Friedrich Lottspeich / Haralabos Zorbas (Hrsg.) Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlin

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1 Friedrich Lottspeich / Haralabos Zorbas (Hrsg.) Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg Berlin

2 Inhalt Bioanalytik - eine eigenständige Wissenschaft Teil I Proteinanalytik , ,2 2.6 Proteinreinigung Eigenschaften von Proteinen Proteinlokalisation und Reinigungsstrategie Homogenisierung und Zellaufsehluss Die Fallung Zentrifugution Zentrifugationstechniken Abtrennung von Salzen oder hydrophilen Verunreinigungen Konzentrierung Deiergen/ien und ihre Entfernung Eigenschanen von Detergenzien Entfernen von Detergenzien Probenvorbereitung für die Protcomanalyse 2, , Proteinbestimmungen Quantitative Bestimmung durch Färbetests Biuret-Assay Lowry-Assay Bicinchoninsäure-Assay (BCA-Assay) Bradford-Assay Spektroskopische Methoden Messungen im UV-Bereich Fluoreszenzmethode Radioaktive Markierung von Peptiden und Proteinen Iodierungen Enzymatische Aktivitätstests 4.1 der Enzymkinetik 4.2 Maßeinheiten der Enzymaktivität 4.3 Messtechniken Photometrische Aktivitätstests Kontinuierliche und diskontinuierliche Tests 4.4 Einflussgrößen auf die Enzymaktivität ph-wert und Puffersystem Temperatur 1 9 y Auswahl des Substrats Substratkonzentration Enzymkonzentration Enzymstabilität Aufbau eines Testsystems Störquellen und Fehlermöglichkeiten , Immunologische Techniken Antikörper Antikörper und lmmunabwehr Antikörper als Ruagei«Eigenschaften von Antikörpern Funküonullü Struktur von igg Antigenbindungsstelle (Hartstelle) Handhabung von Antikörpern Anügene Antigen-Aiitikorper-Rcakiion Immimaggluflnntion Immunprü/.ipilation Immunbindung Western-Blotting; Proteintransfer, Immobilisierung und Immundetektion Herstellung von Antikörpern Arten von Antikörpern Chemische Modifikation von Proteinen und Proteinkomplexen 6.1 Chemische Modifikation funktioneller Gruppen von Proteinen 6.2 Modifizierung als Mittel zur Einführung von Reportergruppen Untersuchungen an natürlich vorkommenden Proteinen Untersuchungen an überexprimierten oder mutierten Proteinen 6.3 Protein-Cross-Linking zur Analyse von Protein-Wechselwirkungen Bifunktionelle Reagenzien Photoaffinitätsmarkierung Spektroskopie Physikalische Prinzipien und Messtechniken M h

3 XII INHALT Physikalische optischer spektroskopischer Messmethoden Wechselwirkung Licht-Materie Absorptionsmessungen Photometer Kinetische spektroskopische Untersuchungen UV/VIS/NIR-Spektroskopie Chromoproteine IR-Spektroskopie Molekülschwingungen Messtechniken Infrarotspektroskopie von Proteinen Raman-Spektroskopie Raman-Experimente Resonanz-Ramanspektroskopie Fluoreszenzspektroskopie Fluoreszenzspektren als Emissionsspektren und als Aktionsspektren Fluoreszenzuntersuchungen mit intrinsischen und extrinsischen Fluorophoren Methoden mit polarisiertem Licht Lineardichroismus Optische Rotationsdispersion und Circulardichroismus Spaltung von Proteinen Proteolytische Enzyme Strategie Denaturierung Spaltung von Disulfidbrücken und Alkylierung Enzymatische Fragmentierung Proteasen Proteolysebedingungen Chemische Fragmentierung Ausblick Chromatographische Trennmethoden Prinzip der Chromatographie Grundbegriffe Instrumentierung Stationäre Phasen Detektion der chromatographischen Trennung Chromatographische Theorie Reinigungsstrategie für Peptide und Proteine Ionenaustausch-Chromatographie Hydroxyapatit-Chromatographie Reversed-Phase-Chromatographie Hvdroohobe Interaktionschromatogranhie Affinitätschromatographie 9.9 Ausschlusschromatographie Elektrophoretische Verfahren Geschichtlicher Überblick Theoretische Instrumentierung und Durchführung von Gelelektrophoresen Probenvorbereitung Gelmedien für Elektrophoresen Nachweis und Quantifizierung der getrennten Proteine Zonenelektrophorese Porengradientengele Puffersysteme Disk-Elektrophorese Saure Nativelektrophorese SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese Blaue Nativ-Polyacrylamidgel- Elektrophorese Isoelektrische Fokussierung Präparative Verfahren Elektroelution aus Gelen Präparative Zonenelektrophorese Präparative isoelektrische Fokussierung Hochauflösende zweidimensionale Elektrophorese Trägerfreie Elektrophorese Elektroblotting Blotsysteme Der Blotvorgang Die Wahl der geeigneten Blotmembran Kapillarelektrophorese Geschichtlicher Überblick Prinzip der Kapillarelektrophorese Gerätetechnik Injektion der Proben Detektion Theoretische Elektroosmotischer Fluss Joulesche Wärmeentwicklung Trennprinzipien in der CE Kapillarzonenelektrophorese (CZE) Elektrodispersion Auflösung Trennungsoptimierung Kapillaraffmitätselektrophorese (CAE) Micellarelektrokinetische Chromatographie (MEKC) Theoretische Chirale MEKC Kapillargelelektrophorese (CGE) Isoelektrische Fokussierung (CIEF) Einschrittfoku s sierung

4 INHALT XIII Fokussierung mit Druck-/Spannungsmobilisierung Fokussierung mit chemischer Mobilisierung Isotachophorese (ITP) Spezielle Applikationen Online-Probenkonzentrierung CE-MS-Kopplung Fraktionierung Ausblick Aminosäurenanalyse Probenvorbereitung Saure Hydrolyse Alkalische Hydrolyse Enzymatische Hydrolyse Freie Aminosäuren Derivatisierung Nachsäulenderivatisierung Vorsäulenderivatisierung Datenauswertung und Beurteilung der Analysen Proteinsequenzanalyse Af-terminale Sequenzanalyse: Der Edman-Abbau Reaktionen des Edman-Abbaus Identifizierung der Aminosäuren Die Qualität des Edman-Abbaus: Die repetitive Ausbeute Instrumentierung Probleme der Aminosäuresequenzanalyse Stand der Technik C-terminale Sequenzanalyse Chemische Abbaumethoden Peptidmengen und Qualität des chemischen Abbaus Abbau der Polypeptide mit Carboxypeptidasen Carboxy-terminale Leitersequenzierung Massenspektrometrie Matrix-unterstützte Laserdesorptions / Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) Ionisierungsprinzip Massenanalyse der Ionen mit dem Flugzeitmassenspektrometer Detektion der Ionen Molekulargewichtsbestimmung mit MALDI Sequenzierung von Peptiden mit MALDI Kopplung von MALDI-MS und PAGE Elektrospray-Ionisations- Massenspektrometrie (ESI-MS) Ionisierungsprinzip ESI-Quelle und Interface Massenanalyse der Ionen mit dem Quadrupolmassenspektrometer Massenanalyse mit der Ionenfalle Molekulargewichtsbestimmung mit ESI-MS Strukturanalyse mit ESI-MS Sequenzierung von Peptiden mit ESI-MS Teil II 3D-Strukturaufklärung 15 NMR-Spektroskopie von Biomolekülen Theorie der NMR-Spektroskopie Kernspin und Energiequantelung Continuous-Wave-Spektroskopie Gepulste Fourier-Transformationsspektroskopie Besetzungszahlen und Gleichgewichtsmagnetisierung Die Bloch-Gleichungen Relaxation Eindimensionale NMR-Spektroskopie Das ld-experiment Spektrale Parameter Zweidimensionale NMR-Spektroskopie Aufbau eines 2D-Spektrums Das COSY-Spektrum Das TOCSY-Spektrum Das NOESY-Spektrum Homonukleare 2D-NMR-Experimente von Proteinen: Grenzen der Anwendung Heteronukleare NMR HSQC Dreidimensionale NMR-Spektroskopie NOESY-HSQC-und TOCSY-HSQC- Experiment HCCH-TOCSY- und HCCH-COSY- Experiment Tripelresonanzexperimente Signalzuordnung Sequentielle Zuordnung homonuklearer Spektren Auswertung heteronuklearer 3D-Spektren Selektive Aminosäuremarkierung Sequentielle Zuordnung mit Tripelresonanzspektren Bestimmung der Proteinstruktur Randbedingungen für die Strukturrechnung Bestimmung der Sekundärstruktur Berechnung der Tertiärstruktur Proteinstrukturen und mehr - ein Ausblick Bestimmung der Dynamik Untersuchung von Protein-Ligand- Komplexen Proteinfaltung

5 XIV INHALT Elektronenmikroskopie Transmissionselektronenmikroskopie - Instrumentation Präparationsverfahren Negativkontrastierung Bedampfung mit Schwermetallen Einbettung in Eis Zweidimensionale Kristallisation von Proteinen Abbildung von Molekülen im Elektronenmikro skop Auflösung eines Transmissionselektronenmikroskops Wechselwirkung des Elektronenstrahls mit dem Objekt Bildanalyse, Bildverarbeitung und 3D-Rekonstruktion Fourier-Transformation Analyse der Kontrastübertragungsfunktion und der Kristallinität des Objekts Digitalisierung Erhöhung des Signal-zu-Rausch- Verhältnisses Korrespondenzanalyse und Klassifizierung Dreidimensionale Elektronenmikroskopie Rastersondenmikroskopie Rastertunnelmikroskopie Rasterkraftmikroskopie Röntgenstrukturanalyse 17.1 Kristallisation 17.2 Kristalle und Röntgenbeugung 17.3 Das Phasenproblem Isomorpher Ersatz: SIR und MIR Multiple anomale Dispersion (MAD) Molekularer Ersatz (MR) 17.4 Modellbau und Strukturverfeinerung Wichtige Monosacchandbausteme Die Reihe der L-Zucker Die glykosidische Bindung Die Proteinglykosylierung Aufbau der JV-Glykane Der Aufbau der O-Glykane Glykoanalytik am intakten Glykoprotein Ist mein Protein glykosyliert? Charakterisierung der Glykosylierung mittels Lectinen Isoelektrische Fokussierung Analyse der neutralen Monosaccharidkomponenten N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure) Freisetzung und Isolierung des Af-Glykanpools Enzymatische Freisetzung mittels PNGase F Enzymatische Freisetzung mittels Endoglykosidasen Chemische Freisetzung mittels Hydrazinolyse Isolierung einzelner TV-Glykane Charakterisierung der Glykane im Glykanpool Mapping nicht-derivatisierter TV-Glykane Mapping derivatisierter./v-glykane Mapping mittels Kapillarelektrophorese (HPCE) Glykoanalytik isolierter N-Glykane (Strukturanalyse) Kompositionsanalyse Methylierungsanalyse Sequenzierung in Verbindung mit Gelfiltration FAB-MS (Fast Atom Bombardment- Massenspektrometrie) ^-NMR-Spektroskopie Schlussbetrachtung Teil III Spezielle Stoffgruppen Analytik synthetischer Peptide Prinzip der Peptidsynthese Untersuchung der Reinheit synthetischer Peptide Charakterisierung und Identität synthetischer Peptide Charakterisierung der Struktur synthetischer Peptide Analytik von Peptidbibliotheken Kohlenhydratanalytik 19.1 Allgemeine stereochemische Die Reihe der D-Zucker Stereochemie der D-Glucose Lipidanalytik Aufbau und Einteilung von Lipiden Extraktion von Lipiden aus biologischem Material Flüssigphasenextraktion Festphasenextraktion Methoden der Lipidanalytik Chromatographische Methoden Massenspektrometrie Immunoassays Weitere Methoden in der Lipidanalytik Online-Kopplung verschiedener Analysesysteme Analytik ausgewählter Lipidklassen Gesamtlipidextrakte Fettsäuren Unpolare Neutraliipide

6 INHALT ÄV Polare Esterlipide Lipidhormone und intrazelluläre Signaltransduktoren Lipidvitamine Ausblick Kolonie- und Plaque-Hybridisierungen Fragmentisolierung Elektroelution Reinigung über Gelfiltrations- oder Reversed-Phase-Säulen Andere Methoden Teil IV Nucleinsäure-Analytik Isolierung und Reinigung von Nucleinsäuren Reinigung und Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäuren Phenolextraktion Gelfiltration Ethanolpräzipitation der Nucleinsäuren Konzentrationsbestimmung von Nucleinsäuren Isolierung genomischer DNA Isolierung niedermolekularer DNA Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien Isolierung niedermolekularer DNA aus eukaryontischen Zellen Isolierung viraler DNA Isolierung von Phagen-DNA Isolierung von DNA aus eukaryontischen Viren Isolierung einzelsträngiger DNA Isolierung von Ml3-DNA Trennung von einzel- und doppelsträngiger DNA Isolierung von RNA Isolierung von cytoplasmatischer RNA Isolierung von poly(a) + -RNA Aufarbeitung von Nucleinsäuren Restriktionsanalyse Prinzip der Restriktionsanalyse Historischer Überblick Restriktionsenzyme Der Restriktionsansatz und seine Anwendungen Elektrophorese Gelelektrophorese von DNA Gelelektrophorese von RNA Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) Zweidimensionale Gelelektrophorese Färbemethoden Fluoreszenzfarbstoffe Silberfärbung Nucleinsäure-Blotting Blotting-Verfahren Wahl der Membranen S outhern-b lotti ng Northern-Blotting Dot- und Slot-Blotting Hybridisierung und Nachweistechniken der Hybridisierung Prinzip und Durchführung der Hybridisierung Spezifität der Hybridisierung und Stringenz Hybridisierungsformate Sonden zur Nucleinsäureanalytik DNA-Sonden RNA-Sonden PNA-Sonden Markierungsverfahren Markierungspositionen Enzymatische Markierungsreaktionen Photochemische Markierungsreaktionen Chemische Markierungsreaktionen Nachweissysteme Färbemethoden Radioaktive Systeme Nichtradioaktive Systeme Amplifikationssysteme Targetamplifikation Targetspezifische Signalamplifikation Signalamplifikation Polymerase-Kettenreaktion Möglichkeiten der PCR Instrumentierung Amplifikation von DNA Amplifikation von RNA (RT-PCR) Optimierung der Reaktion Quantitative PCR Spezielle PCR-Techniken Nested-PCR Asymmetrische PCR Einsatz von degenerierten Primern Multiplex-PCR Cycle-Sequencing In-vitro-Mutagenese Weitere Verfahren Kontaminationsproblematik Vermeidung von Kontaminationen Dekontamination Anwendungen Nachweis von Infektionskrankheiten Nachweis von genetischen Defekten Humangenomproj ekt Alternative Verfahren der Amplifikation

7 XVI INHALT NASBA (nucleic acid sequence based amplification) SDA (Strand displacement amplification) LCR (Ligase-Kettenreaktion) bdna (branched DNA amplification) 24.7 Ausblick DNA-Sequenzierung GelgestützteDNA-Sequenzierungsverfahren Sequenzierung nach Sanger: das Didesoxy-Verfahren Markierungstechniken und Nachweisverfahren Chemische Spaltung nach Maxam und Gilbert Gelfreie DNA-Sequenzierungsmethoden Analyse der genomischen DNA-Methylierung 26.1 Detektionsmethoden der DNA-Basenmethylierung: Definitionen 26.2 Detektionsmethoden Niedrigste horizontale Auflösung: Detektion und Quantifizierung des Gesamtgehaltes an einem methylierten Nucleosid und seiner Dinucleotidzusammensetzung Mittlere horizontale Auflösung: Kartierung einer Teilmenge aller modifizierten Stellen auf Nucleotidsequenz-Ebene Höchste horizontale Auflösung: Kartierung aller modifizierten Stellen auf Nucleotidsequenz-Ebene 27 Protein-DNA-Wechselwirkungen 27.1 Nachweisverfahren für Protein-DNA- Wechselwirkungen Filterbindung EMSA McKay-Assay Southwestern und verwandte Techniken 27.2 Analyse der Proteinbindungsstelle auf der DNA In vitro-footprints Weitere in vitro-methoden zur Analyse von Proteinbindungsstellen auf der DNA Direkte genomische Sequenzierung und in vivo/in situ-footprints 27.3 Native elektrophoretische Verfahren zur Analyse von Veränderungen der DNA-Sekundärstruktur Teil V Funktionsanalytik Sequenzdatenanalyse Bioinformatik Bioinformatik im Internet Sequenzanalyse Sequenzsignale: Funktionale Motive Identifizierung codierender Bereiche Peptideigenschaften Ein neuronales Netz zur Erkennung von Sekretionssignalsequenzen Sekundärstrukturanalysen Sequenzmotive Phylogenetische Analyse Suche nach homologen Sequenzen Identität, Ähnlichkeit und Homologie Die Mutationsdatenmatrix (MDM) Dotplots Optimales Alignment: dynamic programming Multiple Alignments Alignment für schnelle Datenbanksuchen Profilbasierte Datenbanksuchen Wege zur Tertiärstruktur Homologiemodellierung Threading Ab-initio-Strukturvorhersagen Ausblick Proteomanalyse Methoden der Proteomanalyse Definition der Ausgangsbedingungen und Fragestellung Probenvorbereitung Trennung der Proteine Bildverarbeitung und Quantifizierung der Proteine Identifizierung und Charakterisierung der Proteine Bioinformatik Diskussion und Ausblick Genomanalyse mit Methoden der molekularen Cytogenetik Die Technik der Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung Historischer Überblick und technische Durchführung FISH-Sonden Nachweis durch Fluoreszenzfarbstoffe Experimentelle Durchführung Anwendungen von FISH für die Analyse genomischer DNA FISH bei Metaphasechromosomen Fiber-FISH

8 INHALT XVII Interphasecytogenetik Vergleichende genomische Hybridisierung Dreidimensionale Genomstruktur Physikalische und genetische Genkartierung Genetische Kartierung: Lokalisierung von Loci im Genom Rekombination Genetische Marker Kopplungsanalyse - die Erstellung genetischer Karten Die genetische Karte des menschlichen Genoms Genetische Kartierung von Krankheitsgenen Physikalische Kartierung Restriktionskartierung ganzer Genome Kartierung mittels rekombinanter Klone Erstellung der physikalischen Karte Isolierung und Identifizierung von Genen Transkriptkarten des menschlichen Genoms Gen und vererbbare Krankheit - die Mutationssuche Integration der Genkarten Das Humangenom-Projekt Differentielle Genaktivität Grundprinzip des Differential Display Experimentelle Durchführung des Differential Display RNA-Isolierung Synthese der cdna Amplifikation durch die erste PCR Modifikationen der PCR und der Nachweisreaktion Polyacrylamidgelelektrophorese Aufreinigung von PCR-Produkten Northern-Blot-Analyse Klonierung der cdnas Alternative zur Northern-Blot- Analyse:Differential Screening Alternativen zur Klonierung Leistungsfähigkeit des Differential Display Differentielle Hybridisierung Subtraktionshybridisierung Stärken des Differential Display Schwächen des Differential Display Einsatzmöglichkeiten des Differential Display Analyse von Promotorstärke und aktiver RNA-Synthese Methoden zur Analyse von RNA-Transkripten Überblick Nuclease-Sl-AnalysevonRNA Ribonuclease-Protektionsassay (RPA) Primerverlängerung (Primer Extension) Northern-Blotting, Dot- und Slot-Blotting Quantitative Polymerasekettenreaktion Analyse der RNA-Syntheserate in vivo (Nuclear-Run-on-Assay) Zellaufschluss Die Nuclear-Run-on-Transkription und Detektion der Transkripte Die in-vitro-transkription klonierter Gene in Extrakten und Proteinfraktionen Komponenten des in-vitro-transkriptionsansatzes Herstellung transkriptionsaktiver Extrakte und Proteinfraktionen Promotorspezifische Matrizen-DNA und Detektion der in-vitro-transkripte Die in-vivo-analyse klonierter Promotoren in Säugerzellen Plasmidvektoren für die Analyse von ds-aktiven Elementen in Säugerzellen Einschleusen von Fremd-DNA in Säugerzellen Die Charakterisierung der in-vivo- Transkripte der Monierten Promotoren Protein-Protein-Wechselwirkungen: das Two-Hybrid-System Das Konzept des Two-Hybrid-Systems Die Elemente des Two-Hybrid-Systems Konstruktion des Köderproteins für das Two-Hybrid-System und Analyse seiner biologischen Aktivität Aktivatorfusionsprotein und cdna- Bibliotheken Durchführung des Two-Hybrid-Screenings Biochemische und funktionale Analyse der Interaktoren Modifizierte Anwendungen und Weiterentwicklungen der Two-Hybrid- Technologie Assoziationen zwischen Makromolekülen: Analytische Ultrazentrifugation Instrumentelle Grundtypen von Experimenten Sedimentationsgleichgewichts-Experimente Gezielte Genmodifikation 921 In vitro-mutagenese 922 Strategien zur gezielten Gendisruption 924 Vom DNA-Konstrukt zur Maus 926

9 XVIII INHALT Mikroinjektion von ES-Zellen in Blastocysten und Morulaaggregation von ES-Zellen Pronucleusinjektion von DNA, virale Infektion 36.4 Das Cre/loxP-Rekombinasesystem als Beispiel für einen Genschalter 36.5 Strategien zur gezielten Genmodifikation unter Verwendung von Genschaltern 36.6 Konditionale Mutagenese 37 Oligonucleotide als zellbiologische Werkzeuge 37.1 Die Geschichte der Oligonucleotide 37.2 Antisense-Oligodesoxyribonucleotide Mögliche Mechanismen der Expres sionshemmung Modifikationen von Oligodesoxyribonucleotiden zur Steigerung der intrazellulären Stabilität Kombination von Antisense- Oligodesoxyribonucleotiden mit funktioneilen Gruppen Antisense-Oligonucleotide als neue Arzneimittel Chimäre Oligodesoxyribonucleotide 37.6 Anwendungen und Ausblick Triplex-bildende Oligodesoxyribonucleotide 951 Ribozyme Aptamere: Hochaffine RNA- und DNA- Oligonucleotide Überexpression 38.1 Probleme und Lösungsstrategien Toxizität Proteolyse Translation und Codon-Aus wähl Modifikationen Disulfidverbrückung Aggregation und Bildung von Inclusion Bodies (Einschlusskörpern) 38.2 Möglichkeiten der Überexpression Überexpression als Inclusion-Body-Protein Überexpression als Fusionsprotein Sekretion bei Prokaryonten Oberflächenexpression 38.3 Expressions Systeme in E. coli 38.4 Expression in grampositiven Bakterien 38.5 Expression in Hefe Expression in Saccharomyces cerevisiae Expression in methylotrophen Hefen Cytosolische Expression Sekretion in Hefe 38.6 Genexpression in Insektenzellen 38.7 Expression in Säugerzellkulturen 38.8 Expression in transgenen Tieren 38.9 Expression in pflanzlichen Systemen Anhang Anhang 1 Anhang 2 Anhang 3 Strahlenschutz im Labor Aminosäuren und posttranslationale Modifikationen Abkürzungen Index 1017