Gentechnische Methoden

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1 Gentechnische Methoden Eine Sammlung von Arbeitsanleitungen für das molekularbiologische Labor Bearbeitet von Monika Jansohn, Sophie Rothhämel 1. Auflage Taschenbuch. 656 S. Paperback ISBN Format (B x L): 19,3 x 26 cm Weitere Fachgebiete > Chemie, Biowissenschaften, Agrarwissenschaften > Biowissenschaften allgemein > Genetik und Genomik (nichtmedizinisch) schnell und portofrei erhältlich bei Die Online-Fachbuchhandlung beck-shop.de ist spezialisiert auf Fachbücher, insbesondere Recht, Steuern und Wirtschaft. Im Sortiment finden Sie alle Medien (Bücher, Zeitschriften, CDs, ebooks, etc.) aller Verlage. Ergänzt wird das Programm durch Services wie Neuerscheinungsdienst oder Zusammenstellungen von Büchern zu Sonderpreisen. Der Shop führt mehr als 8 Millionen Produkte.

2 Inhalt Vorwort V Autorenverzeichnis VII Abkürzungsverzeichnis IX 1 Allgemeine Methoden (Carolina Río Bártulos, Hella Tappe, Sophie Rothhämel*) 1.1 Absorptionsmessungen Absorptionsmessung im UV-Bereich Absorptionsmessung im sichtbaren Bereich Trübungsmessung Fluoreszenzmessung Radioaktivitätsmessung Autoradiographie und Fluorographie Zentrifugationstechniken Steriles Arbeiten Sterilisation Steriles Arbeiten Silikonisieren von Glasgeräten Phenolextraktion Fällungsmethoden Präzipitation von Nucleinsäuren Säulenchromatographische Trennverfahren für kleine Mengen Nucleinsäuren Ionenaustauschchromatographie an DEAE (Diethylaminoethyl)-Cellulose Gelpermeationschromatographie an Sephadex G-50 oder G Markierung von Nucleinsäuren Endmarkierung von DNA Phosphorylierungen von DNA Endmarkierung von DNA Radioaktive Markierung von DNA durch Nick-Translation Markierung von DNA-Fragmenten durch random priming Dephosphorylierung von DNA Arbeiten mit Escherichia coli Kultivierung von E. coli Antibiotika Genetische Marker Restriktions-Modifikationssysteme von E. coli Der Gebrauch des genetischen Codes Keimzahlbestimmungen Proteinisolierung Chromatographische Verfahren Ionenaustauschchromatographie Gelpermeationschromatographie Hydrophobe Chromatographie Affinitätschromatographie Fällung Gelelektrophoresen (Ute Dechert) 2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese Gelelektrophorese in Tris-Tricin- Puffersystemen Kontinuierliche SDS-Gelelektrophorese Gradienten-Gelelektrophorese Diskontinuierliche Gelelektrophorese unter nativen Bedingungen Isoelektrische Fokussierung (IEF) Zweidimensionale Polyacrylamid- Gelelektrophorese Automatisierte Elektrophorese Nachweismethoden für Proteine Coomassie Blau-Färbung Silberfärbung Merril-Verfahren Ansorge-Verfahren Fluoreszenzfärbung Fluoreszenzmarkierung Detektion von Proteinen in Gelen durch SDS-Präzipitation Gelelektrophorese von Nucleinsäuren Agarose-Gelsysteme Puls-Feld-Gelelektrophorese Native Agarose-Gelelektrophorese für DNA Denaturierende alkalische Agarose- Gelelektrophorese für DNA

3 XIV Inhalt Agarose-Gelelektrophorese für RNA nach Denaturierung mit Glyoxal und DMSO Polyacrylamid-Gelsysteme Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese für DNA Denaturierende Harnstoff-Polyacrylamid- Gelelektrophorese für DNA Anfärbung von Nucleinsäuren in Gelen Anfärbung von Nucleinsäuren in Gelen mit Ethidiumbromid Elution von Nucleinsäuren aus Gelen Elution von DNA aus LM-Agarosegelen Elution von DNA aus LM-Agarosegelen durch GELase Elution von DNA aus Agarosegelen durch reversible Bindung an Silica/Glasfaser- Membranen Elektroelution von hochmolekularer DNA aus Agarosegelen Diffusionselution von DNA aus Polyacrylamidgelen Isolierung von DNA (Carolina Río Bártulos, Hella Tappe, Sophie Rothhämel*) Klassische Verfahren Silikagel basierende Verfahren Anionenaustauschchromatographie Filtrationsverfahren Hinweise zum Arbeiten mit DNA Isolierung chromosomaler DNA Allgemeine Hinweise Silikageltechnologie Allgemeine Hinweise Vollblut und Körperflüssigkeiten Gewebe Lyse weiterer Ausgangsmaterialien Lysate jeder Art Probenkonzentrierung Anionenaustausch-Technologie Lyse von Blut, buffy coat oder Zellkulturen Lyse von Geweben Lyse von Hefe Lyse von Bakterien Isolierung genomischer DNA aus Blut, Kulturzellen, Tiergeweben, Hefen und Bakterien Isolierung von Plasmid-DNA Wichtige allgemeine Parameter Plasmid-Kopienzahl Wirtsstamm Wachstum der Bakterien Antibiotika Minipräparation von Plasmid-DNA Reinheitsgrad der DNA und Technologien für die Plasmidminipräparation Probendurchsatz und Automatisierung Klassische Minipräparation von Plasmid-DNA Minipräparation von Plasmid- DNA mit Silikatechnologie und Zentrifugation Minipräparation von Plasmid-DNA im Hochdurchsatz-Format mittels Filtrationstechnologie Weitere Alternativen im Bereich Minipräparation von Plasmid-DNA Besonderheiten bei Minipräparationen von Plasmid-DNA Analyse von Plasmid-DNA nach der Minipräparation Großpräparation von Plasmid-DNA Anzucht der Bakterien Alkalische Lyse Weitere Reinigung der Plasmid-DNA Reinigung von Plasmid-DNA über CsCl-Dichtegradientenzentrifugation Entfernung von genomischer DNA- Kontamination Analyse der Plasmid-DNA DNA-Präparation und Analyse von Plasmiden mit großem Insert (PAC, BAC) DNA-Isolierung von E. coli-zellen mit PAC- oder BAC-Plasmiden Restriktionskartierung und Größenbestimmung klonierter DNA-Fragmente Aufreinigung von PAC- und BAC- Insert-DNA durch präparative Puls-Feld- Gelelektrophorese Isolierung von Phagen-DNA Großpräparation von λ-dna

4 Inhalt XV Anzucht der Phagen mittels Plattenlysat Anzucht der Phagen mittels Flüssiglysat (Mini- und Midi-Lysate) Protokoll zur Isolierung der λ-dna Präparation von M13-Phagen-DNA Präparation von M13-Phagen-DNA durch Silikamembran-Technologie und Zentrifugation Analyse von Ausbeute, Reinheit und Länge der isolierten Nucleinsäure Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Henning Schmidt, Sophie Rothhämel*) 4.1 Grundprinzip und Einsatzgebiete der PCR Wesentliche Komponenten der PCR Templates Primer DNA-Polymerasen Durchführung der PCR (Basisprotokoll) PCR-Geräte (Thermocycler) und Nachweissysteme für PCR-Produkte Anwendungsgebiete der PCR Verschiedene PCR-Techniken Amplifikation von DNA Hot start-pcr Multiplex-PCR High fidelity-pcr Long range-pcr Inverse PCR zur Amplifikation unbekannter Sequenzabschnitte Amplifikation von RNA (RT-PCR) Grundprinzip der Reverse Transkriptase- Reaktion Enzymatische Aktivitäten der Reversen Transkriptase Stabile RNA-Sekundärstrukturen Priming der cdna-synthese Primer-Typen Verschiedene Reverse Transkriptasen Methoden der RT-PCR Quantitative PCR und RT-PCR Kompetitive RT-PCR Real time-pcr und -RT-PCR Quantifizierung von Zielnucleinsäuren Real time-pcr und RT-PCR mit sequenzspezifischen Fluoreszenzsonden Real time-multiplex-pcr mit sequenzspezifischen Fluoreszenzsonden Real time-pcr und -RT-PCR mit DNAbindenden Fluoreszenzfarbstoffen Real time-one step-rt-pcr in situ-pcr Klonierung von cdna (cdna-phagenbank) (Cornel Mülhardt) 5.1 Klonierung von cdna mit λ-vektoren cdna-synthese und Vorbereitung zur Ligation cdna-erststrangsynthese cdna-zweitstrangsynthese Auffüllreaktion Eco RI-Linkerligation und -phosphorylierung Hydrolyse der cdna Größenfraktionierung der cdna Ligation der cdna mit λ-vektor-dna Titerbestimmung Amplifikation TCA-Präzipitation Klonierung von cdna mit λ-gt in vitro-verpackung von λ-gt11-dna Herstellung von Verpackungsextrakt in vitro-verpackung Lagerung von λ-phagenbanken und -Lysaten Titerbestimmung Überprüfung der Qualität der cdna- Phagenbank durch PCR-Screening Amplifikation Screening der λ-gt11-cdna-bank mit Antikörpern Pseudoscreening: Entfernung der Anti- E. coli- und Anti-Phagen-lmmunglobuline aus Antikörperseren Screening mit Antikörpern und Nachscreening Möglichkeiten eines Authentizitätsnachweises positiver λ-gt11-klone

5 XVI Inhalt Isolierung des β-galactosidase- Fusionsproteins durch SDS-Gelelektrophorese Gewinnung von Antikörpern zum Rescreening und für Western-Blots Isolierung und Reinigung des β-galactosidase-fusionsproteins Etablierung von lysogenen E. coli Y1 089-Zellen Rohlysatherstellung aus lysogenen E. coli Y1 089-Zellen Reinigung von β-galactosidase- Fusionsproteinen aus dem Rohlysat Klonierung von cdna in Plasmide Präparation von Plasmid-DNA mit 3'-überstehendem Thymidin Ligation von amplifizierter cdna mit Plasmid-DNA Herstellung von transformationskompetenten E. coli-zellen Transformation von kompetenten E. coli-zellen Klonierung von genomischer DNA (genomische Genbank) (Cornel Mülhardt*) 6.1 Klonierung mit dem Bakteriophagen λ-embl Partialhydrolyse der chromosomalen DNA Größenfraktionierung von DNA durch Saccharose Dichtegradientenzentrifugation Vektorhydrolyse und Ligationsreaktion in vitro-verpackung der Ligationsprodukte Titerbestimmung und Ausplattieren der Phagenbank Klonierung mit Cosmiden Vektorhydrolyse, Phosphatasebehandlung und Ligationsreaktion in vitro-verpackung der Ligationsprodukte Etablierung der Genbank Herstellung von DNA-Bibliotheken in künstlichen, bakteriellen Chromosomen (BAC) BAC-Vektoren Präparation von HMW-DNA und Größenselektion der DNA-Fragmente zur Klonierung in einen BAC-Vektor Präparation des BAC-Vektors Plasmidaufreinigung Vorbereitung des Vektors zur Ligation Isolierung von Megabasen-DNA aus Pflanzen Einbetten der Pflanzenzellkerne in Agaroseblöcke DNA-Isolierung in der Agarose Partieller DNA-Verdau, grobes Einstellen des Selektionsfensters Partieller DNA-Verdau, Feineinstellung des Selektionsfensters Vorbereitung partiell verdauter DNA zur Ligation Ligation Transformation Isolierung und Markierung von RNA (Martin Schröder) 7.1 Arbeiten mit RNA Arbeitsbedingungen Vorbereiten von Geräten RNase-Inhibitoren Diethylpyrocarbonat (DEPC) Vanadylribonucleosid-Komplexe RNasin/RNAguard Ansetzen von Lösungen Probenmaterial RNAlater Fällung von RNA Methoden zur Isolierung von RNA Isolierung von RNA aus Prokaryoten Grampositive Prokaryoten Gramnegative Prokaryoten Isolierung von RNA aus Saccharomyces cerevisiae Isolierung von RNA aus Pflanzenzellen Isolierung von RNA aus tierischen Zellen Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellkulturen

6 Inhalt XVII Isolierung von Gesamt-RNA aus Geweben Isolierung von Gesamt-RNA aus glycoprotein- und oligosaccharidreichen Geweben Isolierung cytoplasmatischer und nucleärer RNA Reinigung und Fraktionierung von RNA Hydrolyse von DNA mit DNase I Isolierung von poly(a) + -mrna durch Affinitätschromatographie an Oligo(dT)- Cellulose Isolierung von poly(a) + -mrna mit Oligo(dT)-Cellulose ohne Säulenchromatographie Synthese und Markierung von RNA durch in vitro-transkription in vitro-transkription markierter RNA in vitro-transkription radioaktiv markierter RNA in vitro-transkription Digoxigenin markierter RNA in vitro-transkription unmarkierter RNA Qualitätskontrolle und Lagerung der RNA-Präparation Qualitätskontrolle einer RNA-Präparation Lagerung von RNA RNA-interference (Tobias Bopp, Matthias Klein) 8.1 Design von sirna sirna-design Methoden zur Herstellung von sirna PCR-Expressionskassetten sirna-expressionsvektoren Abbau langer dsrna durch Enzyme der RNase III-Familie in vitro-transkription Chemische Synthese von sirna Transfektionsmethoden für sirna Lipid/aminbasierte Transfektionsmethoden Elektroporation Analyse des knock downs Nachweis auf mrna-ebene Nachweis auf Proteinebene Trouble Shooting Ratschläge für ein erfolgreiches sirna- Experiment mirna Prozessierung von mirnas Isolierung von mirnas aus einer Probe Anreicherung von mirnas Detektion der mirnas, Quantifizierung und Analyse Gewebepräparation (Tanja Arndt, Sophie Rothhämel) 9.1 Konservierungsmethoden für Gewebe Fixieren, Einbetten und Schneiden von Gewebe in Paraffinwachs Kryogeleinbetten von Gewebe Schneiden der in Kryogel eingebetteten Gewebe am Kryostaten Detektion von Protein und Nucleinsäure auf Membran Western Blotting (Steffen Bade, Niels Röckendorf, Andreas Frey, Arnd Petersen) Vorbereiten der Proben Gelelektrophoretische Trennung des Proteingemisches Gel-Blot: Elektrophoretischer Transfer in Wet- und Semi-Dry-Verfahren Dot-Blot Färbung der transferierten Proteine Nachweisreaktion: Bindung der Erstund Zweitantikörper Visualisierung: Fluoreszenz, Farb- oder Chemilumineszenz-Reaktion Trouble Shooting Nucleinsäure Blotting (Southern/Northern)..309 (Sophie Rothhämel*) Transfertechniken (Blotting) Dot-Blot Southern-Blot Northern-Blot Kolonietransfer Plaque-Transfer

7 XVIII Inhalt Hybridisierungen Richtlinien zur Berechnung der Schmelztemperatur bei der Hybridisierung Richtlinien zur Hybridisierung und Markierung von Nucleinsäuren Hybridisierung von Genbanken sowie Southern-Blots Hybridisierung von Genbanken sowie Southern-Blots mit Oligonucleotidproben Hybridisierung von Northern-Blots Wiederverwendung der Filter (Sondenentfernung) Selektion und Vereinzelung positiver Klone Vorgehen bei Koloniehybridisierungen Vorgehen bei der Plaque-Hybridisierung Detektion von mrna und Protein in situ (Tanja Arndt, Sophie Rothhämel*) in situ-hybridisierung Immunhistochemie Auswahl der verwendeten Gewebetypen Auswahl der RNA-Sonden in vitro-transkription der RNA-Sonden Vorbereitung von Paraffinschnitten für die Hybridisierung mit einer DIGmarkierten RNA-Sonde Vorbereitung von gefrorenen und mit Kryogel eingebetteten Schnitten für die Hybridisierung mit einer DIG-markierten RNA-Sonde Hybridisierung von Gewebeschnitten mit DIG-markierten Sonden Detektion der DIG-markierten Sonde mittels Antikörper und Farbreaktion Alternativprotokoll: Radioaktive Markierung der RNA-Sonde Waschen der Objektträger Dippen der Objektträger Entwicklung der Objektträger Auswahl der verwendeten Antikörper Vorbereitung von Paraffinschnitten für die Immunhistochemie Vorbereitung von in Kryogel eingebetteten gefrorenen Schnitten für die Immunhistochemie Blockieren unspezifischer Antikörper/ Antigen-Wechselwirkungen und Antikörperinkubation Generierung des ABC-Komplexes und enzymatische Umsetzung des Farbsubstrates Nuclear-fast-Red-Gegenfärbung für NBT/BCIP gefärbte ISH Hematoxylin- und Eosin-Gegenfärbung der DAB-gefärbten Schnitte Entwässern und Eindecken der gefärbten Schnitte Durchführung von Doppel-ISH Durchführung von Doppel-IHCs Kombination von in situ-hybridisierung und Immunhistochemie Automatisierung der in situ- Hybridisierung und der Immunhistochemie Trouble Shooting Trouble Shooting der ISH Trouble Shooting der IHC Transfektion von Säugerzellen (Michael Teifel) 12.1 Einführung Chemische Transfektionsmethoden Physikalische Transfektionsmethoden Biologische Transfektionsmethoden Methoden zur Steigerung von Genexpression und Transfektionseffizienz Stabile Expression und Genamplifikation Zellkulturmethoden Beschichtung von Kulturgefäßen Kultivierung von Säugerzellen am Beispiel der Fibroblastenzelllinie BHK Subkultivierung von BHK Zellzählung durch den Trypanblau- Ausschlusstest Einfrieren und Auftauen von Säugerzellen Herstellung von Zellextrakten durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen

8 Inhalt XIX MTT-Test Bestimmung der Geneticintoleranzdosis Transfektionsmethoden Versuchsplanung Calciumphosphat-Transfektion DEAE-Dextran-Transfektion Transfektion mit aktivierten Dendrimeren Lipofektion Herstellung der Liposomen Lipofektion mit DDAB- oder DOTAP- Liposomen Lipofektion mit kommerziell erhältlichen Lipofektionsreagenzien Elektroporation Transfektion mit komplexen Transfektionsreagenzien Transfektion bestimmter Zelltypen mit speziell optimierten Transfektionsreagenzien Nachweis der Expression und Bestimmung der Transfektionseffizienz Nachweis von β-galactosidase mittels X-Gal-Färbung Nachweis von β-galactosidase in Zellextrakten Messung von Luciferaseaktivität in Zelllysaten Bestimmung der Transfektionseffizienz Selektion auf stabile Expression und Isolierung resistenter Klone Trouble Shooting Transformationsmethoden für filamentöse Pilze (Hella Tappe*) 13.1 Selektionsmarker für filamentöse Pilze Dominante Selektionsmarker Gegenselektionssysteme Essenzielle Gene als Selektionsmarker (Auswahl) Gewinnung einer Sporenlösung filamentöser Pilze Transformation von Aspergillus oryzae- Protoplasten durch Behandlung mit Polyethylenglykol Herstellung von Aspergillus niger-, A. foetidus- und A. oryzae-protoplasten Transformation von Aspergillus oryzae- Protoplasten Biolistische Transformation von Trichoderma reesei Transformation von Aspergillus foetidus durch Agrobacterium tumefaciens Herstellung von elektrokompetenten Agrobacterium tumefaciens-zellen Transformation von elektrokompetenten Agrobacterium tumefaciens-zellen Transformation von Aspergillus foetidus durch Agrobacterium tumefaciens Transformation von Neurospora crassa- Sporen durch Elektroporation Präparation von genomischer DNA aus Aspergillus niger Genexpression in E. coli und Insektenzellen: Produktion und Reinigung rekombinanter Proteine (Achim Aigner) 14.1 Vorüberlegungen zur Auswahl von Wirtszelle und Expressionsvektor Expression eines eukaryotischen GST-Fusionsproteins in E. coli Konstruktion des Expressionsvektors Expression des GST-Fusionsproteins Reinigung des GST-Fusionsproteins Spaltung eines GST-Fusionsproteins Baculovirussystem: Expression eines eukaryotischen Proteins in Insektenzellen Konstruktion des Expressionsvektors Herstellung der rekombinanten Bacmid-DNA zur Transfektion von Insektenzellen Handhabung, Kultivierung und Infektion von Insektenzellen Transfektion von Sf9-Insektenzellen mit rekombinanter DNA Bestimmung günstiger Expressionsparameter

9 XX Inhalt Bestimmung des viralen Titers über Plaque-Test Reinigung eines sekretierten Expressionsprodukts mit His-tag unter nativen Bedingungen Reinigung eines nicht sekretierten Expressionsprodukts mit His-tag unter denaturierenden Bedingungen Das Pichia pastoris- Expressionssystem (Christoph Reinhart, Christoph Krettler*) 15.1 Die Charakteristika des Pichia pastoris- Systems Vergleich mit anderen Expressionssystemen Pichia pastoris-expressionsvektoren Integration der rekombinanten Vektoren ins Pichia pastoris-genom Pichia pastoris-wirtsstämme Proteinexpression mit dem Pichia pastoris- System Transformation von Pichia pastoris Optimierte Elektroporation von Pichia pastoris LiCl-Transformation von Pichia pastoris Analyse des Mut-Phänotyps rekombinanter Pichia pastoris-klone Selektion von Pichia pastoris-klonen mit mehrfach integrierten Expressionskassetten Proteinproduktion im 20 ml-maßstab zur Durchmusterung mehrerer Pichia pastoris- Klone Proteinproduktion im 1 l-maßstab Pichia pastoris im Fermenter Zellaufschluss und Präparation von Rohmembranen in größerem Maßstab Lagerung von Pichia pastoris Trouble Shooting für den gesamten praktischen Teil Verminderung der Genexpression über Ribozym-Targeting (Achim Aigner*) 16.1 Vorüberlegungen zur Ableitung von Ribozymen Herstellung von Ribozymen gegen den HER-2-Rezeptor Identifizierung geeigneter Zielsequenzen und Ableitung der Ribozymsequenzen Auswahl des Expressionsvektors und Klonierung der Ribozyme Herstellung stabiler ribozymtransfizierter Zelllinien mit konstitutiver Ribozymexpression Analyse und Vergleich der Ribozymaktivität Analyse der Genregulation (Korden Walter, Monika Lichtinger*) 17.1 Bestimmung von DNase I hypersensitiven Stellen in silico-identifizierung von regulatorischen DNA-Elementen und DNA-Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren Präparation von Proteinextrakten aus Säugerzellen Präparation von Zellkernextrakten Präparation von cytoplasmatischen Extrakten Kurzprotokoll zur Präparation von Zellkernextrakten EMSA (Electrophoretic mobility shift assay) Selektion und radioaktive Markierung der DNA-Fragmente EMSA-Reaktion Nachweis der DNA-Bindeproteine durch native Polyacrylamid-Gelelektrophorese Bestimmung der Spezifität in vitro-dnase I-Footprinting DNase I-Footprinting DNA-Sequenzierung nach Maxam-Gilbert Funktionelle Analyse von DNase I hypersensitiven Stellen und Transkriptionsfaktoren Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)

10 Inhalt XXI 17.8 Bestimmung der Position von Nucleosomen mittels MNase DNA-Methylierung Peptid-Arrays auf Cellulosemembranen Niels Röckendorf, Steffen Bade, Hans-Heiner Gorris, Andreas Frey 18.1 Synthese der filtergebundenen Peptidbibliothek Aminoderivatisierung des planaren Trägers und Definition der spots Synthese der Peptidkette N-terminale Modifikation der fertigen Peptide und Entschützen der Aminosäureseitenketten Praktische Vorbereitungen und Materialien Durchführung Routine-Arbeitsschritte Aminoderivatisierung des Celluloseträgers Definition der spots und Verlängerung der Membrananker Synthesezyklus End-capping und Abspaltung der Aminosäureseitenketten-Schutzgruppen Lagerung der Peptidbibliotheken Screening der Peptidbibliotheken Durchführung des screenings Regeneration (stripping) der Peptidbibliothek Vorbereitung Durchführung Genexpressionsanalyse mit Microarrays (Susanne Kneitz*) 19.1 Genexpressions-Arrays mit on-chip synthetisierten Oligonucleotiden Präparation von Gesamt-RNA aus Geweben und Zellen Analyse der Genexpressionsdaten Gespottete Microarrays mit synthetischen Oligonucleotiden (50- bis 70-meren) oder PCR-Produkten Microarray-Analyse mit synthetischen Oligonucleotiden Oligonucleotid-Design Resuspendieren, Drucken und Lagerung der Oligonucleotide Array-Herstellung DNA-Immobilisierung Prähybridisierung und Waschen der Microarrays Überprüfung der spot-morphologie Markierung und Hybridisierung der Zielmoleküle (targets) für die Expressionsanalyse Hybridisierung der Microarrays Auswertung Isolation und Anreicherung von micro- RNA Isolation von Gesamt-RNA aus Paraffinmaterial Auftrennung von Gesamt-RNA und kurzen RNA-Stücken (< 200 nt) Anreicherung von kurzen Sequenzen (10 bis 40 nt) Webbasierte Sequenzanalyse und Datenbankabfragen Josef Hermanns, Gerd Moeckel 20.1 Allgemeine Datenbankabfragen Molekularbiologische Datenbanken DNA-Sequenzdatenbanken Proteinsequenz-Datenbanken Charakteristische Sequenzbereiche/ Sequenzmotive D-Strukturdatenbanken Literaturdatenbanken Textbasierte Suche NCBI und Entrez EBI und SRS Anwendungsbeispiel Sequenzinformationen Internetportale Sequenzanalyse DNA-Sequenzbausteine Sequenzformate

11 XXII Inhalt Anwendungsbeispiele Datenbankrecherchen mit BLAST Domänen-Strukturanalysen Restriktionsanalyse als Basis der Klonierung Auswahl von PCR-Primern Vergleich zweier Sequenzen (align, dotplot) Vergleich mehrerer Sequenzen untereinander mit CLUSTALW Bestimmung der offenen Leseraster in einer Sequenz Analyse repetitiver Sequenzen Genomanalyse Orthologie Genomanalyse Genindex Genmodell Gendatenblatt Genome-Browser Proteininteraktionen Anhang Anhang 1 Sequenzierung von DNA (Carolina Río Bártulos, Hella Tappe*) A1.1 Vorüberlegungen A1.2 Vorbereitung der DNA zur Sequenzierreaktion A1.2.1 Sperminpräzipitation A1.3 Sequenzierreaktion A1.3.1 Basisprotokoll A1.3.2 Alternativprotokoll: Sequenzierung in 96 Well-Platten A1.3.3 Alternativprotokoll: Sequenzierung mit dem Klenow-Fragment der E. coli-dna- Polymerase I A1.3.4 Alternativprotokoll: Sequenzierung mit thermostabilen DNA-Polymerasen A1.3.5 Alternativprotokoll: Zyklussequenzierung (thermal cycle sequencing) A1.3.6 Alternativprotokoll: Sequenzierung mit 5'-markierten Primern A1.3.7 Hinweise zur Sequenzierung mit Fluorophor derivatisierten Didesoxynucleotidtriphosphaten (dye terminator sequencing) A1.3.8 Hinweise zur direkten Sequenzierung von PCR-Produkten A1.4 Gelelektrophorese A1.4.1 Herstellung des Sequenziergels A1.4.2 Elektrophorese A1.4.3 Gelbehandlung und Exposition eines Gels mit radioaktiv markierten DNA- Fragmenten A1.4.4 Allgemeine Hinweise zur Gelelektrophorese A1.4.5 Lesen der Sequenz A1.4.6 Trouble Shooting A1.5 Verwendung von automatischen DNA-Sequenziergeräten A1.6 Next-Generation-Sequencing (NGS) Anhang 2 Proteinidentifizierung und Sequenzierung (Sabine Wolf) A2.1 Massenspektrometrie A2.1.1 Massenspektrometrie kompatible Färbemethoden für Proteingele A Kolloidale Coomassie-Färbung A Silberfärbung A Fluoreszenzfärbung mit Sypro-Ruby A2.1.2 Fragmentierungsmethoden der Massenspektrometrie-Analyse A Hydrolyse mit Trypsin A2.2 Chemische Sequenzierung nach Edman A2.2.1 Elektro-Blotting auf PVDF-Membranen A2.2.2 Alkylierung von Cysteinresten A Alkylierung mit Acrylamid A2.2.3 Entsalzungsmethoden A Entsalzung mit ProSorb -Filtereinheit A Ionenpaar-Extraktion mit gleichzeitiger Fällung A2.3 Fragmentierung von Proteinen A2.3.1 Chemische Spaltungen A Spaltung mit Bromcyan A Partielle Säurehydrolyse mit Ameisensäure A2.3.2 Enzymatische Hydrolysen mit Endoproteinasen Mikromethoden A Spaltung in Lösung: Trypsin

12 Inhalt XXIII A Spaltung in Lösung: Endoproteinase Lys-C A Enzymatische Fragmentierung im Gel A Enzymatische Fragmentierung von der PVDF-Membran A2.4 Isolierung von Peptiden A2.4.1 Peptidtrennung mittels HPLC A2.5 Bestimmung der carboxyterminalen Sequenz A2.5.1 Endgruppenbestimmung mittels Carboxypeptidasen A2.6 Aminosäure-Analyse A2.6.1 Hydrolyse A2.6.2 Derivatisierung A2.7 Kombinierte Techniken A2.7.1 N-terminale Leitersequenzierung: Kopplung von Massenspektrometrie und Edman-Chemie A2.7.2 C-terminale Leitersequenzierung A2.8 Zusammenfassung Register