Analyse des Genoms des Pseudomonas-Phagen 0CTX, insbesondere der Steuerung der späten Gene Frank Wilhelm Langewische
Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der Abbildungen Verzeichnis der Tabellen Verzeichnis der Abkürzungen Seite VI VIII IX 1 Einleitung 1 1.1 Pseudomonas aeruginosa 1 1.1.1 Vorkommen und Charakteristik von Pseudomonas aeruginosa 1 1.1.2 Pathogenität von Pseudomonas aeruginosa im human- und veterinärmedizinischen Bereich und Bildung von Virulenzfaktoren 1 1.2 Bakteriophagen 3 1.2.1 Bedeutung und Typisierung von Bakteriophagen 3 1.2.2 Der Phage < >CTX 5 1.3 Ziele dieser Arbeit 6 2 Material 7 2.1 Biologische Materialien 7 2.1.1 Bakterienstämme 7 2.1.2 Plasmide 7 2.1.2.1 Zur Klonierung verwendete Plasmide 7 2.1.2.2 Zur Sequenzierung verwendete ())CTX-Subklone : 8 2.1.2.3 Abbildungen der zur Sequenzierung verwendeten Plasmide 9 2.1.3 Enzyme, DNA-Marker und Loading Dye Solution 15 2.1.4 Nährmedien/-komponenten 16 2.1.5 Kommerzielle Kits 16 2.2 Chemische Substanzen 16 2.2.1 Reagenzien 16
2.3 Geräte und Verbrauchsmaterial 18 2.3.1 Geräte 18 2.3.2 Verbrauchsmaterial 19 2.4 Computerprogramme 20 3 Methoden 21 3.1 Allgemeine Methoden 21 3.1.1 Herstellung von LB-Medium und LB-Medium mit Ampicillin-/Carbenicillin-Zusatz 21 3.1.2 Herstellung von LB-Agarplatten und LB-Ampicillin-/ Carbenicillin-Agarplatten 21 3.1.3 Herstellung von TSB-Medium und TSB-Ampicillin-Medium 21 3.1.4 Herstellung von TSA-Platten und TSA-Ampicillin-Platten 22 3.1.5 Herstellung von NZY+Medium 22 3.1.6 Herstellung von A-Medium und A-Medium mit Ampicillin-/ Carbenicillin-Zusatz 22 3.1.7 Bestimmung des DNA-Gehaltes 22 3.2 Molekularbiologische Methoden 23 3.2.1 Phagen-DNA-Präparation 23 3.2.2 Mikroquick-Plasmid-Präparation 23 3.2.3 Plasmid-Präparation mit dem Qiagen Plasmid Midi Kit" 24 3.2.4 Restriktionsverdau 25 3.2.5 Amplifikation von DNA-Fragmenten mit dem Expand High Fidelity PCR System" 27 3.2.6 Agarosegel-Elektrophorese 28 3.2.7 Präparative Agarosegel-Elektrophorese zur DNA-Gewinnung 29 3.2.8 Extraktion der DNA mit dem QIAEX II Gel Extraction Kit" 30 3.2.9 Ligation von linearisierter DNA mit dem Rapid DNA Ligation Kit" 31 3.2.10 Aufreinigung des Ligationsansatzes mit dem High Pure PCR Product Purification Kit" 32
3.2.11 Herstellung kompetenter E. coli HBIOI-Zellen mittels CaCl 2 -Methode und Plasmidtransformation 33 3.2.12 Herstellung elektrokompetenter E. coli XL 1-Blue Zellen 34 3.2.13 Transformation elektrokompetenter E. co/; XLl-Blue Zellen mittels Elektroporation und anschließende Kontrolle neu erstellter Klone 34 3.2.14 Herstellung elektrokompetenter P. aeruginosa GuA18D Zellen : 35 3.2.15 Transformation elektrokompetenter P. aeruginosa GuA 18D Zellen mittels Elektroporation 36 3.2.16 Transformation von superkompetenten E. coli XLl-Blue Zellen 36 3.2.17 Erstellung von Glycerolsteps plasmidtragender Bakterien 36 3.2.18 Automatisierte DNA-Sequenzierung 37 3.2.18.1 Sequenzierung mit dem Dye Terminator Cycle Sequencing Ready ReactionKit" 37 3.2.18.2 Sequenzierung mit dem BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready ReactionKit" 39 3.2.18.3 Polyacrylamidgel-Elektrophorese und Einlesen der Sequenz 40 3.2.19 Auswahl der Sequehzierprimer 42 3.2.20 Durchführung des ß-Galactosidase-Assays 42 4 Ergebnisse 44 4.1 Sequenzierung des <j>ctx-genoms 44 4.1.1 Sequenzierung der <j>ctx-subklone, 44 4.1.2 Korrektur der gewonnenen Sequenzdaten und Gesamtgenomgröße 45 4.1.3 Probleme bei der Sequenzierung 45 4.2 G+C-Gehalt und Leserahmen des ( >CTX-Genoms und datenbankgestützte Homologiesuche 46 4.2.1 Allgemeine Auswertung 46 4.2.2 Homologien zu Capsidsynthese- und DNA-Verpackungsgenen anderer Phagen 55 4.2.3 Homologien zu Schwanzgenen anderer Phagen 56 4.2.4 Homologien zu Lysisgenen anderer Phagen 57 4.2.5 Homologien zu frühen Genen anderer Phagen 57 III
4.2.6 Vergleiche von cos der Phagen (j)ctx, P2, P4 und 186 58 4.3 Steuerung der späten Gene von (])CTX 58 4.3.1 Transkriptionsaktivatorprotein der späten Promotoren 59 4.3.2 Analyse putativer später Promotoren von < >CTX und Klonierung der putativen Promotoren Po und Pp in das Reporterplasmid pqf50 61 4.3.3 Nachweis der Promotoraktivität von Po und P P durch den ß-Galactosidase-Assay...65 4.4 Terminatorstrukturen von <j>ctx 66 5 Diskussion 71 5.1 Sequenzierung des ( )CTX-Genoms 71 5.2 G+C-Gehalt und Leserahmen des <j)ctx-genoms und datenbankgestützte Homologiesuche 71 5.2.1 Allgemeine Auswertung 71 5.2.2 Homologien zu Capsidsynthese- und DNA-Verpackungsgenen anderer Phagen 75 5.2.3 Homologien zu Schwanzgenen anderer Phagen 75 5.2.4 Homologien zu Lysisgenen anderer Phagen 76 5.2.5 Homologien zu frühen Genen anderer Phagen 76 5.2.6 Vergleiche von cos der Phagen <j>ctx, P2, P4 und 186 76 5.2.7 A+T-reiche Regionen und Codonadaptation von i >CTX-ORFs an P. aeruginosa 77 5.3 Steuerung der späten Gene von <)>CTX und experimentelle Analyse der Aktivität der putativen späten Promotoren P o und Pp : 77 5.4 Terminatorstrukturen von <(>CTX 80 5.5 Schlußfolgerungen aufgrund der Ergebnisse dieser Arbeit 81 Zusammenfassung 83 Summary 85 IV
8 Literatur 87 9 Anhang 93 9.1 Nukleotidsequenz des Phagen (jictx mit Übersetzung in die 6 Leserahmen und Kennzeichnung der Sequenzierprimersequenzen 93 9.2 Verzeichnis der Homologien zu Proteinen anderer Phagen und zu lytischen Enzymen grampositiver Bakterien 153 9.3 PCR-Primer zur Amplifikation der putativen späten 4>CTX-Promotorsequenzen Po und/v.' 197 9.4 Primer zur Sequenzierung der in pqf50 einklonierten putativen späten Promotorsequenzen Po und Pp 197