Southern Blot verifiziert Gramfärbung Bei dieser Färbemethode wurde Zellmaterial mit einer Impfschlinge von einer Agarplatte genommen und auf einem Objektträger in 5-10 µl A.dest verrieben. Zum Fixieren der Zellen wurde der Objektträger kurz mit der Unterseite in eine Flamme gehalten. Es wurde Kristallviolett auf die Zellen getropft und 2 min bei RT inkubiert. Danach wurde das Kristallviolett abgekippt und die Probe für 2 min mit Lugolscher Lösung bedeckt. Die Probe wurde mit 96% EtOH gespült, bis sich kein Kristallviolett mehr lösen lies. Die Zellen wurden dann mit Wasser gespült, getrocknet und mit Karbolfuchsin für 1 min gegengefärbt. Diese Färbelösung wurde mit Wasser abgewaschen und zwischen Filterpapier getrocknet. Bei Betrachtung der Zellen unter dem Mikroskop(1000x) konnte man nun dunkel-violette (Gram-positive) und hell-rote (Gram-negative) Zellen diskriminieren. 49

61 Material und Methoden Resistenzbestimmung mit Antibiotikaplättchen und E-Test- Streifen Es wurde Zellmaterial mit einer Impfschlinge von einer Agarplatte in 0,9%ige NaCl-Lösung eingerieben (McFarland 0,5) und diese mit einem Watte-stäbchen auf einer Agarplatte verteilt. Anschließend wurde ein Antibiotika-plättchen oder E-Teststreifen in die Mitte der Platte gelegt und ün bei 37 C bebrütet. So konnte die MHK bzw. der Hemmhofdurchmesser ermittelt werden Pulsfeldgelelektrophorese Diese Methode wurde dazu benutzt, Verwandtschaftsbeziehungen zwischen S. saprophyticus Stämmen zu ermitteln. Es wurden die zu untersuchenden Stämme auf Blutplatten ausgestrichen und diese ün bei 37 C bebrütet. Am nächsten Tag wurden ÜK in 5 ml Soja-B mit diesen Stämmen beimpft und ün für 18 h angezogen. Die ÜK wurden am nächsten Tag auf Eis gestellt und je 400 µl für 10 s bei g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 500 µl TEN-Puffer resuspendiert. Die Zellen wurden erneut zentrifugiert und das Pellet 270 µl EC- Puffer aufgenommen. Die Bakteriensuspension wurde 3 min auf 55 C erwärmt, danach mit 30 µl Lysostaphin versetzt und gemischt (Vortex). Es wurde an dieser Stelle 300 µl 55 C warme, 2%ige Incert-Agarose (Biozym) dazugegeben und mit dem Vortex gemischt. Für das Herstellen der Plugs wurden 100 µl Portionen dieses Gemisches luftblasenfrei in Plugformen pipettiert. Diese Agarblöckchen wurden nach dem Erstarren (ca. 15 min) in ein Reaktionsgefäß mit 1,5 ml EC-Puffer gegeben und für 1 h bei 37 C inkubiert. Danach wurde der EC-Puffer verworfen und die Plugs in TE-Puffer für 1h bei 55 C auf dem Thermoschüttler bei 300 rpm inkubiert. Der TE-Puffer wurde verworfen und durch 1 ml frischen TE-Puffer ersetzt. Die Plugs können so bei 4 C bis zur Restriktion gelagert werden. Die Plugs in 990 µl TE-Puffer wurden mit 10 µl Proteinase K (20 mg/ml) gemischt und 1 h bei 55 C inkubiert. Anschließend wurden diese 2x 30 min in TE-Puffer gewaschen. Es folgte ein Waschschritt für 1 h bei RT in 500 µl 1xSmaI-Puffer (Roche) auf einer Laborwippe. Der Puffer wurde verworfen und 300 µl frischer 1xSmaI-Puffer und 3 µl SmaI (Roche) 50

62 Material und Methoden hinzugegeben. Die Restriktion erfolgte für 20 h bei 25 C und 300 rpm im Thermoschüttler. Nach diesem Verdau wurde die Lösung entfernt und die Plugs in 1ml TE-Puffer bei 4 C gelagert. Die Plugs wurden auf 6-7 mm zurechtgeschnitten und in die Taschen eines 1%igen Agarosegels (1 g Agarose Pulsed Field certified von Biorad/100 ml 0,5x TBE-Puffer von Biorad, bei 55 C gegossen) überführt. Die Taschen wurden mit derselben, 55 C warmen Agarose versiegelt. Die Elektrophoresekammer wurde auf 14 C vorgekühlt. Das Gel wurde mit der Trägerplatte und den Taschen oben in den Elektrophoresekammerrahmen gelegt (Chef-DRIII System) und der Lauf mit folgenden Parametern gestartet. Initial Switch Time: 1 sec Final Switch Time: 34 sec Run Time: 22 h Volt/cm: 6 Volt Includet Angel: 120 Nach dem Lauf wurde das Gel im Ethidiumbromidbad für ca. 15 min gefärbt und danach für 15 min in A.dest entfärbt. Das Gel wurde mit der Geldokumentationsanlage und dem Programm Multi-Analyst fotographisch festgehalten und mit dem Programm Molekular-Analyst ausgewertet. Es wurde der Jeffreys x coefficient und Ward als Clustering Methode verwendet, um die Verwandtschaftsbeziehungen zwischen den Stämmen zu analysieren. EC-Puffer ph 7,5 95 mg TrisHCl 6 mm 5,84 g NaCl 1 M 3,72 g Dinatrium-EDTA 100 mm 0,5 % Brij 58 0,5 % Sarkosyl 0,2 % Na-Deoxychotal ad 100 ml H 2 O, ph 7,5, autoklaviert 51

63 Material und Methoden TE-Puffer ph 8,0 5 ml 1 M TrisHCl ph 7,6 1 ml 0,5 M Dinatrium-EDTA ph 8,0 ad 500 ml A.dest TEN-Puffer 1,21 g Tris base (100 mm) 876 mg NaCl (150 mm) 2,9 g EDTA (100mM) ad 100 ml A.dest, ph 7,5 0,5xTBE Elektrophoreselaufpuffer 100 ml 10x TBE (Biorad) ad 2000 ml A.dest Wachstum auf PY-Agarplatten mit D-Serin Aus 4 ml LB ÜK wurden 10 ml PY mit 500 µl einer od 600 von 1,0 der zu untersuchenden Stämme angeimpft. Das Wachstum der Stämme wurde photometrisch verfolgt, bis diese eine od 600 von 0,5 erreicht hatten. Es wurden 50 µl einer Verdünnung parallel auf PY-Agar und PY-Agar mit 20 mg/ml D- Serin ausplattiert. Die Platten wurden bei 37 C inkubiert und nach h photographiert D-Serin-Aufnahmetest Bei diesem Test wurde die Inkorporation von D-Serin durch die Zelle über die Abnahme der extrazellulären D-Serinkonzentration gemessen. Hierzu wurden 4 ml LB ÜK mit den entsprechenden Stämmen von einer LB- Agarplatte beimpft. Am nächsten Tag wurde eine Hauptkultur von 25 ml LB mit 3 ml der ÜK OD 600 = 1,0 angeimpft und bei 37 C und 100 rpm so lange bebrütet, bis die Kultur die spätlogarithmische Phase (od 600 = 1,5-2,2) erreicht 52

64 Material und Methoden hat. Die Zellen wurden bei 5600 g und RT in einem 50 ml-falcontube sedimentiert und in 10 ml PBS-Puffer aufgenommen. Protokoll für anschließende Auswertung über 1NMR-Spektroskopie: Die od 600 wurde auf 5,0 eingestellt und 15 ml dieser Zellsuspension mit 5 ml 10 mm D-Serin (in PBS) gemischt, um den Versuch zu starten. In Zeitabständen von 0,5; 1; 3; 6; 9; 18, und 22 h wurden je Stamm 2 ml mit einer Spritze abgenommen und in 2ml-Reaktionsgefäße sterilfiltriert (Sterilfilter 0,2 µm). Zu 630 µl des Filtrats wurden 70 µl 10x TSP(D 2 O) gegeben und die Lösung in eine NMR-Röhre (5 mm, Thin Wall, 7 Lgth, 500 MHz, WILMAD NMR tubes, Sigma-Aldrich) pipettiert. 100x TSP 8,61mg Trimethylsilylpropionat ad 10 ml D 2 O 10x TSP 1 ml 100x TSP ad 10 ml D 2 O Die Proben wurden am Lehrstuhl Biochemie II AG Biomolekulare Spektroskopie an der Ruhr-Universität Bochum gemessen und die erhaltenen Spektren mit dem Programm MestReNova ausgewertet. Hier wurde das Integral des D-Serinsignals in Beziehung zum Integral des TSP-Signals gesetzt und an Hand der Ausgangskonzentration die verbleibende D- Serinkonzentration bestimmt. Dabei musste darauf geachtet werden, dass die Basislinie auf 0 liegt, damit die Integrale korrekt berechnet werden können. Damit minimale Unterschiede in der Konzentration der Referenzsubstanz, die durch das Pipettieren entstehen, sich nicht gravierend auf die berechnete Konzentration der gemessenen Substanz auswirken, sollte die Größe des Integrals der Referenzsubstanz (hier TSP) in etwa der Größe der gemessenen Substanz (hier D-Serin) entsprechen. 53

65 Material und Methoden Abbildung 5 Beispielhafte Darstellung eines 1 H-NMR-Spektrums. Die Abb. zeigt beispielhaft (A) ein 1 H-NMR-Spektrum eines Filtrats im Programm MestReNova mit D-Serin- (Signale bei ca. 4,0-3,8 ppm) und TSP-Signal (0,0 ppm). Das zweite Bild (B) zeigt 5 überlagerte Spektren mit verschiedenen D-Serin Konzentrationen. Protokoll für anschließende Auswertung über den Pyruvat-Assay: Die od 600 wurde auf 2,0 eingestellt und 7,5 ml dieser Zellsuspension mit 2,5 ml 4 mm D-Serin (in PBS) gemischt, um den Versuch zu starten. In Zeitabständen von 30 min wurden je Stamm 1 ml abgenommen, bei g und 4 C für eine Minute zentrifugiert und 900 µl des Überstandes in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dieser Überstand wurde für 10 min bei 80 C inkubiert, um verbleibende Zellen zu inaktivieren. Die Proben wurden bei -20 C gelagert oder sofort ausgewertet. Hierzu wurden je 3x 40 µl je Probe in eine MTP pipettiert, 10 µl DsdA (67 µg/ml in PBS) pro Napf hinzugegeben und den Ansatz für 1,5 h bei 37 C inkubiert. Nach dieser Inkubation war das D-Serin in den Proben vollständig zu Pyruvat und Ammonium umgesetzt. Dies wurde mit einer D- Serin-Eichreihe kontrolliert. Die Pyruvat-Konzentration wurde mit dem Pyruvat- Assay ermittelt Pyruvat-Assay (McFall, 1975) Um die Pyruvatkonzentration einer Lösung zu bestimmen, wurden 50 µl der zu untersuchenden Probe in einer MTP mit 50 µl DNPH gemischt und für 20 min 54

66 Material und Methoden bei RT inkubiert. Danach wurden 100 µl 2,8 M NaOH hinzugegeben und die Extinktion 450nm am ELISA-Reader gemessen. DNPH 0,3 g 2,4,-Dinitrophenylhydrazin (DNPH) ad 1000 ml 1 M HCl NaOH (2,8 M) 112 g NaOH ad 1000 ml A.dest Wachstumstest im chemisch definierten Medium (CDM) Um die Auswirkungen von D-Serin auf das Wachstum von S. saprophyticus untersuchen zu können, wurden Versuche in chemisch definiertem Medium durchgeführt. Hierzu wurden die zu untersuchenden Stämme auf LB- Agarplatten ausgestrichen, die nicht älter als einen Tag war, und bei 37 C ün bebrütet. Am nächsten Tag wurden die Zellen von der Platte in 0,9 % NaCl eingerieben und 10 ml CDM damit auf eine od 600 = 0,05 angeimpft. Die Kulturen schüttelten in 50 ml-falcontubes bei 100 rpm und 37 C. Die od 600 wurde über die Zeit des Wachstums durch Entnahme von 100 µl Proben gemessen Clumpingfaktortest Dieser Test wurde dazu eingesetzt, die Fähigkeit von Staphylokokken zu testen, gelöstes Fibrinogen zu binden. Beim Clumpingfaktortest wurde Zellmaterial des zu untersuchenden Stammes von Agarplatte auf einen Objektträger überführt und in 30 µl humanes Citratplasma eingerieben. Bei einer Verklumpungsreaktion nach spätestens 60 s wurde der Test als positiv gewertet. Für diesen Test wurde ebenfalls das Kit Staphytect Plus (Oxoid) zur Identifikation von Staphylococcus aureus eingesetzt. 55

67 Material und Methoden Adhärenztest Dieser Test (Hartford et al., 1997) wurde eingesetzt, um die Adhärenz von Staphylokokken an die humanen Proteine Fibrinogen und Fibronektin zu untersuchen. Tag1: Die zu untersuchenden Stämme wurden aus Dauerkultur auf Blut-Agar-platten oder auf LB-Agarplatten mit entsprechendem AB ausgestrichen und ün herangezogen. Tag2: Die Mikrotiterplatten (MTP) wurden mit 100 µl Fibrinogen (20 µg/ml in PBS- Puffer)/Napf bei 4 C im Kühlschrank ün beschichtet. Fibronektin beschichtete MTPs wurden käuflich erworben und bei 4 C gelagert. Übernachtkulturen (LB, 4 ml) wurden mit den Stämmen beimpft und 18 h bei 37 C ün im Schüttelwasserbad angezogen. Tag3: Die Fibrinogenlösung wurde verworfen, 100 µl BSA (2% BSA in PBS- Puffer)/Napf hinzugegeben und für 1h bei 37 C inkubiert. In dieser Zeit wurden die Bakterien bei g abzentrifugiert, in PBS aufgenommen und auf eine od 600 von 1,0 eingestellt. Die BSA-Lösung wurde verworfen und die Näpfe 3- mal mit PBS gewaschen (Zugabe von 100 µl PBS-Puffer/Napf, danach verworfen), um ungebundenes Fibrinogen und BSA zu entfernen. Danach wurde 100 µl/napf der Bakteriensuspension hinzugegeben und für 2 h bei RT und 300 rpm inkubiert. Es wurden immer mindestens drei Replikate pro Stamm getestet. Nach der Inkubationszeit wurde die Bakteriensuspension verworfen und die Näpfe 3-mal mit PBS gewaschen, um nicht gebundenen Zellen zu entfernen. Die gebundenen Bakterien wurden durch die Zugabe von 100 µl Formaldehyd (25% Formaldehyd inh 2 O)/ Napf und einer Inkubation von 30 min bei RT fixiert. Die Formaldehydlösung wurde verworfen und die Näpfe 2-mal mit PBS gewaschen. Es verblieben 100 µl PBS in den Näpfen und mit der Zugabe von 50 µl Kristallviolett (0,5% Kristallviolett in H 2 O) wurden die Zellen für 10 min bei RT gefärbt. Die Kristallviolett-Lösung wurde verworfen und die Näpfe 2-mal 56

68 Material und Methoden mit PBS gewaschen und getrocknet. Die od 550 wurde am ELISA-Reader gemessen DNA-Sequenzierung Sequenzierungen von DNA wurden im Lehrstuhl Biochemie I an der Ruhr- Universität Bochum durchgeführt. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit dem Linux-Programm Emboss ausgewertet. 57

69 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Identifizierung von D-Serintransportern und Tetracyclinresistenz in S. saprophyticus Bioinformatische Ergebnisse der putativen D-Serintransporter Im Genom von S. saprophyticus ATCC15305 befinden sich 3 Gene, die als D-Serin/D-Alanin/Glycin-Transporter annotiert sind. Diese putativen D-Serintransporter sind in ihrer Aminosäuresequenz zu 65-68% identisch und zu 82-85% ähnlich zueinander. Sie weisen relativ große Ähnlichkeit zu CycA auf. Dieser Transporter aus E. coli CFT073 transportiert D-Serin, D-Alanin und Glycin. Vergleich auf Proteinebene mit CycA: CycA: Identität Ähnlichkeit Transmembranhelices SSP % 73% 11 SSP % 75% 12 SSP % 72% 12 Zu dem in E. coli CFT073 vorhandenen spezifischen D-Serintransporter DsdX gibt es zwei entfernt ähnliche Proteine, die als Gluconattransporter annotiert sind. Vergleich auf Proteinebene mit DsdX: DsdX: Identität Ähnlichkeit Transmembranhelices SSP % 56% 12 SSP % 54% 12 Die von TMHMM vorhergesagte Anzahl der Transmembranhelices bei SSP1070, SSP2171, SSP0412 und SSP2189 beträgt 12 wie bei CycA und DsdX aus E. coli. Für SSP0286 werden nur 11 Transmembranhelices vorhergesagt. 58

70 Ergebnisse Erstellung und Verifizierung von Allelaustausch-Mutanten putativer D-Serintransporter Es wurden für diese Arbeit Allelaustausch-Mutanten der Gene SSP0286, SSP1070 und SSP2171 erstellt, deren Produkte als putative D-Serin-/D- Alanin-/Glycintransporter annotiert sind. Dies geschah über homologe Rekombination, bei der das Zielgen durch das ermb-resistenzmarkergen im Genom ersetzt wurde. Um dies möglich zu machen, wurde jeweils das gesamte Gen mit je ca. 500 bp 5 und 3 mittels PCR amplifiziert und in den puc18 Vektor kloniert. Mit einer reversen PCR wurden die ca. 500 bp langen Bereiche 5 und 3 vor und nach dem Gen zusammen mit dem puc18 amplifiziert. In diese Amplifikate wurde die ermb-kassette kloniert. Diese Konstrukte wurden dann von puc nach pbt2 umkloniert (nicht gezeigt). Nach erfolgreicher Protoplastentransformation und homologen Rekombination mit anschließendem Curing von pbt2 wurden die so erstellten Mutanten mittels PCR verifiziert (Abbildung 6). Abbildung 6 Verifizierung der Transportermutanten. Die Spuren sind mit der eingesetzten chromosomalen DNA beschriftet, die als Matrize eingesetzt wurde. Die Mutanten wurden mit PCRs verifiziert, bei denen Primer verwendet wurden, die in den entsprechenden Transportergenen binden (Spur 1-6). PCRs mit einem Primer, der in ermb bindet, und einem, der im 3 -Bereich nach dem entsprechenden Gen und außerhalb der für die 59

71 Ergebnisse homologe Rekombination verwendeten Bereiche im Genom bindet, wurden dazu eingesetzt, um den korrekten Integrationsort von ermb im Genom der Mutanten zu bestätigen (Spur 7-9). Auf dem Agarosegel sind Amplifikate aus PCRs zur Verifizierung von Transportermutanten zu sehen. Es wurden folgende Primer verwendet: Ssa_DsTrapo1.2seq/rev (Spur 1 und 2), Ssa_DsTrapo2.2seq/rev (Spur 3 und 4), Ssa_DsTrapo-3.2seq/rev (Spur 5 und 6), pec1_seq (Spur 7-9), T1.1 rev HindIII (Spur 7), T2.1 rev HindIII (Spur 8) und T3.1 rev HindIII (Spur 9). In den Spuren M ist der 1 Kb GeneRuler TM von Fermentas zu sehen. PCRs mit chromosomaler DNA aus 7108 ergaben mit den entsprechenden Primern Amplifikate in der Größe von ca bp für jedes der Transportergene, die bei der entsprechenden Mutante kein Amplifikat ergeben haben (Spur 1-6). PCRs mit einem Primer, der in ermb bindet, und einem, der im 3 -Bereich nach dem entsprechenden Gen und außerhalb der für die homologe Rekombination verwendeten Bereiche im Genom bindet, ergaben Amplifikate von ca. 2 kb bei der chromosomalen DNA der Mutanten (Spur 7-9) Ermittlung der D-Serin Transportleistung der Transportermutanten mittels 1 H-NMR und Pyruvat-Assay In diesen Versuchen wurde mittels 1 H-NMR oder D-Serinverdau über DsdA mit anschließendem Pyruvat-Assay die verbleibende D-Serinkonzentration im Filtrat bzw. Überstand einer Bakteriensuspension gemessen. Dabei wurde die Abnahme der D-Serinkonzentration als Maß für die Aufnahme angenommen. Diese Ergebnisse beschreiben die Gesamttransportleistung von D-Serin der untersuchten Transportermutanten im Vergleich zum Ausgangsstamm Anhand dieses Profils können Rückschlüsse auf die Transportleistung der ausgeschalteten Transporter gezogen werden. In den folgenden Abbildungen sind die ermittelten D-Serintransportprofile dargestellt, welche durch NMR (Abbildung 7) und Pyruvat-Assay (Abbildung 8) ermittelt wurden. 60

72 Ergebnisse 2,5 mm D-Serin im Filtrat 2,0 1,5 1,0 0,5 7108(wt) ΔSSP0286 ΔSSP1070 ΔSSP02171 ΔSSP pmb1458 0, h Abbildung 7 Abnahme der D-Serinkonzentration gemessen mit 1 H-NMR. ΔSSP1070 (rotes Dreieck) zeigt eine Reduktion der D-Serinaufnahme, während diese bei der Komplementante (grünes Sternchen) im Vergleich zum Wt und den anderen Mutanten verstärkt ist. Startparameter bei diesem Versuch waren 2,5 mm D-Serin bei einer od 600 =3,666. In Abbildung 7 ist beispielhaft die Abnahme der D-Serinkonzentration im Filtrat einer Zellsuspension dargestellt, die mittels 1 H-NMR gemessen wurde. Während ΔSSP0286 und ΔSSP2171 ein dem Wt sehr ähnliches Aufnahmeprofil zeigen, ist bei ΔSSP1070 eine Abnahme der D-Serintransportleistung zu erkennen. Die Komplementante von ΔSSP1070 zeigt eine deutlich verstärkte D-Serintransportleistung im Vergleich zum Wt. 61

73 Ergebnisse mm D-Serin im Filtrat 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0, h 7108 ΔSSP0286 ΔSSP1070 ΔSSP2171 ΔSSP1070 pmb1458 Abbildung 8 Abnahme der D-Serinkonzentration gemessen mit dem Pyruvat-Assay. ΔSSP1070 (rotes Dreieck) zeigt eine Reduktion der D-Serinaufnahme, während diese bei der Komplementante (grünes Sternchen) im Vergleich zum Wt und den anderen Mutanten verstärkt ist. Die Startparameter bei diesem Versuch waren 1,0 mm D-Serin, od 600 =1,5. In der Abbildung 8 ist die Abnahme der D-Serinkonzentration im Überstand einer Zellsuspension dargestellt, die mit dem Pyruvat-Assay gemessen wurde Die Ergebnisse aus den 1 H-NMR-Messungen wurden mit dem Pyruvat-Assay bestätigt und statistisch gesichert. ΔSSP1070 zeigt eine reduzierte D-Serintransportleistung gegenüber dem Wt und den anderen Transportermutanten, während die Komplementante von ΔSSP1070 eine verstärkte Transportleistung aufweist. ΔSSP0286 und ΔSSP2171 zeigen kein verändertes D-Serintransportprofil im Vergleich zum Wt. 62

74 Ergebnisse 2,0 1,8 fmol/zelle/h 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0, ΔSSP0286 ΔSSP1070 ΔSSP2171 ΔSSP1070 pmb1458 0,4 0,2 0,0 Abbildung 9 D-Serintransportkapazität. Die D-Serintransportkapazität ist bei ΔSSP1070 reduziert und bei ΔSSP1070 pmb1458 im Vergleich zum Wt und der anderen Mutanten erhöht. Zur Berechnung wurden Daten aus dem linearen Bereich der Aufnahmekinetik verwendet (Abbildung 8). Die Startparameter bei diesem Versuch waren 1,0 mm D-Serin bei einer od 600 =1,5 (Zellzahl von 6*10 8 Zellen/ml). In der Abbildung 9 ist die D-Serintransportkapazität einer einzelnen Zelle des jeweiligen Stammes dargestellt. Die Berechnung der D-Serintransportkapazität für S. saprophyticus 7108 ergab einen mittleren Wert von 0,626 fmol/zelle/h. Die Transportermutanten ΔSSP0286 und ΔSSP2171 weichen von diesem Wert nicht signifikant ab. Die D-Serintransportkapazität von ΔSSP1070 ist mit 0,234 fmol/zelle/h signifikant reduziert (p< 1,5*10-11 ). Die Komplementante von ΔSSP1070, welche SSP1070 plasmidkodiert trägt, zeigt mit 1,926 fmol/zelle/h eine signifikant erhöhte D-Serintransportkapazität (p< 4,7*10-4 ) im Vergleich zum Wt. 63

75 Ergebnisse Einfluss von D-Serin auf das Wachstum von Mutanten putativer D-Serintransporter Es konnte in Vorversuchen gezeigt werden, dass D-Serin bei relativ hohen Konzentrationen (20 mg/ml = 190 mm) in dem Komplexmedium PY einen Effekt auf das Wachstum von S. saprophyticus 7108 hat (Abbildung 10). od h PY PY+ D-Serine Abbildung 10 Wachstum von 7108 in PY mit/ohne D-Serin. S. saprophyticus 7108 zeigt ein verlangsamtes bzw. später einsetzendes Wachstum mit D-Serin in PY- Medium. Die Abbildung 10 zeigt einen wachstumsverlangsamenden Effekt von D- Serin (20 mg/ml) auf das Wachstum von S. saprophyticus 7108 in PY- Medium. Das Phänomen des verlangsamten Wachstums wurde auch auf PY- Agarplatten mit D-Serin untersucht (Abbildung 11). 64

76 Ergebnisse Abbildung 11 Wachstum auf PY-Agarplatten mit D-Serin. Nur bei ΔSSP1070 ist die Koloniegröße auf PY-Agarplatten mit und ohne D-Serin nach 18 h morphologisch nicht zu unterscheiden. Der Wildtyp-Stamm S. saprophyticus 7108 und die Mutanten der anderen putativen D-Serintransporter zeigen ein verlangsamtes Wachstums mit D-Serin. Die Abbildung 11 zeigt einen Wachstumstest auf PY-Agarplatten mit und ohne D-Serin. Nach 18 h ist die Koloniegröße bei Wt, ΔSSP0286 und ΔSSP2171 auf den Platten mit D-Serin kleiner als auf den Platten ohne D-Serin. Die Kolonien von ΔSSP0286 und ΔSSP2171 sind im Vergleich zum Wt noch kleiner mit D-Serin. Bei ΔSSP1070 ist die Koloniegröße auf PY- Agarplatten mit und ohne D-Serin nach 18 h morphologisch nicht zu unterscheiden. Nach 48 h war kein Größenunterschied zwischen den Kolonien der Stämme mit oder ohne D-Serin mehr zu erkennen (nicht gezeigt). In flüssigem Komplexmedium PY ist diese Wachstumsverlangsamung nicht stark ausgeprägt, und auf Agarplatten ist dieses Phänomen schwer zu quantifizieren. Daher mussten Bedingungen gefunden werden, bei denen die Auswirkungen von D-Serin auf das Wachstum von S. saprophyticus 7108 gut zu untersuchen ist. Hierfür wurde das chemisch definierte Medium (CDM) gewählt, da es keine komplexen Bestandteile enthält und der Effekt von D-Serin in Vorversuchen stärker war als in Komplexmedien. Pyruvat wurde als primäre Kohlenstoffquelle gewählt, da S. saprophyticus 7108 mit diesem 65

77 Ergebnisse Stoff in CDM wächst und D-Serin durch DsdA in der Zelle ebenfalls zu Pyruvat abgebaut wird. Das hat den Vorteil, dass die Nutzung von D-Serin als Kohlenstoffquelle bei der Charakterisierung des Effekts von D-Serin auf die Zelle ausgeklammert werden kann, da im Endeffekt nur Pyruvat als Kohlenstoffquelle dient. In Vorversuchen wurde eine D-Serinkonzentration zwischen 2,0 mm und 0,5 mm als minimale Hemmkonzentration mit Pyruvat als Kohlenstoffquelle ermittelt. Bei einer Konzentration von 5 mm D-Serin war das Phänomen des verlangsamten Wachstums in CDM gut zu quantifizieren und diese wurde deshalb später in den Versuchen verwendet. Wenn der Effekt durch die Aufnahme, also intrazellulärem D-Serin verursacht wird, könnte eine Veränderung der transportierten Menge sich auf dieses Phänomen auswirken. S. saprophyticus 7108 und die Transportermutanten wurden in CDM auf dieses Phänomen hin untersucht. In den folgenden Abbildungen wird beispielhaft das Wachstum der Stämme aus einem von drei Versuchen gezeigt. Dem CDM wurde in allen Ansätzen 50 µl 1M Pyruvat (5 mm) als Hauptkohlenstoffquelle zugesetzt. 1,2 1,0 od 600 0,8 0,6 0,4 0, D-Serin 0, h Abbildung 12 Effekt von D-Serin auf das Wachstum von 7108 in CDM. Der Ausgangsstamm 7108 zeigt eine verlängerte lag-phase und eine verlängerte Generationszeit in CDM mit D-Serin (rotes Quadrat). 66

78 Ergebnisse Die Abbildung 12 zeigt den Effekt von 5 mm D-Serin auf das Wachstum von S. saprophyticus 7108 in CDM (Pyruvat 5 mm). In Gegenwart von D-Serin sind lag-phase und Generationszeit verlängert und der Stamm erreicht eine höhere optische Dichte. 1,2 1,0 od 600 0,8 0,6 0,4 0, ΔSSP ΔSSP D-Serin 0, h Abbildung 13 Effekt von D-Serin auf das Wachstum von 7108 ΔSSP0286 in CDM ΔSSP0286 zeigt eine verlängerte lag-phase und eine verlängerte Generationszeit in CDM mit D-Serin (rotes Quadrat). Die Abbildung 13 zeigt den Effekt von 5 mm D-Serin auf das Wachstum von 7108 ΔSSP0286 in CDM (Pyruvat 5 mm). In Gegenwart von D-Serin sind lag-phase und Generationszeit verlängert und der Stamm erreicht eine höhere optische Dichte. 67

79 Ergebnisse od 600 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, h 7108 ΔSSP ΔSSP D-Serin Abbildung 14 Effekt von D-Serin auf das Wachstum von 7108 ΔSSP1070 in CDM ΔSSP1070 zeigt keine verlängerte lag-phase und eine verlängerte Generationszeit in CDM mit D-Serin (rotes Quadrat). Die Abbildung 14 zeigt den Effekt von 5 mm D-Serin auf das Wachstum von 7108 ΔSSP1070in CDM (Pyruvat 5 mm). In Gegenwart von D-Serin ist die lag-phase etwa so lang wie in Abwesenheit von D-Serin. Die Generationszeit ist verlängert und der Stamm erreicht eine höhere optische Dichte. 1,2 1,0 od 600 0,8 0,6 0,4 0, ΔSSP ΔSSP D-Serin 0, h Abbildung 15 Effekt von D-Serin auf das Wachstum von 7108 ΔSSP2171 in CDM ΔSSP2171 zeigt eine verlängerte lag-phase und eine verlängerte Generationszeit in CDM mit D-Serin (rotes Quadrat). 68

80 Ergebnisse Die Abbildung 15 zeigt den Effekt von 5 mm D-Serin auf das Wachstum von 7108 ΔSSP2171 in CDM (Pyruvat 5 mm). In Gegenwart von D-Serin sind lag-phase und Generationszeit verlängert und der Stamm erreicht eine höhere optische Dichte.. 1,2 od 600 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, h 7108 ΔSSP1070 pmb ΔSSP1070 pmb D-Serin Abbildung 16 Effekt von D-Serin auf das Wachstum von 7108 ΔSSP1070 pmb1458 in CDM ΔSSP1070 pmb1458 zeigt eine verlängerte lag-phase aber keine verlängerte Generationszeit in CDM mit D-Serin (rotes Quadrat). Die Abbildung 16 zeigt den Effekt von 5 mm D-Serin auf das Wachstum von 7108 ΔSSP1070 pmb1458 in CDM (Pyruvat 5 mm). In Gegenwart von D-Serin ist die lag-phase verlängert, die Generationszeit ist konstant und der Stamm erreicht eine höhere optische Dichte. Bei allen Stämmen wurde ein Rückgang der od 600 kurz nach Erreichen der stationären Phase beim Wachstum ohne D-Serin beobachtet. Hier war mit dem bloßen Auge eine Klumpenbildung zu sehen, die sich beim Wachstum mit D-Serin nicht oder nur schwach zeigte. Um die Verlängerung der lag-phase zu quantifizieren, wurde bei jedem Stamm die Zeitdifferenz zwischen Erreichen der od 600 = 0,2 ohne D-Serin und Erreichen der od 600 = 0,2 mit 5 mm D-Serin berechnet. Diese wurde aus drei unabhängigen Versuchen gemittelt und in der folgenden Abbildung dargestellt. 69

81 Ergebnisse h ΔSSP ΔSSP ΔSSP ΔSSP1070 pmb Abbildung 17 Verlängerung der lag-phase durch D-Serin. ΔSSP1070 zeigt im Gegensatz zu den anderen Stämmen keine Verlängerung der lag-phase. In Abbildung 17 ist die Verlängerung der lag-phase der Transportermutanten durch D-Serin in CDM aus 3 unabhängigen Versuchen dargestellt Der Ausgangsstamm 7108 zeigt eine Verlängerung der lag-phase mit 5 mm D-Serin in CDM (5 mm Pyruvat) um über 6 h. Diese Verlängerung ist bei ΔSSP0286 auf etwa 5,7 h und bei ΔSSP2171 auf etwa 5,3 h reduziert aber nicht signifikant unterschiedlich im Vergleich zu 7108 (p>0,1). Bei ΔSSP1070 ist keine Verlängerung der lag-phase zu beobachten. Dieser Unterschied zu den anderen Stämmen ist signifikant (p<0,007). Dagegen verlängert sich die lag-phase der Komplementante von ΔSSP1070 im Mittel um 9,2 h. Dieser Unterschied ist zwar nicht signifikant (p>0,12), es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass der Wert im Vergleich zum Wt erhöht ist. In den folgenden Abbildungen sind die Generationszeiten der Stämme aus den drei Versuchen mit und ohne D-Serin abgebildet, um die Auswirkungen von D-Serin auf die Generationszeit in CDM zu quantifizieren. 70

82 Ergebnisse D-Serin ΔSSP0286 ΔSSP D-Serin Generatinszeit in Minuten ΔSSP1070 ΔSSP D-Serin ΔSSP2171 ΔSSP D-Serin ΔSSP1070 pmb1458 ΔSSP1070 pmb D-Serin Abbildung 18 Generationszeit mit und ohne D-Serin in CDM. Die Generationszeiten aller Stämme außer der Komplementante von ΔSSP1070 sind mit D-Serin erhöht. Die Generationszeit wurde aus der logarithmischen Phase berechnet. In der Abbildung 18 sind die Generationszeiten von 7108 und der Transportermutanten in CDM mit und ohne D-Serin aus drei unabhängigen Versuchen dargestellt. Diese Verlängerung ist bei 7108 und ΔSSP0286 signifikant (p< 0,03) aber bei ΔSS1070 und ΔSSP2171 nicht (p> 0,07). Eine Verlängerung ist hier jedoch wahrscheinlich. Die Generationszeit der Komplementante ist mit D-Serin verkürzt. Diese Verkürzung ist nicht signifikant (p> 0,3). 71

83 Ergebnisse 90 Δt Generationszeit in Minuten ΔSSP0286 ΔSSP1070 ΔSSP2171 ΔSSP1070 pmb Abbildung 19 Vergleich der Generationszeitverlängerung durch D-Serin. Die Verlängerung der Generationszeit der Mutanten durch D-Serin ist im Vergleich zu Wt nicht signifikant unterschiedlich (p>0,05). Die Abbildung 19 zeigt die Differenz zwischen den Generationszeiten der Stämme mit und ohne D-Serin in CDM Etablierung eines Tetracyclin-Resistenzmarkers für Doppelknockout-Stämme in S. saprophyticus Da für den D-Serintransport möglicherweise mehr als ein Genprodukt verantwortlich ist, sollte ein zweiter Resistenzmarker etabliert werden, mit dem man Doppelknockout-Stämme erstellen kann. Dafür wurde zunächst nach einer Resistenz gesucht, die S. saprophyticus natürlicherweise besitzen kann, aber 7108 nicht aufweist. In der am Lehrstuhl vorhandenen Stammsammlung klinischer S. saprophyticus Isolate zeigten einige eine Resistenz gegen Tetracyclin. Mit einem dieser Isolate (Bo149) wurde eine Gesamtplasmidisolierung durchgeführt und dieses Plasmidgemisch in S. carnosus TM300 über Protoplastentransformation transformiert. Dabei entstanden Tc R Klone von TM300, die alle ein einzelnes Plasmid enthielten. 72

84 Ergebnisse Dieses Plasmid wurde pmb2200 genannt und S. saprophyticus über PPT damit transformiert. Der so entstandene 7108 pmb2200 zeigte ebenfalls eine erhöhte Resistenz gegen Tetracyclin. Abbildung 20 Tetracyclinresistenz durch pmb2200. Der Hemmhofdurchmesser mit Tetracyclinplättchen (30 µg) ist bei S. carnosus 28 mm und S. saprophyticus 32 mm groß. Tragen beide Spezies pmb2200 ist dieser nur noch 6 mm groß. Die MHK von Tetracyclin steigt bei 7108 von 0,25 µg/ml ohne pmb2200 auf 40 µg/ml mit pmb2200 im E-Test Tc (0, µg/ml) an. Die Abbildung 20 zeigt die Stämme TM300 und 7108 mit und ohne pmb2200 auf Blutagarplatten bzw auf MH-Agar mit E-Teststreifen. Der Hemmhofdurchmesser ist bei beiden Spezies nach Erlangen von pmb2200 verkleinert. Der E-Test zeigt eine MHK von 0,25 µg Tetracyclin ohne pmb2200 und eine MHK von 40 µg Tetracyclin mit pmb2200 an. Es ist also eine 160fach höhere Tetracyclin-Konzentration gegenüber dem Wt nötig, um S. saprophyticus 7108 pmb2200 im Wachstum zu hemmen. 73

85 Ergebnisse Isolierung und Identifizierung des Resistenzgens Um das noch unbekannte Gen zu identifizieren und nutzbar zu machen, musste es sequenziert werden. Zu diesem Zweck wurde eine Plasmidpräparation aus S. carnosus TM300 pmb2200 durchgeführt, der im Gegensatz zu S. saprophyticus 7108 keine zusätzlichen Plasmide besitzt. Das so erhaltene Plasmid wurde zunächst einer Restriktionsanalyse unterzogen. Abbildung 21 Restriktionsanalyse von pmb2200. Auf dem Gelbild der Restriktionsanalyse ist zu sehen, dass das Plasmid mit 3 HindIII- Schnittstellen in Fragmentgrößen von ca. 2,3 kb, 1,5 kb und 0,55 kb zerfällt und eine XbaI-Schnittstelle besitzt. Die Gesamtgröße beträgt damit ca. 4,4 kb. Spur 1: HindIII, Spur 2: 1 kb-standart, Spur 3: XbaI Die Abbildung 21 zeigt ein Agarosegel mit einem Teil der Restriktionsanalyse von pmb2200. Die Enzyme EcoRI, SalI, BamHI, PstI und KpnI schienen hier keine Endonukleaseaktivität zu besitzen. Die HindIII-Fragmente wurden in puc18 kloniert und sequenziert. Auf Grundlage der erhaltenen Sequenzen wurden Primer abgeleitet, um das gesamte Plasmid zu sequenzieren (siehe Liste Oligonukleotide). Die Sequenz aus dem Contig und ein multipler Sequenzvergleich mit verwandten Plasmiden befinden sich im Anhang. Das Plasmid hat eine Größe von 4439 bp und einen GC-Gehalt von 31%. Die Analyse mit BLAST zeigte sehr große Homologien zu Plasmiden aus S. aureus (pkh6, pkh16, pt181, 74

86 Ergebnisse pusa02) und S. epidermidis (pse ). Die Sequenzübereinstimmungen zu diesen Plasmiden beträgt 99,8-99,9% und alle beherbergen drei offene Leserahmen, die für tetk, repc und pre kodieren. TetK ist eine Effluxpumpe, die durch Export die intrazelluläre Tetracyclinkonzentration senkt und damit zur Resistenz bzw. zu einer erhöhten MHK führt (Guay und Rothstein, 1993). Dieses Gen sollte nun zur Erstellung von Doppelknockout- Mutanten dienen Verteilung von pmb2200-ähnlichen Plasmiden in S. saprophyticus Stämmen Um zu klären mit welcher Häufigkeit diese pm2200-ähnlichen Plasmide oder andere Tetracyclinresistenzmechanismen in klinischen, tierischen und Umweltisolaten von S. saprophyticus vorkommen, wurden 358 Stämme auf Tetracyclinresistenz getestet. Dabei zeigte sich, dass 33 (10,2%) von 323 klinischen Stämmen Tc R waren. Unter 35 Umwelt- und tierischen Isolaten waren 5 (14,2%) Tc R. PCRs mit Primern, die in tetk und an anderen Stellen des Plasmids binden, ergaben Amplifikate bei allen Tc R Stämmen (Daten nicht gezeigt). Um zu evaluieren, wie viele dieser Isolate ihre Resistenz durch ein pm2200-ähnliches Plasmid erhalten, wurden Plasmidpräparationen mit diesen Stämmen durchgeführt und die gewonnene DNA mit HindIII verdaut. 75

87 Ergebnisse Abbildung 22 HindIII-Verdau der Gesamtplasmid-DNA aus klinischen S. saprophyticus Stämmen. In dem Agarosegel sind in der Spur von pmb2200 die 3 HindIII-Fragmente mit den Größen 2354 bp, 1525 bp und 560 bp zu sehen. Fragmente dieser Größe findet man in allen Spuren mit HindIII verdauter Plasmid-DNA aus Tc R S. saprophyticus Stämmen. Banden mit anderen Fragmentgrößen stammen wahrscheinlich von zusätzlichen Plasmiden, die oft in S. saprophyticus zu finden sind. Als Größenvergleich dient das aus Bo149 stammende, aus TM300 präparierte und HindIII-verdaute pmb2200 in Spur 11. In Spur 1 und 12 ist die 1 kb- Leiter zu sehen. Die Abbildung 22 zeigt beispielhaft ein Agarosegel mit HindIII-verdauter Plasmid-DNA aus Tc R S. saprophyticus Stämmen. 76

88 Ergebnisse Abbildung 23 PFGE von Tc S und Tc R S. saprophyticus Stämmen. Die Abb. zeigt mit Molekular-Analyst zusammengestellte PFGE von 21 Tc R (grün unterlegt) und 52 Tc S zufällig ausgewählten S. saprophyticus Stämmen. Es wurde der 77

89 Ergebnisse Jeffreys x coefficient und Ward als Clustering Methode verwendet. Der obere Balken und das Dendrogramm (links) zeigen die genetische Ähnlichkeit in %. Die kurzen Striche repräsentieren das digitalisierte Pulsfeldmuster (Mitte) mit den dazugehörigen Stämmen (rechts). In der Abbildung 23 ist zu erkennen, dass sich die S. saprophyticus-stämme in vier große Gruppen unterteilen. Zu jeder dieser Gruppen gehören auch Tc R -Stämme Doppelknockout mit tetk Mit den Primern tet1.1-seq und tet1-rev wurde tetk amplifiziert und über die eingefügten Schnittstellen (statt ermb) in das Konstrukt kloniert, wie es in beschrieben wurde. Diese Konstrukte wurden für alle drei Transporter erstellt, in den pbt2 umkloniert und in S. saprophyticus 7108 Tranportermutanten transformiert. Die mit einem solchen Konstrukt transformierten Stämme zeigten neben der Chloramphenicol-Resistenz (pbt2) auch wie erwartet die Tetracyclin-Resistenz. Das Curing von pbt2 war jedoch nicht erfolgreich. Es konnte keine Allelaustauschmutante mit tetk erzeugt werden. 3.2 Fibrinogen- und Fibronektinbindung von S. lugdunensis Alle klinischen Isolate von S. lugdunensis besitzen das fbl-gen, welches als Fibrinogen-bindendes Protein beschrieben wurde. Dies wurde mittels PCR und den Primerpaaren FBL-Rep, FBL-ADom und fbl-check für alle Isolate bestätigt (Daten nicht gezeigt). Ein Fibronektin-bindendes Protein wurde bei S. lugdunensis noch nicht beschrieben. Auf beiden veröffentlichten Genomen von S. lugdunensis ist ein Gen zu finden, das für ein FnBPA-Homolog codiert. Dieses Gen wurde mittels PCR unter Verwendung der Primerpaare FbpA_F und FbpA_R in allen untersuchten Stämmen nachgewiesen (Szabados et al., 2011b). 78

90 Ergebnisse Fibrinogen-Bindung von S. lugdunensis Es wurden alle zu Verfügung stehenden 102 klinischen S. lugdunensis-isolate STLU auf Fibrinogen-Bindung getestet, um die Verteilung dieser Eigenschaft innerhalb der Spezies zu untersuchen. 0,7 0,6 0,5 od 550 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 STLU110 STLU109 STLU108 STLU107 STLU102 STLU100 STLU97 STLU90 STLU88 STLU86 STLU85 STLU83 STLU81 STLU76 STLU74 STLU72 STLU69 STLU65 STLU62 STLU58 STLU57 STLU55 STLU54 STLU53 STLU52 STLU51 STLU50 STLU45 STLU44 STLU43 STLU42 STLU41 STLU40 STLU39 STLU37 STLU35 STLU33 STLU32 STLU31 STLU28 STLU27 STLU25 STLU23 STLU21 STLU15 STLU12 STLU8 STLU7 STLU6 STLU1 Abbildung 24 Fibrinogenbindung von klinischen S. lugdunensis Isolaten. Es konnte bei 50 von 102 Isolaten (49%) eine Fg-Bindung festgestellt werden. Bei den Tests zeigten 52 Isolate (51%) keine Bindung, 14 Isolate zeigten eine schwache Bindung (od 550 0,023-0,059), 23 Isolate zeigten eine mittelstarke Bindung (od 550 0,060-0,299) und 13 Isolate eine sehr starke Bindung (ab od 550 0,3) an Fg. Als Negativkontrolle in den Tests wurde S. carnosus TM300 verwendet. Der Mittelwert von TM300 wurde bei allen Stämmen abgezogen. Die Bindung eines Isolates wurde als positiv bewertet, wenn der Mittelwert mindestens um die zweifache Standardabweichung im Vergleich zum Mittelwert von TM300 erhöht war. Die Abbildung 24 zeigt die Fg-Bindung aller S. lugdunensis Isolate, die eine Bindung im Adhärenztest mit Fg gezeigt haben. Die Intensität der Bindung divergiert innerhalb der Spezies von 0,023 (STLU33) -0,607 (STLU85). 79

91 Ergebnisse Fibronektin-Bindung von S. lugdunensis Es wurden alle zu Verfügung stehenden 102 klinischen S. lugdunensis Isolate STLU auf Fibronektin-Bindung getestet, um die Verteilung dieser Eigenschaft innerhalb der Spezies zu untersuchen. od 550 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 STLU108 STLU106 STLU105 STLU102 STLU101 STLU99 STLU98 STLU97 STLU92 STLU90 STLU89 STLU86 STLU85 STLU83 STLU82 STLU76 STLU75 STLU70 STLU69 STLU66 STLU62 STLU57 STLU55 STLU54 STLU51 STLU44 STLU43 STLU41 STLU40 STLU37 STLU36 STLU34 STLU33 STLU31 STLU30 STLU28 STLU26 STLU25 STLU23 STLU15 STLU1 Abbildung 25 Fibronektinbindung von klinischen S. lugdunensis Isolaten. Es konnte bei 41 von 102 Isolaten (40%) eine Fn-Bindung festgestellt werden. Bei den Tests zeigten 61 Isolate (60%) keine Bindung, sieben Isolate zeigten eine schwache Bindung (od 550 0,025-0,059), 21 Isolate zeigten eine mittelstarke Bindung (od 550 0,060-0,299) und 13 Isolate eine sehr starke Bindung (ab od 550 0,3) an Fn. Für diesen Test wurden Fn-beschichtete MTP von BD- Biocoat TM verwendet. Als Negativkontrolle wurde S. carnosus TM300 verwendet. Der Mittelwert von TM300 wurde bei allen Stämmen abgezogen. Die Bindung eines Isolates wurde als positiv bewertet, wenn der Mittelwert mindestens um die zweifache Standardabweichung im Vergleich zum Mittelwert von TM300 erhöht war. Die Abbildung 25 zeigt die Fn-Bindung aller S. lugdunensis Isolate, die eine Bindung im Adhärenztest mit Fn gezeigt haben. Die Intensität der Bindung divergiert innerhalb der Spezies von 0,023 (STLU106) -0,498 (STLU85). 80

92 Ergebnisse Erstellung von fbl-knockout-mutanten von S. lugdunensis Es wurden in dieser Arbeit Allelaustausch-Mutanten von fbl in den Stämmen DSM 4804, STLU8, STLU76 und STLU108 erstellt. Dies geschah über homologe Rekombination, bei der fbl durch ermb im Genom ersetzt wurde. Um dies möglich zu machen, wurde fbl mit 510 bp 5 und 486 bp 3 mittels PCR amplifiziert und in den puc18 Vektor kloniert. Mit einer reversen PCR wurden die Bereiche 5 und 3 vor und nach dem Gen zusammen mit dem puc18 amplifiziert. In dieses Amplifikat wurde die ermb-kassette kloniert. Dieses Konstrukt wurde dann von puc nach pbt2 umkloniert. Nach erfolgreicher Protoplastentransformation und homologen Rekombination mit anschließendem Curing von pbt2 wurden die so erstellten Mutanten mittels PCR/Southern Blot verifiziert. Es wurden fbl-mutanten von den Fg-bindenden S. lugdunensis Stämmen DSM4804, STLU8, STLU76 und STLU108 erstellt. Die fbl-mutanten von DSM4804 und STLU8 wurden mit pmb2504 (DSM4804) bzw. pmb2505 (STLU8) komplementiert. Abbildung 26 Southern Blot zur Verifizierung einer fbl-mutante in S. lugdunensis. Die Abb. zeigt (A) ein Agarosegel mit BamHI und XbaI-verdauter, chromosomaler DNA von S. lugdunensis DSM4804 (Spur 3 und 4) und DSM4804 Δfbl (Spur 5 und 6). In der 1. Spur befindet sich die 1 Kb-Ladder und in Spur 2 der digoxigenin-markierte Größenstandard (Roche). In (B) ist der Southern Blot zu dem darüber abgebildetem Gel dargestellt. Als Sonde 81

93 Ergebnisse wurde ein Teil des fbl-gens benutzt, der mit den Primern fbl-check hergestellt wurde. Im Southern Blot ist ein Signal bei der DNA des DSM4804 Wt zu erkennen und bei der fbl::ermb-mutante nicht. Weitere fbl-mutanten wurden mit PCR verifiziert (nicht gezeigt), wie in für S. saprophyticus beschrieben. Hierfür wurden die Primer fbl-check verwendet Charakterisierung von fbl-knockout-mutanten von S. lugdunensis 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 DSM 4804 DSM 4804 Δfbl DSM 4804 Δfbl pmb2504 STLU8 STLU8 Δfbl STLU8 Δfbl pmb2505 STLU76 od 550 STLU76 Δfbl STLU108 STLU108 Δfbl S.car TM300 S. aureus Newman ohne Zellen Abbildung 27 Charakterisierung der Fibrinogen-Bindung von fbl-mutanten von S. lugdunensis. Die Fibrinogenbindung der Δfbl-Stämme (orange) ist komplett aufgehoben. Die Komplementanten (grün), welche fbl auf pbr473 tragen, binden Fg wieder auf dem Niveau des Ausgangsstammes (blau). Als Negativkontrollen dienten der TM300 und Näpfe, in die keine Zellen gegeben wurden (grau). Als Positivkontrolle wurde S. aureus Newman 82

94 Ergebnisse verwendet. Die Daten stammen aus mindestens drei unabhängigen Versuchen mit mindestens vier Messwerten je Stamm. Die Abbildung 27 zeigt die Fg-Bindung der S. lugdunensis Ausgangsstämme, ihrer jeweiligen fbl::ermb-mutanten und der komplementierten Mutanten. 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 STLU108 STLU108 Δfbl STLU76 STLU76 Δfbl STLU8 STLU8 Δfbl od 550 STLU8 Δfbl +pmb2505 S. carnosus TM300 S. aureus Cowan Abbildung 28 Charakterisierung der Fibronektin-Bindung von fbl-mutanten von S. lugdunensis. Die Fibronektinbindung der Δfbl-Stämme (orange) ist bei STLU108 unverändert aber bei der Mutante in STLU76 komplett ausgelöscht. Der STLU8 Wt und fbl-mutante zeigen keine Fn-Bindung. Die pmb2505 (fbl aus STLU76) tragende Komplementante (grün) von STLU8 bindet schwach an Fn. Wt-Stämme sind blau dargestellt. Als Negativkontrollen dienten der TM300 und Näpfe in die keine Zellen gegeben wurden (grau). Als Positivkontrolle wurde S. aureus Newman verwendet. Die Daten stammen aus mindestens drei unabhängigen Versuchen mit mindestens vier Messwerten je Stamm. 83

95 Ergebnisse In Abbildung 28 ist die Charakterisierung der Fibronektinbindung der fbl- Mutanten dargestellt. Die fbl-mutante von STLU108 bindet an Fn wie der Wt. Die Fn-Bindung der fbl-mutante von STLU76 ist im Vergleich zu Wt auf das Niveau der Negativkontrolle reduziert. Weder der Ausgangsstamm noch die Mutante von STLU8 binden Fn. Die Komplementante von STLU8 Δfbl, die das fbl-gen aus STLU76 trägt, bindet schwach Fn. Abbildung 29 Charakterisierung der fbl-mutanten im Clumpingfaktortest. Die Abb. zeigt die Ergebnisse eines in der Diagnostik üblichen Schnelltests (hier: Staphytect Plus, Oxoid) zur Identifikation von Staphylococcus aureus mit S. lugdunensis Stämmen und den jeweiligen fbl-mutanten. Bildeten sich nach 30 sec Klumpen, wurde der Test als positiv bewertet. Alle fbl tragenden S. lugdunensis Stämme, die Fibrinogen binden, zeigen eine Verklumpungsreaktion im Staphytect Plus Schnelltest zur Identifizierung von S. aureus. Die jeweiligen Mutanten dieser Stämme, denen das fbl-gen fehlt, 84