Dissertation. zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalis (Dr. rer. nat.) vorgelegt der

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1 Alternative Strategien für die Bekämpfung von Eimeria- Infektionen: spezifische rekombinante Antikörperfragmente sowie Beeinflussung der Kalzium-vermittelten Signaltransduktion Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalis (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Frau Dipl.-Biochem. Ulrike Schubert geb. am 30. Januar 1978 in Meißen Gutachter: 1. PD Dr. Udo Conrad 2. Prof. Dr. Werner Roos 3. Prof. Dr. Arwid Daugschies Halle (Saale), den urn:nbn:de:gbv: [

2 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis A Adenin; Ampere Abb. Abbildung AG anti-mzp-scfv AH anti-etmic2-scfv Amp r Ampizillinresistenz 2-APB 2-Aminoethoxydiphenylborat AP alkalische Phosphatase BAPTA Bis(o-aminophenoxy)-ethan-N,N,N',N'-tetraessigsäure BAPTA-AM Azetoxymethylester von BAPTA BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat bp Basenpaare BODIPY- 4,4-Difluoro-4-bor-3a,4a-diaza-s-indazen-3-propionsäure-glyzyl- BSA Rinderserum-Albumin (bovine serum albumin) C Cytosin Ca 2+ Kalzium camp zyklisches Adenosinmonophosphat CAT Zellanheftungstest ( cell adherence test ) cdna komplementäre DNA CDRs complementarity determining regions C L bzw. C H konstante Region der leichten bzw. der schweren Kette eines Immunglobulins c-myc-tag Proteinmarkerstruktur bestehend aus der Aminosäurenfolge EQKLISEEDL CFDA, SE Karboxyfluoreszeindiazetat, Succinimidylester Da / kda Dalton / Kilodalton DAB 3,3'-Diaminobenzidin DAPI 4',6-Diamidino-2-phenylindol d.h. das heißt DMEM Dulbecco s modified Eagle medium DNA Desoxyribonukleinsäure dntps Desoxyribonukleotide E.coli Escherichia coli EDC N-Ethyl-N'-(3-dimethyl aminopropyl)-karbodiimid Hydrochlorid EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EGTA Ethylenglycol-O, O'-bis(2-aminoethyl)-N, N, N', N'-tetraessigsäure ELISA Enzymimmuntest ( enzyme-linked immunosorbent assay ) ER endoplasmatisches Retikulum Etmic2 ein Mikronemenprotein von E.tenella-Sporozoiten und -Merozoiten evtl. eventuell FITC Fluoreszeinisothiozyanat G Guanin HBSS Hanks' balanced salt solution II

3 Abkürzungsverzeichnis His His-Tag Ig IMAC IFAT IP 3 IPTG LB M mak mrna MZP MTT NBT NHS OD 600 PAGE PBS pbsk PEG PMSF POD RNA RT-PCR scfv SDS SPR T Tab. TBE TBS TMB U u.a. vgl. V L bzw. V H x g z.b. Histidin Proteinmarkerstruktur bestehend aus sechs aufeinanderfolgenden Histidinen Immunglobulin immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie indirekter Immunfluoreszenz-Antikörper-Test Inositol-1,4,5-triphosphat Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid Luria-Bertani-Medium Molarität in mol/l monoklonaler Antikörper messenger RNA ein Oberflächenantigen von E.tenella-Merozoiten 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid Nitroblau-Tetrazoliumchlorid, 4-Nitrotetrazoliumblau N-Hydroxysuccinimid optische Dichte bei 600nm Polyacrylamidgelelektrophorese phosphate buffered saline pbluescript SK+ Polyethylenglykol Phenylmethylsulfonylfluorid Peroxidase Ribonukleinsäure Umschreiben von RNA in cdna durch PCR mit reverser Transkriptase single-chain Fv, monomeres Antikörperfragment bestehend aus den mit einem Linkerpeptid verbundenen variablen Teilen der schweren bzw. leichten Antikörperkette Natriumdodecylsulfat ( sodium dodecyl sulfate ) Oberflächenplasmonresonanz Thymidin Tabelle Tris-Borat-Puffer Tris buffered saline 5,5 -Tetramethylbenzidin Enzymaktivität in Unit (1 U entspricht 1 µmol Substratumsatz pro min) und andere, unter anderem vergleiche variable Region der leichten bzw. der schweren Kette eines Immunoglobulins relative Zentrifugalbeschleunigung zum Beispiel III

4 1 Einleitung Kokzidiose Charakteristik, phylogenetische Einordnung und wirtschaftliche Bedeutung Kokzidiose beim Haushuhn relevante Eimeria-Arten Lebenszyklus von Eimerien Wichtige Proteine und Strukturen von Eimeria-Sporozoiten Bestehende Methoden zur Bekämpfung von Kokzidiose beim Haushuhn Neue Strategien zur Bekämpfung von Eimeria-Infektionen Ansätze und Herausforderungen Rekombinante Antikörper Struktur und Funktion von Antikörpern Rekombinante Antikörperfragmente Antikörperfragment-Banken Verwendung von monoklonalen Antikörpern und rekombinanten Antikörperfragmenten Kalzium als Botenstoff in eukaryotischen Zellen Kurzer Überblick Wirkstoffe, die Kalzium-Signalvorgänge beeinflussen Bedeutung von Kalzium für die Wirtszellinvasion durch Zoiten der Apikomplexa Zielsetzung der Arbeit Material Geräte Speziallabormaterial Chemikalien, Reagenzien Kits Marker Enzyme Antikörper Primäre Antikörper Sekundäre Antikörper Lösungen und Puffer IV

5 2.9 Medien Oligonukleotide Vektoren Phagen Escherichia coli-stämme Methoden Klonierung und Sequenzierung Darstellung und Reinigung von Etmic2 und scfv Expression in E.coli und Zellaufschluß Proteinreinigung durch immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie Proteinreinigung durch fraktionierte Ammoniumsulfat-Fällung und Anionenaustauscher-Chromatographie Proteinanalyse Quantifizierung SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Proteinnachweis im SDS-Polyacrylamidgel durch Coomassie-Brilliantblau- Färbung Proteinnachweis auf Nitrozellulosemembranen (Immunoblot) Phage Display Isolierung von anti-etmic2-scfv Herstellung der Phage Display -Bank Amplifikation von Helferphagen Anreicherung und Isolierung von anti-etmic2-scfv durch Panning Herstellung monoklonaler Phagen Enzymimmuntest (ELISA) Indirekter Phagen-ELISA Indirekter scfv-elisa Kompetitiver ELISA Untersuchung der Bindung von anti-etmic2-scfv an fragmentiertes Etmic Untersuchung der spezifischen Antigenbindung von anti-etmic2-scfv durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Kopplung des Liganden in der Flußzelle Funktionelle Analyse von scfv Präparation der Parasiten V

6 3.9 Zellanheftungstest (CAT) Indirekter Immunfluoreszenztest (IFAT) Untersuchung der Sporozoiten-Invasion in vitro Anzucht der Wirtszellen Zytotoxizitäts- und Proliferationstest Sporozoiten-Invasionshemmtest Viabilitätstests Fluoreszenzmarkierung von Sporozoiten mit Bodipy FL-X Ryanodin Versuch der Beladung von Sporozoiten mit Calcium Green-1 AM Ergebnisse Isolierung Etmic2 bindender rekombinanter scfv Klonierung des rekombinanten Eimeria tenella-antigens Etmic Bakterielle Expression und Reinigung von Etmic Anreicherung von anti-etmic2-scfv durch Panning Sequenzierung der anti-etmic2-scfv und Sequenzvergleich Charakterisierung der Bindung von anti-etmic2-scfv an rekombinantes Etmic Untersuchung der Bindung von anti-etmic2-scfv an fragmentiertes rekombinantes Etmic2 durch Immunoblot Nachweis der spezifischen Antigenbindung von anti-etmic2-scfv durch Oberflächenplasmonresonanz-Analyse Bestimmung der Affinität von anti-etmic2-scfv Binden anti-etmic2-scfv an natives Etmic2? Untersuchung der Bindung von anti-etmic2-scfv an Sporozoiten- bzw. Oozystenextrakte Untersuchung der Bindung von anti-etmic2-scfv an Sporozoiten durch einen Zellanheftungstest Untersuchung der Bindung von anti-etmic2-scfv an Sporozoiten durch einen indirekten Immunfluoreszenztest Vergleich der Epitopspezifitäten von anti-etmic2-scfv und Serumantikörpern gegen natives Etmic2 durch einen kompetitiven ELISA Untersuchungen zur Kalziumabhängigkeit der Sporozoiten-Invasion Lebensfähigkeit und Infektiosität von E.tenella-Sporozoiten bei verschiedenen Kalziumkonzentrationen VI

7 4.4.2 Test verschiedener Kalziumeffektoren auf ihre Wirksamkeit im Sporozoiten- Invasionshemmtest Besitzen Eimeria tenella-sporozoiten Ryanodin-Bindungsstellen? Hängt der Effekt von Ryanodin mit Ca 2+ -Signalvorgängen zusammen? Diskussion und Ausblick Versuch der Isolierung von Eimeria-spezifischen scfv durch die Phage Display - Technologie Probleme und Diskussion alternativer Strategien Hemmung der Invasion von Eimeria tenella-sporozoiten durch Ca 2+ -Mangel und Ryanodin Zusammenfassung Literaturverzeichnis Anhang VII