Die stationäre Phase. Sortimentsübersicht. Auswahlentscheidung

Transkript

1 1 Die stationäre Phase Sortimentsübersicht Auswahlentscheidung

2 2 Trennmechanismen Adsorptions-Chromatographie Verteilungs-Chromatographie Ionenaustausch-Chromatographie Komplex-Chromatographie

3 3 Adsorption - Verteilung

4 4 Welche stationäre Phase? Aluminiumoxid Kieselgel RP-Schichten Amino-, Cyano und Diolphase Florisil Polyamid Cellulose Kieselgur Imprägnierte Schichten Ionenaustauscher-Schichten

5 5 Weiteres über stationäre Phasen Schichtuntergrund Binder Phosphoreszenzindikator Hersteller-/Chargenabhängigkeit Labordämpfe- Vorwaschen der Schicht Aktivität der Schicht DC-HPTLC

6 6 Abkürzungen (G Gips als Bindemittel (H ohne artfremde Bindemittelzusätze F Fluoreszenzindikator 245 Anregungswellenlänge des F PSC R RP 2,8,18 W S präperative Schichten Schichtdicke > 0,25 mm hochgereinigtes Sorbens Reversed Phae/Umkehrphase mit Kettenlänge/C-Atome 2,8,18 wasserfeste,- benetzbare Schichten säurestabiler Indikator 60 mittlerer Porendurchmesser in Angström (=6 nm)

7 7 Terminologie & Polarität Normalphasen-Chromatographie (Straight Phase): polare SP + unpolare MP Umkehrphasen-Chromatographie (Reversed Phase): unpolare SP + polare MP Polarität der Schichten Si > NH 2 > CN/Diol > RP-2 > RP-8 > RP-18

8 8 Stationäre Phasen auf Kieselgel-Basis O chirale Phasen Cu + O [ CH 3 [ CH 3 unpolare chemisch gebundene Phasen OH N [ ] 8 ] 5 ] 8 Si O O Si Si O CH[ ] CH 3 polare Phase O Si 3 H O O Si O O Si O Si O Si O O Si O O Si CH CH 3 3 NH 2 C N mittelpolare chemisch gebundene Phasen O OH OH

9 9 Gebundene Phasen - DIOL Weniger beeinflusst durch Feuchtigkeit Einsatz als Normal- oder Umkehrphase Brauchbarste der gebundenen Phasen Grosse Ähnlichkeit mit Kieselgel Geringere Retention Hormone, Steroide

10 10 Gebundene Phasen - Aminopropyl Als Normalphase Trennung nach Art und Anzahl funktioneller Gruppen Als NP: H + -Donor oder H + -Akzeptor Als RP: schwacher Anionenaustauscher Fluoreszierende Flecken mit Zuckern Carbonsäuren, Phenole, Nucleotide, Vitamine, Xanthin-Derivative, Zucker

11 11 Gebundene Phasen - Cyano Mittelpolar Als Normalphase wie desaktiviertes Kieselgel Hochselektiv für polare Heterocyclen Als Umkehrphase zur Ionenpaar-Trennung von Säuren Pharmazeutische Konservierungstoffe

12 12 Umkehrphasen (RP 2, RP 8, RP 18) Unpolare Stoffe (Lipide) Fettsäuren, Carotenoide, Steroide Polare Stoffe Basische und saure Wirkstoffe Stoffe, die auf aktiven Schichten labil sind Vitamine, Antibiotika, Cannabinoide Insektizide, Alkaloide, Barbiturate, Antioxidantien, Analgetika, Lebensmittelfarben

13 13 Aktivität der stationären Phase Hängt ab vom Wassergehalt der Oberfläche Aktivierung: Entfernung von Wasser bei 120 o C Konditionierung: Gleichgewicht mit definierter Feuchte Beeinflusst: R F Werte: hohe Aktivität - kleiner R F Trennung Muss kontrolliert werden Relative Feuchte Trennung von Polyphenylen mit Hexan

14 14 Einstellen der relativen Feuchte Masse % H 2 SO 4 %relative Feuchte Gesättigte Salzlösung % relative Feuchte Pb(NO 3 ) KBr NaNO NaHSO 4 H 2 O KF HCOOK ZnCl H 2 O 10

15 15 DC oder HPTLC? TLC HPTLC Mittlere Korngrösse: µm 5-7 µm Korngrössenverteilung: weit eng Schichtdicke: 250 µm 100, 200 µm Probenzahl: max Laufstrecke: mm mm Entwicklungsdauer: min 3-20 min LM-Verbrauch: 50 ml 5-10 ml Detektionsgrenze, Abs.: ng ng Fluor.: ng 0,1-10 ng

16 16 HPTLC DC - Vergleich

17 17 HPTLC DC: Partikelgrössen

18 18 Herstellung von Kieselgel und RP

19 19 HPTLC-Sorbenzien Lichrospher - HPTLC klassisch

20 20 HPTLC - Lichrospher

21 21

22 22

23 23 UTLC

24 24 HPTLC DC: Optimale Trennstrecke

25 Fließmittelauswahl Methodenentwicklung in der DC

26 Anforderungen an das Fließmittel Darf nicht mit der Probe reagieren Ausreichende Selektivität und Stärke Geringe Toxizität Viskosität /sollte gering sein Zusammen mit Oberflächenspannung bestimmt sie die Geschwindigkeit der Fließmittelfront und die Trennzeit Dampfdruck/ nicht hoch nicht niedrig Hoher Dampfdruck erhöht Risiken die mit Adsorption und Desorption des FM-Dampfes an bzw. von der Schicht. Selektive Verdampfung möglich Genügende Reinheit und Stabilität

27 Anforderungen an das Fließmittel Reinheit Trennung von 4 Polyhydroxybutyraten mit Chloroform Stabilisator: Ethanol Amylen

28 Anforderungen an das Fließmittel Reinheit Dateiname: Bahn:16 Currenta SER-ANT, Chempark Dormagen, Geb. Da 5, Dormagen 200 AE 180 3/FEB/ A300 A A A A A200 A190 0 Analyse w: mm Eindampfrückstand aus 4 ml t-bme (Fluka 20257, LOT ) Im AMD-Gradient, UV-Detektion Dateiname: Bahn:6 Currenta SER-ANT, Chempark Dormagen, Geb. Da 5, Dormagen 200 AE /MAR/ A300 A A A A A200 A190 0 Analyse w: mm Eindampfrückstand aus 4 ml t-bme (SIAL 34875, LOT 8323A) Im AMD-Gradient PF-Absicherung, UV-Detektion

29 Anforderungen an das Fließmittel Stabilität Gereinigte Lösemittel gut verschlossen und gegebenenfalls lichtgeschützt aufbewahren Fließmittel immer frisch bereiten Systeme wie n-butanol/eisessig/wasser neigen zur Veresterung! Noch bedenklicher sind Verseifungen- es entstehen freie Säuren und Alkohol!

30 Anforderungen an das Fließmittel Verteilungsisotherme Cs Verteilungsisotherme sollte linear sein Zu trennende Substanzen sollen sich im System Fließmittel-Schicht gleichmäßig verteilen, damit der Fleck rund bleibt cm Zusatz von Säuren, Basen, solvatisierenden Lösemitteln unterdrücken überlagernde Dissoziations- oder Assoziationsgleichgewichte- Substanzen werden in einheitliche Molekülform überführt H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)

31 Charakterisierung von Fließmitteln Lösemittelstärke - ε o Dimensionslose Größe zwischen 0 und 1 Charakterisiert das Vermögen des Lösemittels zum Stofftransport auf der Schicht Adsorptionsenergie des Lösemittels pro Flächeneinheit unabhängig von Adsorptionsaktivität Pentan/Hexan ist als = 0.00 definiert

32 Eluotrope Reihe auf Kieselgel Pentane / Hexane 0.00 Ethyl acetate 0.48 Cyclohexane 0.04 Acetone 0.50 CCl Acetonitrile 0.60 Toluene 0.27 Dioxane 0.60 Isopropyl ether 0.28 Pyridine 0.70 Dichloromethane 0.30 Propanol 0.82 Chloroform 0.36 Methanol 0.95 Diethylether 0.43 Acetic acid >>1 Geiss, Fundamentals of TLC, Huethig 1987

33 Lösemittelstärke Zunehmende Fliessmittelstärke: Einfluss auf die Trennung eines Testfarbstoffes. MP: Hexan mit 0, 5, 10, 15, 20, 30, 40, und 90% Ethylacetat (von links nach recht) CAMAG Applikationslabor

34 Lösemittelstärke binärer Mischungen Die Lösemittelstärke einer Mischung ist nicht additiv Bei Zugabe eines starken Lösemittels zu einem schwachen, ändert sich die Lösemittelstärke erst drastisch, dann immer weniger F. Geiß, Die Parameter der Dünnschichtchromatographie, Fr.Vieweg+Sohn, Braunschweig 1972

35 Lösemittelstärke und Selektivität Vergleichende Entwicklung mit Lösemittel ε o A,B = 0.18 auf Aluminiumoxid bei 58% r.f. a) 7.1% Ethylacetat in Hexan b) 9.53% Aceton in Hexan c) 29.9% Toluen in Hexan H.-P. Frey, K. Zieloff: Qualitative u. quantitative Dünnschichchromatographie, VCH (1993)

36 Polaritätsindex (P`) nach Snyder Maß für die Fähigkeit eines Fließmittels mit verschiedenen Lösungsmitteln (z.b. Ethanol, Dioxan, Nitromethan) in Wechselwirkung zu treten Zur Berücksichtigung der Protonenakzeptor- Protonendonator- und Dipoleigenschaften wurden die Verteilungskoeffizienten der Fließmittel gelöst in den oben genannten Lösemitteln hinzugezogen Aus diesen Daten berechnete Snyder log (K )-Werte, die sich additiv zum P`-Wert zusammenstzen P`= log (K ) Ethanol + log (K ) Dioxan + log (K ) Niromethan

37 Polaritätsindex (P`) nach Snyder P`= log (K ) Ethanol + log (K ) Dioxan + log (K ) Niromethan Es lassen sich daraus die Wechselwirkungsanteile der Fließmittel mit den Lösemitteln Etahanol, Dioxan, Nitromethan berechnen. Zum Beispiel: χ e = log (K ) Ethanol /P P = χ e P + χ d P + + χ n P (χ e + χ d + + χ n ) = 1 P` Polaritätsindex Χ e Χ d Χ n Anteil Fließmittelwechselwirkung mit Ethanol (Protonenakzeptoreigensch.) Anteil Fließmittelwechselwirkung mit Dioxan (Protonendonatoreigensch.) Anteil Fließmittelwechselwirkung mit Nitromethan (Dipoleigensch.)

38 Einteilung der Lösemittel nach Selektivität (Snyder) I II III IV V VI VII VIII Aliphatische Ether, Trialkylamine, Trialkylphosphate Aliphatische Alkohole Pyridin, THF, DMSO, DMF, Diethylenglycol Benzylalkohol, Ethylenglycol, Essigsäure, Formamid Dichlormethan, 1,2-Dichlorethan Ketone, Ester, Dioxan, Nitrile Aromatische (halogenierte) Kohlenwasserstoffe, Nitroverbindungen Chloroform, Wasser, Fluoroalkohole, m- Kresol

39 Polaritätsindex, Selektivitätsparameter, Selektivitätsgruppe X e - gemessene Protonenakzeptorstärke X d - gemessene Protonendonatorstärke X n - gemessene Dipolwirkung Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

40 Lösemittelstärke und Selektivität A: Hexan /15% Ethylacetat B: Hexan /20% Aceton C: Hexan /10% Isopropanol D: Chloroform Aceton und Ethylacetat- gleiche Selektivitätsgruppe IV Isopropanol II, Chloroform VIII Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

41 Zusammenfassung Selektivität- entscheidender Faktor zur Trennung von Substanzen gleicher Polarität Fließmittelstärke Faktor zur Trennung von Substanzen unterschiedlicher Polarität Isoelutrope Fließmittel- gleiche Stärke unterschiedliche Selektivität-unterschiedliche Trennungen

42 Vorbetrachtungen zur Methodenentwicklung Definition der analytischen Zielstellung Soll die Methode zur Routine oder für eine Entwicklung erarbeitet werden? Soll die Methode zur Untersuchung von Rohmaterial, Extrakten, Endprodukten oder Mischproben dienen? Möchten Sie die Identität einer Komponente oder der Komponente in einer Mischung analysieren? Möchten Sie quantifizieren? Welche Matrices erwarten Sie, welche NWG? Können Sie bereits auf eine bestehende Methode zurückgreifen? Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

43 Vorbetrachtungen zur Methodenentwicklung Aspekte Eine qualitative Methode dient als Fingerprint und sollte so viel wie möglich Komponenten auftrennen Steht Ihnen exklusives Referenzmaterial aus kontrolliertem Anbau zur Verfügung ist eine Identitätsprüfung weniger schwierig Ist Ihre Leitdroge Bestandteil einer Mischung kann ein komplexer Fingerprint der Mischung entwickelt werden. Die spezifischen Banden der Leitdroge müssen herausgearbeitet werden, die übrigen werden als Matrix angesehen. Quantitative Methode setzt Basislinientrennung voraus. Das Chromatogramm kann so einfach wie möglich gestaltet werden. Extensive Probenvorbereitung kann erforderlich sein. Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

44 Vorbetrachtungen zur Methodenentwicklung Ausgangspunkt Auftragen der Proben (Lösemittel, Probevolumen, Auftragegeschwindigkeit, Größe und Schärfe der Auftragezone) Modifikation der stationären Phase (Aktivität, Imprägnierung) Chromatographiekammer (Typ, Sättigungsgrad) Entwicklungsmodus (Einfach, Mehrfach, Gradient) Detektion und Derivatisierung (UV-Absorption, Fluoreszenz, Reagentien, Konditionierrung) Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

45 Was ist bekannt? Anzahl der Komponenten Chemische Struktur Molekulargewicht Löslichkeit Matrix Konzentrationsbereich pka ; UV Spektrum, etc. Nichts

46 Schema zur Methodenentwicklung Probe Probenvorbereitung Orientierung über das chromatogr. System (z. B. Dreieck-Schema nach Stahl) Wahl der stationären Phase (mit Kieselgel starten) Optimierung der mobilen Phase Analyten detektierbar? nein ja Probenvorbereitung optimieren, evtl. prächrom. derivatisieren e/o nein Analyten angetrennt 1? ja Optimierung Gasphase, Konditionierung, Zweifachentwicklung e/o AMD Weitere chrom. Verfahren nein Analyten getrennt? Analyten getrennt? ja nein ja Ende Postchrom. Derivatisierung 1 Bei Beurteilung einer Trennung selektive Detektion berücksichtigen CAMAG Applikationslabor

47 Auswahl des Fließmittels Praktische Lösung Standardsysteme Fleckentest Prisma-Modell CAMAG - Optimierungsschema

48 Auswahl des Fließmittels Standardsysteme Lösemittelgemische: 1.Toluen/Ethylacetat 95+5 für unpolare Komponenten 2. Chloroform/Methanol/Wasser für Saponine und Lignane 3. Ethylacetat/Essigsre/Ameisensre/Wasser für Flavonoide 4. Acetonitril/Wasser/Ameisensäure für Aminosäuren 5. Butanol/Essigsäure/Wasser für polare Komponenten Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

49 1.Toluen/Ethylacetat 95+5 für unpolare Komponenten 2. Chloroform/Methanol/Wasser für Saponine und Lignane 5. Butanol/Essigsäure/Wasser für polare Komponenten 3.Ethylacetat/Essigsre/Ameisensre/ Wasser für Flavonoide 4. Acetonitril/Wasser/Ameisensäure für Aminosäuren Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

50 Fleckentest Versuch und Irrtum Lösen der Probe in unpolarem Lösemittel Applikation auf die DC-Platte Applikation ~ 20 µl unterschiedlicher Lösemittel auf die Probenflecken Es erfolgt eine Zirkularentwicklung Trocknen der Lösemittel

51 Fleckentest Goldenseal CAMAG Applikationslabor

52 Fleckentest CAMAG Applikationslabor

53 Fleckentest Lavender CAMAG Applikationslabor

54 Vor- und Nachteile Fleckentest Schnell und automatisiert Lösmittelanzahl und Typ sind flexibel Information über Lösemittelstärke und Selektivität Ungesättigtes offenes System Unsystematisch

55 Vororientierung Dreieck-Schema nach Stahl

56 Auswahl stationäre Phase Beginnen mit Kieselgel Für spezielle Trennprobleme spezielle Schichten: Bsp.:Eugenol, Methyleugenol, Isoeugenol OH OMe OMe OMe 1 Kieselgel Amino- Cyano OH 2 MP: Toluen, D: Schwefelsäurereagenz, OMe 1 Eugenol, 2 Methyleugenol, 3 Isoeugenol Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag 3

57 Reine Fliessmittel Herabsetzen / Erhöhen der Fliessmittelstärke m. Wasser oder stärkeren LSM gleiche Selektivitätsgruppe Mischungen, Modifier-Zugabe (Säuren, Basen) Umgebung der besten Mischung

58 Auswahl mobile Phase Stufe 1 Beispiel Curcuma A: TBME B: Methanol C: THF D: Ethylacetat E: DCM F: Toluen G: Chloroform Gruppe A: die gewünschten Komponenten sind getrennt, die Rf-Werte sind im passenden Bereich, das Trennproblem ist gelöst Gruppe B: Sie erhalten Rf-Werte über 0,8 Gruppe C: Sie erhalten Rf-Werte kleiner 0,2 Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

59 Auswahl mobile Phase Stufe 2 Beispiel Curcuma TBME Methanol THF Ethylacetat TBME Ethylacetat Lösemittel der Gruppe B werden mit n-hexan verdünnt. Je höher die Lösemittelstärke, desto höher muss der Anteil an n-hexan ausfallen. Sollte die Probe komplett in die Front laufen, sollte ein Verhältnis von mindestens 1:4 eingesetzt werden. A-D 1:4 E und F 1:1 Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

60 Auswahl mobile Phase Stufe 2 Beispiel Curcuma DCM/Essigsre Toluol/Essigsre Chloroform/Essigsre 9+1 Lösemitteln der Gruppe C wird ein polarer Modifier zugesetzt (z.b. Essigsäure, Ameisensäure oder Basen wie z.b. Diethylamin, Ammoniak). Ein erster guter Versuch sind ca. 10%. Auch der Zusatz von Wasser ist möglich, wenn die Mischbarkeit gegeben ist. Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

61 Auswahl mobile Phase Stufe 3 Beispiel Curcuma Kombination von 2 Lösemitteln aus den Gruppen B und C zunächst als Mischung 1:1, dann im Umkreis durch pobieren beste Mischung finden Einstellung der Lösemittelstärke mit Modifiern um scharfe Trennzonen zu bekommen. Bei Fleckentailing ist z.b. eine Wasserzugabe von 0,5-1% nützlich. Modifizierung der Trennbedingungen (Kammersättigung, Feuchte) A: Isopropanol/Hexan/Wasser 1:6:0,2 B:TBME/Hexan/Ameisensre 5:5:0,1 C:Toluol/Methanol 4,5:0,5 D: Chloroform/Methanol/Ameisensäure 10:0,1:0,1 Eike Reich, Anne Schibli High-Performance Thin-Layer Chromatography for the Analysis of Medical Plants, Thieme Verlag

62 Feinabstimmung der Methode Es wurde ein Fließmittel gefunden. Variation des Auftragevolumens (qualitativ Maximum an Zonen, quantitativ linearer Arbeitsbereich) Derivatisierung/Visualisierung ( spezifische und unspezifische Reagenzien, Optimierung der Derivatisierung für gute Reproduzierbarkeit) Robustheit der Methode Parameter der densitometrischen Messung (Wellenlänge, Spaltdimension, Geschwindigkeit)

63 Nun kann die Methode validiert werden

64 Detektion/Derivatisierung in der DC

65 Detektion/Derivatisierung Lokalisierung und Identifizierung Lokalisierung (Ermittlung der Lage im Chromatogramm) Physikalische Verfahren Chemische Reaktionen Biologische Reaktionen Identifizierung (Verwendung von gruppenspezifischen Reagenzien) Chemisches Verhalten Physikalische, chemische, biologische Eigenschaften

66 Physikalische Detektion

67 Chemische Reaktionen Derivatisierung bei der Probenvorbereitung am Start visuelle und photom. Auswertung prächromatographisch postchromatographisch chromatogr. Entwicklung Chromatogramm

68 Prächromatographische in-situ-derivatisierung Chemische Reaktionen Für Substanzen mit ähnlichen chromatographischen, aber unterschiedlichen chemischen Eigenschaften Zur Erhöhung der Stabilität Reagenzapplikation punkt- oder strichförmig Umsetzung flüchtiger Substanzen in Derivate Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit durch z.b. Erzeugung einer Fluoreszenz Applikation Untersuchungslösung (in feuchte Reagenzzone) Nachteil: Analyt wird mit Derivatisierungsreagenz verunreinigt und muss zusätzlich abgetrennt werden Molekül wird größer und durch das Reagenz in der Struktur ähnlicher- dadurch schlechtere Trennung Beispiel: Dansylierungen Dansylhydrazin für Carbonylgruppen Dansylchlorid für NH und OH-Gruppen Dansylsemipiperazid für Fettsäuren Dansylazirin selektiv für SH-Gruppen eventuelle Wärmebehandlung (Startzone abdecken) Chromatographische Entwicklung

69 Prächromatographische in-situ-derivatisierung Chemische Reaktionen Beispiel: Dansylierungen Dansylhydrazin für Carbonylgruppen Dansylchlorid für NH und OH-Gruppen Dansylsemipiperazid für Fettsäuren Dansylazirin selektiv für SH-Gruppen Gerad- und ungeradzahlige Fettsäuren nach in-situ-derivatisierung mit Dansylsemicadaverid 1: C-24 bis C-16 2: C-24 bis C-6 3: C-20 bis C-12 4: C-20 bis C-11 5: C-19 bis C-11 6: C24 bis C-16

70 Chemische Reaktionen Postchromatographische Derivatisierung Entwicklung des Chromatogramms Trocknen Derivatisierungstechniken Erwärmen Bedampfen Tauchen Sprühen

71 Trocknen der Platte Vertikale Lage der Platte, um Fließen des Restlösemittels und damit Fleckendiffusion zu verhindern (so lange wie Feuchte offensichtlich).

72 Kritische Trocknung im Luftstrom Anethol in Anis- und Fenchelöl MP: Toluen/Ethylacetat 95+5 D: UV 254 Die etherischen Öle werden im Luftstrom von ihren Plätzen gerissen! E.Reich,A. Schibli HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants, Thieme 2006

73 Derivatisierungstechniken Thermochemische Reaktionen (Erwärmen) Aminophase für die Trennung von Zuckern Erhitzen der Platte 3-5 min auf 150 C

74 Bedampfen Doppeltrogkammer oder Konditionierkammer Nutzung von Joddämpfen, Ammoniak, Brom, Chlor,

75 Chemische Reaktionen Postchromatographische Derivatisierung Erzeugung einer Absorption im sichtbaren-oder UV-Bereich oder einer Fluoreszenz Verwendung von gruppenspezifischen Reagenzien zum stoffspezifischen Nachweis Steigerung der Selektivität Steigerung der Nachweisempfindlichkeit

76 Derivatisierungstechniken Sprühen Spraydosen Laborsprüher Sprühautomat (DESAGA)

77 Derivatisierungstechniken Sprühen Vorteile Einfach und schnell Keine besondere Ausrüstung Kleine Volumina Nachteile Erzeugung von Sprühnebeln Schwierige Gewährleistung der Homogenität Undefiniertes Volumen Routine zum exakten Sprühen muss erst erworben werden Es könne partielle Feuchteinseln entstehen

78 Derivatisierungstechniken Tauchen Gleichmäßige Belegung mit Reagenz Reproduzierbare Ergebnisse durch standardisierte Bedingungen Keine Sprühnebel Reinigen der Rückseite Vertikale Lagerung um Bandenverbreiterung auszuschließen

79 Vergleich Tauchen-Sprühen Tauchen Sprühen CAMAG Applikationslabor

80 Vergleich Tauchen-Sprühen Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel

81 Vergleich Sprühen-Tauchen Derivatisierung von Capsaicin mit Gibbs-Reagenz (Dichlorchinon chlorimid gefolgt von Base) Sprühreagenz: 1%-ige Lsg. Gibbs-Reagen; 2%-ige Natriumcarbonat- Lösungen haben hohe Viskosität und lassen sich somit schlecht dosieren Tauchreagenz: 0,025% Gibbs Reagenz und basische Bedampfung mit z.b. Ammoniak

82 Reagenzien Universalreagenzien Ansprühen mit Wasser macht lipophile Substanzen kurzzeitig als helle Flecken auf grauem Grund

83 Reagenzien Universalreagenzien Anisaldehyd- Schwefelsäure-Reagenz Untersch. gef. Zonen, häufig bei 365nm Fluoreszenz C 1-5 min 3% Phosphormolybdänsäure in Propan-2-ol Schwefelsäure-Reagenz Vanillin-Phosphorsäure Blaue Flecken auf gelbem Grund Fluoreszierende Zonen bei 366nm,oder verkohlte Zone Versch. Gefärbte Zonen auf hellem Grund 10 min C 1-20 min C 5-10 min C

84 Anisaldehyd-Schwefelsäure Welche Rezeptur soll ich nehmen? Anisaldehyd Schwefelsäure Essigsäure Methanol Bedingungen Literatur 1ml 2ml 97 ml 1-15 min, C Jork,Funk,Fisc her Wimmer 0,5ml 5ml 10ml 85ml 100 C, bis zur Farbentw. Kraus,Koch, Hoffstetter, Kuhn 0,5ml 5ml 10ml 85ml 100 C, 2-5 min Reich,Schibli 1ml 2ml 100ml C Stahl

85 Anisaldehyd-Schwefelsäure-Reagenz 10 ml Schwefelsäure werden vorsichtig in eine Mischung aus 170 ml eisgekühltem Methanol und 20 ml Eisessig eingerührt. Zu dieser Mischung wird 1 ml Anisaldehyd zugefügt. Das Reagenz ist farblos und sollte im Kühlschrank aufbewahrt werden. Sollte sich die Farbe ändern, muss es verworfen werden! Die Platte wird in das Reagenz mit einer Verweilzeit von 1 s getaucht. Danach wird 2-5 min auf 100 C erhitzt. Auswertung im Weißlicht und bei UV 366 nm

86 Ergebnis in Abhängigkeit vom zugeführten Reagenz Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel

87 Stoffspezifische Reagenzien Zucker und Glycoside Schicht: HPTLC Kieselgel 60 (rel. Feuchte über 62% Schwefelsäure Fließmittel: Chloroform: Essigsäure: Wasser Derivatisierung: Diphenylamin, Anilin und Orthophosphorsäure gelöst in Aceton

88 Beeinflussung der Nachweisempfindlichkeit zugeführtes Reagenz Funk, Fischer, Wimmer,Dünnschichtchromatographie Bd.1

89 Nachbehandlung Trocknen Abzug vertikale Lagerung ev. Ventilator oder Fön Substanzeigenschaften (Flüchtigkeit, Oxidationsempfindlichkeit beachten)

90 Einwirkung von Wärme Trockenschrank Heizplatte Nicht auf das Gitternetz legen Metallblock verwenden oder frei schwebend Visuelle Verfolgung homogene Umsetzung

91 Hinweise zur Benutzung von Wärmeplatten Legen Sie die Platte auf die noch kalte Heizplatte und heizen Sie Platte und Gerät gleichzeitig auf. Wollen Sie mehrere Platten derivatisieren kühlen Sie auf etwa 60 C ab. Haben Sie hohen Plattendurchsatz, dann legen Sie die Platten auf ca. 1mm dicke seitlich angebrachte Abstandhalter (das Luftpolster verhindert das Aufwölben der Platte. Wählen Sie eine 10 C höhere Temperatur um Wärmeverlust auszugleichen.

92 Temperatur Konzentration und Zusammensetzung der Lösung Stabilität der Lösung

93 Derivatisierung Temperatur Flavonoids of St. John s Wort 1: 3 min Kaltluftstrom 2: 5 min 105 C 3: 30 min 105 C 366 nm, NP, NP/PEG nach 30 min 366 nm, NP, NP/PEG 366 nm, NP, NP/PEG CAMAG Applikationslabor

94 Derivatisierung Temperatur Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel

95 Konzentration und Zusammensetzung der Lösung Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel

96 Derivatisierung Alter des Reagenz Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel

97 Lagerung der derivatisierten Platte Diplomarbeit Katherine Gessler, Uni Basel

98 Einfluss des Plattenuntergrundes auf Derivatisierung

99 Reagenz im Sorbens Reagenz wird in die Sorbensschicht eingearbeitet Reagenz Coffein Ammoniumsulfat Silbernitrat Molybdatophosphorsäure Nachgewiesene Substanzen PAH Lipide Dihydroxybenzole Etherische Öle

100 Reagenz im Fließmittel Voraussetzung: -gleichmäßige Verteilung auf der Schicht-Reagenz muss mit der Fließmittelfront laufen Beispiele: Ninhydrin bei Aminosäuren Fluorescamin bei biogenen Aminen Identifizierung und Quantifizierung von Aminosäuren und Peptiden (CBS 101,Hamon,Diancourt,Roy,Sbaffo-Poasevara) Ninhydrin in der mobilen Phase vermindert das Rauschen um den Faktor 2. Die selektive Derivatisierung ist bestens geeignet, da die nicht derivatisierte Matrix die Detektion nicht beeinflusst

101 Probleme beim Derivatisieren Problem Reaktion Hohe Untergrundfärbung Benetzungsprobleme Fleckenelution bzw. Vergrößerung Verdünnen Reagenz, Temperatur herabsetzen, Platte vorwaschen Polarität Lösemittel ändern ( KG- Polarität erhöhen, RP-Polarität senken) Polarität Lösemittel ändern ( KG- Polarität senken, RP-Polarität erhöhen) Schlechte Reproduzierbarkeit Standardisierte Bedingungen einhalten

102 Wirkungsbezogene Detektion direktes Biomonitoring Direkte Messung der physiologischen Wirkung Referenzsubstanzen müssen nicht vorhanden sein -Enzymatische Reaktionen Acetylcholinesterase- Hemmung durch Phosphorsäureester und Carbamate Bestimmung von Schwermetallen mit Urease -Antibiotische Wirkung mit Bacillus subtilis -Toxische Wirkung mit Vibrio fisheri Marines Bakterium Kontinuierlilches Biolumineszenzsignal Nicht pathogen Seit 1979 für ökotoxische Tests im Einsatz (DIN )

103 Wie funktioniert das? Tauchen der DC-Platte in die Bakteriensuspension Züchtung der Bakterien Beseitigung des Überschusses

104 Ergebnis 200 ng 150 ng 100 ng 100 μg 75 μg 50 μg 25 μg 10 μg Biolumineszenzlöschung Biolumineszenzstimulation np A B C D E A-E: Probenverdünnungen np: Nitrophenol (toxische Referenz)

105 Beispiele Patulin in Apfelsaft

106 Das CAMAG TLC-MS Interface Laser on/off Stempel rauf/runter Schalter Reinigung Sicherheitschutzschild on/off Schaltventil zu MS

107 Stempel

108 Prinzip TLC-MS Kopplung HPLC Pump fördert Lösungsmittel (MeOH) Flow rate: 100µl/min CAMAG TLC-MS Interface MS-ESI (Electrospray Ionization Interface)

109 Funktionsprinzip TLC-MS Interface Positionierung Platte mit Laserkreuz auf gewünschten Spot/Zone Stempel senkt sich mit 4 bar ab und Extraktion beginnt

110 Funktion Stempel und Extraktion MS2 HPLC Pumpe fördert Lösungsmittel Massenspektometer analysiert Probe Stempel senkt sich mit kontrolliertem Druck DC/HPTLC Platte mit Spots/Zonen

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