5 Bestimmung des Milchfettanteiies in Mischfetten anhand des Fettsäurenmusters

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1 5 Bestimmung des Milhfettanteiies in Mishfetten anhand des Fettsäurenmusters J. Molkentin und D. Preht Bundesanstalt für Milhforshung, Institut für Chemie und Physik, Kiel 47 Zusammenfassung Oie Bestimmung von Milhfettanteilen in Mishfetten ist für die Deklarationskontlle von Fetterzeugnissen und verarbeiteten Pdukten von Bedeutung. Dazu kann das aus einer gashmatographishen Analyse ermittelte Fettsäurenmuster verwendet werqen. Es werden vershiedene Verfahren hinsihtlih ihrer Präzision verglihen, die teilweise von der Verfügbarkeit der reinen Fette ausgehen. In diesem Fall lassen sih Milhfettgehalte anhand mehrerer Fettsäuren mit mittleren absoluten Abweihungen von a.,5 % bis 2, % zwishen berehneten und tatsählihen Gehalten bestimmen. Bei ausshließliher Berehnung anhand von Buttersäuregehalten, die mittels internem Standard sehr präzise zu bestimmen sind, wurde im.konzentrationsbereih von 1 % bis 15 % Milhfett in Mishfetten ein mittlerer absoluter Fehler von durhshnittlih,5 % gefunden. Hier ist neben dem Mishfett zusätzlih nur das Milhfett zu analysieren. Steht nur das Mishfett für eine Analyse zur Verfügung, kann eine Bestimmung des Milhfettanteiles unter Annahme eines mittleren Buttersäuregehaltes für das reine Milhfett durhgeführt werden. Aufgrund der natürlihen Variation des Buttersäuregehaltes in Milhfett ergibt sih dabei allerdings ein relativer Fehler von maximal a. 1 O %, der dann bei höhsten Milhfettgehalten a. 1 O % absolut ausmahen kann. 5.1 Einleitung Die Deklarationskontlle von Mishfettpdukten sowie auh von Fetten aus verarbeiteten Lebensmitteln wie z.b. Shokolade, Bakwaren und Speiseeis erfordert die Quantifizierung von Milhfettanteilen. Zur Bestimmung insbesondere kleinerer Fremdfett-Anteile in Milhfett eignet sih die Triglyeridanalytik in Verbindung mit Triglyeridformeln [1], die u.a. in der Reinheitskontlle von Interventionsbutter EU-weit Anwendung finden [2]. Die vorliegende Arbeit befaßt sih dagegen mit den Möglihkeiten zur Quantifizierung vor allem mittlerer und kleiner Milhfett Anteile in Mishfetten anhand des Fettsäuremusters. Eine derartige Methode ist für den Marktordnungs- und Zollbereih in der EU von aktuellem Interesse. -,. Im einfahsten Fall ist die Fettsäurenzusammensetzung aller Fette, d.h. der reinen Komponenten sowie des Gemishes, bekannt. Dann kann der Milhfett-Anteil direkt aus dem Gehalt einzelner oder mehrerer Fettsäuren berehnet werden. Die Buttersäure nimmt dabei eine Sonderstellung ein, da sie ausshließlih in Milhfett und niht in tierishen Depotfetten oder pflanzlihen Fetten vorkommt. Bei unbekannter Fettzusammensetzung der reinen Fette ist in Analogie zu den o.a. Triglyeridformeln [1] eine Berehnung anhand von Fettsäureformeln denkbar. Ebenso kann der Buttersäuregehalt zur Kalkulation verwendet werden, wenn für das reine Milhfett ein empirisher C4-Gehalt zugrunde gelegt wird. Die untershiedlihen Verfahren sollen im folgenden in ihrer Präzision verglihen werden. 5.2 Material und Methoden Die gashmatographishe Analyse des Fettsäurenspektrums erfolgte nah dem von Preht und Moikentin beshriebenen Verfahren [3]. Die Bestimmung der Buttersäure als Methylester mit internem Standard wurde nah den von Molkentin und Preht [4] gemahten Angaben durhgeführt.

2 Ergebnisse und Diskussion Zur gashmatographishen Analyse des Fettsäurespektrums werden die Fettsäuremethylester verwendet, die resultierenden Daten aber als Gehalte freier Fettsäuren bezogen auf 1 g freie Fettsäuren ausgedrükt. Stehen neben dem Mishfett auh die reinen Ausgangsfette für eine Analyse zur Verfügung, läßt sih der Milhfett-Gehalt direkt anhand der Gehalte einer Fettsäure (FS) in den 3 vershiedenen Fetten mit Hilfe der folgenden Formel berehnen: x = ( - b) I (a - b) (Gleihung 1) mit: x = Anteil Milhfett, a = Gehalt FS im Milhfett, b = Gehalt FS im Fremdfett, = Gehalt FS im Mishfett So errehnet sih z.b. anhand von Laurinsäure mit Werten von a = 3,4, b =,2 und = 1, ein Milhfettanteil von 25 % (x =,25). Die Präzision einer derartigen Berehnung läßt sih durh die Durhführung von Doppel-Bestimmungen der Fettsäurengehalte erhöhen. Darüber hinaus kann das Ergebnis der Milhfettbestimmung durh Verwendung mehrerer Fettsäuren mit anshließender Mittelwertbildung verbessert werden. Zur Optimierung der Fettsäurenauswahl wurde in den hier vorgestellten Arbeiten in Anlehnung an ein von Muuse und Martens [5] publiziertes Verfahren das im folgenden beshriebene und in Tabelle 5.1 am Beispiel einer Mishung von 4 % Rinderfett in Milhfett gezeigte Prinzip angewendet [6]. Die Berehnung wurde zunähst mit 8 vershiedenen Fettsäuren durhgeführt und der Mittelwert der Einzelergebnisse bestimmt. Zur Optimierung der Fettsäurenkombination wurde anshließend das am weitesten vom Mittelwert (MW) entfernte Einzelergebnis eliminiert und eine andere Fettsäure zusätzlih zur Berehnung herangezogen. Dieser Shritt wurde mehrfa_h wiederholt, bis die Standardabweihung (SA) der Einzelergebnisse einen vorgegebenen Grenzwert untershritt. Hierbei führte ein Grenzwert von SA = 2 % in der Regel shon zu relativ guten Ergebnissen, d.h. geringen Abweihungen zwishen gemessenen und theoretishen Werten. Bei diesem Beispiel liegt bei einer Standardabweihung von 1,99 % sogar das Fehlerminimum. Auf gleihe Weise wurden die Wiederfindungsraten von 8 vershiedenen Fremdfetten, d.h. 'Niht-Milh-Fetten' (Rinderfett, Shweinefett, Palmöl, Kokosfett, Palmkernfett, Sojaöl, Sonnenblumenöl und Olivenöl) bei ZumishLingen von 1, 2, 3 bis 9 % zu Milhfett ermittelt. Abbildung 5.1 zeigt die zusammengefaßten Ergebnisse [6]. Dargestellt sind die mittleren absoluten Abweihungen der Wiederfindungsraten vom tatsählihen Gehalt von allen 8 Fremdfetten bei den vershiedenen Zumishungen zu Milhfett. Dabei handelt es sih um vorläufige Ergebnisse, die derzeit noh verfeinert werden. Man erkennt, daß dieses Verfahren im Bereih höherer Fremdfett-Anteile, d.h. kleiner Milhfett-Anteile, bessere Resultate liefert als bei hohen Milhfettanteilen. Für den letztgenannten Bereih eignen sih daher Triglyeridformeln besser [7], obwohl diese von unbekannter Zusammensetzung der reinen Fette ausgehen. Eine, besondere Stellung nimmt die Buttersäure (C4) ein. Da Buttersäure ausshließlih in Milhfett, aber in keinem Fremdfett enthalten ist (d.h. b = ), reduziert sih die Berehnungsgleihung für den Milhfettanteil x auf die einfahe Gleihung (2). x =f a {Gleihung 2) mit: x = Anteil Milhfett, a = Gehalt C4 im Milhfett, = Gehalt C4 im Mishfett Es müssen also nur 2 Fette, das Mishfett und das Milhfett, analysiert werden. Außerdem muß lediglih der Buttersäuregehalt und niht das gesamte Fettsäurenspektrum ermittelt werden. Bei einer GC-Analyse der Fettsäuremethylester mit internem Standard kann also eine

3 49 Zeitersparnis bei der Analyse durh ein beshleunigtes Temperaturpgramm erreiht werden. Darüber hinaus weisen die resultierenden, auf Fett bezogenen Buttersäuregehalte eine sehr gute Wiederholbarkeit auf [8]. Mit Hilfe dieser Methode wurden Mishungen von 3 vershiedenen Fremdfetten (Sojaöl, Sonnenblumenöl und Palmkernfett) mit Milhfett im Bereih von % Fremdfett untersuht. Die Ergebnisse basieren auf Einfahmessungen bei tägliher Analyse des reinen Milhfettes. Abbildung 5.2 zeigt die mittleren absoluten Abweihungen der Wiederfindungsraten vom tatsählihen Gehalt für alle Fremdfette. ln dem bis jetzt untersuhten Mishungsbereih liegt der absolute Fehler mit durhshnittlih,5 % besonders niedrig (1,2 % relativ). Der Nahteil dieser Buttersäure-Methode sowie erst reht des Verfahrens unter Verwendung von 8 Fettsäuren ist die Notwendigkeit von ein bzw. zwei Rükstellpben der reinen fette p Mishfett. Der Milhfettgehalt eines Mishfettes kann aiso nur bei Verfügbarkeit der reinen Komponenten ermittelt werden. Arbeitet man ohne Rükstellpben, ist das Fettsäurenmuster der reinen Fette unbekannt. Für diesen Fall ist der Einsatz von Fettsäureformeln, die auf die Fettzusammensetzung des Mishfettes angewendet werden, ein denkbarer Lösungsweg. Die Ableitung erfolgte dabei in ähnliher Weise wie bei den o.a. Triglyeridformeln [1]. Bei einer Nahweiswahrsheinlihkeit von 99 % führte die Entwiklung individueller Formeln für jedes der 8 untersuhten Fremdfette zu teilweise sehr hohen Nahweisgrenzen [6]. Insbesondere bei Rinder- und Shweinefett ergaben sih Nahweisgrenzen von a. 19 % bzw. 25 % Fremdfett in Milhfett. Da bei unbekannter Zusammensetzung der reinen Fette auh die Art des Fremdfettes unbekannt ist, kann allerdings nur eine allgemeine Formel verwendet werden. Bei dieser lagen dann für fast alle Fremdfette die Nahweisgrenzen bei a. 25 % [6]. Aufgrund dieser Berehnungen ist ein quantitativer Fremdfettnahweis bei unbekannter Zusammensetzung der reinen Fette mit Fettsäureformeln z.z. niht mit annehmbarer Präzision möglih. Allerdings ist hier bei Einsatz anderer statistisher Verfahren noh Entwiklungspotential vorhanden. Eine quantitative Bestimmung des Fremdfett- bzw. Milhfettanteiles bei unbekannter Zusammensetzung der reinen Fette ist alternativ über den Buttersäuregehalt möglih. Zur Bestimmung des Milhfettanteiles (x) wird dann neben dem C4-Gehalt des Mishfettes allerdings ein experimenteller Mittelwert für den C4-Gehalt des Milhfettes benötigt. Im Hinblik auf die natürlihe Variation des Buttersäuregehaltes in Milhfett muß dieser mittlere Buttersäuregehalt zur Minimierung des Fehlers möglihst repräsentativ sein. Diesbezüglihe Untersuhungen erfolgten daher an 136 Milhfetten aus 9 eupäishen Ländern [4], die derart ausgewählt wurden, daß sie den gesamten natürlihen Variationsbereih des Triglyerid-C54-Gehaltes umfaßten. C54 beinhaltet alle Triglyeride mit einer Ayl-Koh!enstoffzahl von 54 und ist ein harakteristisher Indikator für vershiedene Fütterungsbedingungen und Milhfettzusammemsetzungen [9}. Es wurde ein mittlerer Buttersäuregehalt von 3,42 g / 1 g Fett (ausgedrükt als freie Säure) mit einem annähernd normalverteilten (Abbildung 5.3) und als repräsentativ anzusehenden Variationsbereih von 3,7-3,75 g / 1 g Fett gefunden [4]. Dabei wurde wie oben bei der Buttersäureanalyse erwähnt mit einem internen Standard und Natriummethylat als Umesterungs-Reagenz gearbeitet, nahdem dieses Verfahren sih in einem Methodenvergleih als geeignetstes herausgestellt hatte [8]. Neben dem in Abbildung 5.2 dargestellten relativ kleinen Fehler (bekannte Zusammensetzung des Milhfettes) kommt bei Verwendung eines Mittelwertes für den C4-Gehalt des reinen Milhfettes also ein zusätzliher Fehler durh die natürlihe Variation des Buttersäuregehaltes in Milhfett hinzu. Dieser Variationsfehler kann nah dem o.a. C4-Variationsbereih bis zu a. 1 O % relativ betragen. Der absolute Variationsfehler hängt dann zum einen davon ab, wie weit der tatsählihe C4-Gehalt des zugrundeliegenden reinen Milhfettes vom Mittelwert abweiht.

4 5 Zum an9eren steigt der absolute Fehler (99 % Wahrsheinlihkeit) mit zunehmendem Milhfett- Anteil im Mishfett auf bis zu a. 1 % an. In Abbildung 5.4 sind die absoluten Fehler der aufgeführten Fettsäure-Verfahren gegenübergestellt. Die maximale absolute Abweihung zwishen berehnetem und tatsählihem Fremdfettanteil für das C4-Verfahren unter Verwendung eines mittleren Buttersäuregehaltes (helle Dreieke, ab 7 % Fremdfett) arbeitet nur bei sehr kleinen Milhfettanteilen mit akzeptablen absoluten Fehlern. Bessere Ergebnisse sind bei bekannter Zusammensetzung der reinen Fette zu erzielen. Hier liefert die Berehnung über eine Kombination von 8 Fettsäuren geringere absolute Fehler zwishen a.,5 und 2, % (dunkle Kreise). Im Bereih kleiner Fremdfettzusätze, d.h. hoher Milhfett-Anteile sind allerdings mit Triglyerid-Formeln [7] sogar bei unbe- kannter Zusammensetzung der reinen Fette deutlih kleinere Fehler zu erzielen. Die Bestimmung des Milhfett-Anteiles bei bekannter Zusammensetzung des reinen Milhfettes über den Buttersäuregehalt weist in dem bisher untersuhten Bereih von % Fremdfett mit durhshnittlih,5 % den geringsten absoluten Fehler auf {helle Kreise), so daß hier weitere Studien sinnvoll ersheinen. Die Ursahe für diese Präzision liegt mögliherweise in der angewendeten Methodik. Hier wird ein interner Standard verwendet sowie der C4-Gehalt des reinen Milhfettes täglih neu bestimmt. Ein derartiger Ansatz ermögliht also die genaueste Bestimmung von Milhfettanteilen in Mishfetten, erfordert allerdings die Verfügbarkeit des reinen Milhfettes. Das Fremdfett wird jedoh niht benötigt, so daß hier ein Vorteil gegenüber der 8-Fettsäuren-Methode zu sehen ist. 5.4 Literatur [1] Preht, D., Z. Lebensm. Unters. Forsh. 194 (1992) [2] Commission Regulation (EC) No 454/95, annex III: Referene method for the detetion of foreign fats in milk fat by gas hmatographi analysis of triglyerides. Offiial Journal No L 46 (1995) 1 ff. [3] Preht, D., und Molkentin, J., Kieler Milhwirtshaft!. Forshungsber. 49 (1997) [4] Molkentin, J., und Preht, D., Milhwissenshaft 52 (1997) [5] Muuse, B., und Martens, R., Bulletin of the IDF 285 (1993) [6] Preht, D., und Molkentin, J., Ergebni~beriht zum Forshungspjekt VO (EWG) Nr. 1116/ vom (1995) [7] Preht, D., Ergebnisberiht zum Forshungspjekt VO (EWG) Nr. 1116/92-:2.4 vom (1995) [8] Molkentin, J., und Preht, D., Z. Lebensm. Unters. Forsh. 2 (1998) im Druk. [9] Preht, D., Kieler Milhwirtshaft!. Forshungsber. 46 (1994) Dr. Joahim Molkentin Bundesanstalt für Milhforshung Institut für Chemie und Physik Postfah Kiel

5 51 Tabelle 5.1 Wiederfindungsraten von 4 % Rinderfett in Milhfett unter Verwendung von Gleihung (1} FS Errehneter Rinderfettgehalt ( 1 (x 1)) [%] C4 37,8 37,8 37,8 C6 38,4 38,4 38,4 38,4 38,4 38,4 C8 39,86 39,86 39,86 39,86 39,86 39,86 39,86 39,86 C1 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 C12 42,31 42,31 42,31 42,31 42,31 42,31 42,31 C14 47,4 C16 41,84 41,84 41,84 41,84 41,84 41,84 41,84 41,84 C18 46,19 43,19 C18:1 39,3 39,3 39,3 39,3 39,3 39,3 39,3 C14:1 43,48 43,48 43,48 C15 37,25 C16:1 39,56 39,56 39,56 39,56 C17 42,19 42,19 42,19 C1:1 4, 4, C17:1 4, MW: 41,71 4,7 4,36 4,38 4,67 4,51 4,71 4,42 SA: 3,58 2,62 1,99 1,96 1,62 1,37 1, 15,99

6 52... ~ rn.. (.) "(j) 5 <(... ID (/) Fremdfettzusatz[%] Abb. 5.1: Mittlere absolute Abweihungen zwishen tatsählihen und anhand von aht Fettsäuren berehneten Zusätzen von aht Fremdfetten zu Milhfett (Zusammen.:. setzung der reinen Fette bekannt)... ~... O>.. (.) '(j) 5 <(... ID (/),4,3,2,1, -+--~~~~~~~~~~~~~~~~---< Fremdfettzusatz[%] Abb. 5.2: Mittlere absolute Abweihungen zwishen tatsählihen und anhand von Buttersäure berehneten Zusätzen von drei Fremdfetten zu Milhfett (Zusammensetzung des Milhfettes bekannt)

7 :: N (!) ,9 3,1 3,3 3,5 3,7 3,9 [g/1 g] Abb. 5.3: Häufigkeitsverteilung der Buttersäuregehalte in 136 eupäishen Milhfettpben,..., ~ O'l ::i.. (.) " 3: <( Q)... ::i (/) m Fremdfettzusatz[%] _._ mit 8 Fettsäuren, Fettzusammensetzung bekannt -A-- mit Buttersäure, Fettzusammensetzung unbekannt -&- mit Buttersäure, Fettzusammensetzung bekannt Abb. 5.4: Absolute Abweihungen zwishen tatsählihen und anhand von Fettsäuren nah vershiedenen Verfahren berehneten Zusätzen von Fremdfetten zu Milhfett (Kreise: experimentelle Mittelwerte, Dreieke: Maximalwerte bei 99 % Wahrsheinlihkeit)