Zur Methodik der Planar-Chromatographie

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1 Zur Methodik der Planar-Chromatographie

2 2 Planar-Chromatographie Wir benutzen Planar-Chromatographie als Synonym für: Moderne Dünnschicht-Chromatographie Instrumentelle Dünnschicht-Chromatographie Hochleistungs-Dünnschicht-Chromatographie DC/HPTLC

3 3 Warum heute Planar-Chromatographie? Schnell Zuverlässig Kostengünstig Extrem flexibel GLP-konform Übersichtlich Sehr gut dokumentierbar

4 4 Einsatzgebiete Forschung und Entwicklung Screening Qualitative Analyse Prozessentwicklung und -optimierung Mikropräparative Trennung Routineanalytik Qualitätskontrolle Identitätsprüfung Gehaltsbestimmung / Verunreinigungen

5 5 Weitere Vorteile Parallele Analyse von Proben und Standards Wenig Matrixprobleme durch einmalige Verwendung der Platte Gezielte Optimierung für einzelne Komponenten Flexible und mehrfache Detektion Mehrdimensionales Ergebnis Flexibilität durch off-line Methodik

6 6 Nachteile der Planar-Chromatographie Umwelteinflüsse durch offenes System Begrenzte Trennleistung Nicht durchgehend automatisierbar (Begrenzte Kontrollierbarkeit der Gasphase)

7 7 Die planar-chromatographische Trennung Gasphase P r o b e Stationäre Phase Mobile Phase

8 8 Die Gasphase Beeinflusst: Schichtaktivität R F Trennung Mobile Phase Hängt ab von: Kammertyp Konditionierung α Front β 4 Front γ Front

9 9 Chromatographische Trennung wie? Die mobile Phase fließt mit Kapillarkräften durch die Poren (60 Angström = 6 nm) Die Substanzen werden in der mobilen Phase gelöst und über eine gewisse Wegstrecke transportiert Unterschiedliche Adsorptions- und/oder Verteilungs- GGW haben unterschiedliche Aufenthaltszeiten in der stationären Phase zur Folge

10 10 Wanderungsstrecke in der DC 2 γ z max = ρ * g * r z max max. Steighöhe in einer einzelnen zylindrischen Kapillare [cm] γ Oberflächenspannung [dyn[ dyn/cm] ρ Dichte [g/ml] g Erdbeschleunigung (9,81 m/s 2 ) r Kapillarradius [cm] z F 2 = κ * t z F κ t Entfernung Fm.front-Eintauchspiegel Fliesskonstante Zeit

11 11 Fliessmittelbewegung Trennstrecke (mm) Entwicklungszeit (min)

12 12 Diffusion und Trennzahl Je länger die Laufstrecke, umso diffuser die Zonen und umso schlechter die Trennzahl!

13 13 Ideales Zonenprofil Häufigkeit Einzelwerte

14 14 Verteilungsisothermen - Konzentrationsprofile Verteilungsisothermen C s C s konvex C s konkav C m Konzentrationsprofile C m C m Zonenformen o.k. Tailing Fronting

15 15 Tailing - Ursachen und Abhilfe Überladung: Substanzmenge reduzieren Zu hohe Schichtaktivität: Sättigung, Vorbedampfen Reaktion: Schicht wechseln, modifizieren Polare Lösungsmittelreste: Trocknen Konvexe Isotherme: Phasensystem ändern Dissoziation: Schicht/Fließmittel puffern Veränderung der Substanz: Schutzatmosphäre

16 16 Fronting-Ursachen und Abhilfe Feuchte Startzone & schwaches Fliessmittel: Startzone trocknen, stärkeres Fliessmittel Konkave Verteilungsisotherme Phasensystem ändern aus: Frey, H.-P. und Zieloff, K.: Qualitative und quantitative Dünnschicht- Chromatographie, VCH, Weinheim, 1992

17 R F - bzw. R rel -Wert Lösemittelfront b a b i b st Startzone

18 R F - bzw. hr F -Wert 18 Rückhaltefaktor, Retardation Factor oder Relate to Front Relative Position einer Zone auf der DC/HPTLC HPTLC-PlattePlatte R F = b a < 1 a b Laufstrecke der Fließmittelfront (Startzone - Fließmittelfront) Laufstrecke der Fraktion (Startzone - Substanzmitte) hr F = R F * 100

19 Auflösung 19 zweier Zonen Laufstrecken-Differenz R S = 2 (z F 1 -z F 2) w 1 + w 2 Summe der Peak-Basisbreiten Basisbreiten/2 z F 1, z F2 w 1, w 2 Wanderungsstrecken Peak-Basisbreiten Unterschiedliche K-Werte K (Steigung der Isothermen, Selektivität) Arbeiten im linearen Bereich (Konzentration!) Optimale Entwicklungsstrecke (Diffusion!)

20 20 Verteilungs-/Adsorptionsisotherme C S K 2 = 2 C m frische mobile Phase K 2 K 1 2 K 1 = 0, C m C S K = C s K C S C M K 2 C m Selektivität α = Verteilungskoeffizient Konzentration in der stationären Phase Konzentration in der mobilen Phase K 1

21 Auflösung 21 nach Snyder R s = 1 4 ( K 1 K 2-1) * * (1 - R F ) R F * N a b c a b c R F N z F H Selektivitätsterm z F N = Schichtqualität H Fliessmitteleinfluss mittlere R F -Wert des zu trennenden Substanzpaares Trennstufenzahl Wanderungsstrecke Trennstufenhöhe, HETP Selektivität von grossem Einfluss: R s ~ α Trennstrecke von geringem Einfluss: R s ~ N i

22 22 Der a-term: Selektivität Abhängig von den Verteilungskoeffizienten der beiden Substanzen Abhängig von der chemischen Natur von: Probe Schicht Fliessmittel Ist nicht einfach ΔR F

23 23 Der b-term: Schichtqualität N ist die Trennstufenzahl über die gesamte Trennstrecke Beeinflusst Auflösung nur über Quadratwurzel Auflösung ist proportional Wurzel R F R F = 0 ergibt R S = 0 Verlangt hohen R F

24 24 Der c-term Extremer R F Effekt: R F =1 ergibt R s =0 Verlangt kleinen R F 1 Auflösung R s 0.5 Vom b und c Term: R F muss optimiert werden R s maximal bei R F =0.3 R f

25 Zonenverbreiterung 25 nach van Deemter H = A + B + C * v v B bei HPTLC: H ~ 12 μm A,C bei DC: H ~ 30 μm A B C Schichtqualität, Eddy-Diffusion Diffusionsterm, longitudinale Diffusion Verzögerungsterm, lokales Nicht-GGW 2 γ D H = 2 λ dp + + v H v λ dp γ D ω chromatographische Stufenhöhe Fliessmittelgeschwindigkeit Funktion der Schichtpackung Teilchendurchmesser Labyrinth-Faktor Diffusionskoeffizient Packungsstruktur-Faktor ω dp 2 v D

26 Ziel 26 der Chromatographie Trennung Anforderung qualitativ quantitativ präparativ geringe Differenz der Laufstrecken "genügende" Differenz der Laufstrecken vollständige Peaktrennung

27 Welches Ziel will ich erreichen? - Trennung qualitativ oder quantitativ? - Zwei- oder Vielkomponentengemische? - Trennzeitoptimierung

28 28 Was ist bekannt Anzahl von Komponenten Chemische Strukturen Molekulargewichte Löslichkeiten Art der Matrix Konzentrationsbereich Sonstiges: pka ; UV Spektrum, etc. NICHTS

29 29 Informationen Ähnliche Trennungen in der Literatur finden CAMAG Bibliography Service (CBS) auch auf CD-ROM Chemical Abstract Service (CAS) Chromatography Abstracts J. Chromatography A (Bibliog. Sect.) Fachzeitschriften (Journal of Planar Chromatography) Offizielle Methoden (USP, EuPh, AOAC) Handbücher CRC Handbook of Chemistry and Physics CRC Handbook of Chromatography Merck Index DC-Literatur: siehe Auslage

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33 Vom Klecksen zur optimalen Probenauftragung

34 Probenauftragung allgemeine Hinweise Die Proben müssen exakt positioniert sein Identitätsprüfung über den Rf-Wert nur möglich wenn Proben in gleichem Abstand vom unteren Rand aufgetragen sind. Abstand vom linken und rechten Rand und Bahnabstand müssen definiert sein Das Probevolumen muss kontrolliert sein Vermeidung von Schichtüberladung oder Auftragemengen unter der Nachweisgrenze. Bei Quantifizierung geht das Probenvolumen in die Berechnung ein! Die Schicht darf nicht verletzt werden Schichtschäden führen zu verzerrten Substanzflecken. Bleistiftmarkierungen können mit der Probe Wechselwirkungen eingehen und stören die densitometrische Auswertung

35 Auftragepositionen Eintauchtiefe 10 mm 10 mm mindestens 4 mm Eintauchtiefe 5 mm 5 mm mindestens 2 mm 25 mm 15 mm 15 mm 8 mm

36 Auftragetechniken Manuelle Auftragung Halbautomatische Auftragung Vollautomatische Auftragung

37 Manuelle Probenauftragung Spritzen mit geradem Kanülenanschnitt Auftragung größerer Volumina möglich Zwischentrocknung der Platte möglich Achtung: nicht während der Auftragung mit dem Fön oder Mund Flecken trocknen! Nachteil: Beschädigung der Schicht- verzerrte Flecken

38 Schöllkraut Elke Hahn-Deinstrop

39 Manuelle Auftragung Festvolumenkapillaren im µl und nl-bereich Nachteile: unzureichende Füllung bedingt durch Adhäsions- oder Cohäsionsvorgänge (Oberflächenspannung und Viskosität der Lösungen) Füll- und Entleerzeiten Innendurchmesser der Kapillare DC-Platten bis 20x20 cm Probevolumen: 0,5µl; 1µl, 2µl, 5µl Rasterung 0,5 cm

40 Probenauftragung Die Größe des Startflecks resultiert aus dem Probevolumen und der Porosität und Dicke der Schicht. d max = 4V(1+ Φ)/ Π d V Auftragevolumen in µl Φ Phasenverhältnis (Hptlc-Schichten=0,395) d Schichtdicke in mm 0,5µl 1µl 2µl 5µl Die Größe des Startflecks belastet die Startbreite und damit die Auflösung des DC- Systems! Dosierqualität: HPTLC 1 mm DC 3 mm

41 Einfluss der Probenmenge auf die Trennung Menge pro Fleck entscheidend für die Trennung. Begrenzung durch Linearkapazität der Schicht (Masse die den oberen Linearbereich der Verteilungsisotherme markiert) Für HPTLC-Schicht 10 bis 50 ng Für DC-Schicht 50 µg Probengröße (ng) Trennstufenzahl H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)

42 Trocknen des Startflecks Vor der Entwicklung Startfleck unbedingt trocknen! Nicht mit dem Mund wegblasen Atemluft enthält Feuchtigkeit Nicht heiß abföhnen kondensierende Feuchtigkeit und Aktivitätserhöhung durch Warmluft. Nach der Trocknung Schicht erst äquilibrieren lassen

43 Probleme bei der Auftragung Nasse Auftragestelle Platte vor der Entwicklung trocknen!? CAMAG Applikationslabor

44 Probleme bei der Auftragung? Gingko-Extrakt Probe auf Bahn 2 wurde zuletzt aufgetragen und nicht ausreichend getrocknet. MP: Ethylacetat/Essigsäure/Ameisensäure/ Wasser D: Naturstoffreagenz

45 Probenauftragung Einfluss des Lösungsmittels auf Größe der Startzone n-hexan Toluol Chloroform Aceton H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)

46 Probenauftragung Einfluss des Lösungsmittels auf Größe der Startzone polar unpolar CAMAG Applikationslabor

47 Probenauftragung Einfluss des Lösungsmittels auf Größe der Startzone H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)

48 Probenvorbereitung Einfluss des Lösungsmittels auf das Ergebnis Usninsäure und Moosextrakte MP: Dichlormethan/Ameisensäure 19+1 D: Anisaldehyd 1-2 Moosextrakt Aceton 3 Usninsäure in Methanol 4 Usninsäure in Aceton 5 Aceton 6 Methanol Aceton ist offensichtlich kein geeignetes Lösemittel! E.Reich,A. Schibli HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006

49 Einfluss der Lösemittels Islandmoos MP: DCM/Ameisensäure 19+1 D: UV 366 nm Bahn 1-6 Lösemittel Aceton Bahn 7 Lösemittel Wasser Startzonen sorgfältig trocknen! E.Reich,A. Schibli HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006

50 Probleme bei der Auftragung? Matrixeffekte Gingko-Extrakt Auf Bahn 2 enthält die Probe Glycerin als nicht flüchtige Komponente die sich nicht mit der mobilen Phase mischt MP: Ethylacetat/Essigsäure/Ameisensäure/ Wasser D: Naturstoffreagenz

51 Probleme beim Auftragen? CAMAG Applikationslabor

52 Automatisches Probenauftragen Hahn-Deinstrop Applied Thin-Layer Chromatography, Willey-VCH

53 Halbautomatisches Probenauftragen Linomat 5 Turm mit Dosierspritze Plattenhalter Anzeige Anzeige und und Programmierung Programmierung

54 Automatisches Probenauftragen DC-Probenautomat 4 Abdeckhaube Turm mit Spritze Verwerf- und Spülflasche Probenrack Verwerfplatte Plattenhalter Display und Programmiereinheit

55 Arten der Auftragung

56 Vergleich punktförmige und strichförmige Auftragung (unpolares Lösemittel) CAMAG Applikationslabor

57 Bärentraubenblätter Bestimmung von Arbutin CAMAG Applikationslabor

58 Rechteckauftragung

59 Overspraying CAMAG DC-Probenautomat 4

60 Vorteile der automatischen Auftragung Proben können punkt- und strichförmig auf die DC/HPTLC-Platte aufgetragen werden Die Proben werden auf die DC-Platte aufgesprüht - keine Verletzung der Schicht Das Lösemittel der Probe verdampft während der Auftragung Problemlose Dosierung im nl-bereich Exakte Positionierung der Auftragungen Rechteckauftragung möglich

61 Was man noch so alles machen kann Arbeitsgruppe Prof. Dr. Schwack, Universität Hohenheim

62 Erzeugung von Startbanden durch Vorlauftechniken Vorlauf auf Schichten mit Konzentrierungszone Retentionsfreier Schichtbereich

63 Erzeugung von Startbanden durch Vorlauftechniken Vorlauf in polaren Fließmitteln Rf 1 Fließmittel vor der Entwicklung sorgfältig trocknen!!

64 Vergleich strichförmige Auftragung manuell / automatisch Manuelle Auftragung Strich durch aneinanderfügen von Punkten Instrumentelle Auftragung CAMAG Applikationslabor

65 Probenanordnung Chrom. Eigenschaften benachbarter Bahnen unterscheiden sich geringer als weit entfernter Bahnen. Daraus folgt, dass es für die Reproduzierbarkeit falsch ist, die Proben auf der einen, die Standards auf der anderen Seite der HPTLC-Platte anzuordnen!

66 Probenanordnung alternierend S1 P1 S2 P2 S3 P3 S4 P4 S5 P5 Probe wird jeweils auf den vorhergehenden Standard bezogen

67 Probenanordnung alternierend S1 P1 P2 S2 P3 P4 S3 P5 P6 Proben werden jeweils auf den vorhergehenden Standard bezogen

68 Probenanordnung alternierend S 1,2 S 2,3 S 3,4 S1 P1 P2 S2 P3 P4 S3 P5 P6 S4 Proben werden jeweils auf den Mittelwert benachbarter Standards bezogen

69 Probenanordnung Data-pair-Technik S120 S100 S80 S80 P1 S100 P2 S120 P3 S80 P1 S100 P2 S120 P3 P1 P2 P3

70 Hinweise zur Probenauftragung Startfleck nicht größer als 1-2 mm Wenn möglich, strichförmig auftragen Nicht mehrere Fraktionen übereinander auftragen Bei Proben- und Vergleichslösungen das gleiche Lösemittel verwenden Ist Matrix vorhanden, Vergleichslösung mit Matrix ansetzen, da Begleitstoffe Veränderung der Rf-Werte hervorrufen können.

71 Trenntechniken Kammerformen und Trennung

72 Chromatogrammentwicklung Runge-Bilder

73 Chromatogrammentwicklung Gasraumtiefe vor der Schicht: > 3 mm- große Trogkammer < 3 mm- Schmalkammer

74 Kammersättigung Alle Komponenten des Fließmittels vor und während der Entwicklung stehen im Gleichgewicht mit allen Zonen des Gasraumes. In der mit Filterpapier ausgekleideten Kammer Gasraumsättigung nach 5 min erreicht, wenn Kp < 100 C, ohne Filterpapier 2h Das Einstellen einer Platte verzögert die Sättigung Fließmittel

75 Vorbeladung Sorptive Aufnahme von Gasmolekülen aus der Kammeratmosphäre durch unbenetzte DC-Schicht Vorbeladung Sorptive Sättigung Polare Moleküle werden bevorzugt festgehalten Gleichgewicht Wasser-KG stellt sich nach wenigen Minuten ein Beeinflussung durch Dampfsättigung der Partner im Fließmittelgemisch

76 Kapillare Sättigung Aufsteigen der Front führt zur kapillaren Sättigung der Schicht Maximaler endgültiger Sättigungszustand der Schicht mit Fremdmolekülen (keine Homogenität der Molekülsorten)

77 Schematische Darstellung chromatographischer Begriffe Vorbeladung Austausch Dampf- Flüssigkeit Kammersättigung kap. Sättigung Fließmittel

78 Normalkammer Doppeltrogkammer Ungesättigt vorkonditioniert gesättigt vorkonditioniert, anderes Lösemittel Falsch eingelegte Platte

79 N-Kammer ohne Vorbeladung Entstehung eines Gradienten von unten nach oben mit abnehmender Sättigung Trockene Schicht Nach 10 min- Sättigung im unteren Drittel, oben nach mehr als einer Stunde Erhöhter Fließmitteltransport bewirkt Erhöhung der Laufstrecke der Substanzen Verbesserung der Trennung von zusammen liegenden Flecken kap. Sättigung Unsicher hinsichtlich der Reproduzierbarkeit Fließmittel

80 Entwicklung ohne Vorbeladung ohne Vorbedampfung Entwicklung Gasmolek. Fließmittel Fließm. Moleküle Flüssig ads. Wasser F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972

81 N-Kammer mit Vorbeladung Je größer die Vorbeladung, desto größer die Frontwanderungsgeschwindigkeit = kleiner Rf Wasserverdrängung durch Vorbeladung = Veränderung der Polarität der stationären Phase Filterpapier Kap. Sättigung Vorbeladung Austausch Dampf- Flüssigkeit kap. Sättigung

82 Entwicklung mit Vorbeladung Vorbedampfung Entwicklung Gasmolek. Fließmittel Fließm. Moleküle Flüssig ads. Wasser F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972

83 Gegenüberstellung der Entwicklung mit und ohne Vorbeladung Kap. transp. Flüssigkeit 35% Vorbedampfung mit Fließmittel 50% Kap. transp. Flüssigkeit 85% Adsorb. Wasser 15% Adsorb. Wasser 15%

84 Vorbeladung der Schicht Unterscheiden Sie zwischen Kammersättigung und Schichtvorbeladung Rechnen Sie immer mit Vorbeladung Luftfeuchte, Lösemitteldämpfe Vorbeladung mit FM-Dämpfen verringert den Wassergehalt im Adsorbens, erhöht damit die Aktivität. Vorbeladung durch Fließmittelgemische mit polaren Komponenten verändert die Schichteigenschaften. Vorbeladung erhöht die Frontwanderungsgeschwindigkeit, nicht die Fleckgeschwindigkeit Vorbeladung mit Einkomponenten-FM erniedrigt den Rf, Trennung wird oft nicht beeinflusst S-Kammern sind ideal ungesättigt und ermöglichen Chromatogramme ohne Vorbeladung

85 Ungesättigt, gesättigt, vorbeladen

86 Entwicklung im Trog Einfluss der Eintauchtiefe der Platte auf die nachfolgende Entwicklung A : zu hoher Fließmittelstand Partielle Wechselwirkung mit dem Fließmittel B: korrekter Fließmittelstand E.Hahn-Deinstrop, Applied Thin-Layer Chromatography,Wiley-VCH,2006

87 Entwicklung im Trog Einfluss der Randabstände auf die Entwicklung Randeffekt Proben sind zu nahe an den Ränden der Platte! CAMAG Applikationslabor

88 Theorie für beste Auflösung: Laufstrecke HPTLC-Platten 5 bis 7 cm mit max. 6 cm DC-Platten cm mit max. 12 cm Hydrastis canadensis 4 cm 6 cm HPTLC-Platte MP:Ameisensäure/Wasser/Ethylacetat Hydrastinin 2 Hydrastin 3 Berberil Wenn das chromatographische System hochselektiv ist, und die Anzahl der Komponenten gering, reichen auch kürzere Laufstrecken E.Reich,A. Schibli HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006

89 Laufstrecke 8 cm 12 cm TLC-Platte MP:Ameisensäure/Wasser/Ethylformat Rutin 2 Hyperosid 3 Phenazon 4 bis 6 Tausendgüldenkraut 7 Enzian Erhöhung der Laufstrecke gibt signifikante Ergebnisse E.Reich,A. Schibli HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006

90 Laufstrecke Ginseng 6 cm 8 cm HPTLC Platte MP: Chloroform/Ethylacetat/Methanol/Wasser Seltener Fall: Auflösung ändert sich nicht signifikant mit der Erhöhung der Laufstrecke E.Reich,A. Schibli HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006

91 Entwicklung im Trog Bananenfront - Kammer ist nicht dicht CAMAG Applikationslabor

92 Entwicklung im Trog Gewelltes Chromatogramm Ungenügende Kammersättigung Luftzug? CAMAG Applikationslabor

93 Entwicklung im Trog Störung des Gleichgewichtes Kammersättigung MP: Chloroform/Methanol 9+1

94 Trocknen der Platte Schnelles Trocknen der Platte, um die Chromatographie zu stoppen, und um Fleckendiffusion zu vermeiden Überschüssiges Lösemittel ablaufen lassen Vertikale Lage der Platte, um Fließen des Restlösemittels und damit Fleckendiffusion zu verhindern (so lange wie Feuchte offensichtlich). Verwendung von Kaltluftstrom, wenn Substanzen das zulassen Bei schwer flüchtigen Lösemitteln -Warmluftstrom

95 Horizontalentwicklungskammern

96 Horizontalentwicklungskammer Mehrfachfunktion: S-Kammer mit ideal ungesättigtem Gasraum Kammersättigung Kammersättigung + Vorbeladung

97 Planar-Chromatographie heute Vortrag Dr. G. Morlock (Analytischer Fortbildungstag 2009, TU Berlin)

98 Vergleich HPLC-HPTLC Vortrag Dr. G. Morlock (Analytischer Fortbildungstag 2009, TU Berlin)

99 Fließmittel-Entmischung in der ungesättigten S-Kammer Ursache: Binäre Fließmittelgemische mit unterschiedlicher Polarität verlieren einen Teil Ihrer polaren Komponente zum Aufbau der stationären Phase

100 Ausbildung von ß-Fronten Alpha-Front Wassermoleküle ß-Front unpolare Komponente polare Komponente stat. Phase mobile Phase F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972

101 Peakform in der ß-Front Front ß-Front Start

102 S u -Kammer Gasraum < 3mm Keine Vorbedampfung Fließmittel- Entmischung Mehrere Fronten Reproduzierbare Trennung Vergleichbar zur Säule F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972

103 Entwicklung im Trog Sekundäre Front Kammersättigung nötig! Änderung der mobilen Phase CAMAG Applikationslabor

104 CAMAG VARIO-System 1.Entwicklung mit 6 verschiedenen Lösemitteln Nebeneinander in S-Konf. 2.Entwicklung in ges. Tank- Konfiguration 3.Vorkonditionierung derplatte, dann wie 2 4.Vorkonditionieren mit 6 untersch. Lösemitteln

105 Spezielle Techniken-warum? Besserer Reproduzierbarkeit: Automatische Entwicklung (ADC2) Komplexe Matrix/schwierige Gemische: Mehrfachentwicklung 2-Dimensionale Entwicklung Durchlauftechnik Großer Polaritätsbereich: Höhere Fleckenkapazität: Gradiententechnik (AMD2) Gradiententechnik (AMD2)

106 Mehrfach- Entwicklung (gleiche Mobile Phase) Erste Entwicklung Zweite Entwicklung Fingerprint von Ölen nach Pharm.Eur. 2x entwickeln gleiche mobile Phase Bessere Auflösung? MP: Dichlormethan/Essigsäure/Aceton D: Phosphormolybdänsäure 1: Maiskeimöl 2: Olivenöl 3: Verfälschung

107 CAMAG ADC 2

108 Einhängen der Platte Kammersättigung Laufstreckenkontrolle

109 Wichtigste Eigenschaften der ADC2 Vollautomatische Entwicklung von TLC/HPTLC- Platten und Folien der Größen 20x10 und 10x10 cm Hohe Reproduzierbarkeit der Rf-Werte Einstellung einer definierten Aktivität der Schicht über die Option Feuchtekontrolle möglich Überwachungsfunktion durch den Nutzer entfällt Einsatz einer herkömmlichen Doppeltrogkammer Betrieb im stand-alone Modus oder unter wincats

110 Reproduzierbarkeit der Rf-Werte Probe: Chlortoluron, Desethylatrazin, Cyanazin, Atrazin je 50 ng/µl in Acetonitril Auftragevolumen: 5 µl Bandlänge: 8 mm, Anzahl Bahnen: 15 Schicht: HPTLC Fertigplatten Kieselgel 60 F x 10 cm, Merck Fliessmittel: t-buthylmethylether n-hexan 60 : 40, Laufstrecke: 60 mm Labortemperatur: 27 C/35% rel. Feuchte

111 Reproduzierbarkeit der Rf-Werte

112 Einfluss der Feuchte auf das Trennergebnis

113 Modul Feuchtekontrolle Salz Relative Luftfeuchtigkeit (%) bei einer Temperatur von C Löslichkeit bei 20 C g/100 g Wasser Magnesiumchlorid ,4 Kaliumthiocyanat ,5 Natriumchlorid ,0

114 Einfluss der Feuchte auf das Trennergebnis Sojalecithin Standardlösung gemäss Vorschrift in CBS90 Auftragevolumen: 1 µl, Bandlänge: 8 mm, Anzahl Bahnen: 15 Fliessmittel: Chloroform Methanol - Aceton Wasser 18:15:3:1.ungesättigte Entwicklung, Laufstrecke: 70 mm Derivatisierung: Tauchen in CuSo4/H3PO4 Reagenz 10 Min. auf 170 C erwärmt. Messung: 338 nm.

115 Einfluss der Feuchte auf das Ergebnis der Trennung Sojalecetin-Standard (Phospholipide) Ohne Feuchteeinstellung Labortemperatur 25 C/52%rel.F. Feuchteeinstellung 17 %

116 1 st development: hexane 2 nd development: mobile phase 1 st development: very polar solvent 2 nd development: mobile phase, less polar Abtrennen nichtpolarer Matrix Abtrennen polarer Matrix Fokussierung Application 1 st development: methanol 2 nd development: mobile phase Mehrfach-Entwicklung (verschiedene Mobile Phasen)

117 Mehrfachentwicklung Metoclopramid in Suppositorien 1. Entwicklung mit polarem Fließmittel, um Matrix in die Front zu schieben 2. Entwicklung mit geeignetem FM Für die Trennung E.Hahn-Deinstrop, Applied Thin-Layer Chromatography,Wiley-VCH,2006

118 Mehrfach- Entwicklung (gleiche Mobile Phase) DC 1.Entw. DC 2.Entw DC-HPTLC Lavendelöl mit Toluen/Ethylacetat 95+5 Derivatisierung: Anisaldehyd HPTLC 1.Entw Der Effekt des Wechsels in diesem Fall- Zeitersparnis! E.Reich,A. Schibli HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006

119 Zweidimensionale Trennung " Entfernen der Matrix 2. Trennung der Probe Verschiedene Fliessmittel, Platte um 180 gedreht

120 Zweidimensionale Entwicklung TRT-Technik: Trennung-Reaktion-Trennung mit dem gleichen Fliessmittel, Platte um 90 gedreht

121 Stabilitätsuntersuchung (Zwei-Dimensionale Chromatographie) CAMAG Applikationslabor

122 Das AMD 2 System automatisierte Mehrfachentwicklung

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124 Gestaltung des Gradienten Universalgradient Basisfließmittel Verstärker Abschwächer Normalphasengradient sehr polar beginnend über mittelpolar und unpolar endend Fließmittel mittlerer Polarität- bestimmend für die Selektivität Fließmittel mit hoher Elutionskraft Unpolares Fließmittel Verstärker Basisfließmittel Abschwächer Methanol Dichlormethan n-hexan Methanol t-butylmethylether n-hexan Methanol/Wasser Acetonitril Dichlormethan

125 Gestaltung des Gradienten

126 Fokussiereffekt

127 AMD2 Schrittweise Entwicklung Focusing Step 1 Step 2 Step 3 Step 4 Step 5 Step.. CAMAG Applikationslabor

128 Gradientenoptimierung Farbstoffgemisch + Benzoesäure

129 AMD2-Anwendung Frangulaextrakt Gelb fluoreszierende Zone- Aloin CAMAG Applikationslabor

130 AMD2 Anwendungen Trennung verbotener Amine Black leather Textile red cotton Textile blue cotton 2µL 5µL10µLS1 S2 S3 S4 2µL 5µL10µL S1 S2 S3 S4 2µL 5µL10µL CAMAG Applikationslabor

131 AMD2 Anwendungen Pestizidtrennung mit Gradient A CAMAG Applikationslabor 2,4-D Atrazine Metazachlor I-St = Benzanilid Pendimethalin

132 AMD2 Anwendungen Pestizidtrennung mit Gradient B CAMAG Applikationslabor 2,4-D Metazachlor Atrazine I-St = Benzanilid Pendimethalin

133 AMD2-Trennung von Zuckern Glucose Fructose CAMAG Applikationslabor

134 AMD-Charakteristika Fokussierung zu scharfen Zonen Zonenprofil nahezu unabhängig von der Trennstrecke Laufstrecke unabhängig von der Matrix Polaritätsgradienten frei programmierbar Substanzen sehr unterschiedlicher Polarität trennbar Trennzahl > 40 auf 80 mm Trennstrecke

135 Es gibt keine beste Kammer Kriterium für gutes Entwicklungssystem: Reproduzierbarkeit der Arbeitsparameter, klimatisierte Räume, gute Schichtqualität, ausgereifte Verfahren Nutzen Sie für die Lösung Ihres analytischen Problems immer die angemessene Trennkammer

136 OPLC System Overpressured Thin-Layer Chromatography Fließmittel wird in eine horizontale hermetisch abgeriegelte Schicht hineingepumpt Fließmittel für Linearentwicklung durch einen gefrästen Spalt auf die Chromatogrammbreite verteilt Linearisierung des Fließgesetzesdadurch kaum Fleckverbreiterung

137 Zirkularentwicklung Punktförmige Einspeisung des Fließmittels Auftragung der Proben im Startkreis