Identifizierung von Proteinen

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1 Identifizierung von Proteinen Genom bekannt, Proteinsequenzen in der Datenbank abgelegt: - Identifizierung von Proteinen mit ilfe der Massenspektrometrie Methode der Wahl, sehr empfindlich, in der egel einige Femtomol eines Proteins ausreichend - -terminale Sequenzierung und/oder Sequenzierung von Peptiden mit Edman-Abbau, nur noch selten durchgeführt in der egel einige picomol eines Proteins erforderlich Genom nicht sequenziert: Aufklärung der kompletten Primärstrukur erforderlich, häufigste Strategie: Peptidsequenzen ligonukleotide P cda-klon Screenen einer Genbank Sequenzieren von cda-klonen Erstellen von Protein-/Peptidsequenzen Edman-Abbau (erste Wahl) Massenspektrometrische Sequenzierung (de novo Sequenzierung, häufig problematisch)

2 Isolierung und Identifizierung von Proteinen im Mikromaßstab: 1. Anreicherung (Methode abhängig von dem jeweiligen Protein) - Subzelluläre Fraktionierung (z.b. Isolierung von Mitochondrien, Zellkerne durch Zentrifugation) - Differenzielle Extraktion/Fällung - hromatographie 1. Affinitäts-hromatographie 2. Ionenaustausch-hromatographie 3. Adsorptions-/Verteilungschromatographie 4. Gel Filtration 2. Trennung durch Gel-Elektrophorese (universell anwendbar) - SDS- Gel-Elektrophorese - 2D- Gel-Elektrophorese 3. Analyse der Banden / Spots durch Massenspektrometrie

3 Strategien zur Identifizierung/Sequenzierung von Proteinen und Peptiden Protein-Gemisch Trennung auf SDS-Gel/ 2D-Gel Bande/Spot ausschneiden Blot auf PVDF- Membran In-Gel Verdau mit Proteasen Extraktion der Peptide Massenspektrometrie Datenbanksuche mit MS-/MS/MS-Daten << 1pmol PL-Trennung -terminale Sequenz Edman-Abbau > 5 pmol Peptidsequenzen Edman-Abbau > 50 pmol

4 Edman-Abbau S Base S (wasserfrei) S + S Thiazolinon S - + neuer Zyklus S intermediäre ingöffnung Phenylthiohydantoin PT-Aminosäure S

5 - +

6 eagents in Glass block Glass fibre filter disc eagents out

7 häufige -terminale Blockierung von Proteinen: Bildung von Pyroglutamat Acetylierung/Acylierung

8 Frequently used enzymes for fragmentation of proteins Enzyms (major sources) E-number Specificity (X- -Y) p optimum Enzymes of high specificity Endoproteinase Arg Arg- -Y 7-8 (lostridium histolyticum) Endoproteinase Lys Lys- -Y 8-9 (Achromobacter lyticus, (Lysobacter enzymogenes) Trypsin (Bos taurus) Lys- -Y, Arg- -Y 7-9 Endoproteinase Glu Glu- -Y, (Asp- -Y) * 8 (4) (Staphylococcus aureus) Endoproteinase Asp- (Pseudomonas fragi) X- -Asp 7-8 Enzymes of lower specificity Major cleaved bonds: hymotrypsin (Bos taurus) X = Tyr, Phe, Trp, (Leu) 7-9 Pepsin (sus scrofa) X,Y = aromatic, large aliphatic aa Elastase (sus scrofa) X = Ala, uncharged, non-aromatic aa, 8-9 Thermolysin (Bacillus thermoproteolyticus) Y = L, F and other aromatic or large hydrophobic aa 8 * Glu- : ammonium bicarbonate, p 7.8, ammonium acetate, p 4.0, Glu-, Asp- :phosphate buffer, p 7.8, (cleavage at Asp often slow) aa = amino acid

9 Br-Spaltung S 3 Br -Br S S S omoserin omoserinlacton

10 eversed-phase-hromatographie Si + l Si ( ) Si Si - l Silan ( ) Derivatisierung des Kieselgels mit Silanen: berfläche wird unpolar Si Si stationäre Phase unpolar Si Si ( ) mobile Phase polar 3 2 ( ) Analyt / Die Phasen sind im Vergleich zur normalen hromatographie an Kieselgel umgekehrt, daher der ame eversed-phase-hromatogaphie (P-hromatogaphie)

11 Theorie/Definitionen t 2 Detektor-Signal t 0 t 1 Injektion w 1 w 2 t 0 t 1 t 2 Zeit etentionskoeffizient: k n = Selektivität: = k 2 k 1 - t n t 0 t 0 t 2 - t 1 Auflösung: = w 1 -- w 2 t 2 Bödenzahl: = 16 w Bodenhöhe: = L L = Säulenlänge

12 Detektor-Signal schlechte Auflösung t 0 t 1 t 2 Zeit Detektor-Signal gute Auflösung aufgrund höherer Bödenzahl t0 t 1 t 2 Zeit Detektor-Signal gute Auflösung aufgrund höherer Selektivität t 0 t 1 t 2 Zeit

13 Faktoren, die zur Peakverbreiterung führen Eddy-Diffusion ( A) longitudinale Diffusion ( _ B ) u Massentransport zwischen mobiler und stationärer Phase ( u ) Totvolumina im hromatographie-system van Deemter-Gleichung: h = A + _ B u + u h = theoretische Bodenhöhe u = Flussgeschwindigkeit

14 Eddy-Diffusion Zeit longitudinale Diffusion Säule Start

15 Massentransfer zwischen stationärer und mobiler Phase Verteilung zwischen stationärer und mobiler Phase benötigt eine gewisse Zeit mobile Phase stationäre Phase Fluss-ichtung Bandbreite langsame Aquilibrierung Verteilungsgeschwindigkeit variiert mit: - Diffusionskoeffizient des Analyten in der stationären Phase - Diffusionskoeffizient des Analyten in der mobilen Phase - Dicke der stationären Phase - Partikelgröße - Verteilungskoeffizient - Flussrate Bandbreite nach einiger Zeit

16 Faktoren, die zur Peakverbreiterung führen Eddy-Diffusion ( A) longitudinale Diffusion ( _ B ) u Massentransport zwischen mobiler und stationärer Phase ( u ) Totvolumina im hromatographie-system van Deemter-Gleichung: h = A + _ B u + u h = theoretische Bodenhöhe u = Flussgeschwindigkeit

17 PL (igh Pressure Liquid hromatography, ochleistungsflüssigkeitschromatographie) ochdruckgradientensystem (pro Fließmittel eine Pumpe) iederdruckgradientensystem

18 Isokratische Elution, Gradientenelution A B Fließmittel 1 Absorption D isokratisch: Absorption A B D Fließmittel 2 (höhere Elutionskraft) Die Zusammensetzung des Fließmittels bleibt während der Trennung konstant Zeit A B D Gradient: Absorption Die Zusammensetzung des Fließmittels ändert sich während der Trennung hin zu höherer Elutionskraft Zeit

19 Funktionsweise eines Injektionsventils Ventilstellung: Load Inject von der Injektionsspritze V zum Abfall- Behälter V V V Probenschleife von der Pumpe V von der Pumpe V V zur Säule V zur Säule

20 Trennung tryptischer Peptide von Ferritin durch eversed-phase-hromatographie 0.05 Absorption [220 nm] 0.01 Start etentionszeit [min]