Herstellung und Konservierung von zellulären Blutkomponenten

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1 Herstellung und Konservierung von zellulären Blutkomponenten Prof. Dr. med. Hermann Eichler Institut für Klinische Hämostaseologie und Transfusionsmedizin Medizinische Fakultät der Universität und Universitätsklinikum des Saarlandes

2 Inhaltsübersicht 1. Herstellung von Blutkomponenten: - Gewinnung von Vollblutspenden - Präparation zellulärer Blutkomponenten aus Vollblutspenden (Fraktionierung von Vollblut, Präparation von EKs / TKs) 2. Konservierung von zellulären Blutkomponenten - Medien zur Flüssiglagerung von EKs / TKs - Einfluss auf Präparate-Qualität in vitro - Einfluss Lagerungsdauer EK auf klinisches Outcome

3 Herstellungsschritte zur Gewinnung von Vollblutspenden

4 Blutversorgung in Deutschland Daten Paul-Ehrlich-Institut aus 2011: 4,93 Mio. Vollblut-Spenden 2,41 Mio. Apherese-Spenden Plasma 191 TSD Apherese-Spenden Thrombozyten Präparate (freigegeben): 4,79 Mio. Erythrozyten-Konzentrate 1,14 Mio. Einheiten Therapeutisches Plasma 574 Tsd. Thrombozyten-Konzentrate (60,6% Apherese) Henseler O, et al. Bundesgesundheitsblatt 2013;56:1352

5 Entwicklung des Spendenaufkommens Henseler O, et al. Bundesgesundheitsblatt 2013;56:1352

6 Anzahl Vollblut-Spenden pro Einwohner (2006) Henseler O, et al. Transfus Med Hemother 2011;38:

7 Herstellungsschritte zur Präparation zellulärer Blutkomponenten aus Vollblutspenden

8 Fraktionierung von Vollblutspenden 1.

9 Bedingungen Vollblut-Zentrifugation (Beispiel Roto Silenta RS, Fa. Hettich) i 22 C (Buffy coats für TK-Produktion) i Anlauf-Phase 4 min i Plateau-Phase 12 min (UpM 3.500, x g) i Auslauf-Phase 14 min i Bremse schwach i Gesamtdauer 30 min

10 Blutkomponenten nach Zentrifugation Plasma Thrombozyten, Leukozyten Erythrozyten

11 2. Präparation leukozytendepletierter Erythrozytenkonzentrate

12 Beispiel Spezifikation Erthrozytenkonzentrat leukozytendepletiert, SAG-M i Packungsgröße Standard: 250 ml +- 20% ( ) i Packungsgröße Babyportion: 60 ml +- 20% (45-70) i Hämoglobin-Gehalt: 50 g (40-65) i Hämatokrit: 60 % (50-70) i Leukozyten-Gehalt: < 1 x 10 6 i Plasma-Gehalt: i SAG-M-Gehalt: i Glucose: i Adenin: i Mannitol: i Haltbarkeit: < 25 ml 100 ml ~ 1 g ~ 15 g ~ 0,5 g 42 Tage bei 4 C (2-6 C)

13 Qualitätskriterien von EK mit SAG-M-Additivlösung i Maximale Lagerzeit (4+-2 C): 42 d (PAGGS-M 49d) i Hämolyserate nach Laufzeit-Ende: < 0,8 % der Ery-Masse i Recovery 24h nach Transfusion: > 75 % (35d: 83,5%) i Mittlere Überlebenszeit: ~ 60 Tage i Hb-Anstieg nach Transfusion: ~ 1-1,5 g/dl i HCT-Anstieg nach Transfusion: ~ 3-4 % i Substitution bei Aplasie (2 x 12 ml pro Tag): ~ 1EKproWoche

14 Spezial-Präparationen: Bestrahltes EK i Behandlung eines frischen EKs mit ionisierenden Strahlen (30 Gy, γ-stahlung, Kalium im zellfreien Überstand < 80 mmol/l ). i Ziel: Inhibierung der Proliferationsfähigkeit von Lymphozyten i Indikation: Patienten mit ausgeprägten angeborenen oder erworbenen Immundefekten Beispiele: SCID, intrauterine Transfusion, ausgeprägte Frühgeburtlichkeit, allogene und autologe Stammzell- Transplantation, M. Hodgkin, Fludarabin-Therapie, gerichtete Blutspende von Blutsverwandten

15 Spezial-Präparationen: Gewaschenes EK i Wiederholtes Auffüllen der Zellsuspension mit isotoner Waschlösung (SAG-M, NaCl 0,9%) im geschlossenen System, Zentrifugation, Abpressen der Waschlösung i Ziel: Weitgehende Entfernung des Restplasmas aus dem EK i Indikation: Nur bei nachgewiesener oder dringlich vermuteter Protein-Unverträglichkeit des Patienten (z.b. bei Anti-IgA Antikörpern bei hereditärem IgA-Mangel)

16 Spezial-Präparationen: Kryokonserviertes EK i Tieftemperatur-Konservierung von Erythrozyten mit speziellen Kälteschutz-Lösungen (HAES, Glycerin) i Ziel: Langzeit-Lagerung von Erythrozyten bei z.b. seltenen Konstellationen von Blutgruppen-Antigenen, jedoch keine unbegrenzte Lagerung. i Indikation: Patienten mit seltenen Blutgruppen-Antikörpern (z.b. Anti-Vel, Anti-Lan oder immunes Anti-H -> Bombay- Blut )

17 Herstellung gefrorenes Frischplasma 3.

18 Beispiel Spezifikation GFP (Quarantänelagerung) i Packungsgröße Standard: 300 ml ( ) i Packungsgröße Babyportion: 40 ml +- 10% (36-44) i Thrombozyten-Gehalt: < 20 x 10 6 / ml i Leukozyten-Gehalt: < 0,5 x 10 6 / ml i Erythrozyten-Gehalt: < 6 x 10 6 / ml i Faktor VIII:C-Gehalt: ~ 0,9 U/ml (> 0,7 U/ml) i Haltbarkeit: 24 Monate bei unter -30 C

19 4. Herstellung von leukozytendepletierten Thrombozytenkonzentraten aus gepoolten Buffy coats

20 Beispiel Spezifikation Thrombozytenkonzentrat (Additivlösung T-Sol, 4er-Pool) i Packungsgröße: 250 ml ( ) i Plasma-Gehalt: ~ 32 % (67-100) i Thrombozyten-Gehalt: 3 x (>2,4-5) i Leukozyten-Gehalt: < 1 x 10 6 i Erythrozyten-Gehalt: < 2 x 10 9 i ph nach 5 d Lagerung: 7,0 (6,5-7,4) i Haltbarkeit: 5 Tage bei 22 (+- 2) C i Abhängig von Additivlösung (PAS III M) kann die Notwendigkeit zur ständigen Agitation stark abnehmen van der Meer PF, et al. Vox Sang 2005;88:

21 5. Hämaphereseverfahren zur Herstellung zellulärer Blutkomponenten

22 Medien zur Flüssiglagerung von Erythrozyten

23 Flüssiglagerung von Erythrozyten i Erste Lagerungsversuche von Kaninchen-RBCs in Zitrat- Glukose-Lösung über 4 Wochen im Kühlschrank. i Kein Auftreten von in vitro-hämolyse, nach Retransfusion Anstieg von HCT ohne Hämoglobinurie. i Einsatz im 1. Weltkrieg von über 26 Tage gelagerten Vollblut-Konserven in Zitrat-Glukose-Lösung. i Später Einführung von ausschließlich Zitrat-gelagertem Vollblut über 5 Tage. Rous P, Turner JR. J Exp Med 1916;23: Robertson OH. Br Med J 1918;1:691-5

24 Vorteile der Konservierung von Erythrozyten i Anlage eines Reservoirs von Präparaten ( Blut-Bank, Blut-Konserve ). i Jederzeitige Verfügbarkeit in ausreichender Menge. i Veränderung des Ablaufs von Vollblut-Spenden, Möglichkeit der Verarbeitung. i Möglichkeit der Etablierung von Qualitätskontrollen und Freigabe-Testen.

25 Veränderungen von Erythrozyten bei Flüssiglagerung i Verlangsamter Stoffwechsel mit Abfall von ATP. i Glykolyse und Entwicklung von Laktat-Azidose. i begleitender Abfall von 2,3-DPG, nahezu kompletter Verlust nach ca. 10 d. i Reduzierte Ionenpumpen-Aktivität mit Verlust von intrazellulärem Kalium, Verschiebung der Elektrolyt- Konzentrationen. i Bakterielle Kontamination (1 : ). Zimrin AB et al, Vox Sang 2009;96:93-103

26 i Azidose und abfallendes ATP induzieren Formveränderungen ( Stachelzellen ) und verschlechterte Fließeigenschaften. Veränderungen von Erythrozyten bei Flüssiglagerung i Zunächst reversibel ( Rejuvination ), später irreversibel. i Anstieg der Rate von Endothel-adhärenten Erythrozyten um ca. 50% bis 4 Wochen nach Herstellung (HUVEC-Modell). i Bindungsstärke an Endothel nimmt mit Ausmaß der RBC- Schädigung zu (BC-Lagerung vs. Leukozyten-Reduktion). Relevy H, et al. Transfusion 2008;48: Anniss AM, et al. Transfusion 2006;46:1561-7

27 Irreversible Veränderungen von Erythrozyten bei Flüssiglagerung i Verursacht u.a. durch ansteigende intrazell. Ca 2+ -Konzentration. i Restleukozyten werden durch Azidose aktiviert; Freisetzung von Phospholipasen und Zytokinen. i Bildung von O 2 -Radikalen mit Veränderung von Membran- Proteinen und Lipiden. i Veränderung von Membran-Phospholipiden, Membran-Verlust durch Bildung von Mikrovesikeln. i Reduzierte Fließeigenschaften und erhöhte Endothel-Bindung gelagerter RBCs könnte Einfluss auf kapillären Blutfluss und O 2 - Versorgung der Gewebe haben. Relevy H, et al. Transfusion 2008;48: Anniss AM, et al. Transfusion 2006;46:1561-7

28 Qualitätskriterien für gelagerte Erythrozyten i Ausbleiben von Hämolyse in vitro. i Bestimmung von Stoffwelchsel-Parametern (ATP). i In vivo-überleben nach Retransfusion: Messung der 24-h in vivo-recovery von Cr 51 -markierten Erys. Dumont LJ, et al. Transfusion 2008;48:

29 Probleme von Lagerversuchen mit EKs Große interindividuelle Unterschiede bzgl. der Lagerungsstabilität von Erythrozyten (Unterschiede von %). Messverfahren zur Bestimmung von ATP-Gehalt von Erys sowie in vivo Recovery sind nicht sehr präzise. Schlechte Korrelation von in vitro und in vivo Daten zur Ery-Viabilität.

30 % 24 Hr RBC Recovery Korrelation zwischen ATP und Viabilität r 2 = RBC ATP Concentration µmol/g Hgb Repeat assays of ATP concentration differ by 5%. Repeat measures of RBC recovery also differ with a SD of 5%. Hess JR, privat communication

31 Qualitätskriterien für gelagerte Erythrozyten 24-h Recovery, in % Vollblut, ACD, 21 d 75 Vollblut, CPD, 21 d 79 Vollblut, CPDA-1, 35 d 81 Ery-Konzentrat, 72 CPDA-1, 35 d Erys in Additivlösungen 82 (AS-1, -3, -5) nach Leukodepletion 84 Zimrin AB et al, Vox Sang 2009;96:93-103

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33 Glucose (mg/dl) ml Erythrozyten in CPDA-1 bei 4 C verbrauchen 3 mmol Glukose über 35 Tage. Erwärmung auf 25 C für 24h an Tag 6 oder 20 erhöht den Glukoseverbrauch um den Faktor 10.! 4 C über gesamte Lagerung! 25 C an Tag 6 " 25 C an Tag 20 Time (Days) Hess JR, Transfusion 1998

34 ml Erythrozyten in CPDA-1 bei 4 C produzieren 6 mmol H + -Ionen über 35 Tage und erniedrigen den ph um 0,5. Der Ery-Metabolismus stoppt bei ph = 6, ph ! 4 C über ges. Lagerung! 25 C an Tag 6 " 25 C an Tag Time (Days) Hess JR, Transfusion 1998

35 5 ATP (mmol/g hb) ! 4 C über ges. Lagerung! 25 C an Tag 6 " 25 C an Tag Tage Hess JR, Transfusion 1998

36 Morphologische Veränderungen von Erys während Lagerung, Morphology Scoring Usry RT, et al. Vox Sang 1975; 28:

37 100 Morphologic Index ! 4 C über ges. Lagerung! 25 C an Tag 6 " 25 C an Tag Time (Days) Hess JR, Transfusion 1998

38 free Hemoglobin (mg/dl) ! 4 C über ges. Lagerung! 25 C an Tag 6 " 25 C an Tag Time (Days) Transfusion 1998 Hess JR, Transfusion 1998

39 Hess JR, et al. Transfusion 2006; 46:50-54

40 Hess JR, et al. Transfusion 2006;46:50-54

41 Hess JR, et al. Transfusion 2003;43:

42 Beeinflusst die Lagerung von EK das klinische Outcome? i Veränderungen während der Lagerung von Erythrozyten nachweisbar, aber auch klinische Relevanz für Patienten? i Wichtige prospektive Studien abgeschlossen (Age of RBC in Premature Infants; Age of Blood Evaluation (ABLE) Study; Red Cell Storage Duration Study (RECESS)). Leal-Noval SR, et al, Crit Care Med 2008;36: Koch CG, et al. NEJM 2008;358: Weinberg JA, et al. J Trauma 2008;65: Tinmouth A, et al. Transfusion 2006;46: Steiner ME, et al. Trans Apher Sci 2010;43:107-16

43 ARIPI Trial: Effect of Fresh RBC Transfusions on Clinical Outcomes in Premature, Very Low-Birth-Weight Infants i To determine if RBCs stored for 7 days or less compared with usual standards will improve outcomes in premature, very low-birth-weight infants requiring a transfusion Fergusson DA, et al; JAMA 2012;308:

44 Fergusson DA, et al; JAMA 2012;308:

45 ARIPI Trial Fergusson DA, et al; JAMA 2012;308:

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48 ARIPI Trial Fergusson DA, et al; JAMA 2012;308:

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50 ARIPI Trial: Conclusion i The use of fresh RBCs compared with standard blood bank practice did not improve outcomes in premature, very low-birth-weight infants requiring a transfusion Fergusson DA, et al; JAMA 2012;308:

51 The effect of blood storage age on treatment of lactic acidosis by transfusion in children with severe malarial anaemia: a pilot, randomized, controlled trial i To evaluate the effect of blood storage age on resolution of lactic acidosis in children with severe malarial anaemia i short storage age (1 to 10 days) or long storage age (21 35 days) i To demonstrate feasibility of conducting a large trial Dhabangi A, et al. Malaria Journal 2013;12:55

52 Profile of study participants with severe malarial anaemia and lactic acidosis at Mulago Hospital during Dec 2010 Aug 2011

53 Time to lactic acidosis resolution among children with severe malarial anaemia and lactic acidosis; N=74 Dhabangi A, et al. Malaria Journal 2013

54 Vital signs before and 2 h after start of transfusion red: short-storage; blue: long storage Dhabangi A, et al. Malaria Journal 2013

55 The Age of Blood Evaluation (ABLE) Randomized Controlled Trial i Design: double-blind, multicenter. Hypothesis: transfusion of prestorage leukoreduced RBCs stored for 7 days or less (fresh arm) as compared with standard-issue RBCs stored 15 to 20 days (control arm) will lead to lower 90-day all-cause mortality and reduced morbidity in critically ill adults. i Population: >2,400 adult patients in ICUs who -have had a request for a first RBC unit transfusion during the first 7 days of ICU admission -and have an anticipated requirement for ongoing invasive and noninvasive mechanical ventilation exceeding 48 hours. Lacroix J, et al. N Engl J Med 2015;372:1410

56 The Age of Blood Evaluation (ABLE) Randomized Controlled Trial i primary outcome: 90-day all-cause mortality. i secondary outcomes: ICU and hospital mortality, organ failure, serious nosocomial infections. i enrolling patients in 23 university-affiliated and communityhospital ICUs across Canada, France and United Kingdom. i Study able to detect 5% absolute risk reduction (from 25% to 20%).

57 Lacroix J, et al. N Engl J Med 2015;372:1410

59 The Age of Blood Evaluation (ABLE) Trial Lacroix J, et al. N Engl J Med 2015;372:1410

61 The Age of Blood Evaluation (ABLE) Trial i Transfusion of fresh red cells, as compared with standard-issue red cells, did not decrease the 90-day mortality among critically ill adults. i To reassure clinicians and blood bankers regarding the effectiveness and safety of standard-issue RBCs.

62 Effects of red-cell storage duration on patients undergoing cardiac surgery i Design: randomized trial at multiple sites from 2010 to i Nearly 1,100 patients 12 years of age or older who were undergoing complex cardiac surgery and were likely to undergo transfusion of red cells i leukocyte-reduced red cells stored for 10 days or less (shorter-term storage group) or for 21 days or more (longer-term storage group) for all intraoperative and postoperative transfusions. i primary outcome: change in Multiple Organ Dysfunction Score (MODS; range, 0 to 24, with higher scores indicating more severe organ dysfunction) from the preoperative score to the highest composite score through day 7 or the time of death or discharge. Steiner ME, et al. N Engl J Med 2015;372:1419

63 Effects of red-cell storage duration on patients undergoing cardiac surgery Steiner ME, et al. N Engl J Med 2015;372:1419

64 Steiner ME, et al. N Engl J Med 2015;372:1419

70 Effects of red-cell storage duration on patients undergoing cardiac surgery The duration of red-cell storage was not associated with significant differences in the change in MODS. The transfusion of red cells stored for 10 days or less was not superior to the transfusion of red cells stored for 21 days or more among patients 12 years of age or older who were undergoing complex cardiac surgery. Steiner ME, et al. N Engl J Med 2015;372:1419

71 Medien zur Flüssiglagerung von Thrombozyten

72 Medien zur Flüssiglagerung von Thrombozyten i Autologes Plasma ACD-A (Apherese-/Pool-TKs): Immer noch optimales Lagerungsmedium für Plättchen. Nachteile: nur die Plättchen, nicht aber der Patient benötigen Plasma; Minor-Inkompatibilität möglich Lagerungsdaten: i 5 Tage (Recovery 63%, Überlebenszeit 6,7 d) i 7 Tage (Recovery 54%, Überlebenszeit 5,5 d) Dumont LJ, et al. Transfusion 2002;42:

73 Medien zur Flüssiglagerung von Thrombozyten i Plättchen-Additivlösung (Apherese-/Pool-TKs): Restplasma-Gehalt ca. 30%, 70% PAS Verschiedene Modifikationen einer phosphatreichen Citrat-Pufferlösung, u.u. mit Zusatz von Kalium und Magnesium, gute in vitro-qualitätsdaten Vorteil: AB0-Minor-Inkompatibilität i.d.r. kein Problem Plasma steht für Komponententherapie zur Verfügung. PAS notwendig für Pathogen-Inaktivierungsverfahren Gulliksson H, et al. Vox Sang 2003;85:

74 Gulliksson H, et al. Vox Sang 2003;85:

75 Dumont LJ, et al. Transfusion 2002;42:

76 Einfluss des in vitro ph von TKs auf Recovery und Überlebenszeit i The ph environment of stored plateles is recognized as a key surrogate measure of PLT viability; translated into regulatory rules or specifications for storage of PLT products. i Data from individual autologous radiolabeled PLT kinetic studies from independent laboratories were analyzed retrospectively. i PLTs stored for at least 5 days in 100 percent autologous plasma with a ph of at least 6.2 were analyzed. Dumont LJ, et al. Transfusion 2006;46:

77 Einfluss des in vitro ph von TKs auf Recovery und Überlebenszeit i 476 individual recovery and survival results with associated ph before labeling from a variety of autologous, radiolabeled PLT kinetic studies from Sep 1999 to March i The effect of ph on either PLT recovery (p = 0.86) or survival (p = 0.55) was not significant. i Time of storage had significant effects on recovery and survival (p < ). i There is no relationship between in vitro ph and in vivo PLT viability as measured by radiolabeled recovery and survival of autologous PLTs (at ph of 6.2 ). Dumont LJ, et al. Transfusion 2006;46:

78 Paired in vitro and in vivo comparison of apheresis platelet concentrates stored in PAS i quality of PLTs stored for 1 vs. 7 days compared by in vitro analyses, in vivo recovery, and survival in blood donors. i Apheresis PCs from 10 donors were divided and stored in PAS (T- Sol / plasma: 60/40) in 2 equal units for a paired comparison. i PLTs in one unit were In 111 labeled at 1 day of storage, and PLTs in the other unit were labeled after 7 days of storage. i PLTs were injected into the autologous donors. i Measurements for PLT recovery and survival. Shanwell A, et al. Transfusion 2006;46:

79 In vitro analysis of apheresis PCs after 1 and 7 days of storage Variable Day 1 Day 7 p Value MPV (fl) 7.0 ± ± 0.8 NS ph 7.09 ± ± 0.08 NS Lactate (mmol/l) 1.3 ± ± 1.2 < pco 2 (kpa at 37 C) 3.41 ± ± 0.69 NS po 2 (kpa at 37 C) 18.9 ± ± 3.4 NS Bicarbonate (mmol/l) 7.5 ± ± 1.6 NS Glucose (mmol/l) 6.4 ± ± 1.1 < LDH (%) 4.7 ± ± 1.9 <0.01 ATP (µmol/10 11 PLTs) (threshold: >4.0) 5.64 ± ± 0.46 < HSR (%) 57.1 ± ± 10.9 NS RANTES (pg/10 6 PLTs) ± ± 50.8 <0.005 PF4 (IU/10 6 PLTs) 19.9 ± ± 7.5 < Data are expressed as means ± SD (n = 10). NS = nonsignificant. Shanwell A, et al. Transfusion 2006;46:

80 PLT recovery and survival time of autologous PLTs after storage for 1 and 7 days Recovery Survival Day 1 69 ± 12% 8.2 ± 1.7 days Day 7 53 ± 13% 5.1 ± 1.7 days pvalue <0.05 <0.005 Day 7 compared with Day 1 80 ± 32% 65 ± 26% Shanwell A, et al. Transfusion 2006;46:

81 Extended storage of autologous apheresis platelets in plasma Slichter SJ, et al. Vox Sang 2013;104:324

82 Hat TK-Lagerung Einfluss auf Outcome? i Keine Daten aus prospektiven, kontrollierten Studien. i Retrospektive Analysen widersprüchlich. Abani U, et al. Transfus Med Hemother 2011;38:272-6 Welsby IJ, et al. Transfusion 2010;50:2311-7

83 Kryokonservierung von Erythrozyten und Thrombozyten Hess JR. Transfus Med 2004;14:1-8 (Review) Valeri CR, et al. Transfusion 2005;45: