Identifikation einer neuen WRKY-Transkriptionsfaktorbindungsstelle in bioinformatisch identifizierten, Pathogen-responsiven c/s-elementen aus Arabidopsis thaliana Von der Fakultät für Lebenswissenschaften der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von aus Fabian Machens Hildesheim
Inhalts Verzeichnis 1. Abkürzungsverzeichnis ^ 2. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis VIII 3. Einleitung 1 3.1. Pflanzen sind einer Vielzahl von Pathogenen ausgesetzt 1 3.2. Das pflanzliche Immunsystem 1 3.3. Transkriptionelle Netzwerke in der Pathogenantwort 6 3.4. Bioinformatische und experimentelle Analysen können zur Identifizierung neuer c/s-elemente führen 8 3.5. Ein neues c/s-element in Motivgruppe 27? 11 3.6. Ziele dieser Arbeit 12 4. Material und Methoden 14 4.1. Chemikalien & Enzyme 14 4.2. Lösungen 14 4.2.1 Agarose-Gelelektrophorese 15 4.2.2 Antibiotika- und Herbizid-Lösungen 15 4.2.3 Isolation und Transfektion von Petersilie-Protoplasten 16 4.2.4 Isolation und Transfektion von Arabidopsis-Protop\as\en 17 4.2.5 Sterilisation und Aussaat von Arabidopsis-Sam&n 18 4.2.6 Transformation von A. thaliana 19 4.2.7 Transformation von Hefe-Zellen 19 4.2.8 Plasmidpräparation aus Hefe-Zellen 20 4.2.9 Plasmid-Mini-Präparation aus. coli 20 4.2.10 Proteinbestimmung nach Bradford 22 4.2.11 Aufreinigung His-getaggter Proteine 22 4.2.12 SDS-PAGE 22 4.2.13 Western Blot 23 4.2.14 Gelshift-Assays 24 4.2.15 Luciferase-Assays 25 4.2.16 ß-Glucuronidase-Assays 26 4.3. Nährmedien 26 4.3.1 Arabidopsis-Pflanzen 26 4.3.2 Bakterien 27!
II 4.3.3 Botrytis cinerea 28 4.3.4 Petersilie-Zellkultur 28 4.3.5 Saccharomyces cerevisiae 30 4.4. Arabidopsis thaliana 4.5. Petersilie-Zellkultur 4.6. Bakterien-, Hefe- und Pilz-Stämme 32 4.7. Oligonukleotide und Peptide 33 4.8. Plasmide 33 4.9. Verbrauchsmaterialien 34 4.10. Geräte 35 4.11. Methoden 35 4.11.1 Manipulation und Erstellung von DNA-Konstrukten 35 4.11.2 Annealing einzelsträngiger Oligonukleotide 35 4.11.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) 36 4.11.4 RNA-Isolation aus A. thaliana 37 4.11.5 Reverse T ranskription 37 4.11.6 Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA- und RNA-Lösungen 38 4.11.7 Agarose-Gelelektrophorese von DNA und RNA 38 4.11.8 Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 39 4.11.9 Herstellung und Transformation elektrokompetenter E. coli- und A. tumefaciens-zellen 39 4.11.10 Herstellung und Transformation chemisch kompetenter E. coli-zellen 40 4.11.11 Plasmidpräparation aus E. coli 40 4.11.12 Erstellung von Dauerkulturen 41 4.11.13 Sequenzierung von DNA-Molekülen 41 4.11.14 Allgemeine Sequenzanalysen, Alignments etc 41 4.11.15 Erstellung von T-DNA-Konstrukten zur Herstellung von Reportergenpflanzen 42 4.11.16 Erstellung von Reportergenkonstrukten für die Protoplasten-Transfektion 42 4.11.17 Erstellung von Reportergenkonstrukten für Yeast One-Hybrid-Screenings 43 4.11.18 Klonierung von Transkriptionsfaktoren 43 4.11.19 Konstrukte zur rekombinanten Proteinexpression 44 4.11.20 T-DNA-Konstrukte zur Überexpression von Transkriptionsfaktoren 45 4.11.21 Expression & Aufreinigung rekombinanter Proteine in E. coli 46 4.11.22 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 47 4.11.23 Dialyse 48 4.11.24 Western Blot 49 w 4.11.25 Coomassie-Färbung von Proteingelen 50
4.11.26 Erstellung Biotin-markierter DNA-Moleküle 50 4.11.27 Gelshift-Assay 50 4.11.28 Transformation von Hefe-Zellen 52 4.11.29 Plasmidpräparation aus Hefe-Zellen 53 4.11.30 Yeast One-Hybrid-Screening 53 4.11.31 Kultivierung der Petersilie-Zellkultur 55 4.11.32 Isolation und Transfektion von Petersilie-Protoplasten 55 4.11.33 Kultivierung von A thaliana in Steril- bzw. Erdkultur 56 4.11.34 Isolation und Transfektion von Arabidopsis-Protop\as\en 57 4.11.35 Transformation und Selektion von A. thaliana 59 4.11.36 Pathogeninfektion von A. thaliana 60 4.11.37 Proteinbestimmung nach Bradford 61 4.11.38 Luciferase-Assays 62 4.11.39 Qualitative GUS-Färbungen 63 4.11.40 Quantitative GUS-Assays 63 4.11.41 Analyse von Promotorsequenzen mittels POBO 64 5. Ergebnisse 66 5.1. Die Pep25-responsive Region in 30I-8_M1S1 bzw. 27D-10_M1S2 enthält die Kernsequenz der Motivgruppe 27 66 5.2. 30I-8_M1S1 und 27D-10_M1S2 vermitteln eine leichte Reportergenaktivität in nicht Pathogen-infizierten Arabidopsis-Pflanzen 71 5.3. 30I-8_M1S1- und 27D-10_M1S2-Pflanzen zeigen bei B. cinerea-infektion eine leichte Pathogen-Responsivität 75 5.4. WRYK70, SPL7 und JAG sind potentielle Regulatoren der untersuchten Sequenzen 82 5.5. Untersuchungen zur Transaktivierbarkeit von 30I-8_M1S1 und 27D-10_M1S2 durch ihre potentiellen Regulatoren 88 5.6. Die potentielle SPL7-TFBS in der 30I-8_M1S1-Sequenz ist klonierungsbedingt 93 5.7. Mutationsanalysen zur Identifikation potentieller WRKY70-TFBS in 30I-8_M1S1 und 27D-10_M1S2 5.8. Expression rekombinanter Transkriptionsfaktoren in E. coli 101 5.9. SPL7 interagiert direkt mit 30I-8_M1 S1 5.10. WRKY70 bindet die für die Transaktivierung notwendige Sequenz CGACTTTT direkt 5.11. WRKY70 interagiert auch mit weiteren Sequenzen aus Motivgruppe 27 109
5.12. Die WRKY70-TFBS liegt innerhalb der Pep25-responsiven Region von 30I-8-M1S1 5.13. Die postulierte WRKY70-TFBS ist in möglichen Zielgenen angereichert 112 6. Diskussion 775 6.1. Die Interaktion von 30I-8_M1S1 und SPL7 hat keine Relevanz für die Pep25-Responsivität 115 6.2. WRKY70, ein zentraler Regulator der Pathogenantwort, bindet die Sequenz CGACTTTT in 30I-8_M1S1 118 6.3. Kann ein WRKY-TF aus Petersilie identifiziert werden, der die Pep25-Responsivität von 30I-8_M1S1 vermittelt? 123 6.4. Sind weitere Faktoren in die Pep25-Responsivität von 30I-8_M1S1 involviert? 124 6.5. Lässt sich die beobachtete Pathogen-Responsivität in transgenen 30I-8_M1S1-Linien mit der Expression von WRKY70 korrelieren? 125 6.6. Mögliche Ursachen für die ungewöhnliche Bindungsspezifität von WRKY70 128 6.7. Anhand von Bindungsstudien kann eine Konsensussequenz für die WRKY70-TFBS postuliert werden 131 6.8. Welche Bedeutung hat die WRKY70-TFBS in vivo? 133 6.9. Sind die potentiellen WRKY70-Zielgene Pathogen-responsiv? 135 6.10. Wie kann die Transaktivierung von 27D-10_M1S2 durch WRKY70 erklärt werden? 136 6.11. Zusammenfassende Bewertung der Ergebnisse und Ausblick 138 7. Zusammenfassung 141 8. Literaturverzeichnis 143 9. Anhang 1 53 10. Materiallisten 221 10.1. Glycerinkulturen und DNA-Konstrukte 221 10.2. Primer und Oligonukleotide 228 10.3. Pflanzensamen 232 11. Danksagung 235